CN117396758A - 神经颗粒蛋白相关肽的分析方法 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
一种分析生物试样所含有的神经颗粒蛋白相关肽的方法，其依次具备下述工序：结合工序，使生物试样在结合溶液中与载体相接触，神经颗粒蛋白相关肽与载体结合而得到结合体；清洗工序，使用清洗溶液清洗结合体；洗脱工序，使结合体与酸性溶液相接触，将神经颗粒蛋白相关肽洗脱到酸性溶液中而得到洗脱液；和检测工序，通过质谱分析法检测洗脱液中的神经颗粒蛋白相关肽。结合溶液及清洗溶液均含有表面活性剂，表面活性剂所具有的疏水基团的碳数为9以上且11以下。
Description
技术领域
本发明涉及神经颗粒蛋白相关肽的分析方法。
背景技术
阿尔茨海默病是痴呆症的主要原因，其罹患者近年来逐渐增加，该病的研究日益变得重要。阿尔茨海默病的发病与通过淀粉样前体蛋白(APP；Amyloid precursorprotein)的切断而产生的β淀粉样蛋白(Aβ)等Aβ相关肽密切相关。并且，有报道指出，将免疫沉淀法与质谱分析法组合来检测血液内的多种Aβ相关肽，其所检测出的特定的Aβ相关肽比有望作为脑内淀粉样物质积累的血液标志物(非专利文献1～2、专利文献1～3)。
另一方面，阿尔茨海默病需要各种标志物，以捕捉其病情进展，除了用于反映淀粉样物质积累的标志物以外，还需要用于反映Tau积累、神经变性的各步骤的标志物。其中，神经颗粒蛋白(Neurogranin)为神经变性的标志物之一，据报道在阿尔茨海默病患者的脑脊髓液(CSF)中是增加的(非专利文献3、非专利文献4)。另外，还有报道指出，在阿尔茨海默病患者的脑内，神经颗粒蛋白的碎片化得到促进而产生片段肽(非专利文献5)。因此，神经颗粒蛋白或其片段肽(神经颗粒蛋白相关肽)的质谱分析法作为捕捉神经变性的手段备受期待。
然而，分析脑脊髓液中的神经颗粒蛋白相关肽需要采集脑脊髓液，从侵入性来说不优选。因此，期望通过能够通过常规检查来采集的、低侵入性的血液来进行分析。
但是，血液中存在的神经颗粒蛋白相关肽极其微量，因此利用现有的质谱分析法无法充分地检测。例如，为据报道通过将免疫沉淀法和质谱分析法组合而成的方法能够检测神经颗粒蛋白或其片段肽的程度(非专利文献6)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:WO2015/178398
专利文献2:WO2017/47529
专利文献3:日本特开2017-20980号公报
非专利文献
非专利文献1:Kaneko N,Nakamura A,Washimi Y,Kato T,Sakurai T,Arahata Y,Bundo M,Takeda A,Niida S,Ito K,Toba K,Tanaka K,Yanagisawa K.:Novel plasmabiomarker surrogating cerebral amyloid deposition.Proc Jpn Acad Ser B PhysBiol Sci.2014；90(9):353-364.
非专利文献2:Nakamura A,Kaneko N,Villemagne VL,Kato T,Doecke J,Dore V,Fowler C,Li QX,Martins R,Rowe C,Tomita T,Matsuzaki K,Ishii K,Ishii K,ArahataY,Iwamoto S,Ito K,Tanaka K,Masters CL,Yanagisawa K.:High performance plasmaamyloid-βbiomarkers for Alzheimer’s disease.Nature.2018；554(7691):249-254.
非专利文献3:Portelius E,Olsson B,Hoglund K,Cullen NC,Kvartsberg H,Andreasson U,Zetterberg H,Sandelius A,Shaw LM,Lee VMY,Irwin DJ,Grossman M,Weintraub D,Chen-Plotkin A,Wolk DA,McCluskey L,Elman L,McBride J,Toledo JB,Trojanowski JQ,Blennow K.:Cerebrospinal fluid neurogranin concentration inneurodegeneration:relation to clinical phenotypes and neuropathology.ActaNeuropathol.2018；136(3):363-376.
非专利文献4:Thorsell A,Bjerke M,Gobom J,Brunhage E,Vanmechelen E,Andreasen N,Hansson O,Minthon L,Zetterberg H,Blennow K.:Neurogranin incerebrospinal fluid as a marker of synaptic degeneration in Alzheimer’sdisease.Brain Res.2010；1362:13-22.
非专利文献5:Kvartsberg H,Lashley T,Murray CE,Brinkmalm G,Cullen NC,Hoglund K,Zetterberg H,Blennow K,Portelius E.:The intact postsynaptic proteinneurogranin is reduced in brain tissue from patients with familial andsporadic Alzheimer’s disease.Acta Neuropathol.2019；137(1):89-102.
非专利文献6:Kvartsberg H,Portelius E,Andreasson U,Brinkmalm G,HellwigK,Lelental N,Kornhuber J,Hansson O,Minthon L,Spitzer P,Maler JM,Zetterberg H,Blennow K,Lewczuk P.:Characterization of the postsynaptic protein neurograninin paired cerebrospinal fluid and plasma samples from Alzheimer’s diseasepatients and healthy controls.Alzheimers Res Ther.2015；7(1):40.
发明内容
发明要解决的问题
但是，在实施非专利文献6的分析方法时、将非专利文献2中记载的Aβ相关肽的分析方法转用于神经颗粒蛋白相关肽时，分析灵敏度都不充分，未达到实用化的水平。因此，在分析血液中的神经颗粒蛋白或其片段肽时，需要进一步提高灵敏度。
本发明的目的在于，以高灵敏度来分析神经颗粒蛋白相关肽。
用于解决问题的方案
本发明的第1方式的分析方法为分析生物试样所含有的神经颗粒蛋白相关肽的方法，其依次具备下述工序：第1结合工序，在结合溶液中，使生物试样与第1载体相接触，神经颗粒蛋白相关肽与第1载体结合而得到第1结合体；第1清洗工序，使用第1清洗溶液清洗第1结合体；第1洗脱工序，使第1结合体与第1酸性溶液相接触，将神经颗粒蛋白相关肽洗脱到第1酸性溶液中而得到第1洗脱液；中性化工序，将第1洗脱液与中性缓冲液混合，得到纯化溶液；第2结合工序，使纯化溶液与第2载体相接触，神经颗粒蛋白相关肽与第2载体结合而得到第2结合体；第2清洗工序，使用第2清洗溶液清洗第2结合体；第2洗脱工序，使第2结合体与第2酸性溶液相接触，将神经颗粒蛋白相关肽洗脱到第2酸性溶液中而得到第2洗脱液；和检测工序，通过质谱分析法检测第2洗脱液中的神经颗粒蛋白相关肽，结合溶液、第1清洗溶液、中性缓冲液及第2清洗溶液均含有表面活性剂，表面活性剂所具有的疏水基团的碳数为9以上且11以下。
本发明的第2方式的分析方法为分析生物试样所含有的神经颗粒蛋白相关肽的方法，其依次具备下述工序：结合工序，使生物试样在结合溶液中与载体相接触，神经颗粒蛋白相关肽与载体结合而得到结合体；清洗工序，使用清洗溶液清洗结合体；洗脱工序，使结合体与酸性溶液相接触，得到将神经颗粒蛋白相关肽洗脱到酸性溶液而形成的洗脱液；和检测工序，通过质谱分析法检测洗脱液中的神经颗粒蛋白相关肽，结合溶液及清洗溶液均含有表面活性剂，表面活性剂所具有的疏水基团的碳数为9以上且11以下。
发明的效果
根据本发明的第1方式及第2方式，能够以高灵敏度来分析神经颗粒蛋白相关肽。
附图说明
图1示出参照例1中用MALDI-TOF/MS装置检测Ng相关肽而得到的质谱。
图2为示出SIL-Ng50-78的情况下各实施例及各比较例的灵敏度(S/N)相对于参照例1的灵敏度(S/N)的相对比值的图。
图3为示出Ng43-75的情况下各实施例及各比较例的灵敏度(S/N)相对于参照例1的灵敏度(S/N)的相对比值的图。
具体实施方式
1.第1方式
第1方式的分析方法为分析生物试样中的神经颗粒蛋白相关肽的方法，依次具备第1结合工序、第1清洗工序、第1洗脱工序、中性化工序、第2结合工序、第2清洗工序、第2洗脱工序和检测工序。以下对各工序进行详细说明。
需要说明的是，“神经颗粒蛋白相关肽”(以下简单记作“Ng相关肽”。)包括神经颗粒蛋白及神经颗粒蛋白发生碎片化而得到的片段肽。作为片段肽，可列举例如Ng50-78(序列号1)、Ng43-75(序列号2)等。
(第1结合工序)
第1结合工序中，在结合液中使生物试样与第1载体相接触。例如，将结合溶液、生物试样及第1载体以合适的顺序混合。由此，生物试样中的Ng相关肽结合于第1载体，得到第1结合体。
作为生物试样，可列举：例如血液、脑脊髓液、尿、身体分泌液、唾液、痰等体液；例如粪便等。血液包括全血、血浆、血清等。血液可以为：对从个体采集而得的全血进行离心分离、冷冻保存等处理而得者。本分析方法中，优选列举血液。血液与脑脊液相比侵入性低，另外为体检等中的筛查的对象试样，容易获得。
结合溶液含有表面活性剂。优选结合溶液为含有表面活性剂的中性缓冲液。
作为中性缓冲液，可列举例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液、乙酸铵缓冲液等。中性缓冲液的pH例如为pH6.0以上、优选6.5以上，另外，例如为8.5以下、优选8.0以下。
结合溶液所含有的表面活性剂中，表面活性剂的疏水基团的碳数为9以上且11以下。即，结合溶液所含有的表面活性剂由具有碳数9～11的疏水基团的表面活性剂构成。疏水基团的碳数更优选11。通过含有这样的碳数的表面活性剂，能够抑制向第1结合体的非特异性吸附。
另外，从抑制蛋白质变性、除去容易性、减少对质谱分析中的电离的干扰等观点出发，优选列举中性表面活性剂。作为这样的中性表面活性剂，可列举例如：在亲水性部分具有麦芽糖的表面活性剂、在亲水性部分具有海藻糖的表面活性剂、在亲水性部分具有葡萄糖的表面活性剂等。
作为具有碳数9～11的疏水基团及麦芽糖的表面活性剂，可列举例如正壬基-β-D-麦芽糖苷(NM：n-Nonyl-β-D-maltoside)、正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷(NTM：n-Nonyl-β-D-thiomaltoside)、正癸基-β-D-麦芽糖苷(DM：n-Decyl-β-D-maltoside)、正十一烷基-β-D-麦芽糖苷(UDM：n-Undecyl-β-D-maltoside)等。
作为具有碳数9～11的疏水基团及海藻糖的表面活性剂，可列举例如α-D-吡喃葡糖基α-D-吡喃葡糖苷单癸酸酯(海藻糖C10)等。
作为具有碳数9～11的疏水基团及葡萄糖的表面活性剂，可列举例如正癸基-β-D-葡糖苷等。
这些表面活性剂可以单独使用1种，另外也可以将2种以上组合使用。
表面活性剂的临界胶束浓度(cmc)例如为0.2mmol/L以上、优选0.4mmol/L以上，另外，例如为10mmol/L以下、优选5mmol/L以下。另外，例如为0.01％以上、优选0.02％以上，另外，例如为0.5％以下、优选0.3％以下。临界胶束浓度为上述范围时，能够提高Ng相关肽的分析灵敏度。
结合溶液中的表面活性剂浓度例如为0.02％(w/v)以上、优选0.2％(w/v)以上，另外，例如为10％(w/v)以下、优选3％(w/v)以下。另外，表面活性剂浓度例如为临界胶束浓度的2倍以上且20倍以下。表面活性剂浓度为上述范围时，充分地形成胶束，因此能够可靠地实现表面活性剂的效果。
第1载体只要能够结合Ng相关肽即可，可列举例如抗体固定化载体。
固定化于第1载体的抗体为具有能够识别Ng相关肽的抗原结合部位的抗体(抗Ng相关肽抗体)，可列举例如具有能够识别Ng相关肽的抗原结合部位的免疫球蛋白或其片段。
作为免疫球蛋白，可列举例如IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgY、IgD、IgE等。作为免疫球蛋白片段，可列举例如F(ab’)2、F(ab’)、F(ab)、Fd、Fv、L链、H链等。更具体而言，为克隆NG2、NG7、EPR21152及它们的片段等。抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体中的任意者。
作为第1载体的材质，可列举例如琼脂糖、琼脂糖凝胶(sepharose)、葡聚糖、硅胶、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、(甲基)丙烯酸系聚合物、氟树脂、金属络合物树脂、玻璃、金属、磁性体等。
作为第1载体的形状，可以为球状(包括珠状)、板状、针状、不定形等中任意形状，另外可以为微型设备内的流路壁等。
在第1结合工序之前，可以根据需要实施除去IgG、IgM等抗体的前处理等。
(第1清洗工序)
第1清洗工序中，在第1结合工序之后，使用第1清洗溶液清洗第1结合体。
第1清洗溶液含有表面活性剂。优选第1清洗溶液为含有表面活性剂的中性缓冲液。
第1清洗溶液所含有的表面活性剂的疏水基团的碳数为9以上且11以下，最优选11。即，第1清洗溶液所含有的表面活性剂由具有碳数9～11的疏水基团的表面活性剂构成。由此，能够有效地除去疏水性高的不需要的成分(血中蛋白质、脂质、糖脂等)。
作为第1清洗溶液中的中性缓冲液及表面活性剂，可列举与在结合溶液中例示出的中性缓冲液及表面活性剂同样的中性缓冲液及表面活性剂。
第1清洗溶液中的表面活性剂浓度例如为0.01％(w/v)以上、优选0.1％(w/v)以上，另外，例如为5％(w/v)以下、优选2％(w/v)以下。另外，表面活性剂浓度例如为临界胶束浓度以上且临界胶束浓度的10倍以下。表面活性剂浓度为上述范围时，充分形成胶束，因此能够可靠地实现表面活性剂的效果。
清洗方法可以采用公知的方法，优选实施多次清洗。例如，使用含有表面活性剂的中性缓冲液进行清洗，接着，使用不含表面活性剂的中性缓冲液进行清洗。
不含表面活性剂的中性缓冲液也可以使用与在结合溶液中例示的中性缓冲液同样的中性缓冲液。由此，能够抑制由表面活性剂残存于第1结合体引起的发泡。
作为清洗方法，可以使用常规方法，可列举例如将载体在清洗溶液内进行搅拌的方法、从清洗喷嘴喷射清洗溶液的方法等。在利用这些中性缓冲液清洗后，可以根据需要进一步实施用水进行的清洗。
(第1洗脱工序)
第1洗脱工序中，在第1清洗工序之后，使第1结合体与第1酸性溶液相接触。由此，Ng相关肽从第1结合体上解离，神经颗粒蛋白被洗脱到第1酸性溶液中。其结果是，得到含有Ng相关肽的第1洗脱液。
作为第1酸性溶液，可列举例如甘氨酸缓冲液、盐酸等酸性水溶液，优选列举甘氨酸缓冲液。第1酸性溶液的pH例如为3.5以下、优选3.0以下，另外，例如为0.5以上、优选1.0以上。
第1酸性溶液优选含有表面活性剂。第1酸性溶液所含有的表面活性剂的疏水基团的碳数为9以上且11以下，最优选11。即，第1酸性溶液所含有的表面活性剂由具有碳数9～11的疏水基团的表面活性剂构成。由此，能够使Ng相关肽从第1结合体更可靠地解离。另外，抑制洗脱下来的Ng相关肽附着于试管、微孔板等容器。因此，能够可靠地提高Ng相关肽的回收率。
作为第1酸性溶液中使用的表面活性剂，可列举与在结合溶液中例示的表面活性剂同样的表面活性剂。另外，第1酸性溶液中的表面活性剂浓度与第1清洗溶液中的表面活性剂浓度相同。
(中性化工序)
中性化工序中，在第1洗脱工序之后，将第1洗脱液与中性缓冲液混合。由此，使第1洗脱液中性化，得到含有Ng相关肽的纯化溶液。
中性化工序中使用的中性缓冲液可以含有表面活性剂。特别是第1酸性溶液(进而，第1洗脱液)不含表面活性剂时，优选中性缓冲剂含有表面活性剂。中性缓冲液所含有的表面活性剂的疏水基团的碳数为9以上且11以下，最优选11。即，纯化溶液所含有的表面活性剂由具有碳数9～11的疏水基团的表面活性剂构成。由此，在第2结合工序中能够抑制向第2结合体的非特异性吸附。
作为中性化工序中使用的中性缓冲液及表面活性剂，可列举与在结合溶液中例示的中性缓冲液及表面活性剂同样的中性缓冲液及表面活性剂。另外，中性缓冲液中的表面活性剂浓度与第1结合溶液中的表面活性剂浓度相同。
纯化溶液的pH为中性，例如为pH6.0以上、优选6.5以上，另外，例如为8.5以下、优选8.0以下。由此，在第2结合工序中，能够提高结合效率。
(第2结合工序)
第2结合工序中，在中性化工序之后，使纯化溶液与第2载体相接触。由此，纯化溶液的Ng相关肽结合于第2载体，得到第2结合体。
作为第2载体，优选抗体固定化载体，具体而言可列举与在第1载体中例示的抗体固定化载体同样的载体。
(第2清洗工序)
第2清洗工序中，在第2结合工序之后，使用第2清洗溶液清洗第2结合体。
第2清洗溶液含有表面活性剂。优选第2清洗溶液为含有表面活性剂的中性缓冲液。
第2清洗溶液所含有的表面活性剂的疏水基团的碳数为9以上且11以下，最优选11。即，第2清洗溶液所含有的表面活性剂由具有碳数9～11的疏水基团的表面活性剂构成。由此，能够有效地除去例如疏水性高的不需要成分(血中蛋白质、脂质、糖脂等)。
作为第2清洗溶液中使用的中性缓冲液及表面活性剂，可列举与在结合溶液中例示的中性缓冲液及表面活性剂同样的中性缓冲液及表面活性剂。另外，第2清洗溶液中的表面活性剂浓度与第1清洗溶液中的表面活性剂浓度相同。
清洗方法可以采用公知的方法，具体而言，可以实施与在第1清洗工序中例示的清洗方法同样的方法。
(第2洗脱工序)
第2洗脱工序中，在第2清洗工序之后，使第2结合体与第2酸性溶液相接触。由此，Ng相关肽从第2结合体上解离，Ng相关肽洗脱到第2酸性溶液中。其结果是，得到含有Ng相关肽的第2洗脱液。
作为第2酸性溶液，可列举与在第1洗脱工序中例示的第1酸性溶液同样的酸性溶液，优选列举盐酸。
第2酸性溶液优选含有挥发性有机溶剂。由此，能够使Ng相关肽从第2结合体上高效地解离而洗脱到第2酸性溶液中，能够提高Ng相关肽的回收率。
作为挥发性有机溶剂，可列举与水以任意比例混溶的有机溶剂，可列举例如乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、甲苯、异丙醇、己烷、丁醇、环己烷、乙二醇、苯、氯仿、乙醛、三乙基胺、苯酚、萘、甲醛、四氢呋喃、乙酸乙酯等，优选列举乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇等。这些有机溶剂可以单独使用一种，另外也可以组合使用两种以上。
第2酸性溶液中的挥发性有机溶剂浓度例如为10％(v/v)以上、优选25％(v/v)以上，另外，例如为90％(v/v)以下、优选80％(v/v)以下。浓度在上述范围内时，能使Ng相关肽从第2载体上高效地解离，另外，能提高质谱分析时的灵敏度(S/N比)。
第2酸性溶液优选还含有甲硫氨酸等氨基酸。由此，在配置于质谱分析装置至开始分析期间，能够降低Ng相关肽的氧化，能够提高分析精度。第2酸性溶液中的氨基酸浓度例如为0.01mM以上、优选0.05mM以上，另外，例如为5mM以下、优选1mM以下。
(分析工序)
分析工序中，在第2洗脱工序之后，通过质谱分析法检测第2洗脱液所含有的Ng相关肽。
作为质谱分析法，可列举MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization；基质辅助激光解析电离法)、ESI(Electrospray ionization；电喷雾电离法)、APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization；大气压化学电离法)等。从由于不借助液相色谱也能够测定而能够减少吸附等损耗、即使共存有一些夹杂物也能够使Ng相关肽可靠地电离的观点出发，优选列举MALDI。
MALDI的检测中，例如可以使用MALDI-TOF(基质辅助激光解析电离-飞行时间)型质谱分析装置、MALDI-IT(基质辅助激光解析电离-离子阱)型质谱分析装置、MALDI-IT-TOF(基质辅助激光解析电离-离子阱-飞行时间)型质谱分析装置、MALDI-FTICR(基质辅助激光解析电离-傅里叶变换离子回旋共振)型质谱分析装置等按照常规方法进行操作。
利用MALDI检测时，例如通过将含有基质的溶液滴加于MALDI板并使其干燥来配置基质。
作为基质，可列举例如α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA；α-cyano-4-hydroxycinnamicacid)、2,5-二羟基苯甲酸、芥子酸、3-氨基喹啉等。这些基质可以单独使用一种，另外也可以组合使用两种以上。
作为使之含有基质的溶剂，可列举例如乙腈、三氟乙酸、甲醇、乙醇、水等。这些溶剂可以单独使用一种，另外也可以组合使用两种以上。
含有基质的溶剂中的基质浓度例如为0.1mg/mL以上、优选0.5mg/mL以上，另外，例如为50mg/mL以下、优选10mg/mL以下。
优选与基质一起组合使用基质添加剂。作为基质添加剂，可列举例如含有膦酸基的化合物、铵盐等，从能够抑制清洗溶液的残存对背景的不良影响的观点出发，优选列举含有膦酸基的化合物。作为含有膦酸基的化合物，可列举例如膦酸、甲基膦酸、苯基膦酸、1-萘基甲基膦酸、亚甲基二膦酸(MDPNA；Methylenediphosphonic acid)、亚乙基二膦酸、乙烷-1-羟基-1,1-二膦酸、次氮基三膦酸、亚乙基二氨基四膦酸等。
含有基质的溶剂中的基质添加剂浓度例如为0.01％(w/v)以上、优选0.1％(w/v)以上，另外，例如为10％(w/v)以下、优选1％(w/v)以下。
由此，能够测定第2洗脱液(进而，生物试样)所含有的Ng相关肽。该分析方法中，特别是通过使第1结合溶液中使用的结合溶液、第1清洗工序中使用的第1清洗溶液、中性化工序中使用的中性缓冲液及第2清洗工序中使用的第2清洗溶液均含有疏水基团的碳数为9以上且11以下的特定表面活性剂，从而能够使结合工序中的Ng相关肽与载体的结合效率、洗脱工序中的Ng相关肽的回收率等分别提高到高水平，其结果是与以往的分析方法相比，能够以非常高的灵敏度(S/N)来分析Ng相关肽。
2.第2方式
第1方式的分析方法中实施了2次免疫沉淀法(亲和纯化)，但是例如也可以为1次免疫沉淀法。这种情况下，第2方式的分析方法具备第1结合工序(结合工序)、第1清洗工序(清洗工序)、第2洗脱工序(洗脱工序)和检测工序。各工序与第1方式相同。该第2方式也发挥与第1方式同样的作用效果。从即使生物试样中的Ng相关肽存在量为更微量时也能够可靠地分析Ng相关肽的观点出发，优选第1方式。
3.方式
本领域技术人员可以理解，上述的多个例示性实施方式为以下方式的具体例。
(第1项)一方式所涉及的分析方法可以为：一种分析生物试样所含有的神经颗粒蛋白相关肽的方法，其依次具备：结合工序，使上述生物试样在结合溶液中与载体相接触，上述神经颗粒蛋白相关肽与上述载体结合而得到结合体；清洗工序，使用清洗溶液清洗上述结合体；洗脱工序，使上述结合体与酸性溶液相接触，将上述神经颗粒蛋白相关肽洗脱到上述酸性溶液中而得到洗脱液；和检测工序，通过质谱分析法检测上述洗脱液中的上述神经颗粒蛋白相关肽，上述结合溶液及上述清洗溶液均含有表面活性剂，上述表面活性剂所具有的疏水基团的碳数为9以上且11以下。
(第2项)第1项所述的分析方法中，上述酸性溶液可含有有机溶剂。
(第3项)第1项或第2项所述的分析方法中，上述生物试样可以为血液。
(第4项)第1～3项中任一项所述的分析方法中，上述质谱分析法可以为基质辅助激光解析电离法。
(第5项)一方式所涉及的分析方法可以为：一种分析生物试样所含有的神经颗粒蛋白相关肽的方法，其依次具备下述工序：第1结合工序，在结合溶液中，使上述生物试样与第1载体相接触，上述神经颗粒蛋白相关肽与上述第1载体结合而得到第1结合体；第1清洗工序，使用第1清洗溶液清洗上述第1结合体；第1洗脱工序，使上述第1结合体与第1酸性溶液相接触，将上述神经颗粒蛋白相关肽洗脱到上述第1酸性溶液中而得到第1洗脱液；中性化工序，将上述第1洗脱液与中性缓冲液混合，得到纯化溶液；第2结合工序，使上述纯化溶液与第2载体相接触，上述神经颗粒蛋白相关肽与上述第2载体结合而得到第2结合体；第2清洗工序，使用第2清洗溶液清洗上述第2结合体；第2洗脱工序，使上述第2结合体与第2酸性溶液相接触，将上述神经颗粒蛋白相关肽洗脱到上述第2酸性溶液中而得到第2洗脱液；和检测工序，通过质谱分析法检测上述第2洗脱液中的上述神经颗粒蛋白相关肽，上述结合溶液、上述第1清洗溶液及上述第2清洗溶液均含有表面活性剂，上述表面活性剂所具有的疏水基团的碳数为9以上且11以下。
(第6项)第5项所述的分析方法中，上述第2酸性溶液可含有有机溶剂。
(第7项)第5项或第6项所述的分析方法中，上述第1酸性溶液可含有表面活性剂，并且上述表面活性剂所具有的疏水基团的碳数为9以上且11以下。
(第8项)第5～7项中任一项所述的分析方法中，上述生物试样可以为血液。
(第9项)第5～8项中任一项所述的分析方法中，上述质谱分析法可以为基质辅助激光解析电离法。
实施例
接着列举实施例及比较例详细说明本发明，但是本发明的范围不受这些限定。
＜参照例1＞
作为参照例1，参照非专利文献2中记载的淀粉样物质β的质谱分析方法如下所述地分析了Ng相关肽。
(第1结合工序、第1清洗工序、第1洗脱工序)
准备以人神经颗粒蛋白(Ng)的52-63残基为表位的抗Ng抗体(IgG1)的克隆NG2(BioLegend公司)。使磁性珠(Dynabeads M-270Epoxy)4.95mg在固定化缓冲液(含有1.5M硫酸铵的0.1M磷酸缓冲液；pH7.4)中在37℃下与抗Ng抗体100μg反应16～24小时。由此，制作抗体珠。
以经稳定同位素标记的Ng50-78(SIL-Ng50-78)达到300pM的方式在人血浆中加标。将该血浆250μL与结合缓冲液(表面活性剂[0.2％DDM及0.2％NTM]、800mM GlcNAc、100mM Tris-HCl、300mM NaCl；pH7.4)250μL混合，在冰上静置5～60分钟。将该血浆与抗体珠混合，在冰上振荡1小时。之后将抗体珠用第1清洗缓冲液(表面活性剂[0.1％DDM及0.1％NTM]、50mM Tris-HCl、150mM NaCl；pH7.4)100μL清洗3次，用50mM乙酸铵缓冲液50μL清洗2次。之后使抗体珠与第1酸性溶液(含有表面活性剂[0.1％DDM]的50mM甘氨酸缓冲液；pH2.8)相接触，将Ng相关肽洗脱到第1酸性溶液中。由此，得到包含Ng相关肽的第1洗脱液。
(中性化工序)
将第1洗脱液与中性缓冲液(表面活性剂[0.2％DDM]、800mM GlcNAc、300mM Tris-HCl、300mM NaCl；pH7.4)混合，得到纯化溶液。
(第2结合工序、第2清洗工序、第2洗脱工序)
将纯化溶液与抗体珠混合，在冰上振荡1小时。之后将抗体珠用第2清洗缓冲液(表面活性剂[0.1％DDM]、150mM Tris-HCl、150mM NaCl；pH7.4)50μL清洗5次，用50mM乙酸铵缓冲液50μL清洗2次，用水30μL清洗1次。之后使抗体珠与第2酸性溶液(包含5mM盐酸和0.1mM甲硫氨酸的70％(v/v)乙腈水溶液；pH2.3)相接触，将Ng相关肽洗脱到第2酸性溶液中。由此，得到包含Ng相关肽的第2洗脱液。
(分析工序)
作为质谱分析装置，使用MALDI-TOF MS装置(岛津制作所制)。作为线性TOF用的基质，使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)，作为基质添加剂，使用亚甲基二膦酸(MDPNA)，作为溶剂，使用乙腈，制备0.5mg/mL CHCA/0.2％(w/v)MDPNA基质溶液。向MALDI板(μFocusMALDI plate900μm(Hudson Surface Technology,Inc.,Fort Lee,NJ))的4个孔中各滴加基质溶液0.5μL，使其干固。向这4个孔中滴加、配置第2洗脱液。
接着，运行MALDI-TOF MS而检测Ng相关肽。作为设定条件，使用AXIMAPerformance(Shimadzu/KRATOS,Manchester,UK)，以正离子模式的线性TOF获得质谱数据。对于1个孔，对400个点累积16000次。线性TOF的m/z值以峰的平均质量来表示。m/z值使用以人血管紧张素II及人ACTH片段18-39、牛胰岛素氧化物β链、牛胰岛素、细胞色素c作为外标进行校准。
＜实施例1～3＞
将各液所含有的表面活性剂及其浓度变更为表1记载的表面活性剂及其浓度，除此以外与参照例1同样地实施分析方法。
＜比较例1～3＞
将各液所含有的表面活性剂及其浓度变更为表1记载的表面活性剂及其浓度，除此以外与参照例1同样地实施分析方法。
[表1]
表1中，％表示％(w/v)。
表中的缩写及其碳数以及临界胶束数如下所示。
TC12：海藻糖C12
DDM：正十二烷基-β-D-麦芽糖苷
UDM：正十一烷基-β-D-麦芽糖苷
DM：正癸基-β-D-麦芽糖苷
NTM：正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷
OG：正辛基-β-D-葡糖苷
[表2]
| TC12 | DDM | UDM | DM | NTM | OG | |
| 疏水基团的碳数 | 12 | 12 | 11 | 10 | 9 | 8 |
| 临界胶束浓度：cmc(mmol/l) | 0.15 | 0.17 | 0.55 | 1.8 | 2.4 | 25 |
| 临界胶束浓度：cmc(％) | 0.0079 | 0.0087 | 0.0273 | 0.0869 | 0.1163 | 0.7309 |
＜分析结果＞
将参照例1中得到的1个质谱(1个孔)示于图1。从检测到的峰中提取与SIL-Ng50-78及Ng43-75的质量相当的峰，将AXIMA Performance的分析软件(Shimadzu BiotachLaunchpad：Shimadzu/KRATOS，Manchester，UK)中显示的各峰的S/N作为灵敏度的指标。此时，采用4个孔的质谱中的平均值作为S/N。表3示出SIL-Ng50-78及Ng43-75的氨基酸序列和理论平均值m/z。Ng43-75为血浆内源性Ng肽。
[表3]
| 名称 | 氨基酸序列 | 理论平均值m/z |
| SIL-Ng50-78 | ERGRKGPGPGGPGGAGVARGGAGGGPSGD | 2476.68 |
| Ng43-75 | RKKIKSGERGRKGPGPGGPGGAGVARGGAGGGP | 2985.4 |
各实施例及各比较例也与参照例1同样地由4个孔的质谱分别计算SIL-Ng50-78及Ng43-75的峰的S/N。
接着，对于SIL-Ng50-78及Ng43-75的各峰，计算实施例1～3的S/N相对于参照例1的S/N的相对比值及比较例1～3的S/N相对于参照例1的S/N的相对比值。
重复实施包括上述参照例、各实施例及各比较例在内的一系列分析实验，获得4～5次的分析数据(上述相对比值)，然后计算这4～5次的平均值。将其结果示于图2及图3。
由图2及图3可知，确认与参照例1相比实施例1～3的灵敏度(S/N)提高1.5倍以上，确认实施例1的灵敏度提高3倍以上。由此，本分析方法能够从血液中非常高灵敏度地检测Ng片段肽，能够可靠地测定血液中的Ng片段肽。另一方面，比较例1～3与参照例1为同等灵敏度。
序列表
<110> 株式会社岛津制作所（SHIMADZU CORPORATION）
<120> 神经颗粒蛋白相关肽的分析方法
<130> SP20200601
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Glu Arg Gly Arg Lys Gly Pro Gly Pro Gly Gly Pro Gly Gly Ala Gly
1 5 10 15
Val Ala Arg Gly Gly Ala Gly Gly Gly Pro Ser Gly Asp
20 25
<210> 2
<211> 33
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Arg Lys Lys Ile Lys Ser Gly Glu Arg Gly Arg Lys Gly Pro Gly Pro
1 5 10 15
Gly Gly Pro Gly Gly Ala Gly Val Ala Arg Gly Gly Ala Gly Gly Gly
20 25 30
Pro
Claims (9)
1.一种神经颗粒蛋白相关肽的分析方法，其为分析生物试样所含有的神经颗粒蛋白相关肽的方法，其依次具备：
结合工序，使所述生物试样在结合溶液中与载体相接触，所述神经颗粒蛋白相关肽与所述载体结合而得到结合体；
清洗工序，使用清洗溶液清洗所述结合体；
洗脱工序，使所述结合体与酸性溶液相接触，将所述神经颗粒蛋白相关肽洗脱到所述酸性溶液中而得到洗脱液；和
检测工序，通过质谱分析法检测所述洗脱液中的所述神经颗粒蛋白相关肽，
所述结合溶液及所述清洗溶液均含有表面活性剂，所述表面活性剂所具有的疏水基团的碳数为9以上且11以下。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述酸性溶液含有有机溶剂。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述生物试样为血液。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的分析方法，其中，所述质谱分析法为基质辅助激光解析电离法。
5.一种神经颗粒蛋白相关肽的分析方法，其为分析生物试样所含有的神经颗粒蛋白相关肽的方法，其依次具备下述工序：
第1结合工序，在结合溶液中，使所述生物试样与第1载体相接触，所述神经颗粒蛋白相关肽与所述第1载体结合而得到第1结合体；
第1清洗工序，使用第1清洗溶液清洗所述第1结合体；
第1洗脱工序，使所述第1结合体与第1酸性溶液相接触，将所述神经颗粒蛋白相关肽洗脱到所述第1酸性溶液中而得到第1洗脱液；
中性化工序，将所述第1洗脱液与中性缓冲液混合，得到纯化溶液；
第2结合工序，使所述纯化溶液与第2载体相接触，所述神经颗粒蛋白相关肽与所述第2载体结合而得到第2结合体；
第2清洗工序，使用第2清洗溶液清洗所述第2结合体；
第2洗脱工序，使所述第2结合体与第2酸性溶液相接触，将所述神经颗粒蛋白相关肽洗脱到所述第2酸性溶液中而得到第2洗脱液；和
检测工序，通过质谱分析法检测所述第2洗脱液中的所述神经颗粒蛋白相关肽，
所述结合溶液、所述第1清洗溶液及所述第2清洗溶液均含有表面活性剂，所述表面活性剂所具有的疏水基团的碳数为9以上且11以下。
6.根据权利要求5所述的分析方法，其中，所述第2酸性溶液含有有机溶剂。
7.根据权利要求5所述的分析方法，其中，所述第1酸性溶液含有表面活性剂，
所述表面活性剂所具有的疏水基团的碳数为9以上且11以下。
8.根据权利要求5所述的分析方法，其中，所述生物试样为血液。
9.根据权利要求5所述的分析方法，其中，所述质谱分析法为基质辅助激光解析电离法。
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