JP2023536162A - 神経変性疾患の診断と予後推定におけるマーカーとしてのｐ５３の翻訳後修飾 - Google Patents

神経変性疾患の診断と予後推定におけるマーカーとしてのｐ５３の翻訳後修飾 Download PDF

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Abstract

本発明は、ｐ５３の配列および翻訳後修飾（ＰＴＭ）に関し、また生体サンプルにおける神経変性疾患および認知機能低下の診断、および／または、様々なステージのアルツハイマー病の予後推定、および／または、神経変性疾患の予後推定におけるバイオマーカーとしてのそれらの使用に関する。また本発明は、患者のヒト血漿に特異的な前記ｐ５３直鎖状タンパク質配列に対するＰＴＭ、およびその全配列の可能な切断を評価することにより、１）被験者の軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、レビー小体（ＬＢ）、及び血管性認知症（ＶＤ）などの神経変性疾患の高精度質量分析に基づく診断方法；および、２）ＣＵおよびＭＣＩ患者におけるＡＤの予後推定を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、ｐ５３の配列および翻訳後修飾（ＰＴＭ）に関し、また生体サンプルにおける神経変性疾患およびアルツハイマー病に至る認知機能低下およびアルツハイマー病の診断、および／または、様々なステージのアルツハイマー病の予後推定、および／または、神経変性疾患の予後推定におけるバイオマーカーとしてのそれらの使用に関する。
また本発明は、生体液サンプル中の前記ｐ５３直鎖状タンパク質配列に対する変化（ＰＴＭ）を特異的に評価することにより、被験者の軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、レビー小体（ＬＢ）、及び血管性認知症（ＶＤ）などの神経変性疾患の高精度質量分析に基づく診断方法を提供する。
また本発明は、生体液サンプル中のｐ５３タンパク質の直鎖配列に対する前記ＰＴＭの変化を特異的に評価することにより、無症状期および前駆期（ＭＣＩ）のアルツハイマー病（ＡＤ）の予後推定のための高精度質量分析に基づく診断方法を提供する。
アルツハイマー病（略して「ＡＤ」）の早期のリスクファクターとして、構造変化した大量のｐ５３アイソフォームの存在が、さまざまな公表された研究により確認されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
最初に、ＡＤ、軽度認知障害、パーキンソン病、その他の認知症、及び健常者の中から４００名超の被験者を様々な独立した研究に登録し、市販の構造特異的抗ｐ５３抗体を用いて、様々な手法（免疫沈降実験、ＦＡＣＳ分析、ＥＬＩＳＡ）により折りたたみ不全ｐ５３を検査した（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。
２００６年、Ｕｂｅｒｔｉら（非特許文献８）は、散発性アルツハイマー病（ＡＤ）患者の線維芽細胞が、年齢を合致させた非ＡＤ患者の線維芽細胞の細胞とは異なる、異常で検出可能なｐ５３のコンフォメーション状態を特異的に発現することを初めて明らかにした。
この構造変化した状態では、ｐ５３はその標的遺伝子を転写活性化する能力を失い、その結果、生物学的機能を失う（非特許文献９；非特許文献１０）。健康な非認知症の被験者、または他の認知症およびＰＤ並びにＡＤに移行したＭＣＩに罹患している患者と比較して、ＡＤの血液中では、折りたたみ不全ｐ５３の量が多いことも確認されている。
これらのデータは、折りたたみ不全ｐ５３とＡＤ病態の直接的な関連性を示唆する。
特許文献１では、２Ｄ３Ａ８という名前の新しい構造特異的抗Ｕｐ５３抗体の開発が報告されている。これは、ｐ５３がその野生型構造を失って折りたたみ不全表現型となった場合にのみアクセス可能なエピトープ（ａａ２８２－２９７）に結合する。ＡＤで発見された折りたたみ不全ｐ５３の最初に使用された市販の抗体（ＰＡｂ２４０、ａａ２１４－２１７）と比較すると、２Ｄ３Ａ８抗体は、Ｏｖｉｅｄｏコホートの健康な高齢者と比較して、ＡＤ患者の識別においてより高い感度と特異性を示した。
特に、前記免疫診断法は、ＡＤの指標である生体サンプル中の免疫複合体を同定し、軽度認知障害（ＭＣＩ）に罹患した被験者のＡＤ発症の素因を決定することができる。
特許文献２は、アルツハイマー病に罹患した患者又はＡＤ発症の素因となる症状を有する患者のヒト血漿中の質量分析により検出された「Ｐ１」及び「Ｐ２」として示される特定のｐ５３ペプチドの同定及びレベルの定量化に基づく方法を開示している。
現在、アルツハイマー病の診断および／または予後推定に利用できる新しい特異的な生物学的マーカーを同定し、特に疾患の前臨床および前駆期で、ＡＤと他の認知症（前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、血管性認知症など）の識別解析に使用される、ＡＤの診断や予後推定に利用できる正確で賢明な診断方法を開発する必要がある。
ＥＰ３２０１２３４Ｂ１ ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５１７８５
Ｓｔａｎｇａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐ５３ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｉｓ ＨＩＰＫ２ ｔｈｅ ｌｉｎｋ？ Ａｇｉｎｇ，２（９），ｐｐ．５４５－５５４ Ｌａｎｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００７．Ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐ５３：Ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．ｐｐ．９３－９９ Ｕｂｅｒｔｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３：ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏ－ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ，５（３－４），ｐｐ．２０９－１１ Ｌａｎｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３：ａ ｎｏｖｅｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｍａｒｋｅｒ？ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１３（６），ｐｐ．６４１－７ Ｌａｎｎｉ，Ｃ．，Ｒａｃｃｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐ５３ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｓ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｔｏ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ＪＡＤ，２０（１），ｐｐ．９７－１０４ Ｂｕｉｚｚａ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，２０１２．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｌｔｅｒｅｄ ｐ５３ ａｓ ａｎ ｅａｒｌｙ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ，７（１），ｐ．ｅ２９７８９ Ａｒｃｅ－Ｖａｒａｓ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｌｏｏｄ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ ｒｅｄｏｘ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｍｉｌｄ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１７；１４（１）：１１２－１２２ Ｕｂｅｒｔｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｔａｎｔ－ｌｉｋｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｓｐｏｒａｄｉｃ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ，２７（９），ｐｐ．１１９３－２０１ Ｌａｎｎｉ，Ｃ．，Ｎａｒｄｉｎｏｃｃｈｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２：ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｂｅｔａ ａｍｙｌｏｉｄ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐ５３ ａｎｄ ｉｎａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ，５（４），ｐ．ｅ１０１７１ Ｌａｎｎｉ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２００８． Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｇｉｎｇ Ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｐ５３．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ，１４（２６），ｐｐ．２６６５－２６７１ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｓｓ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ（ＰＭＦ；Ｃｒｉｓｔｏｎｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００４ Ｄｅｃ；１（４）：４６９－８３）
本発明の目的は、アミノ酸１～３７１の領域内のｐ５３タンパク質のアミノ酸配列における１１個の主要な翻訳後修飾（ＰＴＭ）（本明細書中では、ＰＴＭ－１、ＰＴＭ－２、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５、ＰＴＭ－６、ＰＴＭ－７、ＰＴＭ－８、ＰＴＭ－９、ＰＴＭ－１０、ＰＴＭ－１１という）および／または、生体液サンプル中のｐ５３タンパク質のいくつかのトランケーション型を同定することによって達成された。
したがって、本発明の一態様は、異なる形態の認知症と認知機能低下の診断、および／または、様々な段階のアルツハイマー病の予後推定に使用するための、前記ＰＴＭの同定に基づく診断方法に関する。
本発明の特徴および利点は、以下の詳細な説明および例示目的で提供される実施例、ならびに添付の図面から明らかになるであろう：
ＡＤに罹患した被験者のサンプルで検出されたタンパク質のユビキチン化部位 対照サンプル（ＣＵ）で検出されたタンパク質ユビキチン化部位 前頭葉型認知症（ＦＴＤ）に罹患した被験者のサンプルで検出されたタンパク質のユビキチン化部位 レビー小体型認知症（ＬＢ）に罹患した被験者のサンプルで検出されたタンパク質のユビキチン化部位 血管性認知症（ＶＤ）に罹患した被験者のサンプルで検出されたタンパク質のユビキチン化部位 軽度認知障害（ＭＣＩ）に罹患した被験者のサンプルで検出されたタンパク質のユビキチン化部位 少なくとも１８ヶ月の間にわたってＡＤを発症した認知機能のある健常者（ＣＵ）のサンプルで検出されたタンパク質のユビキチン化部位 ＡＤを発症したＭＣＩ群の被験者のサンプルで検出されたタンパク質のユビキチン化部位 図で報告されている配列は、配列番号１の直鎖配列に対応する。
［定義］
「Ｕ－ｐ５３」という用語は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸１～３７１の領域を意味し、以下に述べるように、直鎖状タンパク質配列上の翻訳後修飾（ＰＴＭ）、場合によってはトランケーションも含む。
「ｐ５３」という用語は、データベース「ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、タンパク質ＩＤ：Ｐ０４６３７、アミノ酸：１－３９３」の野生型タンパク質ｐ５３を意味する。
「神経変性疾患」という用語は、主にヒトの脳のニューロンに影響を与える一連の状態を示すことを意図し、また軽度認知障害（ＭＣＩ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、レビー小体（ＬＢ）、血管性認知症（ＶＤ）などの認知症、および前記神経変性疾患、認知症に至る認知機能低下、アルツハイマー病（ＡＤ）（前臨床期、前駆期を含む）の様々な段階も含む。
［発明の詳細な説明］
したがって、本発明は、神経変性疾患の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ法におけるバイオマーカーとして使用することができる、高精度質量分析法によって検出されたｐ５３翻訳後修飾の組み合わせに関する。前記方法は、アルツハイマー病に罹患した患者、またはＡＤもしくは異なる型の認知症の発症の素因となり得る症状を有する患者から得られた生体液サンプル中の質量分析によって検出された、その直線配列と比較した特定のｐ５３修飾（略称「ＰＴＭ」）の同定に基づいている。
具体的には、まず、アルツハイマー病の前臨床期、前駆臨床期にある患者、軽度認知障害（ＭＣＩ）安定患者、認知障害のない被験者（ＣＵ）、前頭側頭型認知症（ＦＤ）、血管性認知症（ＶＤ）、およびレビー小体型認知症（ＬＢ）の生体液サンプルにおいて、ｐ５３タンパク質を免疫沈降法により捕捉する。次に、捕捉したタンパク質の翻訳後修飾を、高感度選択的質量分析法を用いたタンパク質配列決定により同定する。また、配列決定後、データベース検索により翻訳後修飾を同定し、文献に既に記載されているものを確認する。
次に、各サンプルについて得られたデータを、同じ臨床的証拠を有する被験者からの生体液サンプルで検出されたＰＴＭと比較することにより、「ＰＴＭと診断」の間の相関が示され、これにより、Ｕ－ｐ５３ ＰＴＭが神経変性疾患の予後推定および診断における信頼性の高いバイオマーカーとして考慮できるという強力な証拠が示される。
前記方法は有利には迅速であり、少量の生体液サンプルで、分析される各サンプル中のＵ－ｐ５３ ＰＴＭを確実に同定する。
さらに、本方法と同定されたバイオマーカーは、無症状者やＭＣＩ患者のアルツハイマー病の診断と予後推定にも利用できるため、診断法市場への参入が可能となる。
さらに、本方法と同定されたバイオマーカーは、アルツハイマー病を、認知症患者のＬＢ、ＶＤ、ＦＴＤなどの他の形態の認知症と識別するためにも使用できる。実際、以下に示すように、アルツハイマー病に罹患した患者の生体液サンプル中のＵ－ｐ５３タンパク質配列は、アミノ酸１～２７１の領域内の長さの点で変動性を示し、前記変動性は、同じ領域内のトランケーションを含む。前記変動性とトランケーションはアルツハイマー病に特有のものであり、他の形態の認知症に罹患している患者の生体液サンプルでは検出されず、ましてや認知障害のない被験者では検出されないことが理解されよう。
同時に、生体サンプル中のＵ－ｐ５３残存量は、その配列長を維持しており、そこにアルツハイマー病特有のＰＴＭが検出される。つまり、アルツハイマー病の患者は、Ｕ－ｐ５３タンパク質配列のトランケーションと、トランケーションされていないＵ－ｐ５３タンパク質の残存量に特異的なＰＴＭの両方を示す限り、明確に特定され、他の認知症患者と区別される。
さらに、前記バイオマーカーは、無症状およびＭＣＩの被験者のアルツハイマー病への認知機能低下の予後推定および認知症としての神経変性疾患の診断に用いることができるので、前記方法は、臨床試験においてＵ－ｐ５３ ＰＴＭを使用して被験者を選択することで、試験の成功を可能にし、アルツハイマー病患者をＬＢ、ＶＤ、ＦＴＤなどの他の形態の認知症と区別することを有利に可能にする。
したがって、本発明は、神経変性疾患の診断または予後推定のためのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法に関し、該方法は、以下の工程を含む：
ａ）ｐ５３タンパク質（Ｕ－ｐ５３）のアミノ酸１～３７１の領域における翻訳後修飾（ＰＴＭ）の存在について生体液サンプルを分析する工程であって、前記ＰＴＭは以下の通りであり、ＰＴＭ－２、ＰＴＭ－７、ＰＴＭ－８、およびＰＴＭ－１１から選択される少なくとも２つのＰＴＭの存在が、認知障害のない被験者（ＣＵ）の指標である工程：
アミノ酸Ｍ１におけるＰＴＭ－１；
アミノ酸Ｋ１６４におけるＰＴＭ－２；
アミノ酸Ｋ３７０におけるＰＴＭ－３；
アミノ酸Ｌ１０１におけるＰＴＭ－４；
アミノ酸Ｋ１２０におけるＰＴＭ－５；
アミノ酸Ｋ１３２におけるＰＴＭ－６；
アミノ酸Ｋ１３９におけるＰＴＭ－７；
アミノ酸Ｋ２９１におけるＰＴＭ－８；
アミノ酸Ｋ３５７におけるＰＴＭ－９；
アミノ酸Ｓ６におけるＰＴＭ－１０；
アミノ酸Ｓ３３におけるＰＴＭ－１１。
ｂ）神経疾患の発生または発症リスクの指標として、以下の存在を評価する工程であって、前記神経変性疾患が、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、レビー小体（ＬＢ）、および血管性認知症（ＶＤ）から選択される工程：
－ ＰＴＭ－１、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５、ＰＴＭ－６、ＰＴＭ－９、およびＰＴＭ－１０から選択される少なくとも２つのＰＴＭ、および
－ ＰＴＭ－２、ＰＴＭ－７、ＰＴＭ－８、およびＰＴＭ－１１から選択される少なくとも１つのＰＴＭ。
ｃ）工程ｂ）で評価されたＰＴＭを、対応する神経変性疾患を同定する指標と関連付ける工程。
本発明によれば、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法において、以下の通りである：
－ 翻訳後修飾ＰＴＭ－１は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｍ１に分岐した基ＣＯ－ＣＨ３を有する；
－ 翻訳後修飾ＰＴＭ－２は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１６４に分岐した基ＣＯ－ＣＨ３を有する；
－ 翻訳後修飾ＰＴＭ－３は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ３７０に分岐した基ＣＯ－ＣＨ３を有する；
－ 翻訳後修飾ＰＴＭ－４は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１０１に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有する；
－ 翻訳後修飾ＰＴＭ－５は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１２０に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有する（［ＧＧ］は「グリシン」の２残基の側鎖を表す。）；
－ 翻訳後修飾ＰＴＭ－６は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１３２に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有する；
－ 翻訳後修飾ＰＴＭ－７は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１３９に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有する；
－ 翻訳後修飾ＰＴＭ－８は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ２９１に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有する；
－ 翻訳後修飾ＰＴＭ－９は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ３５７に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有する；
－ 翻訳後修飾ＰＴＭ－１０は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｓ６がリン酸化されている；
－ 翻訳後修飾ＰＴＭ－１１は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｓ３３がリン酸化されている。
好ましい実施形態では、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの方法は、アルツハイマー病を、認知症患者におけるＬＢ、ＶＤ、ＦＴＤなどの他の形態の認知症と識別するための方法である。実際、上述したように、以下の基準の評価は、ＡＤの指標である：
－ アミノ酸１～２７１の領域内の長さに関する配列変動性であって、同一領域内のトランケーションを含む、前記変動性；および
－ トランケーションされていない配列の残存量におけるＰＴＭ－１、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５、およびＰＴＭ－６から選択される少なくとも２つのＰＴＭの存在、好ましくはＰＴＭ－１、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５、およびＰＴＭ－６の全ての存在。
主に生体反応による前記トランケーションは、前記トランケーションされていない配列の残存量におけるＰＴＭの検出性に影響を及ぼさない。
上記のように、他の認知症患者の生体液サンプルでは検出されないことから、前記変動およびトランケーションはアルツハイマー病特有のものであることが理解されるべきである。一方、生体液サンプル中のＵ－ｐ５３の残存量は、その配列長を維持し、アルツハイマー病特有のＰＴＭが検出される。したがって、アルツハイマー病患者は、Ｕ－ｐ５３タンパク質配列のトランケーションと、トランケーションされていないＵ－ｐ５３タンパク質の残存量における特異的なＰＴＭの両方を示す限り、他の認知症患者とは明確に識別および区別される。
好ましくは、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの方法において、ＰＴＭ－２、ＰＴＭ－７、ＰＴＭ－８、およびＰＴＭ－１１の全ての存在は、認知障害のない被験者（ＣＵ）の指標である。
好ましくは、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの方法において、ＰＴＭ－１、及びＰＴＭ－１０の存在は、ＭＣＩの指標である。
好ましくは、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法において、ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５及びＰＴＭ－９から選択される少なくとも２つのＰＴＭの存在、より好ましくは、ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５及びＰＴＭ－９の全ての存在は、アルツハイマー型認知症（ＡＤ）の認知機能の低下の予後を有する無症状の被験者の指標である。この点で、本発明の方法は、両被験者が形式的には無症状であり、したがって、従来の認知テストによっては互いに区別することができないが、認知障害のない被験者（ＣＵ）を識別し、アルツハイマー型認知症の認知機能の低下の予後を有する無症状被験者と区別することができると理解される。
好ましくは、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法において、ＰＴＭ－１、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－５、ＰＴＭ－６、及びＰＴＭ－１０から選ばれる少なくとも２つのＰＴＭの存在、より好ましくはＰＴＭ－１、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－５、ＰＴＭ－６、及びＰＴＭ－１０の全ての存在は、ＡＤの認知機能低下の予後を有するＭＣＩの指標である。
好ましくは、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法では、ＰＴＭ－５、およびＰＴＭ－９の存在は、ＦＴＤの指標である。
好ましくは、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法では、ＰＴＭ－５、およびＰＴＭ－６の存在は、ＬＢの指標である。
好ましくは、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法では、ＰＴＭ－４、およびＰＴＭ－５の存在は、ＶＤの指標である。
好ましくは、前記生体液は、血液、血漿、血清、唾液、尿、神経細胞、血液細胞または他の細胞である。
好ましい実施形態によれば、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの方法の工程ａ）において、以下のサブステップを実行することにより、ｐ５３タンパク質を生体液サンプル中に捕捉する：
（ｉ）生体液サンプルを提供するステップ；
（ｉｉ）ｐ５３タンパク質と結合する抗体によるタンパク質免疫沈降を行うステップ；
（ｉｉｉ）トリプシンによるタンパク質の断片化を行うステップ。
そして、工程ｂ）は、ＨＰＬＣ－質量分析、ペプチド質量フィンガープリントおよびデータベース検索によって実施される。
好ましい実施形態では、工程ａ）のｐ５３タンパク質は、ミスフォールドした構造にあるＵ－ｐ５３である。
好ましくは、サブステップ（ｉｉ）の抗体は、ｐ５３ペプチドに結合する構造特異的な抗体であり、より好ましくは、モノクローナル／ポリクローナル抗体である。好ましい実施形態において、前記モノクローナル抗体は、抗体２Ｄ３Ａ８である。
２Ｄ３Ａ８抗体のアミノ酸配列は、重鎖（配列番号７）および軽鎖（配列番号８）；重鎖可変領域（配列番号９）および軽鎖可変領域（配列番号１０）；重鎖ＣＤＲ１、２および３（それぞれ配列番号１１、１２および１３）および軽鎖ＣＤＲ１、２および３（それぞれ配列番号１４、１５および１６）を含む。
好ましくは、工程ａ）の生体サンプルは、ステップ（ｉｉ）を行う前に、ＨＰＬＣまたはクロマトグラフィーカラムまたは化学処理によるタンパク質血漿ディプリーション（ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｌａｓｍａ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）に供される。
好ましい実施形態では、本発明の方法の工程ｃ）において、検出されたＰＴＭは、認知症による疾患または認知機能低下の様々な段階の患者において、アルツハイマー病の診断／予後推定と相関する。
好ましくは、工程ｃ）において、検出されたＰＴＭは、無症状者及びＭＣＩを患っている被験者のアルツハイマー病の認知機能低下の予後と相関する。
さらなる態様において、また本発明は、上記のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法の実施に使用する診断キットに関し、該キットは、抗体、タンパク質の消化（好ましくは、Ｌｙｓ Ｃを含む／含まないトリプシン）、抗体により捕捉されたタンパク質を沈殿させる溶出緩衝液、および注入緩衝液を含む免疫沈降を行うための試薬セットを含む。
さらなる態様において、また本発明は、前記被験者からのサンプル中に存在するｐ５３タンパク質（Ｕ－ｐ５３）のアミノ酸１～３７１の領域における翻訳後修飾（ＰＴＭ）のタイプを識別することによって、被験者における神経変性疾患または神経変性疾患の発症を検出する方法に関する。この方法は、以下の工程を包含する：
ａ．Ｕ－ｐ５３のアミノ酸２８２～２９７によって定義されるアミノ酸配列に結合する抗体を用いた免疫沈降に前記サンプルを供する工程；
ｂ．工程（ａ）の前記免疫沈降サンプルをプロテアーゼ消化に供する工程；
ｃ．工程（ｂ）の前記消化サンプル中のｐ５３タンパク質（Ｕ－ｐ５３）のアミノ酸１～３７１の領域における翻訳後修飾（ＰＴＭ）の存在を検出し、ＰＴＭをＰＴＭ－１、ＰＴＭ－２、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５、ＰＴＭ－６、ＰＴＭ－７、ＰＴＭ－８、ＰＴＭ－９、ＰＴＭ－１０およびＰＴＭ－１１として分類する工程。
前記ＰＴＭ－１は前記Ｕ－ｐ５３のアミノ酸Ｍ１にあり、前記ＰＴＭ－２は前記Ｕ－ｐ５３のアミノ酸Ｋ１６４にあり、前記ＰＴＭ－３は前記Ｕ－ｐ５３のアミノ酸Ｋ３７０にあり、前記ＰＴＭ－４は前記Ｕ－ｐ５３のアミノ酸Ｌ１０１にあり、前記ＰＴＭ－５は前記Ｕ－ｐ５３のアミノ酸Ｋ１２０にあり、前記ＰＴＭ－６は前記Ｕ－ｐ５３のアミノ酸Ｋ１３２にあり、前記ＰＴＭ－７は前記Ｕ－ｐ５３のアミノ酸Ｋ１３９にあり、前記ＰＴＭ－８は前記Ｕ－ｐ５３のアミノ酸Ｋ２９１にあり、前記ＰＴＭ－９は前記Ｕ－ｐ５３のアミノ酸Ｋ３５７にあり、前記ＰＴＭ－１０は前記Ｕ－ｐ５３のアミノ酸Ｓ６にあり、そして前記ＰＴＭ－１１は前記Ｕ－ｐ５３のアミノ酸Ｓ３３にある。
ＰＴＭ－１、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５、ＰＴＭ－６、ＰＴＭ－９、およびＰＴＭ－１０から選ばれる少なくとも２つのＰＴＭの存在、ならびにＰＴＭ－２、ＰＴＭ－７、ＰＴＭ－８、およびＰＴＭ－１１から選ばれる少なくとも１つのＰＴＭの存在は、神経変性疾患または神経変性疾患の発症の指標である。
前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、アルツハイマー病（ＡＤ）に至る認知機能低下、軽度認知障害（ＭＣＩ）、ＡＤに至る認知機能低下の予後を有する軽度認知障害（ＭＣＩ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）及び／又はレビー小体型認知症（ＬＢ）、及び血管性認知症（ＶＤ）である。
本発明によれば、好ましくは、前記方法において、前記ＰＴＭ－１は、前記ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｍ１に分岐した基ＣＯ－ＣＨ３を有し；前記ＰＴＭ－２は、前記ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１６４に分岐した基ＣＯ－ＣＨ３を有し；前記ＰＴＭ－３は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ３７０に分岐した基ＣＯ－ＣＨ３を有し；前記ＰＴＭ－４は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１０１に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有し；前記ＰＴＭ－５は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１２０に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］１０を有し；前記ＰＴＭ－６は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１３２に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有し；前記ＰＴＭ－７は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１３９に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有し；前記ＰＴＭ－８は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ２９１に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有し；前記ＰＴＭ－９は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ３５７に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有し；前記ＰＴＭ－１０は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｓ６がリン酸化され；および、前記ＰＴＭ－１１は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｓ３３がリン酸化されている。
好ましくは、前記方法において、工程（ｃ）で検出される前記少なくとも２つのＰＴＭは、ＰＴＭ－１、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５、及びＰＴＭ－６からなる群から選択され、前記検出はアルツハイマー病（ＡＤ）またはＡＤの予後推定の指標である。
好ましくは、前記方法において、工程（ｃ）で検出される前記少なくとも２つのＰＴＭは、ＰＴＭ－１及びＰＴＭ－１０からなる群から選択され、前記検出は、ＭＣＩの指標である。
好ましくは、前記方法において、前記サンプルは、ＡＤの症状を示さない被験者からのものであり、工程（ｃ）で検出された前記少なくとも２つのＰＴＭは、ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５及びＰＴＭ－９からなる群より選択され、前記検出は、ＡＤに至る認知機能の低下の予後の指標である。
好ましくは、前記方法において、工程（ｃ）で検出される前記少なくとも２つのＰＴＭは、ＰＴＭ－１、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－５、ＰＴＭ－６、及びＰＴＭ－１０からなる群から選択され、前記検出は、ＡＤに至る認知機能低下の予後を有するＭＣＩの指標である。
好ましくは、前記方法において、工程（ｃ）で検出される前記少なくとも２つのＰＴＭは、ＰＴＭ－５、及びＰＴＭ－９からなる群から選択され、前記検出はＦＴＤの指標である。
好ましくは、前記方法において、工程（ｃ）で検出される前記少なくとも２つのＰＴＭは、ＰＴＭ－５、及びＰＴＭ－６からなる群から選択され、前記検出はＬＢの指標である。
好ましくは、前記方法において、工程（ｃ）で検出される前記少なくとも２つのＰＴＭは、ＰＴＭ－４、及びＰＴＭ－５からなる群から選択され、前記検出はＶＤの指標である。
好ましくは、前記方法において、前記サンプルは、血液、血漿、血清、唾液、尿、神経細胞からなる群から選択される。
好ましくは、前記方法において、前記プロテアーゼはトリプシンである。
好ましくは、前記方法において、工程（ｃ）の前記検出は、ＨＰＬＣ－質量分析、ペプチド質量フィンガープリント及びデータベース検索のうちの１つ以上によって行われる。
好ましくは、前記方法において、前記抗体はモノクローナル抗体であり、より好ましくは２Ｄ３Ａ８である。
好ましくは、前記方法において、前記サンプルは、工程（ａ）～（ｃ）を行う前に、ＨＰＬＣまたはクロマトグラフィーカラムまたは化学処理によるタンパク質血漿ディプリーションに供される。
さらなる態様において、また本発明は、被験者における神経変性疾患または神経変性疾患の発症を検出するためのキットであって、該キットは免疫沈降を行う試薬セットを含み、前記試薬セットは、Ｕ－ｐ５３のアミノ酸２８２～２９７によって定義されるアミノ酸配列に結合可能な抗ヒトｐ５３抗体を含み、好ましくは、前記抗ヒトｐ５３抗体はモノクローナル抗体であり、より好ましくは、前記モノクローナル抗体は２Ｄ３Ａ８である。
また、本発明のペプチドの好ましい態様の全ての組み合わせ、ならびに上記で報告された、調製方法、キットおよびそれを用いる方法の全ての組み合わせは、本明細書によって開示されると見なされるべきであると理解される。
上記に開示された本発明のＰＴＭ、調製プロセス、キットおよび方法の好ましい態様のすべての組み合わせは、本明細書に記載されていると理解される。
以下、説明の目的で提供される本発明の実施例である。
材料と方法
Ｕ－ｐ５３タンパク質配列とその翻訳後修飾の単離と同定
この解析は、認知障害のない被験者（ＣＵ）、ＡＤや他の認知症（ＦＴＤ、ＬＢ、ＶＤ）の患者、および軽度認知機能低下（ＭＣＩ）を有する個体、ＡＤの認知機能低下の予後を有するＭＣＩ患者（ＡＤに至るＭＣＩ）、および無症状ＡＤの認知機能低下の予後を有する患者（ＡＤに至るＣＵ）の血漿から抽出したＵ－ｐ５３タンパク質の配列とその翻訳後修飾の同定に関する。
サンプル調製
１．緩衝液
－ 緩衝液Ａ：Ｔｒｉｓ ２５ｍＭ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）０．１５ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ－２０ ５０ｍＭ；調製：Ｔｒｉｓ（３０３ｍｇ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ；８８５ｍｇ）、およびＴｗｅｅｎ－２０（５．５ｇ）を得る。最終容量が１００ｍＬになるように再蒸留水を加える。注：溶液は、分析セクションごとに新しく調製する必要がある。
－ 緩衝液Ｂ：グリシン０．１Ｍ ｐＨ２．０。調製：グリシン（７５０ｍｇ）グリシンを再蒸留水で処理する。１００ｍＬの溶液が得られた。ＨＣｌ ０．１Ｍを添加してｐＨ３とする。注：溶液は、分析セクションごとに新しく調製する必要がある。
－ 重炭酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）０．４ｇを１００ｍＬの再蒸留水に可溶化する。注：分析を進める前に、溶液のｐＨを確認する必要がある。消化の再現性を得るために、ｐＨを８未満とする必要がある。
２．試薬の調製
－ ５０ｍＭ ＡｍＢｉｃ中のジチオスレイトール（ＤＴＴ）１８０ｍＭ。手順：ＤＴＴ ０．３ｇを再蒸留水０．５ｍＬに可溶化する。５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）１０ｍＬを加える。ボルテックスを使用して混合物を可溶化する。注：溶液は、分析セクションごとに新しく調製する必要がある。
－ ５０ｍＭ ＡｍＢｉｃ中のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）４００ｍＭ。手順：ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）０．７ｇを、５０ｍＭ 重炭酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）溶液１０ｍＬに可溶化する。ボルテックスを使用して混合物を可溶化する。注：溶液は、分析セクションごとに新しく調製する必要がある。
－ ２５ｎｇ／μＬ トリプシン溶液。手順：２０μｇのトリプシンを８００μＬの５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３で可溶化する。ボルテックスを使用して混合物を可溶化する。注：溶液は、分析セクションごとに新しく調製する必要がある。
３．ビーズ－抗体結合
タンパク質磁気ビーズＬ ５０μＬ（０．５ｍｇ）をバイアルに集める；
１５０μＬの緩衝液Ａを加える。ボルテックスにかける；
磁性体表面を使用し、上清（浮遊する固体の下の液体）を廃棄する。
１ｍＬの緩衝液Ａを加える。ボルテックスに１分間かける；
磁性体表面を使用し、上清を廃棄する；
抗体溶液（２００μＬ、１０μｇに相当する０．０５μｇ／μＬ）をＰｒｏｔｅｉｎＬ磁気ビーズに添加する；
溶液を２時間混合する；
磁性体表面を使用し、上清を廃棄する；
５００μＬの緩衝液Ａを加える；
磁性体表面を使用し、上清を廃棄する；
再度洗って上清を廃棄する。
１ｍＬの緩衝液Ａを加える。
溶液を室温で保存する。
４．血漿の化学汚染物質の除去（ディプリーション）と免疫沈殿
様々なカテゴリの患者から抽出されたサンプルを、層流キャビネット下で、室温で３０分間解凍する。
サンプルを２５μＬのアリコートにスパイクする。これらは別々に処理される。
残りの材料は、再試験の目的で、－２０℃で保存する。
２５μＬの血漿に５μＬのＣＨ３ＣＮを添加する。アセトニトリルの添加は、５０μＬの混合量に達するまで１分ごとに繰り返す。白い沈殿物が観察されるまで、５分間ボルテックスを行う。
サンプルの遠心分離は、１３０００ｇで１０分間行う。４０μＬの上清をビーズ－抗体複合体に加える。ボルテックスを弱くかける。
混合物を室温で１時間、次いで４°で一晩インキュベートする。
磁性体表面を使用して上清を除去する。
５００μＬの緩衝液Ａを加え、混合物をボルテックスした。
磁性面を使用して上清を除去する。
４５μＬの緩衝液Ｂをペレットに添加する。混合後、室温で１０分間インキュベートする。
磁性体表面を使用して、酵素的に消化された溶出液（４０μＬ）を回収する。
５．免疫捕捉したｐ５３タンパク質の酵素消化
２．１５μｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ）１８０ｍＭを４０μＬの溶出液に添加する。
混合物を５０℃で１５分間、室温で３０分間インキュベートする；
２．１５μｌのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）４００ｍＭを４２．１５μＬの混合物に加える。
得られた混合物を室温で１５分間インキュベートする。
得られた混合物４４．３０μＬに、２．１５μＬのＡｍＢｉｃ ５０ｍＭを加える。
得られた混合物４６．４５μＬに、Ｌｙｓ－ｃ（５０ｎｇ／μＬ）とＡｍＢｉｃ ５０ｍＭを含むトリプシン（２５ｎｇ／μＬ）１μＬを加える。
インキュベーションは３７℃で３．５時間、その後５７℃で３０分間行う。
４７．４５μＬの得られた混合物に、１μＬのギ酸（ＨＣＯＯＨ）を加えて、酵素消化を停止する。ｐＨ値を確認し、１～４の範囲内にする。４より高い場合は、１～４の間のｐＨ値になるように、段階的にギ酸（１μＬ）を添加する。１０μＬの得られたサンプルを分析する。
６．ＬＣ－ＳＡＣＩ－ＭＳによるＰＴＭの検出
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ＰＦＰ ５０×４．１ｍｍ ２．６μｍを備えたＨＰＬＣ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、米国）を使用して、クロマトグラフィー分析を実行する。バイナリグラジエントを使用する：Ａ相（Ｈ２Ｏ＋０．２％ ギ酸（ＨＣＯＯＨ））およびＣ相 アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）。グラジエントは下記表で報告する。１０μＬのサンプルを注入する。
ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬをデータ取得に使用する。ＳＡＣＩイオン化源を採用する。ポテンシャル面は４７Ｖ、ガスネブライザーの圧力は７５Ｐｓｉ、乾燥ガス流量は１．０Ｌ／分である。３５０℃のネブライザー温度と、３２０℃のドライガス温度を併用した。ＳＡＣＩペプチド付加プロファイルモードがデータ取得に採用されている（Ｃｒｉｓｔｏｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００３；１７（１７）：１９７３－８１）。
Figure 2023536162000001
７．データ抽出とタンパク質の特性評価
タンパク質配列とＰＴＭデータは、ボトムアップ条件で動作するＳＡＮＩＳＴ－ｐｒｏｔツールを使用して取得する。
ｐ５３配列ペプチドとＡＤ診断との相関
ＡＤ患者７名、認知障害のない被験者（ＣＵ）５名、ＭＣＩ患者２名、前頭葉型認知症（ＦＤ）患者６名、血管性認知症（ＶＤ）１名、レビー小体型認知症（ＬＢ）患者１名、並びに、ＡＤに至るＭＣＩ患者６名およびＡＤに至るＣＵ患者６名の血漿サンプルを、上記開示のタンパク質ｐ５３を単離するために、タンパク質Ｌベースの実験プロトコルにより処理した。このタンパク質は、ペプチドを最大限に回収するために、二重酵素消化（Ｌｙｓ－Ｃ＋トリプシン）を受けた。
Figure 2023536162000002
＊サンプルＩＤは、サンプルのラベル付けに使用される単なるコードであり、対応する患者のその後の診断とは相関しない。
得られた結果
１．ＡＤ被験者から免疫捕捉したＵ－ｐ５３タンパク質
個々のＡＤから抽出されたｐ５３タンパク質は、ｗｔ ｐ５３タンパク質（配列番号１）に対して、アミノ酸１～２４８の領域でトランケーションされた結果となる（データベース：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ，Ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：Ｐ０４６３７，アミノ酸数：１～３９３）。酵素消化のさまざまな間違いが報告されている。これは、トランケーションされたタンパク質の残基２４９～３７１の間に、被験者間で可変領域が存在することにつながる。
表２に、ＡＤ患者において同定されたｐ５３直鎖状配列とそれぞれの分子量（ＭＷ）を報告する。
Figure 2023536162000003
２．認知障害のない被験者（ＣＵ）とＡＤに至る認知障害のない患者から免疫捕捉されたＵ－ｐ５３
５名の認知障害のない患者と、後にＡＤに至った６名の認知障害のない患者から抽出したｐ５３の直鎖配列は、１～３７１アミノ酸の全配列（配列番号６）に対応し、分子量は４１１３４Ｄａであった。３７２～３９１の領域に対応する残基は確認されていない。表３は、認知障害のない患者と、ＡＤに至る認知障害のない患者から得られた直鎖配列を報告する。
Figure 2023536162000004
３．前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、血管性認知症、軽度認知機能低下（ＭＣＩ）、ＡＤに至るＭＣＩの被験者から免疫捕捉されたＵ－ｐ５３蛋白質
被験者１６名（前頭側頭型認知症６名、血管性認知症１名、レビー小体型認知症１名、ＭＣＩ被験者２名、及びＡＤを発症したＭＣＩ ６名）から得られた結果は、１～３７１残基の全タンパクの存在を報告した。表４は、被験者のタンパク質直鎖配列を報告する。
Figure 2023536162000005
４．免疫捕捉されたタンパク質で観察されたＰＴＭの説明
様々な臨床グループから抽出され配列決定されたｐ５３タンパク質は、様々な分子量に従って対応する様々な直鎖配列に加えて、主に特定のアミノ酸残基のユビキチン化、アセチル化、およびリン酸化を特徴とする翻訳後修飾（ＰＴＭ）を示した。また、同じ臨床グループに属するサンプルは、ＰＴＭの均一性が高く、同じタンパク質配列との組み合わせで、属する臨床グループを特徴づける要素を示す。
図１～８に、観察されたユビキチン化部位を報告する。
４．１．ＡＤ被験者
ＡＤ患者では、アミノ酸領域１～２４８に属する発現量の少ないペプチド配列が検出された。その存在量の少なさから、抗体との相互作用が弱いと考えられているｐ５３タンパク質の全配列に由来する可能性がある。このタンパク質配列は、図１において「＊」の表記で示されるいくつかのユビキチン化部位を有する。
４．２．認知障害のない（ＣＵ）被験者
認知障害のないサンプルで検出されたユビキチン化部位を図２に報告する。
４．３．前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）に罹患した被験者
ＦＴＤサンプルで検出されたユビキチン化部位を図３に報告する。
４．４．レビー小体型認知症（ＬＢ）に罹患した被験者
ＬＢサンプルで検出されたユビキチン化部位を図４に報告する。
４．５．血管性認知症（ＶＤ）に罹患した被験者
ＶＤのサンプルで検出されたユビキチン化部位を図５に報告する。
４．６．ＭＣＩに罹患した被験者
ＭＣＩのサンプルで検出されたユビキチン化部位を図６に報告する。
４．７．ＡＤを発症した認知障害のない被験者（ＣＵ）のサンプル
１８～７２ヶ月間にわたってＡＤを発症した認知機能のある健常者のサンプルで検出されたタンパク質のユビキチン化部位を図７に示す。
４．８．ＡＤを発症したＭＣＩ被験者のサンプル
ＡＤを発症したＭＣＩ被験者で検出されたユビキチン化部位を図８に報告する。
得られたデータから、タンパク質の全配列にわたって累積で１１個のＰＴＭがあったことが観察できる。すべてのサンプルで、３７１残基までのタンパク質にわたるペプチドが検出されたが、ＡＤ患者の１～２４８残基の領域に属するペプチドは、分析プロトコルによる酵素消化の結果ではなく、ｐ－５３タンパク質全体の生物学的プロセスによってタンパク質から切断されたようであった。ｐ－５３タンパク質の３７２から末端までの領域のアミノ酸は、様々な臨床グループに属するすべてのサンプルで欠落していた。
様々な患者で観察されたＰＴＭを表５に開示する（Ｙ＝検出、Ｎ＝非検出）。
Figure 2023536162000006

Claims (10)

  1. 神経変性疾患の診断または予後推定のためのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、以下の工程を含み：
    ａ）ｐ５３タンパク質（Ｕ－ｐ５３）のアミノ酸１～３７１の領域における翻訳後修飾（ＰＴＭ）の存在について生体液サンプルを分析する工程であって、
    前記ＰＴＭは以下の通りであり：
    アミノ酸Ｍ１におけるＰＴＭ－１；
    アミノ酸Ｋ１６４におけるＰＴＭ－２；
    アミノ酸Ｋ３７０におけるＰＴＭ－３；
    アミノ酸Ｌ１０１におけるＰＴＭ－４；
    アミノ酸Ｋ１２０におけるＰＴＭ－５；
    アミノ酸Ｋ１３２におけるＰＴＭ－６；
    アミノ酸Ｋ１３９におけるＰＴＭ－７；
    アミノ酸Ｋ２９１におけるＰＴＭ－８；
    アミノ酸Ｋ３５７におけるＰＴＭ－９；
    アミノ酸Ｓ６におけるＰＴＭ－１０；
    アミノ酸Ｓ３３におけるＰＴＭ－１１；
    ＰＴＭ－２、ＰＴＭ－７、ＰＴＭ－８、およびＰＴＭ－１１から選択される少なくとも２つのＰＴＭの存在が、認知障害のない被験者（ＣＵ）の指標となる工程；
    ｂ）神経疾患の発生または発症リスクの指標として、以下の存在：
    － ＰＴＭ－１、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５、ＰＴＭ－６、ＰＴＭ－９、およびＰＴＭ－１０から選択される少なくとも２つのＰＴＭ；および
    － ＰＴＭ－２、ＰＴＭ－７、ＰＴＭ－８、およびＰＴＭ－１１から選択される少なくとも１つのＰＴＭ；
    を評価する工程であって、
    前記神経変性疾患が、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、レビー小体（ＬＢ）、および血管性認知症（ＶＤ）から選択される工程；
    ｃ）工程ｂ）で評価されたＰＴＭを、対応する神経変性疾患を同定する指標と関連付ける工程であって、
    ＰＴＭ－１、及びＰＴＭ－１０の存在は、ＭＣＩの指標であり；
    ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５及びＰＴＭ－９から選択される少なくとも２つのＰＴＭの存在は、無症状の被験者のＡＤに至る認知機能の低下の予後の指標であり；
    ＰＴＭ－１、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－５、ＰＴＭ－６、及びＰＴＭ－１０から選択される少なくとも２つのＰＴＭの存在は、ＡＤに至る認知機能低下の予後を有するＭＣＩの指標であり；
    ＰＴＭ－５、およびＰＴＭ－９の存在は、ＦＴＤの指標であり；
    ＰＴＭ－５、およびＰＴＭ－６の存在は、ＬＢの指標であり；
    ＰＴＭ－４、およびＰＴＭ－５の存在は、ＶＤの指標である；
    または、
    前記ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法が、アルツハイマー病を、他の神経変性疾患から識別するための方法であって、
    工程ｂ）において、以下の基準の評価がＡＤの指標である方法：
    － アミノ酸１～２７１の領域内の長さに関する配列変動性であって、同一領域内のトランケーションを含む、前記変動性；および
    － トランケーションされていない配列の残存量におけるＰＴＭ－１、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５、およびＰＴＭ－６から選択される少なくとも２つのＰＴＭの存在。
  2. 請求項１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、
    － 翻訳後修飾ＰＴＭ－１は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｍ１に分岐した基ＣＯ－ＣＨ３を有し；
    － 翻訳後修飾ＰＴＭ－２は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１６４に分岐した基ＣＯ－ＣＨ３を有し；
    － 翻訳後修飾ＰＴＭ－３は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ３７０に分岐した基ＣＯ－ＣＨ３を有し；
    － 翻訳後修飾ＰＴＭ－４は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１０１に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有し；
    － 翻訳後修飾ＰＴＭ－５は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１２０に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有し；
    － 翻訳後修飾ＰＴＭ－６は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１３２に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有し；
    － 翻訳後修飾ＰＴＭ－７は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ１３９に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有し；
    － 翻訳後修飾ＰＴＭ－８は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ２９１に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有し；
    － 翻訳後修飾ＰＴＭ－９は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｋ３５７に分岐したユビキチン化部位［ＧＧ］を有し；
    － 翻訳後修飾ＰＴＭ－１０は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｓ６がリン酸化されており；
    － 翻訳後修飾ＰＴＭ－１１は、ｐ５３タンパク質のアミノ酸Ｓ３３がリン酸化されている、方法。
  3. 請求項１または２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、
    前記ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法が、アルツハイマー病を、他の神経変性疾患から識別するための方法であり、
    工程ｂ）において、以下の基準の評価がＡＤの指標である方法：
    － アミノ酸１～２７１の領域内の長さに関する配列変動性であって、同一領域内のトランケーションを含む、前記変動性；および
    － ＰＴＭ－１、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５、およびＰＴＭ－６の全ての存在。
  4. ＰＴＭ－４、ＰＴＭ－５及びＰＴＭ－９の全ての存在が、無症状の被験者のＡＤに至る認知機能の低下の予後の指標である、請求項１または２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法。
  5. ＰＴＭ－１、ＰＴＭ－３、ＰＴＭ－５、ＰＴＭ－６、及びＰＴＭ－１０の全ての存在が、ＡＤに至る認知機能低下の予後を有するＭＣＩの指標である、請求項１または２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法。
  6. 前記生体液が、血液、血漿、血清、唾液、尿、神経細胞、好ましくは血液、特に血漿である、請求項１～５のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、
    工程ａ）において、以下のサブステップを実行することにより、ｐ５３タンパク質を生体液サンプル中で捕捉し：
    （ｉ）生体液サンプルを提供するステップ；
    （ｉｉ）ｐ５３タンパク質と結合する抗体によるタンパク質免疫沈降を行うステップ；
    （ｉｉｉ）トリプシンによるタンパク質の断片化を行うステップ；
    工程ｂ）が、ＨＰＬＣ－質量分析、ペプチド質量フィンガープリントおよびデータベース検索によって実施される、方法。
  8. サブステップ（ｉｉ）の免疫沈降が、ｐ５３ペプチドに結合するモノクローナル抗体／ポリクローナル抗体を用いて実施され、好ましくは前記モノクローナル抗体が、抗体２Ｄ３Ａ８である、請求項７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法。
  9. 工程ａ）の生体サンプルが、ステップ（ｉｉ）を行う前に、ＨＰＬＣまたはクロマトグラフィーカラムまたは化学処理によるタンパク質血漿ディプリーション（ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｌａｓｍａ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）に供される、請求項７または８に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法を実施するための診断キットの使用であって、
    該キットが、抗体、タンパク質の消化（好ましくは、Ｌｙｓ Ｃを含む／含まないトリプシン）、抗体により捕捉されたタンパク質を沈殿させる溶出緩衝液、および注入緩衝液を含む免疫沈降を行うための試薬セットを含む、使用。
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