WO2023002967A1 - アルツハイマー病モデルマウスのＡβバイオマーカー及びその分析方法 - Google Patents

アルツハイマー病モデルマウスのＡβバイオマーカー及びその分析方法 Download PDF

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mouse
app669
model
brain
accumulation
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直樹 金子
泰輔 富田
将也 松崎
雅シャラ 横山
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株式会社島津製作所
国立大学法人東京大学
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to A ⁇ biomarkers for Alzheimer's disease (AD) model mice and methods for their analysis.
  • AD Alzheimer's disease
  • the number of dementia patients is estimated to be about 50 million worldwide in 2017, and is expected to reach about 82 million in 2030. It is estimated that the number of dementia patients in Japan will reach 7 million in 2025.
  • Amyloid ⁇ (A ⁇ ) is thought to be deeply involved in the onset of AD.
  • Amyloid precursor protein (APP) consisting of 770 amino acid residues is cleaved by various proteases to produce various molecular species of A ⁇ .
  • Major A ⁇ s include A ⁇ 1-40 with 40 amino acid residues and A ⁇ 1-42 with 42 amino acid residues, and A ⁇ 1-42 has a strong aggregation property.
  • senile plaques appear in the brain due to aggregation of A ⁇ accompanied by fibrosis, which is considered to be the earliest pathological change.
  • test methods used for AD diagnosis include PET (Positron Emission Tomography) imaging (amyloid PET) that visualizes A ⁇ accumulation in the brain, and A ⁇ in cerebrospinal fluid (CSF) as a biomarker. (also referred to simply as a "marker").
  • PET Positron Emission Tomography
  • CSF cerebrospinal fluid
  • amyloid PET is a technique for imaging the site and amount of A ⁇ amyloid accumulation in the brain with high accuracy, and is currently established as an imaging biomarker capable of detecting the early pathology of AD.
  • amyloid PET is expensive to test, it is realistic to use it under limited conditions in clinical practice.
  • the CSF examination is a highly invasive examination, and thus imposes a heavy physical burden. Under such circumstances, the development of biomarkers that are non-invasive and easy to collect has been desired.
  • IP-MS Immunoprecipitation-Mass Spectrometry
  • APP669-711 / A ⁇ 1-42 ratio in plasma and A ⁇ 1-40 / It has been reported that the A ⁇ 1-42 ratio and a composite biomarker combining them can accurately estimate human brain A ⁇ accumulation (Patent Documents 2 and 3, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • This biomarker has value in human AD differentiation and as a risk factor for the onset of AD, and is expected to play an important role in determining intervention methods such as treatment and prevention. is placed.
  • Non-Patent Document 3 shows that A ⁇ 1-40 accumulates in the brains of AD model mice by staining with the A ⁇ 1-40-specific antibody BA27
  • Non-Patent Document 4 describes mouse brain FA soluble Ab ( It has been shown that A ⁇ 1-40 in the fraction where A ⁇ accumulation is lysed) is increased in transgenic mice over wild type (WT).
  • Non-Patent Documents 6, 7 As a method for evaluating the amount of A ⁇ accumulation in the brain of AD model mice, there is the above-mentioned PET imaging, but it is a potentially dangerous experiment because it requires a PET device for experimental animals and also needs to handle radioactive substances (non Patent document 5). In addition, since AD model mice are small, it is difficult to collect CSF. On the other hand, as a relatively easy method for evaluating A ⁇ accumulation in the brain, there is also a method of evaluating the state of amyloid accumulation in the brain by measuring the amyloid in the insoluble fraction after dissolving the brain of an AD model mouse. Continuous monitoring is not possible because it kills the mice (Non-Patent Documents 6, 7).
  • the present invention aims to provide a biomarker for evaluating the state of A ⁇ accumulation in the brain of AD model mice, which is relatively easy to collect, is safe, and can be continuously observed, and a method for analyzing the same. aim.
  • a biological sample derived from an AD model mouse is subjected to detection of markers including mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 to detect mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in the biological sample. and the ratio of the mouse APP669-711 level to the mouse A ⁇ 1-40 level: the step of obtaining APP669-711/A ⁇ 1-40, and the ratio of the AD model mouse to determine whether A ⁇ accumulation in the brain appears. determining that the amount of A ⁇ accumulated in the brain of the AD model mouse is higher than the amount of A ⁇ accumulated in the brain of the reference mouse when the ratio is higher than the ratio of the reference mouse without It relates to an analytical method for determining
  • biological samples derived from AD model mice are subjected to detection of markers including mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711, obtaining measured levels of mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in said biological sample; determining the ratio of mouse APP669-711 levels to mouse A ⁇ 1-40 levels: APP669-711/A ⁇ 1-40;
  • a method of analysis for determining the effectiveness of said intervention with respect to the state of A ⁇ accumulation in the brain comprising the step of comparing said ratio of AD model mice before and said ratio of AD model mice after intervention.
  • a biological sample derived from an AD model mouse is subjected to detection of markers including mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 to detect mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in the biological sample. and the ratio of the mouse APP669-711 level to the mouse A ⁇ 1-40 level: the step of obtaining APP669-711 / A ⁇ 1-40 is performed multiple times on the same AD model mouse over time, and the AD model mouse
  • the present invention relates to an analysis method for evaluating changes in the ratio of A ⁇ to determine whether the amount of A ⁇ accumulation in the brain is increasing or decreasing.
  • a biological sample derived from an AD model mouse is treated with mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669 before and after providing a candidate substance for improving the state of A ⁇ accumulation in the brain to the AD model mouse.
  • a marker comprising 711 to obtain measured levels of mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in said biological sample, and a ratio of mouse APP669-711 levels to mouse A ⁇ 1-40 levels: APP669- A ⁇ in the brain, comprising the steps of determining 711/A ⁇ 1-40, and comparing the ratio of the AD model mouse before receiving the candidate substance and the ratio of the AD model mouse after receiving the candidate substance.
  • the present invention relates to analytical methods for screening candidate substances for improving accumulation conditions.
  • a fifth aspect of the present invention relates to a marker for determining the state of brain A ⁇ accumulation, which consists of a combination of mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in a biological sample derived from an AD model mouse.
  • the analysis method and biomarker for evaluating the state of A ⁇ accumulation in the brain of AD model mice are relatively easy to collect, safe, and allow continuous observation. Markers can be provided.
  • FIG. 1 is an immunostained image of brain tissue of a 23-month-old APP/PS1 mouse in Example 1.
  • FIG. 2 shows mass spectra of mouse A ⁇ -related peptides in the plasma of 2-month-old (A) and 25-month-old (B) APP/PS1 mice in Example 1.
  • a first aspect of the present invention is an analysis method for determining the state of accumulation of A ⁇ in the brain, comprising: subjecting a biological sample derived from an AD model mouse to detection of markers including mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 to obtain measured levels of mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in the biological sample; determining the ratio of mouse APP669-711 levels to mouse A ⁇ 1-40 levels: APP669-711/A ⁇ 1-40; When the ratio of the AD model mouse is higher than the ratio of the reference mouse in which brain A ⁇ accumulation does not appear, the amount of A ⁇ accumulation in the brain of the AD model mouse is higher than the amount of A ⁇ accumulation in the brain of the reference mouse. and the step of determining that the
  • a biological sample derived from an AD model mouse is subjected to detection of markers containing mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711, and each measurement of mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in the biological sample. It includes a step of obtaining the level (this step is called a "measurement step").
  • the AD model mouse is not particularly limited, and for example, the AD model mouse described in Non-Patent Document 8 can be used as appropriate.
  • Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo) (Non-Patent Document 9), 5xFAD (B6SJL) (Non-Patent Document 10), 5xFAD (C57BL6) (Non-Patent Document 11), APP/PS1/rTg21221 (Non-Patent Document Document 12), APPSwe/PSEN1 (A246E) (Non-Patent Document 13), APPSwe/PSEN1dE9 (C3-3 x S-9) (Non-Patent Document 14), APPswe/PSEN1dE9 (line 85) (Non-Patent Document 15), Tg2576/Tau (P301L) (APPSwe-Tau) (Non-Patent Document 16), TREM2-BAC X 5xFAD (Non-Patent Document 17), 3xTg (Non-Patent Document 18), APP23 (Non-Patent Document 19), APP Knock-in (
  • an APP/PS1 mouse which is a transgenic mouse overexpressing human Swedish mutant APP and ⁇ Exon mutant PS1 by a nervous system-specific prion promoter (PrP), is preferable.
  • PrP nervous system-specific prion promoter
  • APPswe, PSEN1dE9)85Dbo is used.
  • APP/PS1 mice are known to develop brain A ⁇ accumulation from about 6 to 7 months of age (Non-Patent Document 21). /PS1 mice are used for the study.
  • the "biological sample” can be selected from blood, urine, feces, body secretions (eg, saliva, tears), and the like.
  • the biological sample is preferably blood because it is easy to collect and reflects the state of A ⁇ in the brain.
  • Blood is a sample that is directly subjected to the marker expression level measurement step, and includes whole blood, plasma, serum, and the like. Blood can be prepared by appropriately treating whole blood collected from AD model mice. There are no particular restrictions on the processing performed when preparing a blood sample from collected whole blood, and any processing such as centrifugation may be performed.
  • the blood to be subjected to the measurement process may be stored at a low temperature such as freezing as appropriate in the middle stage of the preparation process or in the latter stage of the preparation process.
  • the biological sample may be used to measure the concentration of the component as it is, or may be used to measure the concentration of the component after being appropriately pretreated as necessary.
  • Pretreatment includes, for example, termination of enzymatic reaction in the biological sample, removal of fat-soluble substances, removal of protein, and the like. These pretreatments may be performed using known methods. Also, the biological sample may be appropriately diluted or concentrated before use.
  • mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 have the following amino acid sequences.
  • the level of a marker basically means concentration, but may be other units used by those skilled in the art according to concentration, such as detected ion intensity in mass spectrometry.
  • Biomolecule-specific affinity-based tests are methods well known to those skilled in the art and are not particularly limited, but immunoassays are preferred. Specifically, Western blot, radioimmunoassay, ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) (including sandwich immunomethod, competitive method, and direct adsorption method), immunoprecipitation method, precipitation reaction, immunodiffusion method, immunoagglutination measurement, Immunoassays, including competitive and non-competitive assay systems, such as complement fixation assays, immunoradiometric assays, fluorescence immunoassays, protein A immunoassays, are included. Immunoassays detect antibodies that bind to the above markers in biological samples.
  • IP-MS antibody-immobilized carrier
  • a step of determining the ratio of mouse APP669-711 levels to mouse A ⁇ 1-40 levels: APP669-711/A ⁇ 1-40 (this step is referred to as a “calculating step”).
  • the marker that is the ratio APP669-711/A ⁇ 1-40 is the level in plasma samples from reference AD model mice in which A ⁇ accumulation in the brain does not appear, and AD model mice in which A ⁇ is excessively accumulated in the brain. A significant difference was observed between the levels in plasma samples from
  • a ⁇ 1-42 has so far been used as a suitable indicator in AD analysis of humans (Patent Documents 2 and 3, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • mouse A ⁇ 1-42 having the following amino acid sequence exists in mice.
  • mouse A ⁇ 1-42 DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 3)
  • mouse A ⁇ 1-42 is difficult to measure because the amount of blood collected is small and the concentration of mouse A ⁇ 1-42 is low, unlike in humans. Therefore, the present inventors found that mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 can be more suitable indicators than mouse A ⁇ 1-42 when AD model mice are used as test subjects.
  • the ratio of the AD model mouse is higher than the ratio of the reference mouse in which brain A ⁇ accumulation has not appeared, then A ⁇ accumulation in the brain of the AD model mouse
  • the amount includes the step of determining that it is greater than the amount of A ⁇ accumulation in the brain of the reference mouse.
  • concentration analysis of the marker in the biological sample is performed by comparing the measured value with the reference value.
  • reference mice 2- to 5-month-old (young) AD model mice and wild-type mice can be suitably used.
  • the analysis method for evaluating the state of A ⁇ accumulation in the brain of an AD model mouse is relatively easy to collect, safe, and allows continuous observation. can be provided.
  • a second aspect of the present invention is an analytical method for determining the effectiveness of the intervention with respect to the state of A ⁇ accumulation in the brain, Before and after intervention performed on AD model mice, A step of subjecting a biological sample derived from an AD model mouse to detection of a marker containing mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 to obtain each measured level of mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in the biological sample (measurement process) and Determining the ratio of mouse APP669-711 levels to mouse A ⁇ 1-40 levels: APP669-711/A ⁇ 1-40 (calculation step); Comparing said ratio of AD model mice before intervention with said ratio of AD model mice after intervention.
  • the analysis method of the second aspect is performed before and after intervention performed on AD model mice.
  • intervention includes administration of therapeutic or prophylactic drugs for AD, diet therapy, exercise therapy, learning therapy, surgical operation, and the like.
  • Exercise therapy, learning therapy, and surgery include both known and unknown ones.
  • the measurement step and calculation step in the second aspect are the same as the measurement step and calculation step in the first aspect described above.
  • the ratio of the AD model mouse before the intervention and the ratio of the AD model mouse after the intervention comparison is evaluated. be able to.
  • a third aspect of the present invention is an analysis method for determining whether the amount of A ⁇ accumulated in the brain is increased or decreased,
  • the measurement step and the calculation step are performed multiple times on the same AD model mouse over time.
  • the measurement step and calculation step in the third aspect are also the same as the measurement step and calculation step in the first aspect described above.
  • the measurement step and the calculation step are performed multiple times on the same AD model mouse over time to evaluate changes in the ratio of the AD model mouse. According to such a third aspect, changes in A ⁇ accumulation in the brain of AD model mice can be evaluated over time to determine whether the amount of A ⁇ accumulation in the brain is increasing or decreasing.
  • a fourth aspect of the present invention is an analysis method for screening candidate substances for improving the state of A ⁇ accumulation in the brain, Before and after providing a candidate substance for improving the A ⁇ accumulation state in the brain to an AD model mouse, A step of subjecting a biological sample derived from an AD model mouse to detection of a marker containing mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 to obtain each measured level of mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in the biological sample (measurement process) and Determining the ratio of mouse APP669-711 levels to mouse A ⁇ 1-40 levels: APP669-711/A ⁇ 1-40 (calculation step); A step of comparing the ratio of AD model mice before administration of the candidate substance with the ratio of AD model mice after administration of the candidate substance.
  • the analysis method of the fourth aspect is performed before and after providing a candidate substance for improving the state of A ⁇ accumulation in the brain to an AD model mouse.
  • candidate substance refers to an unknown substance that has the potential to become a candidate for a therapeutic or prophylactic drug for AD for improving the state of accumulation of A ⁇ in the brain.
  • the measurement step and calculation step in the fourth aspect are also the same as the measurement step and calculation step in the first aspect described above.
  • the ratio of AD model mice before provision of the candidate substance and the ratio of AD model mice after provision of the candidate substance are compared. According to such a fourth aspect, by applying the candidate substance for improving the A ⁇ accumulation state in the brain to the AD model mouse before and after providing it, the A ⁇ accumulation state in the brain is improved. of candidate substances can be evaluated.
  • the present invention also provides a marker for judging the state of accumulation of A ⁇ in the brain, which consists of a combination of mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in a biological sample derived from an AD model mouse. Since the blood APP669-711/A ⁇ 1-40 ratio has not been reported as a biomarker in humans so far, it can be said that it is an AD model mouse-specific biomarker. By using the marker of the present invention, it becomes possible to determine with high accuracy the state of accumulation of A ⁇ in the brain of AD model mice derived from biological samples.
  • the biological sample and AD model mouse in the marker of the present invention may be those described above in the first aspect, but similarly, the biological sample is preferably blood, and the AD model mouse is preferably APP/PS1 mouse.
  • APP/PS1 mice are transgenic mice overexpressing human Swedish mutant APP and ⁇ Exon mutant PS1 by the nervous system-specific prion promoter (PrP).
  • APP/PS1 mice aged 2-5 months (young) or 23-30 months (old) were used.
  • APP/PS1 mice are known to exhibit brain A ⁇ accumulation from about 6 to 7 months of age (Non-Patent Document 21). Mice are used for research.
  • the prepared block was sliced to a thickness of 4 mm using MICROM HM 430 (Thermo SCIENTIFIC), spread on a slide glass coated with PLL (poly-L-lysine), and dried at 37° C. for 2 days. .
  • An anti-human A ⁇ mouse monoclonal antibody (82E1, IBL) and an anti-mouse A ⁇ rabbit polyclonal antibody (APP597, IBL) were used as primary antibodies.
  • each 500-fold diluted biotinylated secondary antibody was applied at room temperature for 2 hours, ABC elite (VECTOR) for 1 hour, ImmPACT SG (VECTOR) for 5 minutes, 0.1% hematoxylin solution for 10 seconds, and running water for 5 minutes. Penetrated for minutes.
  • IP-MS is a combination of immunoprecipitation (IP) and mass spectrometry (MS).
  • IP immunoprecipitation
  • MS mass spectrometry
  • Mass spectral data were obtained with linear TOF in positive ion mode using AXIMA Performance (Shimadzu/KRATOS, Manchester, UK).
  • the m/z value of Linear TOF is displayed as the average mass of the peak.
  • the m/z values and signal intensities were calibrated using standard peptides.
  • the m/z values were calibrated using human angiotensin II, human ACTH fragment 18-39, bovine insulin oxidized beta-chain, and bovine insulin as external standards.
  • the internal standard peptide SIL-A ⁇ 1-42 was used to normalize the signal intensity of each A ⁇ -related peptide in plasma.
  • the average value of the normalized intensities of four mass spectra obtained from one sample was obtained and evaluated as the amount of A ⁇ -related peptides. If there were two or more pieces of data that did not reach the detection limit (S/N ⁇ 3), the detection was not allowed.
  • This measurement method uses an antibody that specifically reacts with the mouse A ⁇ sequence, and in the mass spectrum, the peak detected by the theoretical mass of the mouse A ⁇ sequence is analyzed. For this reason, the present analytical data are intended for mouse A ⁇ -related peptides, and are not analyzed for A ⁇ -related peptides derived from overexpressed human Swedish mutant APP.
  • FIG. 2 shows mass spectra of mouse A ⁇ -related peptides obtained by IP-MS analysis of 2-month-old and 25-month-old APP/PS1 mouse plasma.
  • a ⁇ 1-40, A ⁇ 1-42, APP669-711 peaks at the position of the theoretical mass shown in Table 1 was detected.
  • APP669-711/A ⁇ 1-40 in the aged group increased more than in the young group (Fig. 5).
  • the blood APP669-711/A ⁇ 1-40 ratio reflects the accumulation of A ⁇ in the brain of AD model mice. Since the blood APP669-711/A ⁇ 1-40 ratio has not been reported as a biomarker in humans so far, it can be said that it is an AD model mouse-specific biomarker.
  • An analysis method is an analysis method for determining the state of accumulation of A ⁇ in the brain, wherein a biological sample derived from an AD model mouse is subjected to detection of markers including mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711, and the biological sample is Obtaining each measured level of mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in a sample, determining the ratio of mouse APP669-711 level to mouse A ⁇ 1-40 level: APP669-711/A ⁇ 1-40, AD model mouse is higher than the ratio of the reference mouse in which brain A ⁇ accumulation has not appeared, the amount of A ⁇ accumulation in the brain of the AD model mouse is higher than the amount of A ⁇ accumulation in the brain of the reference mouse. and determining.
  • an analysis method for evaluating the state of A ⁇ accumulation in the brain of AD model mice which is relatively easy to collect, is safe, and allows continuous observation. It becomes possible to
  • An analysis method is an analysis method for determining the effectiveness of intervention with respect to the state of A ⁇ accumulation in the brain. subjecting the biological sample to the detection of markers including mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 to obtain measured levels of mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in said biological sample; determining the ratio of 711 levels: APP669-711/A ⁇ 1-40, and comparing said ratio in AD model mice before intervention with said ratio in AD model mice after intervention.
  • An analysis method is an analysis method for determining whether the amount of accumulated A ⁇ in the brain is increased or decreased, and the AD model mouse-derived biological sample contains mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711. subjecting to detection of markers to obtain measured levels of mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in said biological sample, and a ratio of mouse APP669-711 levels to mouse A ⁇ 1-40 levels: The step of obtaining 40 is performed multiple times on the same AD model mouse over time, and changes in the ratio of the AD model mouse are evaluated.
  • changes in A ⁇ accumulation in the brain of AD model mice can be evaluated over time to determine whether the amount of A ⁇ accumulation in the brain is increasing or decreasing. .
  • An analysis method is an analysis method for screening candidate substances for improving the state of A ⁇ accumulation in the brain, and providing a candidate substance for improving the state of A ⁇ accumulation in the brain to an AD model mouse.
  • biological samples derived from AD model mice were subjected to detection of markers containing mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711, and each measured level of mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in the biological sample was determined. and the ratio of mouse APP669-711 levels to mouse A ⁇ 1-40 levels: the step of obtaining APP669-711/A ⁇ 1-40, the ratio of AD model mice before provision of the candidate substance, and the ratio after provision of the candidate substance making a comparison with said ratio in AD model mice.
  • the biological sample is blood.
  • the AD model mouse is an APP/PS1 mouse.
  • a marker for determining the state of accumulation of A ⁇ in the brain consists of a combination of mouse A ⁇ 1-40 and mouse APP669-711 in a biological sample derived from an AD model mouse.
  • the biological sample is blood.
  • the AD model mouse is an APP/PS1 mouse.

Abstract

ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得、マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求め、ＡＤモデルマウスの前記比が、脳内Ａβ蓄積が出現していない基準マウスの前記比よりも高い場合に、前記ＡＤモデルマウスの脳内Ａβ蓄積量は、前記基準マウスの脳内Ａβ蓄積量よりも多いと判断する。

Description

アルツハイマー病モデルマウスのＡβバイオマーカー及びその分析方法
　本発明は、アルツハイマー病（Alzheimer's　disease：ＡＤ）モデルマウスのＡβバイオマーカー及びその分析方法に関する。
　ＡＤは認知症の主な原因で、認知症全体の半数以上を占める神経変性疾患である。認知症患者数は２０１７年で世界中に約５０００万人いると推計され、２０３０年には約８２００万人になると見込まれている。日本国内でも認知症患者数は２０２５年には７００万人に達すると推定されている。
　ＡＤの発症にはアミロイドβ（Ａβ）が深く関わっていると考えられている。７７０残基のアミノ酸からなるアミロイド前駆タンパク質（Amyloid　precursor　protein：ＡＰＰ）が各種プロテアーゼによる切断を受けることによって、様々な分子種のＡβが産生される。主要なＡβとしてはアミノ酸４０残基のＡβ１－４０とアミノ酸４２残基のＡβ１－４２が存在し、Ａβ１－４２は凝集性が強い。ＡＤでは、Ａβの線維化を伴う凝集により脳内に老人斑が出現するが、それが最も早期の病理学的変化と考えられている。
　Ａβの脳内蓄積はＡＤ発症の２０年前から始まっているとも言われており、より早期の段階でＡＤ発症の可能性を判別することが重要となる。ＡＤ診断に利用される検査法としては脳内のＡβ蓄積を可視化するＰＥＴ（Positron　Emission　Tomography：陽電子放出断層撮影）イメージング（アミロイドＰＥＴ）や脳脊髄液（cerebrospinal　fluid：ＣＳＦ）中のＡβをバイオマーカー（単に「マーカー」とも呼称する）として検出する方法などがある。このうちアミロイドＰＥＴは脳内のＡβアミロイド蓄積の部位と量を高い精度で画像化する技術であり、現在ＡＤの早期病態を検出可能な画像バイオマーカーとしての地位が確立している。しかしながら、アミロイドＰＥＴは検査費用が高額なため、臨床現場では限られた条件下で使用するのが現実的である。一方、ＣＳＦ検査は侵襲性の高い検査であるため身体的負担が大きい。このような背景のもと、非侵襲的で採取が容易なバイオマーカーの開発が望まれていた。
　近年、脳内Ａβ蓄積状態を反映する有望なバイオマーカーとして、ヒト血漿試料に対して免疫沈降法（Immuno　Precipitation：ＩＰ）とＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ（Matrix　Assisted　Laser　Desorption/Ionization－Time　of　Flight　Mass　Spectrometry：マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法）を組み合わせたＩＰ－ＭＳ（Immunoprecipitation-Mass　Spectrometry）法（特許文献１）により、血漿中のＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２比とＡβ１－４０／Ａβ１－４２比、及びそれらを組み合わせたcomposite　biomarkerがヒトの脳内Ａβ蓄積を高精度に推定できることが報告された（特許文献２、３、非特許文献１、２）。このバイオマーカーはヒトのＡＤ鑑別やＡＤ発症のリスク因子としての利用価値があり、それにより治療や予防などの介入方法の決定に重要な役割を担うことが期待され、臨床的な利用価値に重きが置かれている。
　一方、ＡＤは根本的治療または発症予防について確立された方法は存在しないため、その開発が急務となっている。介入方法の研究開発や、ＡＤの発症メカニズムを解明する上でＡＤモデルマウスを用いた実験は必要となる研究であり、それを遂行するにあたってＡＤモデルマウスの脳内Ａβ蓄積開始時期や進行具合を把握し、介入のタイミングの検討や、研究段階の介入法の効果などを評価するためにバイオマーカーを利用することができ、製薬企業や研究機関が行なう基礎研究や非臨床試験において利用価値が存在する。
　ＡＤモデルマウスの脳内ではＡβ１－４２だけではなくＡβ１－４０（Ａβ４０）が蓄積されていることが分かってきている。たとえば非特許文献３には、Ａβ１－４０特異的抗体ＢＡ２７による染色でＡＤモデルマウスの脳内にＡβ１－４０が蓄積することが示され、非特許文献４には、マウス脳のFA　soluble　Ab（Ａβ蓄積が溶解される画分）中のＡβ１－４０が野生型（ＷＴ）よりもトランスジェニックマウスで増えていることが示されている。
特許第６４２４７５７号 特許第６４１０８１０号 特許第６４６７５１２号
Kaneko　N,　Nakamura　A,　Washimi　Y,　Kato　T,　Sakurai　T,　Arahata　Y,　Bundo　M,　Takeda　A,　Niida　S,　Ito　K,　Toba　K,　Tanaka　K,　Yanagisawa　K.　:　Novel　plasma　biomarker　surrogating　cerebral　amyloid　deposition.　Proc　Jpn　Acad　Ser　B　Phys　Biol　Sci.　2014;90(9):353-64 Nakamura　A,　Kaneko　N,　Villemagne　VL,　Kato　T,　Doecke　J,　Dore　V,　Fowler　C,　Li　QX,　Martins　R,　Rowe　C,　Tomita　T,　Matsuzaki　K,　Ishii　K,　Ishii　K,　Arahata　Y,　Iwamoto　S,　Ito　K,　Tanaka　K,　Masters　CL,　Yanagisawa　K.　:　High　performance　plasma　amyloid-β　biomarkers　for　Alzheimer's　disease.　Nature.　2018;8;554(7691):249-254 富士フイルム和光の抗体カタログ「For　Alzheimer’s　Disease　Research　Anti　Amyloid　β　Antibody　BAN50/BNT77/BA27/BC05」［令和3年6月8日検索］、インターネット＜URL：https://labchem-wako.fujifilm.com/us/category/docs/01222_doc02.pdf＞ Li　X,　Feng　Y,　Wu　W,　Zhao　J,　Fu　C,　Li　Y,　Ding　Y,　Wu　B,　Gong　Y,　Yang　G,　Zhou　X.　「Sex　differences　between　APPswePS1dE9　mice　in　A-beta　accumulation　and　pancreatic　islet　function　during　the　development　of　Alzheimer's　disease」,　Lab　Anim.　2016　Aug;50(4):275-85 Franke　TN,　Irwin　C,　Bayer　TA,　Brenner　W,　Beindorff　N,　Bouter　C,　Bouter　Y.　:　In　vivo　Imaging　With　18　F-FDG-　and　18　F-Florbetaben-PET/MRI　Detects　Pathological　Changes　in　the　Brain　of　the　Commonly　Used　5XFAD　Mouse　Model　of　Alzheimer's　Disease.　Front　Med　(Lausanne).　2020　Sep　15;7:529 Loffler　T,　Flunkert　S,　Temmel　M,　Hutter-Paier　B.　:　Decreased　Plasma　Aβ　in　Hyperlipidemic　APPSL　Transgenic　Mice　Is　Associated　with　BBB　Dysfunction　Front　Neurosci.　2016　Jun　1;10:232 Wu　Q,　Li　Q,　Zhang　X,　Ntim　M,　Wu　X,　Li　M,　Wang　L,　Zhao　J,　Li　S.　:　Treatment　with　Bifidobacteria　can　suppress　Aβ　accumulation　and　neuroinflammation　in　APP/PS1　mice.　PeerJ.　2020　Oct　28;8:e10262 「Research　Models」［令和3年6月14日検索］、インターネット＜https://www.alzforum.org/research-models/alzheimers-disease＞ 「B6.Cg-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax」［令和3年6月14日検索］、インターネット＜https://www.jax.org/strain/005864＞ 「B6.Cg-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax」［令和3年6月14日検索］、インターネット＜https://www.jax.org/strain/008730＞ 「B6;C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax」［令和3年6月14日検索］、インターネット＜https://www.jax.org/strain/004462＞ 「APP/PS1/rTg21221」［令和3年6月14日検索］、インターネット＜https://www.alzforum.org/research-models/appps1rtg21221＞ 「B6.Cg-Tg(APP695)3Dbo　Tg(PSEN1dE9)S9Dbo/Mmjax」［令和3年6月14日検索］、インターネット＜https://www.jax.org/strain/005866＞ 「B6;C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/Mmjax」［令和3年6月14日検索］、インターネット＜https://www.jax.org/strain/004462＞ 「APPSWE-Model　1349」［令和3年6月14日検索］、インターネット＜https://www.taconic.com/transgenic-mouse-model/appswe-model-1349＞ 「APPSWE-Tau」［令和3年6月14日検索］、インターネット＜https://www.taconic.com/transgenic-mouse-model/appswe-tau＞ 「B6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax」［令和3年6月14日検索］、インターネット＜https://www.jax.org/strain/006554＞ 「B6;129-Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa　Psen1tm1Mpm/Mmjax」［令和3年6月14日検索］、インターネット＜https://www.jax.org/strain/004807＞ 「B6.Cg-Tg(Thy1-APP)3Somm/J」［令和3年6月14日検索］、インターネット＜https://www.jax.org/strain/030504＞ 「STOCK　Apptm1Sud/J」［令和3年6月14日検索］、インターネット＜https://www.jax.org/strain/008390＞ Macklin　L,　Griffith　CM,　Cai　Y,　Rose　GM,　Yan　XX,　Patrylo　PR.　:　Glucose　tolerance　and　insulin　sensitivity　are　impaired　in　APP/PS1　transgenic　mice　prior　to　amyloid　plaque　pathogenesis　and　cognitive　decline.　Exp　Gerontol.　2017　Feb;88:9-18
　ＡＤモデルマウスの脳内Ａβ蓄積量を評価する手法として上述したＰＥＴイメージングがあるが、実験動物用のＰＥＴ装置が必要となり、放射性物質も取り扱う必要があるため危険性の潜在する実験となる（非特許文献５）。また、ＡＤモデルマウスは体が小さいためＣＳＦ採取が難しく、採取できたとしても少量で、さらに血液が混入するリスクもある。一方、脳内Ａβ蓄積評価で比較的容易な方法として、ＡＤモデルマウスの脳を溶解したあとの不溶性画分のアミロイドを測定することにより脳内アミロイド蓄積状態を評価する方法もあるが、ＡＤモデルマウスを殺してしまうため、継続的なモニタリングは不可能である（非特許文献６、７）。
　本発明は、採取が比較的容易で、安全性もあり、継続的な観察が可能である、ＡＤモデルマウスの脳内のＡβ蓄積状態を評価するバイオマーカー及びその分析方法を提供することをその目的とする。
　本発明の第１の態様は、ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程と、マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程と、ＡＤモデルマウスの前記比が、脳内Ａβ蓄積が出現していない基準マウスの前記比よりも高い場合に、前記ＡＤモデルマウスの脳内Ａβ蓄積量は、前記基準マウスの脳内Ａβ蓄積量よりも多いと判断する工程とを含む、脳内Ａβ蓄積状態を判断する分析方法に関する。
　本発明の第２の態様は、ＡＤモデルマウスに対して行なわれた介入の前後において、ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程と、マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程と、介入前におけるＡＤモデルマウスの前記比と、介入後におけるＡＤモデルマウスの前記比との比較を行なう工程とを含む、脳内のＡβ蓄積状態に関して前記介入の有効性を判断する分析方法に関する。
　本発明の第３の態様は、ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程と、マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程とを同じＡＤモデルマウスに経時的に複数回行ない、ＡＤモデルマウスの前記比の変化を評価し、脳内のＡβ蓄積量が増加または減少していることを判断する分析方法に関する。
　本発明の第４の態様は、ＡＤモデルマウスに対して脳内のＡβ蓄積状態の改善するための候補物質を供与した前後において、ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程と、マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程と、候補物質の供与前におけるＡＤモデルマウスの前記比と、候補物質の供与後におけるＡＤモデルマウスの前記比との比較を行なう工程とを含む、脳内のＡβ蓄積状態を改善するための候補物質をスクリーニングする分析方法に関する。
　本発明の第５の態様は、ＡＤモデルマウス由来の生体試料中のマウスＡβ１－４０とマウスＡＰＰ６６９－７１１との組み合わせからなる脳内Ａβ蓄積状態を判断するマーカーに関する。
　本発明に係る分析方法及びマーカーによれば、採取が比較的容易で、安全性もあり、継続的な観察が可能である、ＡＤモデルマウスの脳内のＡβ蓄積状態を評価する分析方法及びバイオマーカーを提供することが可能となる。
実施例１における、２３か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳組織の免疫染色画像である。 実施例１における、２か月齢（Ａ）と２５か月齢（Ｂ）のＡＰＰ／ＰＳ１マウスの血漿中マウスＡβ関連ペプチドのマススペクトルである。 実施例１において、若齢ＡＤモデルマウス（２～５か月齢、Ｎ＝１１）の血漿Ａβ１－４０の標準化強度（Normalized　intensity）と高齢ＡＤモデルマウス（２３～３０か月齢、Ｎ＝１３）の血漿Ａβ１－４０の標準化強度とを比較したグラフである。 実施例１において、若齢ＡＤモデルマウス（２～５か月齢、Ｎ＝１１）の血漿ＡＰＰ６６９－７１１の標準化強度と高齢ＡＤモデルマウス（２３～３０か月齢、Ｎ＝１３）の血漿ＡＰＰ６６９－７１１の標準化強度とを比較したグラフである。 実施例１において、若齢ＡＤモデルマウス（２～５か月齢、Ｎ＝１１）の血漿ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０比と高齢ＡＤモデルマウス（２３～３０か月齢、Ｎ＝１３）の血漿ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０比とを比較したグラフである。
　＜分析方法＞
　（第１の態様）
　本発明の第１の態様は、脳内Ａβ蓄積状態を判断する分析方法であって、
　ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程と、
　マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程と、
　ＡＤモデルマウスの前記比が、脳内Ａβ蓄積が出現していない基準マウスの前記比よりも高い場合に、前記ＡＤモデルマウスの脳内Ａβ蓄積量は、前記基準マウスの脳内Ａβ蓄積量よりも多いと判断する工程とを含む。
　第１の態様では、ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程（当該工程を「測定工程」と呼称する）を含む。ＡＤモデルマウスとしては、特に制限されるものではなく、たとえば非特許文献８などに記載のＡＤモデルマウスを適宜用いることができる。具体的には、Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo）（非特許文献９）、5xFAD(B6SJL)（非特許文献１０）、5xFAD(C57BL6)（非特許文献１１）、APP/PS1/rTg21221（非特許文献１２）、APPSwe/PSEN1(A246E)（非特許文献１３）、APPSwe/PSEN1dE9(C3-3　x　S-9)（非特許文献１４）、APPswe/PSEN1dE9(line　85)（非特許文献１５）、Tg2576/Tau(P301L)(APPSwe-Tau)（非特許文献１６）、TREM2-BAC　X　5xFAD（非特許文献１７）、3xTg（非特許文献１８）、APP23（非特許文献１９）、APP　Knock-in（非特許文献２０）などが挙げられる。
　ＡＤモデルマウスとして、ヒトＳｗｅｄｉｓｈ変異型ＡＰＰ及びΔＥｘｏｎ変異型ＰＳ１を神経系特異的プリオンプロモーター（ＰｒＰ）により過剰発現しているトランスジェニックマウスであるＡＰＰ／ＰＳ１マウスが好ましく、後述する実施例１ではTg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo）を用いている。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは６～７か月齢程度から脳内Ａβ蓄積が出現することが知られており（非特許文献２１）、そのため、脳内Ａβ蓄積の有無の比較として、若齢と高齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスが研究に使用される。
　測定工程において、「生体試料」は、血液、尿、糞便、体分泌液（例えば、唾液、涙）などから選ぶことができる。これらのうち、採取のし易さ、脳内のＡβの状態の反映しやすさなどの理由から、生体試料は血液であることが好ましい。血液は、マーカーの発現レベルの測定工程に直接供される試料であり、全血、血漿及び血清などが含まれる。血液は、ＡＤモデルマウスから採取された全血を、適宜処理することによって調製することができる。採取された全血から血液試料の調製を行なう場合に行なわれる処理としては特に限定されず、例えば遠心分離などいかなる処理が行なわれてもよい。また、測定工程に供される血液は、その調製工程の中途段階又は調製工程の後段階において、適宜冷凍など低温下での保存が行なわれたものであってもよい。
　生体試料は、そのまま成分の濃度の測定に用いてもよいが、必要に応じて適宜前処理を行なってから成分の濃度の測定に用いてもよい。前処理としては、例えば、生体試料中の酵素反応の停止、脂溶性物質の除去、タンパク質の除去等が挙げられる。これらの前処理は、公知の方法を用いて行なえばよい。また、生体試料は、適宜、希釈又は濃縮して用いてもよい。
　測定工程では、生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る。マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１は、以下のアミノ酸配列を有するものである。
　・マウスＡβ１－４０：
　　DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV（配列番号１）
　・マウスＡＰＰ６９９－７１１：
　　VKMDAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV（配列番号２）
　本発明において、マーカーのレベルとは、基本的には濃度を意味するが、当業者が濃度に準じて用いる他の単位、例えば、質量分析における検出イオン強度であってもよい。
　マーカーの測定は、好ましくは、生体分子特異的親和性に基づく検査によって行なわれる。生体分子特異的親和性に基づく検査は、当業者によく知られた方法であり、特に限定されないが、イムノアッセイが好ましい。具体的には、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked　ImmunoSorbent　Assay）（サンドイッチイムノ法、競合法、及び直接吸着法を含む）、免疫沈降法、沈降反応、免疫拡散法、免疫凝集測定、補体結合反応分析、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系を含むイムノアッセイが含まれる。イムノアッセイにおいては、生体試料中の上記マーカーに結合する抗体を検出する。
　マーカーの測定を、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）由来のペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ免疫グロブリン、またはアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）由来のペプチドを認識可能な抗原結合部位を含む免疫グロブリン断片を用いて作製された抗体固定化担体を用いて行なってもよい。前記抗体固定化担体を用いた免疫沈降法により質量分析装置での試料中ペプチドの検出を行なうことができる（ＩＰ－ＭＳ）。
　第１の態様では、上述した測定工程の後、マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程（当該工程を「算出工程」と呼称する）を含む。前記比ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０であるマーカーは、脳内Ａβ蓄積が出現していない基準ＡＤモデルマウスからの血漿試料中のレベルと、脳内のＡβが過剰に蓄積されているＡＤモデルマウスからの血漿試料中のレベルとの間に有意な差が認められたものである。
　なお、ヒト等のＡＤ分析において、これまでＡβ１－４２が好適な指標として用いられてきた（特許文献２、３、非特許文献１、２）。マウスにおいても、同様に、下記アミノ酸配列を有するマウスＡβ１－４２が存在する。
　・マウスＡβ１－４２：
　　DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA（配列番号３）
　しかしながら、ＡＤモデルマウスを被験対象とする場合、ヒト等の場合とは異なり採血量が少なく濃度の薄いマウスＡβ１－４２は測定しにくい。このため、本発明者等は、ＡＤモデルマウスを被験対象とする場合には、マウスＡβ１－４２よりも、マウスＡβ１－４０、マウスＡＰＰ６６９－７１１がより好適な指標となり得ることを見出した。
　第１の態様では、上述した算出工程の後、ＡＤモデルマウスの前記比が、脳内Ａβ蓄積が出現していない基準マウスの前記比よりも高い場合に、前記ＡＤモデルマウスの脳内Ａβ蓄積量は、前記基準マウスの脳内Ａβ蓄積量よりも多いと判断する工程を含む。当該工程では、測定値と基準値との比較によって生体試料中のマーカーの濃度分析を行なう。基準マウスとしては、２～５か月齢（若齢）のＡＤモデルマウスや野生型マウスを好適に用いることができる。
　このような第１の態様の分析方法によれば、採取が比較的容易で、安全性もあり、継続的な観察が可能である、ＡＤモデルマウスの脳内のＡβ蓄積状態を評価する分析方法を提供することが可能となる。
　（第２の態様）
　本発明の第２の態様は、脳内のＡβ蓄積状態に関して前記介入の有効性を判断する分析方法であり、
　ＡＤモデルマウスに対して行なわれた介入の前後において、
　ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程（測定工程）と、
　マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程（算出工程）と、
　介入前におけるＡＤモデルマウスの前記比と、介入後におけるＡＤモデルマウスの前記比との比較を行なう工程とを含む。
　第２の態様の分析方法は、ＡＤモデルマウスに対して行なわれた介入の前後に行なわれる。ここで、「介入」とは、ＡＤの治療薬や予防薬の投与、食事療法、運動療法、学習療法、外科手術などが含まれる。なお、運動療法、学習療法、外科手術は既知、未知のいずれのものも含む。
　第２の態様における測定工程及び算出工程は、上述した第１の態様における測定工程及び算出工程と同様である。
　第２の態様では、ＡＤモデルマウスに対して行なわれた介入の前後で測定工程及び算出工程を行なった後、介入前におけるＡＤモデルマウスの前記比と、介入後におけるＡＤモデルマウスの前記比との比較を行なう。このような第２の態様によれば、ＡＤモデルマウスに対して行なわれた介入の前後に適用することで、ＡＤの治療薬、予防薬の薬効評価、あるいはその他の処置の有効性評価を行なうことができる。
　（第３の態様）
　本発明の第３の態様は、脳内のＡβ蓄積量が増加または減少していることを判断する分析方法であり、
　ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程（測定方法）と、マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程（算出工程）とを同じＡＤモデルマウスに経時的に複数回行ない、ＡＤモデルマウスの前記比の変化を評価する。
　第３の態様の分析方法は、測定工程及び算出工程を同じＡＤモデルマウスに経時的に複数回行なう。第３の態様における測定工程及び算出工程も、上述した第１の態様における測定工程及び算出工程と同様である。
　第３の態様では、測定工程及び算出工程を同じＡＤモデルマウスに経時的に複数回行なってＡＤモデルマウスの前記比の変化を評価する。このような第３の態様によれば、ＡＤモデルマウスの脳内のＡβ蓄積の変化を経時的に評価し、脳内のＡβ蓄積量が増加または減少していることを判断することができる。
　（第４の態様）
　本発明の第４の態様は、脳内のＡβ蓄積状態を改善するための候補物質をスクリーニングする分析方法であり、
　ＡＤモデルマウスに対して脳内のＡβ蓄積状態の改善するための候補物質を供与した前
後において、
　ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程（測定工程）と、
　マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程（算出工程）と、
　候補物質の供与前におけるＡＤモデルマウスの前記比と、候補物質の供与後におけるＡＤモデルマウスの前記比との比較を行なう工程を含む。
　第４の態様の分析方法は、ＡＤモデルマウスに対して脳内のＡβ蓄積状態の改善するための候補物質を供与した前後に行なわれる。ここで、「候補物質」とは、脳内のＡβ蓄積状態の改善するためのＡＤの治療薬や予防薬の候補となる可能性を有する未知の物質を指す。
　第４の態様における測定工程及び算出工程も、上述した第１の態様における測定工程及び算出工程と同様である。
　第４の態様では、候補物質の供与前におけるＡＤモデルマウスの前記比と、候補物質の供与後におけるＡＤモデルマウスの前記比との比較を行なう。このような第４の態様によれば、ＡＤモデルマウスに対して脳内のＡβ蓄積状態の改善するための候補物質を供与した前後に適用することで、脳内のＡβ蓄積状態の改善するための候補物質の有効性評価を行なうことができる。
　＜脳内Ａβ蓄積状態を判断するマーカー＞
　（第５の態様）
　本発明は、ＡＤモデルマウス由来の生体試料中のマウスＡβ１－４０とマウスＡＰＰ６６９－７１１との組み合わせからなる脳内Ａβ蓄積状態を判断するマーカーについても提供する。これまでヒトでは血液ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０比がバイオマーカーとして報告されていないことから、ＡＤモデルマウス特異的なバイオマーカーと言える。本発明のマーカーを用いることで、生体試料に由来するＡＤモデルマウスの脳内Ａβ蓄積状態を高い精度で判断可能となる。
　本発明のマーカーにおける生体試料、ＡＤモデルマウスは、第１の態様で上述したものであればよいが、同様に生体試料としては血液が好ましく、ＡＤモデルマウスとしてはＡＰＰ／ＰＳ１マウスが好ましい。
　以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　＜実施例１＞
　［１］ＡＤモデルマウス
　ＡＤモデルマウスとして汎用されるＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo、非特許文献９）を用いた。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスはヒトＳｗｅｄｉｓｈ変異型ＡＰＰ及びΔＥｘｏｎ変異型ＰＳ１を神経系特異的プリオンプロモーター（ＰｒＰ）により過剰発現しているトランスジェニックマウスである。２～５か月齢（若齢）もしくは２３～３０か月齢（高齢）のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを使用した。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは６～７か月齢程度から脳内Ａβ蓄積が出現することが知られており（非特許文献２１）、脳内Ａβ蓄積の有無の比較として、若齢と高齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスが研究に使用される。
　［２］脳組織の免疫染色
　本実施例で使用する２３か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスで、その脳組織の免疫染色で脳内Ａβ蓄積が出現することを以下の手順で確認した。マウスから摘出した半脳を４％　ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド：paraformaldehyde）／ＰＢＳ（リン酸緩衝液：Phosphate　Buffer　Solution）（ｐＨ６．７）で２４時間浸透し、脳を細切した。その後、脳を７０％　エタノールで１時間、８０％　エタノールで２時間、９０％　エタノールで２時間、９９％　エタノールで３時間×３回、キシレンで３時間、キシレンで２時間、パラフィンで３時間×３回により脱水し包埋した。作製したブロックはMICROM　HM　430（Thermo　SCIENTIFIC）を用いて４ｍｍ厚で薄切、ＰＬＬ（ポリ－Ｌ－リジン：poly-L-lysine）コートされたスライドガラス上で伸展し３７℃で２日間乾燥した。
　作製した脳切片の脱パラフィンのために、キシレンで５分間×３回浸した。続いて、１００％　エタノールで２．５分間×２回、９０％　エタノールで２．５分間、８０％　エタノールで２．５分間、７０％　エタノールで２．５分間、流水に１０分間浸した。抗原を賦活化するために、０．０１Ｍ　クエン酸（ｐＨ６．０）／ＤＷ（蒸留水：distilled　water）中で１２１℃、１０分間の条件でオートクレーブし、流水に１０分間、ＴＳ（Tris　buffer）に浸した。その後、非働化済みの１０％　calf　serum／ＰＢＳを用いて室温３０分間でブロッキングし、各種１０００倍希釈した一次抗体を室温で一晩充てた。一次抗体として抗ヒトＡβ　マウスモノクローナル抗体（８２Ｅ１、ＩＢＬ）と抗マウスＡβ　ラビットポリクローナル抗体（ＡＰＰ５９７、ＩＢＬ）を用いた。次に、各種５００倍希釈したビオチン化二次抗体を室温で２時間、ABC　elite（VECTOR）で１時間、ImmPACT　SG（VECTOR）に５分間、０．１％　ヘマトキシリン液に１０秒間、流水に５分間浸透した。最後に、脱水のために、７０％　エタノールで２．５分間、８０％　エタノールで２．５分間、９０％　エタノールで２．５分間、１００％　エタノールで２．５分間×２回、透徹のためにキシレンで５分間×３回浸透した。そして封入剤ＨＳＲ液（Sysmex）を用いて封入し、乾燥後EVOS　FL　Auto2（Invitrogen）により観察し、２３か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスで、その脳組織の免疫染色で脳内Ａβ蓄積が出現することを確認した（図１）。
　［３］ＡＤモデルマウスからの採血
　ＡＤモデルマウスの顎骨付近の顔面静脈から、２１Ｇの注射針を用いて穿刺し、表面に出てきた血液を採取した。採取中に血液の凝固を防ぐため、それぞれの採血用チューブに予めＥＤＴＡ－２Ｎａ（終濃度：０．１５％）を加えた。採取した血液をすぐに４℃、３，５００ｒｐｍ、５分間で遠心分離し、上清である血漿を採取した。得られた上記の血液成分はそれぞれ－８０℃で凍結保存した。
　［４］血漿Ａβ関連ペプチド測定
　血漿中のＡβ関連ペプチドは免疫沈降（ＩＰ）と質量分析（ＭＳ）を組み合わせたＩＰ－ＭＳを用いて測定した。抗マウスＡβ　ラビットポリクローナル抗体ＡＰＰ５９７（ＩＢＬ）からＢＳＡを除くためにProtein　G（Thermo　Fisher　Scientific）で抗体を精製した後、Dynabeads　Epoxy（Thermo　Fisher　Scientific）に共有結合させた抗体ビーズをＩＰに使用した。凍結保存したマウス血漿（４０～１００μＬ）を融解し、内部標準ペプチド溶液と血漿を等量で混合した。抗体ビーズと混ぜて、１時間４℃で抗原抗体反応させた。内部標準ペプチドは４０ｐＭ　安定同位体標識マウスＡβ１－４２（ＳＩＬ－Ａβ１－４２、理論質量m/z　４４７１．３０）を使用した。抗原抗体反応後、抗体ビーズを洗浄し、Ａβ関連ペプチドをＤＤＭ（ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド：n-dodecyl-β-D-maltoside）を含むグリシン緩衝液（ｐＨ２．８）で溶出した。トリス緩衝液で中性に戻した後、もう一度、抗体ビーズでＡβ関連ペプチドと抗原抗体反応させ、洗浄後、Ａβ関連ペプチドを溶出液（５ｍＭ　ＨＣｌ、０．１ｍＭ　Methionine、７０％（ｖ／ｖ）　アセトニトリル）で溶出した。予め、０．５ｍｇ／ｍＬ　ＣＨＣＡ（α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸：α-cyano-4-hydroxycinnamic　acid）／０．２％（ｗ／ｖ）　ＭＤＰＮＡ（メチレンジホスホン酸：methylenediphosphonic　acid）　０．５μＬを滴下、乾燥させたμFocus　MALDI　plate（商標）　900μm（Hudson　Surface　Technology,　Inc.,　Fort　Lee，NJ）の４well上へ、ＩＰ後の溶出液を滴下して乾燥させた。
　マススペクトルデータはAXIMA　Performance（Shimadzu/KRATOS,　Manchester,　UK）を用いて、ポジティブイオンモードのLinear　TOFで取得した。Linear　TOFのm/z値はピークのアベレージマスで表示した。m/z値とシグナル強度は標準ペプチドを用いて校正を行なった。human　angiotensin　IIとhuman　ACTH　fragment　18-39、bovine　insulin　oxidized　beta-chain、bovine　insulinを外部標準として用いてm/z値をキャリブレーションした。内部標準ペプチドＳＩＬ－Ａβ１－４２は、血漿中の各Ａβ関連ペプチドのシグナル強度の標準化に使用した。その後、１サンプルから得られる４つのマススペクトルの標準化強度（Normalized　intensity）の平均値を求め、それをＡβ関連ペプチド量として評価した。検出下限に達しない（Ｓ／Ｎ＜３）データ数が二つ以上存在した場合は検出不可とした。
　本測定法はマウスのＡβ配列に特異的に反応する抗体を用いており、かつ、マススペクトルにおいてはマウスのＡβ配列の理論質量で検出されるピークを分析している。このことから、本分析データはマウスのＡβ関連ペプチドを対象としており、過剰発現しているヒトＳｗｅｄｉｓｈ変異型ＡＰＰ由来のＡβ関連ペプチドは分析対象ではない。
　［５］血漿Ａβ関連ペプチドの解析
　２か月齢と２５か月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウス血漿をＩＰ－ＭＳにより分析して得られたマウスＡβ関連ペプチドのマススペクトルを図２に示す。ここでは２か月齢と２５か月齢、それぞれ一個体のデータを示しており、これらのマススペクトルでは、表１に示される理論質量の位置にＡβ１－４０、Ａβ１－４２、ＡＰＰ６６９－７１１のピークが検出された。
　次に、脳内Ａβ蓄積のない若齢群（２～５か月齢）と脳内Ａβ蓄積のある高齢群（２３－３０か月齢）に分類し、Ａβ１－４０とＡＰＰ６６９－７１１の標準化強度の群間比較した。２群間の比較はｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ－ｔｅｓｔで行ない有意水準を５％とした。その結果、Ａβ１－４０とＡＰＰ６６９－７１１では若齢群と高齢群で有意な差は確認できなかった（図３，４）。一方、Ａβ１－４０に対するＡＰＰ６６９－７１１の標準化強度の比（ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０）を算出し、２群間の比較を行なうと、ｐ＝０．００１２となり、若齢群と高齢群で有意な差を確認できた。つまり、高齢群のＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０は若齢群よりも増加していることになる（図５）。このことから、血液ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０比はＡＤモデルマウスの脳内Ａβ蓄積を反映していることが示唆された。これまでヒトでは血液ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０比がバイオマーカーとして報告されていないことから、ＡＤモデルマウス特異的なバイオマーカーと言える。
　［態様］
　上述した例示的な実施形態及び実験例は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
　（第１項）
　一態様に係る分析方法は、脳内Ａβ蓄積状態を判断する分析方法であり、ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程と、マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程と、ＡＤモデルマウスの前記比が、脳内Ａβ蓄積が出現していない基準マウスの前記比よりも高い場合に、前記ＡＤモデルマウスの脳内Ａβ蓄積量は、前記基準マウスの脳内Ａβ蓄積量よりも多いと判断する工程とを含む。
　第１項に記載の分析方法によれば、採取が比較的容易で、安全性もあり、継続的な観察が可能である、ＡＤモデルマウスの脳内のＡβ蓄積状態を評価する分析方法を提供することが可能となる。
　（第２項）
　一態様に係る分析方法は、脳内のＡβ蓄積状態に関して介入の有効性を判断する分析方法であり、ＡＤモデルマウスに対して行なわれた介入の前後において、ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程と、マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程と、介入前におけるＡＤモデルマウスの前記比と介入後におけるＡＤモデルマウスの前記比との比較を行なう工程とを含む。
　第２項に記載の分析方法によれば、ＡＤモデルマウスに対して行なわれた介入の前後に適用することで、ＡＤの治療薬、予防薬の薬効評価、あるいはその他の処置の有効性評価を行なうことができる。
　（第３項）
　一態様に係る分析方法は、脳内のＡβ蓄積量が増加または減少していることを判断する分析方法であり、ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程と、マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程とを同じＡＤモデルマウスに経時的に複数回行ない、ＡＤモデルマウスの前記比の変化を評価する。
　第３項に記載の分析方法によれば、ＡＤモデルマウスの脳内のＡβ蓄積の変化を経時的に評価し、脳内のＡβ蓄積量が増加または減少していることを判断することができる。
　（第４項）
　一態様に係る分析方法は、脳内のＡβ蓄積状態を改善するための候補物質をスクリーニングする分析方法であり、ＡＤモデルマウスに対して脳内のＡβ蓄積状態の改善するための候補物質を供与した前後において、ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程と、マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程と、候補物質の供与前におけるＡＤモデルマウスの前記比と、候補物質の供与後におけるＡＤモデルマウスの前記比との比較を行なう工程を含む。
　第４項に記載の分析方法によれば、ＡＤモデルマウスに対して脳内のＡβ蓄積状態の改善するための候補物質を供与した前後に適用することで、脳内のＡβ蓄積状態の改善するための候補物質の有効性評価を行なうことができる。
　（第５項）
　第１項～第４項のいずれかに記載の分析方法において、生体試料は血液である。
　第５項に記載の分析方法によれば、血液以外の生体試料と比較して容易に採取することができる。
　（第６項）
　第１項～第５項のいずれかに記載の分析方法において、ＡＤモデルマウスはＡＰＰ／ＰＳ１マウスである。
　第６項に記載の分析方法によれば、ＡＤモデルマウスとして汎用されているものであり、容易に入手することができる。
　（第７項）
　一態様に係る脳内Ａβ蓄積状態を判断するマーカーは、ＡＤモデルマウス由来の生体試料中のマウスＡβ１－４０とマウスＡＰＰ６６９－７１１との組み合わせからなる。
　第７項に記載のマーカーによれば、生体試料に由来するＡＤモデルマウスの脳内Ａβ蓄積状態を高い精度で判断可能となる。
　（第８項）
　第７項に記載のマーカーにおいて、生体試料は血液である。
　第８項に記載のマーカーによれば、血液以外の生体試料と比較して容易に採取することができる。
　（第９項）
　第７項または第８項に記載のマーカーにおいて、ＡＤモデルマウスはＡＰＰ／ＰＳ１マウスである。
　第９項に記載のマーカーによれば、ＡＤモデルマウスとして汎用されているものであり、容易に入手することができる。

Claims (9)

  1. 　アルツハイマー病（ＡＤ）モデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程と、
    　マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程と、
    　ＡＤモデルマウスの前記比が、脳内Ａβ蓄積が出現していない基準マウスの前記比よりも高い場合に、前記ＡＤモデルマウスの脳内Ａβ蓄積量は、前記基準マウスの脳内Ａβ蓄積量よりも多いと判断する工程とを含む、脳内Ａβ蓄積状態を判断する分析方法。
  2. 　ＡＤモデルマウスに対して行なわれた介入の前後において、
    　ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程と、
    　マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程と、
    　介入前におけるＡＤモデルマウスの前記比と介入後におけるＡＤモデルマウスの前記比との比較を行なう工程とを含む、脳内のＡβ蓄積状態に関して前記介入の有効性を判断する分析方法。
  3. 　ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程と、マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程とを同じＡＤモデルマウスに経時的に複数回行ない、ＡＤモデルマウスの前記比の変化を評価し、脳内のＡβ蓄積量が増加または減少していることを判断する、分析方法。
  4. 　ＡＤモデルマウスに対して脳内のＡβ蓄積状態の改善するための候補物質を供与した前後において、
    　ＡＤモデルマウス由来の生体試料を、マウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１を含むマーカーの検出に供して、前記生体試料中のマウスＡβ１－４０及びマウスＡＰＰ６６９－７１１の各測定レベルを得る工程と、
    　マウスＡβ１－４０レベルに対するマウスＡＰＰ６６９－７１１レベルの比：ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４０を求める工程と、
    　候補物質の供与前におけるＡＤモデルマウスの前記比と、候補物質の供与後におけるＡＤモデルマウスの前記比との比較を行なう工程を含む、脳内のＡβ蓄積状態を改善するための候補物質をスクリーニングする分析方法。
  5. 　前記生体試料が血液である、請求項１～４のいずれか１項に記載の分析方法。
  6. 　前記ＡＤモデルマウスがＡＰＰ／ＰＳ１マウスである、請求項１～５のいずれか１項に記載の分析方法。
  7. 　ＡＤモデルマウス由来の生体試料中のマウスＡβ１－４０とマウスＡＰＰ６６９－７１１との組み合わせからなる脳内Ａβ蓄積状態を判断するマーカー。
  8. 　前記生体試料が血液である、請求項７に記載のマーカー。
  9. 　前記ＡＤモデルマウスがＡＰＰ／ＰＳ１マウスである、請求項７に記載のマーカー。
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