KR20230042506A - 신경퇴행성 질환의 진단 및 예후에서 마커로서의 p53 번역후 변형 - Google Patents

신경퇴행성 질환의 진단 및 예후에서 마커로서의 p53 번역후 변형 Download PDF

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Abstract

본 발명은, p53 서열 및 번역후 변형(PTM), 및 신경퇴행성 질환 및 인지 저하의 진단 및/또는 상이한 단계에서의 알츠하이머병의 예후 및/또는 생물학적 샘플에서 신경퇴행성 질환의 예후에서의 바이오마커로서의 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 1) 상기 p53 선형 서열 단백질에 대한 PTM 및 환자의 인간 혈장에서 이의 전체 서열의 절두 가능성을 특이적으로 평가함으로써 대상체에서 경도 인지 장애(Mild Cognitive Impairment; MCI), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 전두측두엽 치매(fronto-temporal dementia; FTD), 루이 소체(Lewi's Body; LB) 및 혈관성 치매(vascular dementia; VD)를 포함하는 신경퇴행성 질환의 진단을 위한 고정밀 질량 분석에 기반한 진단 방법; 및 2) CU 및 MCI 환자에서 AD의 예후를 제공한다.

Description

신경퇴행성 질환의 진단 및 예후에서 마커로서의 p53 번역후 변형
본 발명은, p53 서열 및 번역후 변형(post-translation modification; PTM), 및 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease) 및 알츠하이머병(Alzheimer's disease)에 대한 인지 저하 및 알츠하이머병의 진단 및/또는 상이한 단계에서의 알츠하이머병의 예후 및/또는 생물학적 샘플에서 신경퇴행성 질환의 예후에서 바이오마커로서의 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 생체액 샘플(biofluid sample)에서 상기 p53 선형 서열 단백질에 대한 변화(PTM)를 특이적으로 평가함으로써 경도 인지 장애(Mild Cognitive Impairment; MCI), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 전두측두엽 치매(fronto-temporal dementia; FTD), 루이 소체(Lewi's Body; LB) 및 혈관성 치매(vascular dementia; VD)를 포함하는 신경퇴행성 질환의 진단을 위한 고정밀도 질량 분석에 기반한 진단 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 생체액 샘플에서 p53 단백질의 선형 서열에 대한 상기 PTM의 변화를 특이적으로 평가함으로써 무증상 및 전구 단계(MCI)에서 알츠하이머병(AD)의 예후를 위한 고정밀도 질량 분석에 기반한 진단 방법을 제공한다.
알츠하이머병(단축하여 "AD")에 대한 초기 위험 인자로서 대량의 변화된 입체구조 p53 이소형(isoform)의 존재에 대한 확인은 상이한 공개된 연구에서 입증되었다[1-3]. 초기에, 알츠하이머병, 경도 인지 장애, 파킨슨병(Parkinson Disease), 기타 치매(Dementia) 및 건강한 대상체 중 400명 이상의 대상체가 상이한 독립적 연구에 등록되었고, 상업적 형태의 특이적 항-p53 항체에 의한 상이한 기술(면역침전(immunoprecipitation) 실험, FACS 분석, ELISA)을 사용하여 비폴딩된 p53에 대해 시험되었다[4-7]. 2006년에, 처음으로 우베르티 등(Uberti et al. [8])은 산발성 알츠하이머병(AD) 환자로부터의 섬유아세포가, 이들 세포를 연령-정합 비-AD 대상체의 섬유아세포로부터 구별하는, p53의 비정상 및 검출가능한 입체배좌 상태를 특이적으로 발현한다는 것을 입증했다. 이러한 구조적 변화된 상태에서, p53은 이의 표적 유전자를 트랜스활성화하는 능력을 상실하고, 결과적으로 이의 생물학적 기능을 상실했다[9-10]. 비폴딩된 p53의 보다 많은 양은 또한, 기타 치매 및 PD에 의해 영향을 받은 건강한-비치매 대상체 또는 환자와 비교하여, AD의 혈액, 게다가 AD로 전환된 MCI에서 확인되었다.
전체적으로, 이러한 데이터는 비폴딩된 p53과 AD 병리학 사이의 직접적 연관성을 시사했다.
EP3201234B1에서, 2D3A8이라는 명칭의 신규한 입체배좌 특이적 항-Up53 항체의 개발이 보고되었고, 이는 에피토프(aa 282-297)에 결합하고, p53이 비폴딩된 표현형에 대한 이의 야생형 입체구조를 상실하는 경우에만 접근가능하다. AD에서 발견되는 비폴딩된 p53의 개시에 사용된 시판 항체(PAb240, aa214-217)와 비교할 때, 2D3A8 항체는 오비에도(Oviedo) 코호트에서 건강한 고령자와 비교하여 AD 환자를 동정(identifying)할 때에 더 높은 민감도와 특이성을 나타냈다.
특히, 상기 면역진단 방법은, AD를 나타내는 생물학적 샘플에서 면역복합체를 동정할 수 있고, 경도 인지 장애(MCI)에 의해 영향을 받아 AD를 발증하는 대상체의 소인을 결정할 수 있다.
PCT/IB2019/051785는, 알츠하이머병에 의해 영향을 받은 환자 또는 AD의 발증에 소인으로 될 수 있는 증상을 갖는 환자의 인간 혈장에서 질량 분광 분석에 의해 검출되는, "P1" 및 "P2"로 표시된 특정 p53 펩티드의 수준의 동정 및 정량화에 기반한 방법을 개시한다.
현재, 알츠하이머병의 진단 및/또는 예후에 사용될 수 있는 신규한 특이적 생물학적 마커를 동정하고, 특히 질환의 전임상 및 전조 단계에서 AD의 진단 및/또는 예후 및 전두측두엽 치매, 루이 소체 치매(Levy Body dementia) 및 혈관성 치매 등의 기타 형태의 치매로부터 AD의 차등 분석에 사용될 수 있는 정확하고 현명한 진단 방법을 개발할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은, 아미노산 1-371의 영역 내의 p53 단백질의 아미노산 서열에서 11개의 주요 번역후 변형(PTM)(본 명세서에서 PTM-1, PTM-2, PTM-3, PTM-4, PTM-5, PTM-6, PTM-7, PTM-8, PTM-9, PTM-10, PTM-11로 지칭됨) 및/또는 p53 단백질의 일부 절두된 형태(truncated form)를 생체액 샘플에서 동정함으로써 달성되었다.
따라서, 본 발명의 측면은 상이한 형태의 치매 및 인지 저하의 진단 및/또는 상이한 단계에서의 알츠하이머병의 예후에 사용하기 위한 상기 PTM의 동정에 기초한 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명의 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명 및 예시 목적을 위해 제공된 작업 실시예 및 첨부된 도면으로부터 명백해질 것이다:
도 1. 알츠하이머병의 영향을 받은 대상체의 샘플에서 검출된 단백질 유비퀴틴화 부위(ubiquitination site).
도 2. 대조군 샘플(CU)에서 검출된 단백질 유비퀴틴화 부위.
도 3. 전두엽 치매(FTD)의 영향을 받은 대상체의 샘플에서 검출된 단백질 유비퀴틴화 부위.
도 4. 루이 소체 치매(Lewy Body's diemntia; LB)의 영향을 받은 대상체의 샘플에서 검출된 단백질 유비퀴틴화 부위.
도 5. 혈관성 치매(vascular dementia; VD)의 영향을 받은 대상체의 샘플에서 검출된 단백질 유비퀴틴화 부위.
도 6. 경도 인지 장애(mild cognitive disorder; MCI)의 영향을 받은 대상체의 샘플에서 검출된 단백질 유비퀴틴화 부위.
도 7. 적어도 18개월에 걸쳐 AD를 발증한 인지적으로 건강한 대상체(CU)의 샘플에서 검출된 단백질 유비퀴틴화 부위.
도 8. AD 발증한 MCI 그룹의 대상체의 샘플에서 검출된 단백질 유비퀴틴화 부위.
도면에 보고된 서열은 서열번호 1의 선형 서열에 상응한다.
정의
용어 "U-p53"은 p53 단백질의 아미노산 1-371의 영역을 나타내는 것을 의미하고, 이는 하기 기재된 선형 단백질 서열 상에서 번역후 변형(PTM) 및 일부 경우에 또한 절두를 포함한다.
용어 "p53"은 데이터베이스 "UniProtKB, 단백질 ID: P04637, 아미노산: 1 내지 393"에 따른 야생형 단백질 p53을 의미한다.
용어 "신경퇴행성 질환"은 인간 뇌의 뉴런에 주로 영향을 미치는 다양한 상태를 나타내는 것을 의미하고, 경도 인지 장애(Mild Cognitive Impairment; MCI), 전두측두엽 치매(fronto-temporal dementia; FTD), 루이 소체(Lewi's Body; LB) 및 혈관성 치매(vascular dementia; VD), 뿐만 아니라 상이한 단계의 상기 신경퇴행성 질환 및 치매에 대한 인지 저하, 및 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD)(전임상 및 전구 단계를 포함)을 포함한다.
발명의 상세한 설명
따라서, 본 발명은, 신경퇴행성 질환의 진단을 위한 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 방법에서 바이오마커로서 사용될 수 있는, 매우 정확한 질량 분광법에 의해 검출된 p53 번역후 변형의 조합에 관한 것이다. 상기 방법은, "PTM"으로 간단히 지칭되는 이의 선형 서열과 비교하여, 특정 p53 변형의 동정에 기초하고, 이는 알츠하이머병의 영향을 받은 환자, 또는 AD의 발증 또는 상이한 형태의 치매에 대해 소인으로 될 수 있는 증상을 갖는 환자로부터 유래하는 생체액 샘플에서 질량 분광 분석에 의해 검출될 수 있다.
특히, 첫째, p53 단백질은 알츠하이머병의 전임상, 전구 임상 단계의 환자, 경도 인지 장애(MCI) 안정한 환자 및 인지 무손상된 대상체(cognitive unimpaired subject; CU), 전두측두엽 치매(FD), 혈관성 치매(VD) 및 루이 소체 치매(LB)로부터의 생체액 샘플에서 면역침전에 의해 포획된다. 이어서, 포획된 단백질의 번역후 변형은 고감도 선택적 질량 분석법을 사용한 단백질 서열분석에 의해 동정된다. 서열분석 후, 번역후 변형은 문헌에 이미 기재된 변형을 확인하기 위해 데이터베이스 검색에 의해 동정된다.
이어서, 각 샘플에 대해 수득된 데이터는 "PTM 및 진단" 사이의 상관관계를 나타내는 동일한 임상 증거를 갖는 대상체로부터의 생체액 샘플에서 검출된 PTM과 비교되고, 따라서 U-p53 PTM이 신경퇴행성 질환의 예후 및 진단에서 매우 신뢰할 수 있는 바이오마커로서 간주될 수 있다는 강력한 증거를 입증한다.
상기 방법은 유리하게는 신속하며, 소량의 생체액 샘플을 필요로 하고, 분석된 각 샘플에서 U-p53 PTM을 확실하게 동정한다.
추가로, 동정된 방법 및 바이오마커는 무증상 개인 및 MCI를 앓고 있는 사람들의 알츠하이머병의 진단 및 예후에도 사용될 수 있고, 따라서 진단 시장에의 접근을 가능하게 한다.
추가로, 동정된 방법 및 바이오마커는 치매 환자에서 LB, VD, FTD 등의 기타 형태의 치매로부터 알츠하이머병을 구별하기 위해서도 사용될 수 있다. 사실, 하기에서 볼 수 있듯이, 알츠하이머병의 영향을 받은 환자의 생체액 샘플 중의 U-p53 단백질 서열은 아미노산 1-271의 영역 내에서 길이 측면에서 가변성을 나타내며, 이러한 가변성은 동일한 영역 내의 절두를 포함한다. 상기 가변성 및 절두는, 동일한 것이 기타 형태의 치매의 영향을 받은 환자의 생체액 샘플에서는 검출되지 않고, 인지 무손상된 대상체에서는 훨씬 적게 검출되기 때문에, 알츠하이머병에 독특한 것임을 인식해야 한다. 동시에, 생체액 샘플에 잔류하는 U-p53의 양은 이의 서열 길이를 유지하고, 여기서 알츠하이머병의 독특한 PTM이 검출된다. 그 결과, 알츠하이머병의 영향을 받은 환자는, 전자가 U-p53 단백질 서열에서의 절두, 및 비절두된 U-p53 단백질의 잔류량에서 독특한 PTM 둘 다를 나타내는 한, 기타 치매 환자로부터 명확하게 동정되고 구별된다.
또한, 상기 바이오마커는 무증상 및 MCI 대상체의 알츠하이머성 치매에 대한 인지 저하의 예후 및 치매로서의 신경퇴행성 질환의 진단에 사용될 수 있기 때문에, 상기 방법은 유리하게는, U-p53 PTM을 사용하여 임상 시험에서 대상체를 선택하여 시험의 성공을 가능하게 하고, AD의 영향을 받은 환자를 LB, VD, FTD 등의 기타 형태의 치매로부터 구별할 수 있게 한다.
따라서, 본 발명은, 신경퇴행성 질환의 진단 또는 예후를 위한 시험관내 또는 생체외 방법으로서, 상기 방법은
a) p53 단백질(U-p53)의 아미노산 1-371의 영역에서 번역후 변형(PTM)의 존재에 대해 생체액 샘플을 분석하는 단계로서, 상기 PTM은
아미노산 M1에서의 PTM-1,
아미노산 K164에서의 PTM-2,
아미노산 K370에서의 PTM-3,
아미노산 L101에서의 PTM-4,
아미노산 K120에서의 PTM-5,
아미노산 K132에서의 PTM-6,
아미노산 K139에서의 PTM-7,
아미노산 K291에서의 PTM-8,
아미노산 K357에서의 PTM-9,
아미노산 S6에서의 PTM-10,
아미노산 S33에서의 PTM-11이고,
여기서, PTM-2, PTM-7, PTM-8 및 PTM-11로부터 선택된 적어도 2개의 PTM의 존재는 인지 무손상된 대상체(CU)를 나타내는, 단계,
b) 신경계 질환(neurological disease)의 발생 또는 발증(development) 위험의 지표로서,
- PTM-1, PTM-3, PTM-4, PTM-5, PTM-6, PTM-9 및 PTM-10으로부터 선택된 적어도 2개의 PTM, 및
- PTM-2, PTM-7, PTM-8 및 PTM-11로부터 선택된 적어도 하나의 PTM
의 존재를 평가하는 단계로서, 상기 신경퇴행성 질환은 경도 인지 장애(Mild Cognitive Impairment; MCI), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 전두측두엽 치매(Fronto-temporal dementia; FTD), 루이 소체(Lewi's Body; LB) 및 혈관성 치매(vascular dementia; VD)로부터 선택되는, 단계,
c) 단계 b)에서 평가된 PTM을 상응하는 신경퇴행성 질환을 동정하는 PTM과 상관시키는 단계를 포함하는, 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는 시험관내 또는 생체외 방법에서:
- 번역후 변형 PTM-1은 p53 단백질의 아미노산 M1에 분지된 그룹 CO-CH3를 갖고;
- 번역후 변형 PTM-2는 p53 단백질의 아미노산 K164에 분지된 그룹 CO-CH3를 갖고;
- 번역후 변형 PTM-3은 p53 단백질의 아미노산 K370에 분지된 그룹 CO-CH3를 갖고;
- 번역후 변형 PTM-4는 p53 단백질의 아미노산 K101에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고;
- 번역후 변형 PTM-5는 p53 단백질의 아미노산 K120에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고, 여기서 [GG]는 "글리신"의 2개 잔기의 측쇄를 나타내고;
- 번역후 변형 PTM-6은 p53 단백질의 아미노산 K132에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고;
- 번역후 변형 PTM-7은 p53 단백질의 아미노산 K139에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고;
- 번역후 변형 PTM-8은 p53 단백질의 아미노산 K291에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고;
- 번역후 변형 PTM-9는 p53 단백질의 아미노산 K357에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고;
- 번역후 변형 PTM-10은 p53 단백질의 아미노산 S6에서 인산화(phosphorylation)를 갖고;
- 번역후 변형 PTM-11은 p53 단백질의 아미노산 S33에서 인산화를 갖는다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 시험관내 또는 생체외 방법은 치매 환자의 LB, VD, FTD 등의 기타 형태의 치매로부터 알츠하이머병을 구별하기 위한 것이다. 실제로, 상기에서 언급한 바와 같이, 하기 기준의 평가는 AD를 나타낸다:
- 아미노산 1-271의 영역 내에서 길이 측면에서, 동일한 영역 내의 절두를 포함하는 서열 가변성(sequence variability), 및
- 잔류량의 비절두된 서열(untruncated sequence)에서, PTM-1, PTM-3, PTM-4, PTM-5 및 PTM-6으로부터 선택되는 적어도 2개의 PTM의 존재, 바람직하게는 모든 PTM-1, PTM-3, PTM-4, PTM-5 및 PTM-6의 존재.
주로 생물학적 반응으로 인해, 상기 절두는 상기 잔류량의 비절두된 서열에서 PTM의 검출가능성에 영향을 미치지 않는다.
상기에서 언급한 바와 같이, 기타 형태의 치매에 의해 영향을 받은 환자의 생체액 샘플에서는 동일한 것이 검출되지 않기 때문에, 상기 가변성 및 절두는 알츠하이머병의 톡특한 것임을 이해해야 한다. 동시에, 생체액 샘플에서 잔류량의 U-p53은 이의 서열 길이를 유지하고, 여기서 알츠하이머병의 독특한 PTM이 검출된다. 따라서, 전자가 U-p53 단백질 서열의 절두 및 잔류량의 비절두된 U-p53 단백질의 독특한 PTM 둘 다를 나타내는 한, 알츠하이머병의 영향을 받은 환자는 다른 치매 환자와 명확하게 동정되고 구별된다.
바람직하게는, 본 발명의 시험관내 또는 생체외 방법에서, 모든 PTM-2, PTM-7, PTM-8 및 PTM-11의 존재는 인지 무손상된 대상체(CU)를 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명의 시험관내 또는 생체외 방법에서, PTM-1 및 PTM-10의 존재는 MCI를 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명의 시험관내 또는 생체외 방법에서, PTM-4, PTM-5 및 PTM-9로부터 선택된 적어도 2개의 PTM의 존재, 보다 바람직하게는 모든 PTM-4, PTM-5 및 PTM-9의 존재는 알츠하이머 치매(AD)의 인지 저하의 예후를 갖는 무증상 대상체(asymptomatic subject)를 나타낸다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은, 양쪽 대상체가 정식으로 무증상이고 따라서 종래의 인지 시험을 통해 서로 구별할 수 없더라도, 알츠하이머 치매의 인지 저하의 예후를 갖는 무증상 대상체로부터 인지 무손상 대상체(CU)를 동정하고 구별할 수 있게 한다는 것을 이해해야 한다.
바람직하게는, 본 발명의 시험관내 또는 생체외 방법에서, PTM-1, PTM-3, PTM-5, PTM-6 및 PTM-10으로부터 선택되는 적어도 2개의 PTM의 존재, 보다 바람직하게는 모든 PTM-1, PTM-3, PTM-5, PTM-6 및 PTM-10의 존재는 AD의 인지 저하의 예후를 갖는 MCI를 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명의 시험관내 또는 생체외 방법에서, PTM-5 및 PTM-9의 존재는 FTD를 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명의 시험관내 또는 생체외 방법에서, PTM-5 및 PTM-6의 존재는 LB를 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명의 시험관내 또는 생체외 방법에서, PTM-4 및 PTM-5의 존재는 VD를 나타낸다.
바람직하게는, 상기 생체액은 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 신경 세포, 혈액 세포 또는 기타 유형의 세포이다.
바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명의 시험관내 또는 생체외 방법의 단계 a)에서, p53 단백질은 하기의 하위 단계:
(i) 생체액 샘플을 제공하는 단계;
(ii) p53 단백질에 결합하는 항체에 의해 단백질 면역침전을 수행하는 단계;
(iii) 트립신에 의한 단백질 단편화(protein fragmentation)를 수행하는 단계를 수행함으로써 생체액 샘플에 포획되고,
단계 b)는 HPLC-질량 분석, 펩티드 질량 핑거프린트(Peptide Mass Fingerprint) 및 데이터베이스 검색에 의해 수행된다.
바람직한 실시형태에서, 단계 a)의 p53 단백질은 잘못 폴딩된 입체구조의 U-p53이다.
바람직하게는, 하위 단계 (ii)의 항체는 p53 펩티드에 결합하는 입체구조적으로 특이적 항체이고, 더욱 바람직하게는 모노클로날/폴리클로날 항체(monoclonal/polyclonal antibody)이다. 바람직한 실시형태에서, 상기 모노클로날 항체는 항체 2D3A8이다.
2D3A8 항체의 아미노산 서열은 중쇄(서열번호 7) 및 경쇄(서열번호 8), 중쇄 가변 영역(서열번호 9) 및 경쇄 가변 영역(서열번호 10), 중쇄 CDR 1, 2 및 3(각각 서열번호 11, 12 및 13) 및 경쇄 CDR 1, 2 및 3(각각 서열번호 14, 15 및 16)을 포함한다.
바람직하게는, 단계 a)의 생물학적 샘플은, 단계 (ii)를 수행하기 전에, HPLC 또는 크로마토그래피 컬럼 또는 화학적 처리에 의해 단백질 혈장 고갈(protein plasma depletion)에 적용된다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법의 단계 c)에서, 검출된 PTM은 치매로 인한 질환 또는 인지 저하의 상이한 단계에서 환자의 알츠하이머병의 진단/예후와 상관관계가 있다.
바람직하게는, 단계 c)에서, 검출된 PTM은 무증상 개인 및 MCI를 앓고 있는 대상체에서 알츠하이머병의 인지 저하의 예후와 상관관계가 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 또한 상기 기재된 시험관내 또는 생체외 방법의 수행에 사용되는 진단 키트(diagnostic kit)에 관한 것이고, 상기 키트는, 항체를 포함하는 면역침전, 단백질의 소화(바람직하게는 Lys C의 존재/부재하의 트립신)를 수행하기 위한 시약 세트, 항체에 의해 포획된 단백질을 침전시키기 위한 용출 완충액(elution buffer) 및 주사 완충액을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 또한, 상기 대상체의 샘플에 존재하는 p53 단백질(U-p53)의 아미노산 1-371의 영역에서 번역후 변형(PTM)의 유형을 동정함으로써 대상체에서 신경퇴행성 질환 또는 신경퇴행성 질환의 발증을 검출하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은
a. 상기 샘플을, U-p53의 아미노산 282-297에 의해 정의된 아미노산 서열에 결합하는 항체를 사용한 면역침전에 적용하는 단계;
b. 단계 (a)의 상기 면역침전된 샘플을 프로테아제 소화에 적용하는 단계;
c. 상기 단계 (b)의 소화된 샘플에서 p53 단백질(U-p53)의 아미노산 1-371의 영역에서 번역후 변형(PTM)의 존재를 검출하고, PTM을 PTM-1, PTM-2, PTM-3, PTM-4, PTM-5, PTM-6, PTM-7, PTM-8, PTM-9, PTM-10 및 PTM-11로 분류하는 단계
를 포함하고,
상기 PTM-1은 상기 U-p53의 아미노산 M1에 있고, 상기 PTM-2는 상기 U-p53의 아미노산 K164에 있고, 상기 PTM-3은 상기 U-p53의 아미노산 K370에 있고, 상기 PTM-4는 상기 U-p53의 아미노산 L101에 있고, 상기 PTM-5는 상기 U-p53의 아미노산 K120에 있고, 상기 PTM-6은 상기 U-p53의 아미노산 K132에 있고, 상기 PTM-7은 상기 U-p53의 아미노산 K139에 있고, 상기 PTM-8은 상기 U-p53의 아미노산 K291에 있고, 상기 PTM-9는 상기 U-p53의 아미노산 K357에 있고, 상기 PTM-10은 상기 U-p53의 아미노산 S6에 있고, 상기 PTM-11은 상기 U-p53의 아미노산 S33에 있고,
여기서, PTM-1, PTM-3, PTM-4, PTM-5, PTM-6, PTM-9 및 PTM-10으로부터 선택되는 적어도 2개의 PTM의 존재 및 PTM-2, PTM-7, PTM-8 및 PTM-11로부터 선택되는 적어도 하나의 PTM의 존재는 신경퇴행성 질환 또는 신경퇴행성 질환의 발증을 나타내고,
여기서, 상기 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병, 알츠하이머병(AD)에 대한 인지 저하, 경도 인지 장애(MCI), AD에 대한 인지 저하의 예후를 갖는 경도 인지 저하(MCI), 전두측두엽 치매(FTD), 및/또는 루이 소체 치매(LB) 및 혈관성 치매(VD)이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는 상기 방법에서, 상기 PTM-1은 p53 단백질의 아미노산 M1에 분지된 그룹 CO-CH3를 갖고; 상기 PTM-2는 p53 단백질의 아미노산 K164에 분지된 그룹 CO-CH3를 갖고; 상기 PTM-3은 p53 단백질의 아미노산 K370에 분지된 그룹 CO-CH3를 갖고; 상기 PTM-4는 p53 단백질의 아미노산 K101에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고; 상기 PTM-5는 p53 단백질의 아미노산 K120에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고; 상기 PTM-6은 p53 단백질의 아미노산 K132에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고; 상기 PTM-7은 p53 단백질의 아미노산 K139에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고; 상기 PTM-8은 p53 단백질의 아미노산 K291에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고; 상기 PTM-9는 p53 단백질의 아미노산 K357에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고; 상기 PTM-10은 p53 단백질의 아미노산 S6에서 인산화를 갖고; 상기 PTM-11은 p53 단백질의 아미노산 S33에서 인산화를 갖는다.
바람직하게는 상기 방법에서, 단계 (c)에서 검출된 상기 적어도 2개의 PTM은 PTM-1, PTM-3, PTM-4, PTM-5 및 PTM-6으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 검출은 알츠하이머병(AD) 또는 AD의 예후를 나타낸다.
바람직하게는 상기 방법에서, 단계 (c)에서 검출된 상기 적어도 2개의 PTM은 PTM-1 및 PTM-10으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 검출은 MCI를 나타낸다.
바람직하게는 상기 방법에서, 상기 샘플은 AD의 증상을 나타내지 않는 대상체로부터의 것이고, 여기서 단계 (c)에서 검출된 상기 적어도 2개의 PTM은 PTM-4, PTM-5 및 PTM-9로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 검출은 AD에 대한 인지 저하의 예후를 나타낸다.
바람직하게는 상기 방법에서, 단계 (c)에서 검출된 상기 적어도 2개의 PTM은 PTM-1, PTM-3, PTM-5, PTM-6 및 PTM-10으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 검출은 AD에 대한 인지 저하의 예후를 갖는 MCI를 나타낸다.
바람직하게는 상기 방법에서, 단계 (c)에서 검출된 상기 적어도 2개의 PTM은 PTM-5 및 PTM-9로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 검출은 FTD를 나타낸다.
바람직하게는 상기 방법에서, 단계 (c)에서 검출된 상기 적어도 2개의 PTM은 PTM-5 및 PTM-6으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 검출은 LB를 나타낸다.
바람직하게는 상기 방법에서, 단계 (c)에서 검출된 상기 적어도 2개의 PTM은 PTM-4 및 PTM-5로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 검출은 VD를 나타낸다.
바람직하게는 상기 방법에서, 상기 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 신경 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게는 상기 방법에서, 상기 프로테아제는 트립신이다.
바람직하게는 상기 방법에서, 단계 (c)의 상기 검출은 HPLC-질량 분석법, 펩티드-질량 핑거프린트 및 데이터베이스 검색 중 하나 이상에 의해 수행된다.
바람직하게는 상기 방법에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이고, 보다 바람직하게는 2D3A8이다.
바람직하게는 상기 방법에서, 상기 샘플은, 단계 (a) 내지 (c)를 수행하기 전에, HPLC 또는 크로마토그래피 컬럼 또는 화학적 처리에 의해 단백질 혈장 고갈에 적용된다.
추가 측면에서, 본 발명은 또한, 대상체에서 신경퇴행성 질환 또는 신경퇴행성 질환의 발증을 검출하기 위한 키트에 관한 것이고, 상기 키트는 면역침전을 수행하기 위한 시약 세트를 포함하고, 상기 시약 세트는 U-p53의 아미노산 282-297에 의해 정의된 아미노산 서열에 결합할 수 있는 항-인간 p53 항체를 포함하고, 바람직하게는 상기 항-인간 p53 항체는 모노클로날 항체이고, 보다 바람직하게는 상기 모노클로날 항체는 2D3A8이다.
또한, 상기 보고된 바와 같이, 본 발명의 펩티드, 뿐만 아니라 이의 제조 공정, 키트 및 이를 사용하는 방법의 바람직한 측면의 모든 조합이 본 명세서에 개시된 것으로 간주되어야 함을 이해해야 한다.
본 발명의 PTM, 상기 개시된 제조 공정, 키트 및 방법의 바람직한 측면의 모든 조합은 본 명세서에 기재된 바와 같이 이해되어야 한다.
하기는 설명의 목적으로 제공된 본 발명의 작업 실시예이다.
재료 및 방법
U -p53 단백질 서열 및 이의 번역후 변형의 단리 및 동정
이 분석은, 인지 무손상된 대상체(CU), AD의 영향을 받은 환자, 기타 형태의 치매(FTD, LB 및 VD) 및 경도 인지 저하(MCI)를 갖는 개인, AD의 인지 저하의 예후를 갖는 MCI 환자(MCI 내지 AD) 및 무증상 AD의 인지 저하의 예후를 갖는 환자(CU 내지 AD)의 혈장으로부터 추출하는 경우, U-p53 단백질 서열 및 이의 번역후 변형의 동정에 관한 것이다.
샘플 준비
1. 완충액(buffer)
- 완충액 A: 트리스 25mM, 염화나트륨(NaCl) 0.15mM, 트윈-20 50mM; 제조: 트리스(303mg), 염화나트륨(NaCl; 885mg) 및 트윈-20(5.5g)을 수집한다. 최종 용적이 100mL에 도달하도록 이중 증류수를 첨가한다. 주: 용액은 각 분석 섹션에 대해 신선하게 준비해야 한다.
- 완충액 B: 글리신 0.1M pH 2.0. 제조: 글리신(750mg)은 이중 증류수로 처리된다. 100mL 용액을 수득했다. HCl 0.1M을 첨가하여 pH 3 값을 수득한다. 주: 용액은 각 분석 섹션에 대해 신선하게 준비해야 한다.
- 중탄산암모늄(NH4HCO3) 0.4g을 이중 증류수 100mL에서 가용화한다. 주: 분석을 진행하기 전에, 용액의 pH를 확인해야 한다. 재현가능한 소화를 수득하기 위해, pH는 8보다 낮아야 한다.
2. 시약 준비
- 50mM AmBic 중의 디티오트레이톨(DTT) 180mM. 절차: DTT 0.3g을 0.5mL의 이중 증류수에 용해시킨다. 50mM 중탄산암모늄(NH4HCO3) 10mL를 첨가한다. 와동을 사용하여 혼합물을 가용화한다. 주: 용액은 각 분석 섹션에 대해 신선하게 준비해야 한다.
- 50mM AmBic 중의 요오도아세트아미드(IAA) 400mM. 절차: 요오도아세트아미드(IAA) 0.7g을 50mM 중탄산암모늄(NH4HCO3) 용액 10mL에서 가용화한다. 와동을 사용하여 혼합물을 가용화한다. 주: 용액은 각 분석 섹션에 대해 신선하게 준비해야 한다.
- 25ng/μL 트립신 용액. 절차: 트립신 20μg을 50mM NH4HCO3 800μL에 용해시킨다. 와동을 사용하여 혼합물을 가용화한다. 주: 용액은 각 분석 섹션에 대해 신선하게 준비해야 한다.
3. 비드 -항체 결합
단백질 자기 비드 L 50μL(0.5mg)를 바이알에 수집하고;
150μL 완충액 A를 첨가한다. 와동을 적용하고;
자기 표면을 사용하여 상청액을 폐기한다.
완충액 A 1mL를 첨가한다. 와동을 1분 동안 적용하고;
자기 표면을 사용하여 상청액을 폐기하고;
항체 용액(200μL, 10μg에 상응하는 0.05μg/μL)을 단백질 L 자기 비드에 첨가하고;
용액을 2시간 동안 혼합하고;
자기 표면을 사용하여 상청액을 폐기하고;
완충액 A 500μL를 첨가하고;
자기 표면을 사용하여 상청액을 폐기하고;
상청액을 다시 세척하여 폐기하고;
완충액 A 1mL를 첨가한다.
용액은 실온에서 저장된다.
4. 혈장 화학 오염물질 고갈 및 면역 침전
상이한 범주의 환자에서 추출한 샘플을 층류 캐비닛하에 실온에서 30분 동안 해동시킨다.
샘플은 25μL 분취량으로 스파이크된다. 이들은 개별적으로 처리된다.
나머지 재료는 재시험 목적을 위해 -20℃에 저장된다.
5μL의 CH3CN을 25μL의 혈장에 첨가한다.
아세토니트릴 스파이크는 혼합물 용적이 50μL에 도달할 때까지 1분마다 반복된다. 백색 침전물이 관찰될 때까지 5분 동안 와동을 적용한다.
샘플 원심분리는 10분 동안 13000g에서 수행된다. 40μL의 상청액이 비드-항체 복합체에 첨가된다. 와동은 약하게 적용된다.
혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하고, 이어서 4℃에서 밤새 배양한다.
자기 표면을 사용하여 상청액을 제거한다.
완충액 A 500μL를 첨가하고, 혼합물을 와동시켰다.
자기 평면을 사용하여 상청액을 제거한다.
완충액 B 45μL를 펠릿에 첨가한다. 혼합 후, 실온에서 10분 동안 인큐베이팅한다.
자기 표면을 사용하여 효소 소화된 용출액(40μL)을 수집한다.
5. 면역포획된 p53 단백질의 효소 소화
2,15μl의 디티오트레이톨(DTT) 180mM을 40μL의 용출액에 첨가한다.
혼합물을 50℃에서 15분 동안 및 실온에서 30분 동안 인큐베이팅한다.
2,15μl의 요오도아세트아미드(IAA) 400mM을 혼합물 42.15μL에 첨가한다.
수득된 혼합물을 실온에서 15분 동안 인큐베이팅한다.
44.30μL의 수득된 혼합물에 2,15μL의 AmBic 50mM를 첨가한다.
Lys-c(50ng/μL) 및 AmBic 50mM을 함유하는 1μL의 트립신(25ng/μL)을 46.45μL의 수득된 혼합물에 첨가한다.
37℃에서 3.5시간 동안 인큐베이팅한 후, 57℃에서 30분 동안 인큐베이팅한다.
포름산(HCOOH) 1μL를 수득된 혼합물 47.45μL에 첨가하여 효소 소화를 중지한다. pH 값을 확인하고, 이는 1-4 범위에 있어야 한다. 4를 초과하는 경우, 1 내지 4의 pH 값을 수득하기 위해, 진행 용적(1μL)의 포름산을 첨가한다. 수득된 샘플 10μL를 분석한다.
6. LC- SACI -MS에 의한 PTM의 검출
페노메넥스 키네텍스(Phenomenex Kinetex) PFP 50×4.1mm 2.6μm를 갖는 HPLC 얼티메이트(Ultimate) 3000(Thermofisher, USA)을 사용하여 크로마토그래피 분석을 수행한다. 2원 구배가 사용된다: 상 A(H2O + 0.2% 포름산(HCOOH)) 및 상 C 아세토니트릴(CH3CN). 구배는 하기 표에 보고된다. 10μL의 샘플이 주입된다.
LTQ 오비트랩(Orbitrap) XL은 데이터 수집에 사용된다. SACI 이온화 공급원이 사용된다. 전위 표면은 47V이고, 가스 분무기 압력은 75Psi이고, 건조 가스 유동은 1.0L/min이다. 350℃의 분무기 온도는 320℃의 건조 가스 온도와 함께 사용했다. SACI 펩티드 부가물 프로파일 모드가 데이터 수집에 사용된다[참조: Cristoni et al. Rapid Commun Mass Spectrom. 2003;17(17):1973-81.].
크로마토그래피 구배.
구배
시간 (분) % C 유동 (mL/min)
0 2% 0.250
2.5 2% 0.250
3 80% 0.250
7 80% 0.250
8 2% 0.250
7. 데이터 추출 및 단백질 특성화
단백질 서열 및 PTM 데이터는 상향식 조건에서 작동하는 SANIST-prot 도구를 사용하여 수득한다.
p53 서열 펩티드와 AD 진단 사이의 상관관계 .
AD에 영향을 받은 7명의 환자, 5명의 인지 무손상된(CU) 환자, MCI에 의해 영향을 받은 2명의 환자, 6명의 전두엽 치매(FD), 혈관성 치매(VD)를 갖는 1명의 환자 및 루이 소체 치매(LB)를 갖는 1명의 환자 및 AD에 대한 MCI를 갖는 6명의 환자 및 AD에 대한 CU를 갖는 6명의 환자의 혈장 샘플을 단백질 L에 기반하는 실험 프로토콜로 처리하여 상기 개시된 단백질 p53을 단리했다. 펩티드 회수를 최대화하기 위해, 상기 단백질은 이중 효소 소화(Lys-C + 트립신)에 노출시켰다.
Figure pct00001
* 샘플 ID는 샘플을 표지하기 위한 독점적으로 사용된 단순한 코드이고, 따라서, 상응하는 환자의 후속 진단과는 아무런 상관관계가 없다.
수득된 결과
1. 대상체 AD로부터 면역포획된 U-p53 단백질
AD 개체로부터 추출된 p53 단백질은 wt p53 단백질(서열번호 1)(데이터베이스: UniProtKB, 단백질 ID: P04637, 아미노산: 1-393)에 대해 아미노산 1-248의 영역에서 절두된 결과를 초래한다. 효소 소화의 상이한 오류가 보고되었고, 이는 절두된 단백질의 잔기 249-371 사이에서 대상체간의 가변 영역의 존재를 유도한다.
표 2에는 AD 환자에서 동정된 p53 선형 서열 및 각각의 분자량(MW)이 보고되어 있다.
샘플 ID 서열 서열번호 MW ( Da )
1-AD EVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKS 서열번호 2 11425
2-AD RPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKS 서열번호 3 13823
3-AD SGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKS 서열번호 4 12471
4-AD TLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKS 서열번호 5 13016
5-AD EVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKS 서열번호 2 11425
4-S EVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKS 서열번호 2 11425
7-S RPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKS 서열번호 3 13823
MW-평균 12432
2. 인지 무손상된(CU) 환자 및 인지 비손상 내지 AD 환자로부터 면역포획된 U-p53.
5명의 인지 무손상된 환자 및 인지 무손상되고 이후 AD로 저하된 6명의 환자로부터 추출된 p53의 선형 서열은 41134Da의 분자량을 갖는, 1-371 아미노산(서열번호 6)을 갖는 전체 서열에 상응한다. 영역 372-391에 상응하는 잔기는 동정되지 않았다. 표 3은 인지 무손상된 환자 및 인지 무손상된 AD 환자로부터 수득된 선형 서열을 보고한다.
샘플 ID 서열 서열번호 MW ( Da )
1-C;2-C;
3-C;
4-C;
5-C;
1-S;
2-S;
5-S;
8-S;
10-S;
13-S		 MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKS 서열번호 6 41139
MW-평균 41139
3. 전두측두엽 치매, 루이 소체 치매, 혈관성 치매, 경도 인지 저하(MCI) 및 AD에 대한 MCI의 영향을 받은 대상체로부터 면역포획된 U-p53 단백질
16명의 대상체(전두측두엽 치매를 갖는 6명, 혈관성 치매를 갖는 1명, 루이 소체 치매를 갖는 1명, MCI 대상체 2명 및 AD를 발증한 MCI 6명)로부터 수득된 결과는 1-371 잔기의 전체 단백질의 존재를 보고한다. 표 4는 시험 대상체의 선형 단백질 서열을 보고한다.
샘플 ID 서열 서열번호 MW ( Da )
1D-FD;
2D-FD;
3D-FD;
4D-FD;
5D-FD;
6D-FD;
7D-FD;
8D-FD V;
9D-MCI;
10D-MCI;
3-S;
6-S;
9.S;
11-S
12-S
14-S		 MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKS 서열번호 6 41139
MW-평균 41139
4. 면역포획된 단백질로부터 관찰된 PTM의 설명
상이한 분자량에 상응하는, 상이한 선형 서열에 추가하여 상이한 임상 그룹으로부터 추출된 및 서열분석된 p53 단백질은 또한, 주로 특정 아미노산 잔기에 대한 유비퀴틴화, 아세틸화 및 인산화를 특징으로 하는 형질도입후 변형(PTM)을 나타냈다. 동일한 임상 그룹에 속하는 샘플은 또한 PTM에서 높은 균질성을 나타냈고, 이는, 동일한 단백질 서열과 조합되어, 이들이 속한 임상 그룹을 특성화하는 요소를 나타낸다.
도 1-8에서는 관찰된 유비퀴틴화 부위가 보고된다.
4.1. AD 대상체
AD 환자에서는, 아미노산 영역 1-248에 속하는 저-발현된 펩티드 서열이 검출되었다. 이들의 존재량이 적은 것을 고려하면, 이들은, 항체와 약하게 상호작용하는 것으로 생각되는 p53 단백질의 전체 서열로부터 유래할 수 있다. 단백질 서열은 도 1에서 표기 "*"로 표시된 몇몇 유비퀴틴화 부위를 갖는다.
4.2. 인지 무손상된(CU) 대상체
인지 무손상된 샘플에서 검출된 유비퀴틴화 부위는 도 2에 보고되어 있다.
4.3. 전두측두엽 치매( FTD )의 영향을 받은 대상체
FTD 샘플에서 검출된 유비퀴틴화 부위는 도 3에 보고되어 있다.
4.4. 루이 소체 치매(LB)의 영향을 받은 대상체
LB 샘플에서 검출된 유비퀴틴화 부위는 도 4에 보고되어 있다.
4.5. 혈관성 치매(VD)의 영향을 받은 대상체
VD 샘플에서 검출된 유비퀴틴화 부위는 도 5에 보고되어 있다.
4.6. MCI의 영향을 받은 대상체
MCI 샘플에서 검출된 유비퀴틴화 부위는 도 6에 보고되어 있다.
4.7. AD를 발증한 인지 무손상된 대상체(CU)의 샘플
18-72개월의 기간에 걸쳐 알츠하이머병을 발증한 인지적으로 건강한 대상체의 샘플에서 검출된 단백질 유비퀴틴화 부위는 도 7에 제시되어 있다.
4.8. AD를 발증한 MCI 대상체의 샘플
AD를 발증한 MCI 대상체에서 검출된 유비퀴틴화 부위는 도 8에 보고되어 있다.
수득된 데이터로부터, 단백질의 전체 서열에 걸쳐 누적적으로 11개의 PTM이 있는 것을 관찰할 수 있다. 371개 잔기의 단백질에 걸친 펩티드는 모든 샘플에서 검출되었지만, AD 환자의 1-248 잔기 영역에 속하는 펩티드는, 분석 프로토콜로 인한 효소 소화의 결과가 아니라, 전체 p-53 단백질의 생물학적 프로세스로 인해 단백질로부터 절두되는 것으로 보였다. 372에서 p-53 단백질의 말단까지의 영역의 아미노산은 상이한 임상 그룹에 속하는 모든 샘플에서 누락되어 있었다.
상이한 환자에서 관찰된 PTM은 표 5에 개시되어 있다(Y=검출됨; N=검출되지 않음)
AC-M1 AC-K164 AC-K370 U- K101 U-K120 U-K132 U-K139 U-K291 U-K357 포스포-S6 포스포-S33 절두
CU N Y N N N N Y Y N N Y N
MCI Y N N N N N Y Y N Y Y N
CU 내지 AD N N N Y Y N N Y Y N N N
MCI 내지 AD Y N Y N Y Y Y Y N Y Y N
AD Y Y Y Y Y Y N Y N N Y Y
FTD N N N N Y N N Y Y N N N
LB N Y N Y Y Y N Y N N N N
VD N N N Y Y N N Y N N N N
참조문헌
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서열 목록
서열번호 1
Figure pct00002
Figure pct00003
서열번호 2
Figure pct00004
서열번호 3
Figure pct00005
서열번호 4
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서열번호 5
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서열번호 6
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서열번호 7
Figure pct00011
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서열번호 8
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서열번호 9
Figure pct00015
서열번호 10
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서열번호 11
Figure pct00017
서열번호 12
Figure pct00018
서열번호 13
Figure pct00019
서열번호 14
Figure pct00020
서열번호 15
Figure pct00021
서열번호 16
Figure pct00022
SEQUENCE LISTING <110> DIADEM s.r.l. <120> p53 POST-TRANSLATIONAL MODIFICATIONS AS MARKERS IN THE DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF A NEURODEGENERATIVE DISEASE <130> ADV-00519PTITWO <150> IT102020000018544 <151> 2020-07-30 <160> 16 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 392 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln 130 135 140 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Ala 145 150 155 160 Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys Pro 165 170 175 His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln His 180 185 190 Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp Arg 195 200 205 Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu Val 210 215 220 Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser Ser 225 230 235 240 Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu 245 250 255 Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg 260 265 270 Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu 275 280 285 Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys 290 295 300 Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys 305 310 315 320 Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg 325 330 335 Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala 340 345 350 Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu 355 360 365 Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe 370 375 380 Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp 385 390 <210> 2 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu 1 5 10 15 Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly 20 25 30 Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro 35 40 45 Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly 50 55 60 Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu 65 70 75 80 Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser 85 90 95 Ser His Leu Lys Ser 100 <210> 3 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu 1 5 10 15 Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg 20 25 30 Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His 35 40 45 His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr 50 55 60 Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe 65 70 75 80 Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu 85 90 95 Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly 100 105 110 Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser 115 120 <210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val Arg Val Cys Ala 1 5 10 15 Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn Leu Arg Lys Lys 20 25 30 Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr Lys Arg Ala Leu 35 40 45 Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu Asp 50 55 60 Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu Arg Phe Glu Met 65 70 75 80 Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gln Ala Gly 85 90 95 Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser 100 105 110 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Thr Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu 1 5 10 15 Val Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu 20 25 30 Asn Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser 35 40 45 Thr Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys 50 55 60 Lys Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg 65 70 75 80 Glu Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys 85 90 95 Asp Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser 100 105 110 His Leu Lys Ser 115 <210> 6 <211> 337 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 20 25 30 Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp 35 40 45 Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro 50 55 60 Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly 100 105 110 Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro 115 120 125 Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln 130 135 140 Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met 145 150 155 160 Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys 165 170 175 Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln 180 185 190 His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp 195 200 205 Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu 210 215 220 Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser 225 230 235 240 Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr 245 250 255 Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val 260 265 270 Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn 275 280 285 Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr 290 295 300 Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys 305 310 315 320 Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu 325 330 335 Arg <210> 7 <211> 572 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Phe Pro Leu 115 120 125 Val Ser Cys Glu Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val Ala Met Gly 130 135 140 Cys Leu Ala Arg Asp Phe Leu Pro Ser Thr Ile Ser Phe Thr Trp Asn 145 150 155 160 Tyr Gln Asn Asn Thr Glu Val Ile Gln Gly Ile Arg Thr Phe Pro Thr 165 170 175 Leu Arg Thr Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Ser 180 185 190 Pro Lys Ser Ile Leu Glu Gly Ser Asp Glu Tyr Leu Val Cys Lys Ile 195 200 205 His Tyr Gly Gly Lys Asn Arg Asp Leu His Val Pro Ile Pro Ala Val 210 215 220 Ala Glu Met Asn Pro Asn Val Asn Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly 225 230 235 240 Phe Ser Gly Pro Ala Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Glu Ala Thr 245 250 255 Asn Phe Thr Pro Lys Pro Ile Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Lys 260 265 270 Leu Val Glu Ser Gly Phe Thr Thr Asp Pro Val Thr Ile Glu Asn Lys 275 280 285 Gly Ser Thr Pro Gln Thr Tyr Lys Val Ile Ser Thr Leu Thr Ile Ser 290 295 300 Glu Ile Asp Trp Leu Asn Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg Val Asp His 305 310 315 320 Arg Gly Leu Thr Phe Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys Ala Ala Ser 325 330 335 Pro Ser Thr Asp Ile Leu Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe Ala Asp 340 345 350 Ile Phe Leu Ser Lys Ser Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val Ser Asn Leu 355 360 365 Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln Ser Gly Glu 370 375 380 Pro Leu Glu Thr Lys Ile Lys Ile Met Glu Ser His Pro Asn Gly Thr 385 390 395 400 Phe Ser Ala Lys Gly Val Ala Ser Val Cys Val Glu Asp Trp Asn Asn 405 410 415 Arg Lys Glu Phe Val Cys Thr Val Thr His Arg Asp Leu Pro Ser Pro 420 425 430 Gln Lys Lys Phe Ile Ser Lys Pro Asn Glu Val His Lys His Pro Pro 435 440 445 Ala Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu 450 455 460 Ser Ala Thr Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro Ala Asp Ile 465 470 475 480 Ser Val Gln Trp Leu Gln Arg Gly Gln Leu Leu Pro Gln Glu Lys Tyr 485 490 495 Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gly Ala Pro Gly Phe Tyr Phe 500 505 510 Thr His Ser Ile Leu Thr Val Thr Glu Glu Glu Trp Asn Ser Gly Glu 515 520 525 Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Leu Val Thr 530 535 540 Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val 545 550 555 560 Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly Thr Cys Tyr 565 570 <210> 8 <211> 214 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Ser Tyr Val Met His 1 5 <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5

Claims (10)

  1. 신경퇴행성 질환의 진단 또는 예후를 위한 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 방법으로서,
    a) p53 단백질(U-p53)의 아미노산 1-371의 영역에서 번역후 변형(post-translation modification; PTM)에서의 존재에 대해 생체액 샘플(biofluid sample)을 분석하는 단계로서, 상기 PTM은
    아미노산 M1에서의 PTM-1,
    아미노산 K164에서의 PTM-2,
    아미노산 K370에서의 PTM-3,
    아미노산 L101에서의 PTM-4,
    아미노산 K120에서의 PTM-5,
    아미노산 K132에서의 PTM-6,
    아미노산 K139에서의 PTM-7,
    아미노산 K291에서의 PTM-8,
    아미노산 K357에서의 PTM-9,
    아미노산 S6에서의 PTM-10,
    아미노산 S33에서의 PTM-11이고,
    여기서, PTM-2, PTM-7, PTM-8 및 PTM-11로부터 선택된 적어도 2개의 PTM의 존재는 인지 무손상된 대상체(cognitive unimpaired subject; CU)를 나타내는, 단계,
    b) 신경계 질환(neurological disease)의 발생 또는 발증(development) 위험의 지표로서
    - PTM-1, PTM-3, PTM-4, PTM-5, PTM-6, PTM-9 및 PTM-10으로부터 선택된 적어도 2개의 PTM, 및
    - PTM-2, PTM-7, PTM-8 및 PTM-11로부터 선택된 적어도 하나의 PTM
    의 존재를 평가하는 단계로서, 상기 신경퇴행성 질환은 경도 인지 장애(Mild Cognitive Impairment; MCI), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 전두측두엽 치매(Fronto-temporal dementia; FTD), 루이 소체(Lewi's Body; LB) 및 혈관성 치매(vascular dementia; VD)로부터 선택되는, 단계,
    c) 단계 b)에서 평가된 PTM을 상응하는 신경퇴행성 질환을 동정(identifying)하는 PTM과 상관시키는 단계로서, 여기서
    - PTM-1 및 PTM-10의 존재는 MCI를 나타내고;
    - PTM-4, PTM-5 및 PTM-9로부터 선택된 적어도 2개의 PTM의 존재는 무증상 대상체(asymptomatic subject)의 AD에 대한 인지 저하의 예후를 나타내고;
    - PTM-1, PTM-3, PTM-5, PTM-6 및 PTM-10으로부터 선택된 적어도 2개의 PTM의 존재는 AD에 대한 인지 저하의 예후와 함께 MCI를 나타내고;
    - PTM-5 및 PTM-9의 존재는 FTD를 나타내고;
    - PTM-5 및 PTM-6의 존재는 LB를 나타내고;
    - PTM-4 및 PTM-5의 존재는 VD를 나타내거나, 또는
    상기 시험관내 또는 생체외 방법은 다른 신경퇴행성 질환으로부터 알츠하이머병을 구별하기 위한 것이고, 여기서 단계 b)에서 하기 기준:
    - 아미노산 1-271의 영역 내에서 길이 측면에서, 동일한 영역 내의 절두(truncation)를 포함하는 서열 가변성(sequence variability) 및
    - 잔여량의 비절두된 서열(untruncated sequence)에서, PTM-1, PTM-3, PTM-4, PTM-5 및 PTM-6으로부터 선택된 적어도 2개의 PTM의 존재의 평가는 AD를 나타내는, 단계
    를 포함하는, 시험관내 또는 생체외 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    - 번역후 변형 PTM-1은 p53 단백질의 아미노산 M1에 분지된 그룹 CO-CH3를 갖고;
    - 번역후 변형 PTM-2는 p53 단백질의 아미노산 K164에 분지된 그룹 CO-CH3를 갖고;
    - 번역후 변형 PTM-3은 p53 단백질의 아미노산 K370에 분지된 그룹 CO-CH3를 갖고;
    - 번역후 변형 PTM-4는 p53 단백질의 아미노산 K101에서 분지된 유비퀴틴화 부위(ubiquitination site)[GG]를 갖고;
    - 번역후 변형 PTM-5는 p53 단백질의 아미노산 K120에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고;
    - 번역후 변형 PTM-6은 p53 단백질의 아미노산 K132에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고;
    - 번역후 변형 PTM-7은 p53 단백질의 아미노산 K139에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고;
    - 번역후 변형 PTM-8은 p53 단백질의 아미노산 K291에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고;
    - 번역후 변형 PTM-9는 p53 단백질의 아미노산 K357에서 분지된 유비퀴틴화 부위[GG]를 갖고;
    - 번역후 변형 PTM-10은 p53 단백질의 아미노산 S6에서 인산화(phosphorylation)를 갖고;
    - 번역후 변형 PTM-11은 p53 단백질의 아미노산 S33에서 인산화를 갖는, 시험관내 또는 생체외 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시험관내 또는 생체외 방법이 다른 신경퇴행성 질환으로부터 알츠하이머병을 구별하기 위한 것이고, 단계 b)에서 하기 기준:
    - 아미노산 1-271의 영역 내에서 길이 측면에서, 동일한 영역 내의 절두를 포함하는 서열 가변성 및
    - 모든 PTM-1, PTM-3, PTM-4, PTM-5 및 PTM-6의 존재의 평가가 AD를 나타내는, 시험관내 또는 생체외 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모든 PTM-4, PTM-5 및 PTM-9의 존재가 무증상 대상체의 AD에 대한 인지 저하의 예후를 나타내는, 시험관내 또는 생체외 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모든 PTM-1, PTM-3, PTM-5, PTM-6 및 PTM-10의 존재가 AD에 대한 인지 저하의 예후와 함께 MCI를 나타내는, 시험관내 또는 생체외 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체액이 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 소변, 신경 세포, 바람직하게는 혈액, 특히 혈장인, 시험관내 또는 생체외 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a)에서, p53 단백질이 하기의 하위 단계:
    (i) 생체액 샘플을 제공하는 하위 단계;
    (ii) p53 단백질에 결합하는 항체에 의해 단백질 면역침전(immunoprecipitation)을 수행하는 하위 단계;
    (iii) 트립신에 의한 단백질 단편화(protein fragmentation)를 수행하는 하위 단계를 수행함으로써 생체액 샘플에서 포획되고,
    단계 b)가 HPLC-질량 분석, 펩티드 질량 핑거프린트(Peptide Mass Fingerprint) 및 데이터베이스 검색에 의해 수행되는, 시험관내 또는 생체외 방법.
  8. 제7항에 있어서, 하위 단계 (ii)의 면역침전이, p53 펩티드에 결합하는 모노클로날/폴리클로날 항체(monoclonal/polyclonal antibody)로 수행되고, 바람직하게는 상기 모노클로날 항체가 항체 2D3A8인, 시험관내 또는 생체외 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 단계 a)의 생물학적 샘플이, 단계 (ii)를 수행하기 전에, HPLC 또는 크로마토그래피 컬럼 또는 화학적 처리에 의해 단백질 혈장 고갈(protein plasma depletion)에 적용되는, 시험관내 또는 생체외 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 시험관내 또는 생체외 방법을 수행하기 위한 진단 키트(diagnostic kit)의 용도로서,
    상기 키트는 항체를 포함하는 면역침전, 단백질(바람직하게는 Lys C의 존재/부재하의 트립신)의 소화를 수행하기 위한 시약 세트, 항체에 의해 포획된 단백질을 침전시키기 위한 용출 완충액(elution buffer), 및 주입 완충액을 포함하는, 진단 키트의 용도.
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