KR20240002810A - 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 이용한 알츠하이머병 조기 진단, 단계 구분 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법 - Google Patents

알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 이용한 알츠하이머병 조기 진단, 단계 구분 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인산화 펩타이드를 이용한 알츠하이머병 조기 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생물학적 시료 내 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 인산화 수준 측정을 통한 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분 방법, 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드 정량 방법을 통해 알츠하이머병을 효과적으로 조기 진단하거나 단계를 구분하고 뇌의 아밀로이드 베타의 축적을 판별할 수 있다.

Description

알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 이용한 알츠하이머병 조기 진단, 단계 구분 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법 {Method for Early Diagnosis and Staging of Alzheimer's Disease and Screening Cerebral Amyloid Deposition Using Phosphorylated Peptide Derived from Alzheimer's Disease Related Protein}
본 발명은 인산화 펩타이드를 이용한 알츠하이머병 조기 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생물학적 시료 내 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 인산화 수준 측정을 통한 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분 방법, 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법에 관한 것이다.
알츠하이머병은 치매를 일으키는 가장 큰 원인의 하나로 환자의 수가 점점 증가하고 있어 관심이 높아지고 있다. 그러나 지금까지 정확한 원인이 규명되지 않고 있으며 치료제 또한 발견되지 않고 있다. 현재 임상적으로 사용되는 알츠하이머병의 진단은 자기공명영상법 (MRI), SPECT (single-photon emission computed tomography), positron emission tomography (PET) 등을 이용하여 특정 뇌조직 (해마, 피질 등)의 변화양상을 관찰하고, MMSE (mini mental status examination)와 같은 문진을 통하여 행동과 지각능력의 변화 관찰을 종합하여 알츠하이머병으로서 진단을 내리게 된다.
그러나, 상기 방법들은 비용이 많이 들거나 대부분의 방법이 질환이 진행되어 증상이 나타난 이후에 진단이 가능하다는 한계점을 가진다. 현재 진단을 확증할 수 있는 유일한 방법은 환자가 사망한 후 부검을 통해 뇌 조직을 검사하는 사후 분석으로 아밀로이드 베타 플라크(amyloid beta plaque)의 뇌세포에서의 침착 여부와 타우 단백질의 과인산화로 형성된 신경섬유다발(neurofibrillary tangles)을 확인하는 것이다. 이처럼 확진이 어렵고 경도의 인지기능장애 단계를 지나 치매에 이른 환자들의 치료 방법이 없기 때문에 초기 환자들을 대상으로 한 약물 개발의 필요성과 그를 위한 초기 환자들의 선별 및 정확한 조기진단의 중요성이 부각되고 있다. 알츠하이머병은 대부분 질환의 증상이 나타나기 이전 단계에 환자의 행동은 정상적으로 보이나 뇌에서는 병리학적인 변화가 일어나는 “잠복기(preclinical)” 단계와 경도의 인지능력저하가 일어난 “경도인지장애(MCI)” 단계가 존재하기 때문에 이러한 조기 단계에 알츠하이머병 진단이 이루어질 수 있다면 보다 효과적인 치료가 가능할 것이다. 또한 알츠하이머성 치매의 원인물질이며 질병의 진행과 큰 연관성을 갖는 뇌의 아밀로이드 베타 축적의 감별은 동일한 정도의 인지기능을 가진 치매 단계별 환자군에서도 알츠하이머성 질환과 비알츠하이머성 질환을 갖는 환자군으로 세분류하는 근거가 되어 환자개인별 맞춤치료 및 향후 추가진단에 활용할 수 있다.
현재 증상이 나타나기 이전의 알츠하이머병 환자의 혈액이나 뇌척수액에서 특이하게 증가하거나 감소하는 단백질 수준을 측정하여 알츠하이머병을 조기에 진단하고 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적을 감별하는 방법에 대한 연구들이 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 뇌척수액은 시료 채취 과정에 있어서 고통을 수반하며 채취가 용이하지 않고 의학적 부작용 등이 우려되며 특히 고령의 알츠하이머병 환자로부터 채취가 어려워 실제 일반적 진단방법으로는 용이하게 사용될 수 없는 문제점이 있다. 반면 혈액의 경우 뇌척수액에 비해 채취가 용이하다는 점과 매일 500 ml의 뇌척수액이 혈액으로 흡수된다는 연구결과 등을 바탕으로 효과적인 알츠하이머병 바이오마커 개발에 적합한 시료로 여겨진다.
그에 따라, 혈액 내 아밀로이드 베타와 타우 단백질을 조기진단 마커로서 사용하고자 많은 연구가 이루어졌다. 그러나 아밀로이드 베타의 경우 연구그룹마다 전혀 상반된 결과들이 나왔고 타우 단백질의 경우 알츠하이머병 환자군와 정상 대조군의 타우 단백질의 농도범위가 많이 겹치는 결과가 나왔기 때문에 조기진단을 위한 지표로서의 활용도가 매우 떨어지는 것으로 보였다. 치매 발생/진행 기전과 비정상적인 뇌단백질들의 과인산화 현상은 높은 연관성을 보이는 것으로 알려져 있어 전체 단백질이 아닌 단백질의 인산화 현상이 알츠하이머병 진단의 새로운 혈액 내 지표로 주목을 받고 있다. 특히 대표적인 치매 특이적 과인산화 현상인 타우 단백질의 인산화 현상을 정상 및 알츠하이머병 환자들의 혈액에서 정량한 연구결과들에서도 기존 타우 전체 단백질보다 타우 단백질의 인산화 현상이 알츠하이머병에 특이적이고 뇌의 아밀로이드베타 병변 및 타우 병변과의 연관성도 더 높은 것으로 드러났다. 이는 치매 발생/진행 기전과 관련된 타우 이외의 치매 관련 인자들의 과인산화 현상들도 알츠하이머병 진단을 위한 뛰어난 혈액 내 지표가 될 수 있음을 시사한다. 그러나 그러나 혈액 내 인산화된 알츠하이머병 관련 단백질은 뇌조직으로부터 뉴런의 사멸(신경변성)에 의한 수동적 방출뿐만 아니라 인산화 위치에 따른 알츠하이머병 관련 단백질의 능동적 방출을 종합적으로 반영하기 때문에, 뇌조직이 아닌 혈액 내 존재하는 알츠하이머병 관련 단백질의 인산화 수준을 직접적으로 측정하여 조기진단, 단계 구분 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 감별을 위한 지표로 이용하는 것이 필수적이다. 하지만 혈액 시료의 경우 소수의 혈액 기능 관련 단백질들이 전체 단백질 양의 90% 이상을 차지하고 있는데 반해 인산화된 단백질들은 다른 조직 시료들에 비해 ~20% 정도에 미치지 못하는 특수성 때문에 현재 혈액 내 단백질의 인산화를 정량하고 진단하는 방법은 수십 마이크로 크기의 마이크로웰 어레이를 이용, 효소 단일 분자 활동을 디지털방식으로 측정하는 초고감도 면역분석기술인 Digital ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay)에 의한 타우 단백질의 과인산화 정량에 국한되어 있다. 상기 방법은 immunoassay의 문제점(low throughput, 시료와 epitope마다 달라지는 친화도와 특이성, 정량하려는 epitope에 대한 antibody의 필요성)을 가지고 있기 때문에 실제 임상에서 사용이 가능한 알츠하이머병 조기진단을 위해서는 대체적인 방법이 필요하다. 진단 분야에서 가장 궁극적인 목적인 높은 정확도와 민감도를 통해 질병을 진단하기 위해서 종래의 타우 단백질의 과인산화을 대상으로 한 단일 검출방법의 대체제로서 치매 발생/진행 기전과 높은 연관성을 갖는 타우 이외의 다양한 치매 관련 인자들의 비정상적인 과인산화 현상을 대상으로 한 다중검출기술이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 알츠하이머병의 효과적인 조기진단 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 감별을 위한 검사방법을 개발하고자 연구 노력한 결과, 효율적인 인산화 펩타이드 농축 방법과 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS)를 이용하여 혈액 내에 존재하는 다양한 알츠하이머성 치매 관련 단백질로부터 유래된 인산화 펩타이드의 양을 측정함으로서 알츠하이머병 특이적인 단백질 인산화위치들과 이들의 인산화 정도 차이를 이용하여 알츠하이머병의 조기진단과 단계 구분을 가능하게 하고 뇌의 아밀로이드 베타 축적을 감별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은, 혈액과 뇌척수액을 포함한 생물학적 시료 내 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 수득하고 정량 분석함으로써 알츠하이머병의 조기 진단, 단계 구분과 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은, 상기 알츠하이머병 조기 진단, 단계 구분과 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 바이오마커 및 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 단계를 포함하는, 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, (c) 상기 정량된 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 상기 알츠하이머병 조기 진단, 단계 구분 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법은, 분리된 생물학적 시료 내 단백질을 단백질 분해효소를 이용하여 펩타이드화하는 단계; 상기 수득된 펩타이드에 인산화 펩타이드 농축법을 적용하여 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 농축하는 단계; 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS)를 이용한 질량분석법을 이용하여 상기 농축된 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 단계; 및 상기 정량된 인산화 펩타이드의 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명의 기본적인 특징은, 알츠하이머병의 효과적인 조기 진단, 단계 구분 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 검사방법을 개발하고자 하는 데에 있는 것으로서, 알츠하이머병에 아직 도달하기 이전의 환자에 대하여, 잠복기 단계(preclinical AD, 전임상 알츠하이머병) 및/또는 알츠하이머성 경도인지장애(MCI) 여부를 조기에 알 수 있고 동일한 정도의 인지기능을 가진 인지기능 정상군, 경도인지장애군 또는 치매군에서의 뇌의 아밀로이드 베타 축적 감별을 하는 것일 수 있다.
기존에는 실제 알츠하이머병 치매 환자와 정상인 간의 유의미한 차이를 보이는 연구는 다수 진행되었으나, 질환의 증상이 나타나기 이전 단계인 잠복기 단계(preclinical AD) 및/또는 알츠하이머성 경도인지장애(MCI) 단계와 정상인 간에는 유의미한 차이가 나타나지 않아 조기 진단이 어려웠다. 그러나, 본 발명에서는 특정 위치에서 인산화가 일어난 다양한 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 펩타이드를 통한 정량을 통해 혈액 시료를 이용한 조기 진단 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 감별 방법을 개발한 것이다.
구체적으로는 상기 인산화 펩타이드의 종류에 따라 알츠하이머병의 각 단계를 판단하고 동일 인지기능 단계에 있는 환자군으로부터 뇌의 아밀로이드 베타 축적을 감별할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 알츠하이머병 조기 진단은 알츠하이머병 잠복기 및 알츠하이머성 경도인지장애의 조기 진단을 포함할 수 있으며, 알츠하이머병 단계 구분은 알츠하이머병 잠복기 단계, 알츠하이머성 경도인지장애 단계, 및 알츠하이머성 치매 단계 간의 구분을 포함할 수 있다.
상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질은 GSK3B (Glycogen synthase kinase 3 beta), NEFM (Neurofilament medium polypeptide), DPYSL2 (Dihydropyrimidinase-related protein 2), MAP1B (Microtubule-associated protein 1B) 및 MAP2 (Microtubule-associated protein 2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질일 수 있다.
또한, 상기 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분을 위하여 정량되는 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 인산화는 GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화일 수 있다. 구체적으로, 상기 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분을 위한 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 GSK3B 단백질에서 Y216, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 NEFM 단백질에서 S837, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 DPYSL2 단백질에서 T509, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 MAP1B 단백질에서 S831;S832, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 MAP2 단백질에서 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 3 내지 50개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있고, 구체적으로는 5 내지 30개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 11 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태로서, 상기 알츠하이머병 조기 진단은 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머병 잠복기를 조기 진단하는 것일 수 있다. 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머병 잠복기를 조기 진단하는 방법은, MAP2 단백질의 T1605 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 인지기능이 정상이고 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머병 잠복기인 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 정량된 단백질 유래 인산화 펩타이드가 인지기능이 정상이고 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 정상 대조군과 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 높은 경우 알츠하이머병 잠복기인 것으로 판단할 수 있으며, 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머병 잠복기인 것으로 판단할 수 있다.
다른 일 실시양태로서, 상기 알츠하이머병 조기 진단은 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머성 경도인지장애를 조기 진단하는 것일 수 있다. 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머성 경도인지장애를 조기 진단하는 방법은, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, 및 MAP1B 단백질의 S831;S832로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 인지기능이 정상이고 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애인 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 정량된 단백질 유래 인산화 펩타이드가 인지기능이 정상이고 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 정상 대조군과 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애인 것으로 판단할 수 있으며, 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태로서, 상기 알츠하이머병 단계 구분은 알츠하이머병 잠복기 단계와 알츠하이머성 경도인지장애 단계를 구분하는 것일 수 있다. 알츠하이머병 잠복기 단계와 알츠하이머성 경도인지장애 단계를 구분하는 방법은, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 알츠하이머병 잠복기 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애 단계인 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 정량된 단백질 유래 인산화 펩타이드가 알츠하이머병 잠복기 대조군과 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애 단계인 것으로 판단할 수 있으며, 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애 단계인 것으로 판단할 수 있다.
다른 일 실시양태로서, 상기 알츠하이머병 단계 구분은 알츠하이머성 경도인지장애 단계와 알츠하이머성 치매 단계를 구분하는 것일 수 있다. 알츠하이머성 경도인지장애 단계와 알츠하이머성 치매 단계를 구분하는 방법은, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 보다 바람직하게는 GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, 및 MAP2 단백질의 T1605로 구성된 군에서 선택되는 인산화를 포함하는 타우 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 알츠하이머성 경도인지장애 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 치매 단계인 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 정량된 단백질 유래 인산화 펩타이드가 알츠하이머성 경도인지장애 대조군과 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 높은 경우 알츠하이머성 치매 단계인 것으로 판단할 수 있으며, 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 치매 단계인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에서, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드는 분리된 생물학적 시료 내 단백질을 단백질 분해효소를 이용하여 펩타이드화하여 수득되는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 단백질 분해효소는 Lys-c, Arg-C, Asp-N, Gluc-C, Lys-N, 서몰리신(thermolysin), 엘라스타제(elastase), Tryp-N, 트립신(trypsin) 및 키모트립신(chymotrypsin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 분해효소일 수 있다. 또한, 상기 인산화된 알츠하이머성 치매 관련 단백질 또는 단백질의 단편은 인산화 단백질 또는 인산화 펩타이드 농축법에 의해 수득되는 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드의 정량은 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS)를 이용한 질량분석법에 의해 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 질량분석법은 LC-SRM(liquid chromatography-selected reaction monitoring), PRM(Parallel Reaction Monitoring), SIM(Selected Ion monitoring) 또는 MRM(Multiple Reaction Monitoring)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 정량된 인산화 펩타이드의 양은 총 단백질에 대한 비율일 수 있다.
본 발명에서, 상기 정량된 인산화 펩타이드의 양에 대하여 정량적 프로파일링을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 정량된 인산화 펩타이드의 양에 대하여 T 검정 p-값 분석, ROC (Receiver-Operating curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석 중 한 가지 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 정량적 프로파일링을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 정량적 프로파일링은 동위원소로 치환된 단백질 표준물(stable isotope labeled protein standard) 또는 펩타이드 표준물(stable isotope labeled peptide standard)을 단백질들의 펩타이드화 이전 또는 이후에 주입하여 합성 표지 펩타이드를 이용하여 구한 인산화 펩타이드의 절대 정량값을 이용하여 얻어지는 것일 수 있다. 상기 절대 정량값은 총 단백질양에 대한 비율로서 비교될 수 있고, 여기서 총 단백질의 양도 동위원소로 치환된 단백질 표준물(stable isotope labeled protein standard) 또는 펩타이드 표준물(stable isotope labeled peptide standard)에 의해 구해진 절대 정량값일 수 있다. 해당 기준치는 구체적인 실시양태에 따라 적절한 기준치를 설정하여 실시할 수 있다. 그 예로 대조군 범위의 임계값 (cutoff) (증가하는 경우에는 상한치 / 감소하는 경우에는 하한치)을 결정하여, 인산화가 일어난 단백질의 단편 펩타이드의 양이 임계값보다 변동한 경우, “평균에 비해 유의하게 높은 경우”로 판단할 수 있다. 상기 정량된 인산화 펩타이드의 절대 함량값을 이용하여 대조군에 해당하는 절대 정량값 참조 정보와 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 높은 경우 각각의 단계인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에서 상기 알츠하이머병 조기 진단이라 함은, 이후의 발병에 대하여 대상체를 식별하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 알츠하이머병 잠복기의 조기 진단은 알츠하이머성 경도인지장애의 발병으로부터 약 5 년 내지 25 년 이하로 대상체를 식별하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 알츠하이머성 경도인지장애의 조기 진단은 알츠하이머성 치매 발병으로부터 약 5 년 내지 25 년 이하로 대상체를 식별하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 알츠하이머병 단계 구분이라 함은, 피험자를 대상으로 임상시험에서 실제 치료제가 목표로 하는 알츠하이머병 단계에 해당하는 대상만으로 선별하기 위한 것이거나, 또는 각 단계에 해당하는 약학 조성물을 투여하기 위한 대상을 선별하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시양태에서, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군 또는 치매 환자군에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부를 판별하는 것일 수 있다.
상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위하여 정량되는 알츠하이머성 치매 관련 단백질은 MAP1B (Microtubule-associated protein 1B) 및 MAP2 (Microtubule-associated protein 2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질일 수 있다.
또한, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위하여 정량되는 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 인산화는 MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화일 수 있다. 구체적으로 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 MAP1B 단백질에서 S831;S832, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 MAP2 단백질에서 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 인산화 펩타이드일 수 있으며, 상기 인산화 펩타이드는 상기 나열된 위치의 인산화를 포함하는 3 내지 50개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있고, 구체적으로는 5 내지 30개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 11 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태로서, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은 인지기능 정상군에서 판별하는 것일 수 있다. 인지기능 정상군에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은, MAP2 단백질의 T1605 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 뇌의 아밀로이드 베타 축적되지 않은 인지기능 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 정량된 단백질 유래 인산화 펩타이드가 뇌의 아밀로이드 베타 축적되지 않은 인지기능 정상군과 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 높은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단할 수 있으며, 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단할 수 있다.
다른 일 실시양태로서, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은 경도인지장애 환자군에서 판별하는 것일 수 있다. 경도인지장애 환자군에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은, MAP1B 단백질의 S831;S832 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 뇌의 아밀로이드 베타 축적되지 않은 경도인지장애 환자 대조군과 비교하여 낮은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 낮은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 정량된 단백질 유래 인산화 펩타이드가 뇌의 아밀로이드 베타 축적되지 않은 경도인지장애 환자군과 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 낮은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단할 수 있으며, 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 낮은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에서 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별이라 함은, 피험자를 대상으로 임상시험에서 실제 치료제가 목표로 하는 뇌 아밀로이드 베타 축적에 해당하는 대상만으로 선별하기 위한 것이거나, 또는 각 단계에서 뇌 아밀로이드 베타 축적에 해당하는 약학 조성물을 투여하기 위한 대상을 선별하기 위한 것일 수 있다. 또한 상기 뇌 아밀로이드 베타 축적은 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단, 또는 아밀로이드 베타 관련 PET 검사가 필요한지 여부의 판단으로 사용되며, 상기 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환은 알츠하이머병 파킨슨병 치매, 루이소체 치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함하는 것인 뇌 아밀로이드 축적 여부의 판단을 위한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화 부위를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분, 또는 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 조성물을 제공한다.
상기 인산화 부위 및 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분, 또는 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분, 또는 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 인산화 펩타이드를 제공할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 GSK3B 단백질에서 Y216, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 NEFM 단백질에서 S837, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 DPYSL2 단백질에서 T509, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 MAP1B 단백질에서 S831;S832, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 MAP2 단백질에서 T1605 위치의 인산화를 포함하는 인산화 펩타이드로서, 각각의 위치의 인산화를 포함하는 3 내지 50개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있고, 구체적으로는 5 내지 30개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 11 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
일 실시양태로서, 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머병 잠복기를 조기 진단하기 위한, MAP2 단백질의 T1605 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 9의 인산화 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 일 실시양태로서, 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머성 경도인지장애를 조기 진단하기 위한, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 및/또는 서열번호 9의 인산화 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 일 실시양태로서, 알츠하이머병 잠복기 단계와 알츠하이머성 경도인지장애 단계를 구분하기 위한, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 및/또는 서열번호 9의 인산화 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 일 실시양태로서, 알츠하이머성 경도인지장애 단계와 알츠하이머성 치매 단계를 구분하기 위한, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 및/또는 서열번호 9의 인산화 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 일 실시양태로서, 인지기능 정상군에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한, MAP2 단백질의 T1605 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 9의 인산화 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 일 실시양태로서, 경도인지장애 환자군에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한, MAP1B 단백질의 S831;S832 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 7의 인산화 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 전술한 바와 같이 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 과인산화를 측정하여 알츠하이머병의 조기 진단 및 단계 구분과 뇌내 아밀로이드 베타 축적 감별을 가능하게 하며, 이러한 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 과인산화는 타우병증(tauopathy)의 주된 특징이기 때문에 알츠하이머병 뿐만 아니라, 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy, PSP), 피질기저핵변성(Corticobasal degeneration, CBD), 피크병(Pick’s disease), FTDP-17(frontotemporal dementias with parkinsonism liked to chromosome 17), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy, CTE)을 비롯한 타우병증과 관련된 퇴행성 뇌질환에도 적용이 가능하다.
본 발명의 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드 정량 방법을 통해 알츠하이머병을 효과적으로 조기 진단하거나 단계를 구분하고 뇌의 아밀로이드 베타의 축적을 판별할 수 있다.
도 1은 본 발명의 치매 관련 인산화 펩타이드의 선정을 위한 혈장에서 동정된 대표적 알츠하이머성 뇌조직 특이적 인산화 단백질과 인산화 위치를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 전체적인 모식도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 구체적인 단계를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 인산화 펩타이드의 정량을 수치로 기재한 도이다.
도 5는 본 발명의 인산화 펩타이드의 정량을 히스토그램으로 도식화한 도이다.
도 6은 본 발명의 인산화 펩타이드의 정량을 히트맵(heatmap)으로 도식화한 도이다.
도 7은 본 발명의 알츠하이머성 경도인지장애를 판단할 수 있는 인산화 펩타이드를 정량한 결과이다.
도 8은 본 발명의 알츠하이머병 단계에 따른 특이적 증가를 보이거나 동일 단계에서 뇌의 아밀로이드 축적에 따른 특이적 변화를 보이는 인산화 위치들을 도식화한 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
혈액을 통해 알츠하이머병을 진단하는 것은 비침습성, 비용, 시설 등 여러 측면에 있어서 장점이 있지만 혈액은 뇌를 포함한 다양한 조직들과 물질교환이 이루어지기 때문에 혈액 내 지표를 통한 진단에 있어 지표로서의 특이성이 떨어지는 경우가 많다. 아울러, Immunoassay 방법을 이용하는 기존의 사례에서는, 항체의 가용도, 특이도, 민감도 등에 의해 제한이 존재하였다.
그에 따라, 혈액시료를 분석하는데 방해가 되는 혈액시료의 특성에서 기인한 문제점들을 해결하기 위한 다양한 전처리 방법, 예컨대, 소수의 고농도 단백질들을 제거하는 immunodepletion 방법, 단백질 농도의 dynamic range를 줄이는 방법으로서 다양한 펩타이드 리간드 조합의 bead library를 이용하여 고농도의 단백질 농도를 희석시키고 저농도의 인산화 단백질을 농축시키는 방법, complexity를 낮추기 위해 fractionation하는 방법 등이 시도되었으나, 각각의 한계점이 존재하였다.
이러한 혈액시료의 특성을 극복하기 위한 많은 연구들이 있었음에도 불구하고 혈액 인산화 단백질의 분석은 조직이나 세포시료에 비해 현저히 낮은 인산화 펩타이드 농축효율과 선택성으로 고통받고 있다.
이에, 본 발명에서는 높은 complexity와 넓은 dynamic range를 가진 depletion이 시행되지 않은 혈액 시료를 대상으로 인산화 펩타이드 농축법을 최적화하고 가장 높은 인산화 펩타이드 농축효율을 가진 방법을 개발하고자 하였다. 그에 따라, 동일한 양의 혈장시료를 사용했음에도 불구하고 인산화 펩타이드 농축법의 종류나 버퍼조성에 따라서 동정된 인산화 펩타이드, 인산화단백질, 인산화 위치, 인산화 펩타이드에 해당하는 spectra의 수가 크게 달라지는 것을 알 수 있었으며, 본 발명의 방법은 높은 인산화 펩타이드 농축효율을 가진 농축법을 이용할 수 있으나 이에 한정되지 아니한다.
실시예 1: 혈액 내 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드의 선정
알츠하이머병 조기 진단을 위하여 혈액의 인산화 단백질체에서 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 선정하고자 하였다. 이를 위해 8명의 건강한 참여자의 혈장 집합시료를 대상으로 혈장 인산화 단백질체를 대규모 분석한 후 기존의 대규모 알츠하이머성 치매 뇌조직 인산화 단백질체 연구(Dammer. et. al., Proteomics, 2015)에서 보고된 알츠하이머성 치매 뇌조직 특이적 인산화 단백질 141개와 비교하였고 44개의 인산화 단백질이 혈장에서 동정된 것을 확인하였다. 상기 44개의 인산화 단백질의 알츠하이머성 뇌조직 특이적 과인산화 현상에 대해 해당 대규모 인산화 단백질체 연구가 아닌 별도의 연구로도 추가로 보고된 단백질인 GSK3B (Glycogen synthase kinase 3 beta), NEFM (Neurofilament medium polypeptide), DPYSL2 (Dihydropyrimidinase-related protein 2), MAP1B (Microtubule-associated protein 1B) 및 MAP2 (Microtubule-associated protein 2)를 바이오마커로 이용할 혈액 내 치매 관련 인산화 단백질로 선정하였다 (Vanleuven. et. al., Frontiers in molecular neuroscience,4, 17, (2011); Gu. et. al., Biochemistry 39, 4267-4275 (2000); Rudrabhatla. et. al., The FASEB Journal 25, 3896-3905 (2011); Kang. et. al., Analytical and bioanalytical chemistry 406, 5433-5446 (2014)). 혈장에서 동정된 알츠하이머성 치매 뇌조직 특이적 인산화 위치를 포함하는 혈액 내 치매 관련 인산화 펩타이드 마커를 선정하기 위하여 치매 관련 단백질에서 혈장에서 동정된 인산화 위치와 알츠하이머성 치매 뇌조직 특이적 인산화 위치들을 도 1과 같이 비교하였다. 구체적으로, 혈장 인산화 단백질체와 알츠하이머성 뇌조직 특이적 인산화 단백질에서 중복되는 인산화 위치, 즉 혈장에서 동정된 알츠하이머성 치매 뇌조직 특이적 인산화 위치를 붉은 색으로 표시하였다.
실시예 2: 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드의 정량
알츠하이머병 조기 진단을 위하여 GSK3B (Glycogen synthase kinase 3 beta), NEFM (Neurofilament medium polypeptide), DPYSL2 (Dihydropyrimidinase-related protein 2), MAP1B (Microtubule-associated protein 1B) 및 MAP2 (Microtubule-associated protein 2) 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하여 이를 토대로 알츠하이머 조기 진단, 구체적으로는 알츠하이머성 경도인지장애(MCI-AD)를 판단하고자 하였다.
전체적인 실험의 모식도는 도 2에 나타내었고 구체적인 실험 방법은 도 3에 도시된 바와 같다. 구체적으로, 실험에 이용한 그룹별 혈장은 각 그룹에 해당하는 환자 10명으로부터 동일한 양을 얻어 합쳐진 혈액샘플로부터 얻었다.
여기에서 각 그룹은 다음을 의미한다.
Normal-: 인지능력도 정상이고 아밀로이드(amyloid) 침착이 일어나지 않은 그룹
Normal+ (preclinical AD): 인지능력은 정상이지만 아밀로이드 침착이 발견된 그룹
MCI-: 경도인지장애를 가지고 있지만 아밀로이드 침착이 일어나지 않은 그룹
MCI+ (MCI-AD): 경도인지장애를 가지고 있고 아밀로이드 침착이 발견된 그룹
AD-: 치매로 진단될 정도의 인지능력 저하가 일어났지만 아밀로이드 침착이 일어나지 않은 그룹
AD+ (Dementia-AD): 치매로 진단될 정도의 인지능력 저하가 일어났고 amyloid 침착이 발견되어 알츠하이머성 치매로 진단된 그룹
혈장 샘플을 용해 버퍼 (50mM Tris HCl pH 8.0, 8M urea, 25x Complete (protease inhibitor), 10X phosphatase inhibitor)로 용해(lysis)시켰다. 상기 용해된 샘플을 37℃에서 DTT(최종 농도 20mM)를 첨가하여 실온에서 30분 내지 1시간 동안 디설파이드 환원반응 시키고, 이오도아세트아미드(최종 농도 50mM)를 첨가하여 실온에서 암조건으로 30분간 설프히드릴기 알킬화 반응을 수행하였다. 처리된 샘플을 50mM NH4HCO3 를 이용하여 우레아의 최종 농도가 2M 이하가 되도록 희석하였고, 트립신과 샘플의 비율을 1:50으로 트립신 처리하여 37℃에서 18시간 반응시켰다. 그 후 C-18 Reverse Phase로 탈염화 하여 펩타이드 혼합물을 수득하였다. 리간드로 철 이온(Fe3+)이 흡착된 Fe-IMAC column을 사용하여 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography, IMAC)를 수행하였다. 수득된 펩타이드 혼합물을 로딩 버퍼 용액에 용해시킨 후 동일한 로딩 버퍼 용액으로 평형화 시켜놓은 Fe-IMAC column에 주입하였다. 샘플이 로딩된 Fe-IMAC column을 로딩 버퍼 용액으로 세척된 후 용출 버퍼 용액에 의해 인산화 펩타이드가 농축된 용출액을 수득하였다. 수득한 용출액을 액체크로마토그래피-병행 반응 모니터링(liquid chromatography-parallel reaction monitoring: LC-PRM)을 이용한 질량분석법을 통해 정량하였다.
여기에서 정량된 인산화 펩타이드의 목록은 하기 표 2에 기재된 바와 같다. 구체적으로, GSK3B (서열번호 2), NEFM (서열번호 4), DPYSL2 (서열번호 6), MAP1B (서열번호 8), MAP2 (서열번호 10) 전체 아미노산 서열로부터 넘버링된 인산화 위치를 기재하였으며, 각 펩타이드의 인산화 위치를 밑줄 및 볼드로 표시하였다.
추가로, 인산화 펩타이드 중에서, NEFM 단백질의 832번째 위치에는 deamidation이, MAP1B 단백질의 830번째 위치에는 oxidation이 존재함을 확인하였다(밑줄로 위치 표시).
일련번호 단백질 아미노산 서열 인산화 위치 서열목록
#1 GSK3B GEPNVS Y ICSR Y216 서열번호 1
#2 NEFM GVVTNGLDL S PADEK S837 서열번호 3
#3 DPYSL2 GLYDGPVCEVSV T PK T509 서열번호 5
#4 MAP1B SLM SS PEDLTK S831;S832 서열번호 7
#5 MAP2 SGTSTPTTPGSTAITPG T PPSYSSR T1605 서열번호 9
실시예 3: 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드의 정량결과 확인
상기 실시예 2의 방법을 통하여 각 그룹 별로 인산화 펩타이드를 정량한 결과를 나타내었다.
구체적으로, 도 4에서 인산화 펩타이드의 정량을 수치로 기재하였으며, 이를 히스토그램(도 5)과 히트맵(heatmap)(도 6)을 이용하여 도식화하였다. 히트맵에서는 대조군 대비 fold change로 도식화하였다.
도 4 내지 도 6에서 보는 바와 같이, 각각의 단백질로부터 유래된 인산화 펩타이드들이 알츠하이머병 특이적으로 증가된 것이 확인되었으며, 특히 대부분의 인산화 펩타이드들은 알츠하이머성 치매 초기, 즉 이전 단계인 MCI-AD에서 이미 2배 이상으로 증가한 것이 확인되었다.
실시예 4: MCI-AD 단계에서 조기 진단이 가능한 인산화 펩타이드의 정량결과 분석
상기 실시예 3의 결과를 통하여, 일부 인산화 펩타이드들이 알츠하이머성 치매 초기에 이미 증가한 것을 확인하였는바, 각 단계에 따른 특이적 증가를 보다 상세하게 확인하였다.
도 7은 인산화 펩타이드를 정량한 결과를 나타낸다. Normal+ 그룹에서는 별다른 증가를 확인할 수 없으나, MCI+ 그룹, 즉 경도인지장애를 가지고 있고 아밀로이드 침착이 발견된 그룹의 인산화 펩타이드 측정값이 2배 이상 증가한 것을 확인하였다.
이를 통해, 상기 인산화 펩타이드의 정량을 통해 경도인지장애가 있을 뿐 아니라 추후 치매로 발전될 수 있는 가능성이 있는 피검체를 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 도 4의 결과를 통해 치매 단계에 따른 인산화 펩타이드의 정량 결과가 인산화 펩타이드별로 양상이 달라진다는 것을 확인하였다. 이는 혈액 내 인산화된 알츠하이머병 관련 단백질은 뇌조직으로부터 뉴런의 사멸(신경변성)에 의한 수동적 방출뿐만 아니라 단백질의 종류와 인산화 위치에 따른 알츠하이머병 관련 단백질의 능동적 방출을 종합적으로 반영하는 것으로 보인다.
구체적으로 Normal-와 Normal+ 그룹에서 다른 인산화 펩타이드들은 전체적으로 큰 변화가 없지만 서열번호 9에 해당하는 MAP2 단백질 유래 인산화 펩타이드는 Normal+에서만 검출이 되는 것을 확인하였고, 해당 인산화 펩타이드의 정량을 통해 정상군과 구분하여 알츠하이머병 잠복기를 조기 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.
MCI-과 MCI+ 그룹의 구분에 있어서도 다른 펩타이드들은 최소 3배에서 7배 가량 증가하는 양상을 보인 반면, 서열번호 7번에 해당하는 MAP1B 단백질 유래 인산화 펩타이드는 오히려 약 2배 가량 감소하는 것을 확인하였다.
따라서 본 연구에서 확인한 치매 단계에 따른 인산화 펩타이드별 정량 결과를 통해, 도 8에서 제시한 바와 같이, 알츠하이머 특이적 인산화 잔기들의 다양한 조합을 이용하여 알츠하이머성 치매의 조기진단 및 단계구분, 또는 뇌 아밀로이드 베타 축적의 판별이 가능함을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Gwangju Institute of Science and Technology Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University Seoul National University R&DB Foundation <120> Method for Early Diagnosis and Staging of Alzheimer's Disease and Screening Cerebral Amyloid Deposition Using Phosphorylated Peptide Derived from Alzheimer's Disease Related Protein <130> KPA190117-KR <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GSK3B phophorylated peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> PHOSPHORYLATION <400> 1 Gly Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 420 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Gly Arg Pro Arg Thr Thr Ser Phe Ala Glu Ser Cys Lys Pro 1 5 10 15 Val Gln Gln Pro Ser Ala Phe Gly Ser Met Lys Val Ser Arg Asp Lys 20 25 30 Asp Gly Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro 35 40 45 Asp Arg Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr Lys Val Ile Gly Asn 50 55 60 Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu Cys Asp 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Asp 1685 1690 1695 Ser Ser Leu Ser His Lys Ile Pro Pro Met Glu Glu Pro Ser Tyr Thr 1700 1705 1710 Gln Asp Asn Asp Leu Ser Glu Leu Ile Ser Val Ser Gln Val Glu Ala 1715 1720 1725 Ser Pro Ser Thr Ser Ser Ala His Thr Pro Ser Gln Ile Ala Ser Pro 1730 1735 1740 Leu Gln Glu Asp Thr Leu Ser Asp Val Ala Pro Pro Arg Asp Met Ser 1745 1750 1755 1760 Leu Tyr Ala Ser Leu Thr Ser Glu Lys Val Gln Ser Leu Glu Gly Glu 1765 1770 1775 Lys Leu Ser Pro Lys Ser Asp Ile Ser Pro Leu Thr Pro Arg Glu Ser 1780 1785 1790 Ser Pro Leu Tyr Ser Pro Thr Phe Ser Asp Ser Thr Ser Ala Val Lys 1795 1800 1805 Glu Lys Thr Ala Thr Cys His Ser Ser Ser Ser Pro Pro Ile Asp Ala 1810 1815 1820 Ala Ser Ala Glu Pro Tyr Gly Phe Arg Ala Ser Val Leu Phe Asp Thr 1825 1830 1835 1840 Met Gln His His Leu Ala Leu Asn Arg Asp Leu Ser Thr Pro Gly Leu 1845 1850 1855 Glu Lys Asp Ser Gly Gly Lys Thr Pro Gly Asp Phe Ser Tyr Ala Tyr 1860 1865 1870 Gln Lys Pro Glu Glu Thr Thr Arg Ser Pro Asp Glu Glu Asp Tyr Asp 1875 1880 1885 Tyr Glu Ser Tyr Glu Lys 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(18) <223> PHOSPHORYLATION <400> 9 Ser Gly Thr Ser Thr Pro Thr Thr Pro Gly Ser Thr Ala Ile Thr Pro 1 5 10 15 Gly Thr Pro Pro Ser Tyr Ser Ser Arg 20 25 <210> 10 <211> 1827 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Ala Asp Glu Arg Lys Asp Glu Ala Lys Ala Pro His Trp Thr Ser 1 5 10 15 Ala Pro Leu Thr Glu Ala Ser Ala His Ser His Pro Pro Glu Ile Lys 20 25 30 Asp Gln Gly Gly Ala Gly Glu Gly Leu Val Arg Ser Ala Asn Gly Phe 35 40 45 Pro Tyr Arg Glu Asp Glu Glu Gly Ala Phe Gly Glu His Gly Ser Gln 50 55 60 Gly Thr Tyr Ser Asn Thr Lys Glu Asn Gly Ile Asn Gly Glu Leu Thr 65 70 75 80 Ser Ala Asp Arg Glu Thr Ala Glu Glu Val Ser Ala Arg Ile Val Gln 85 90 95 Val Val Thr Ala Glu Ala Val Ala Val Leu Lys Gly Glu Gln Glu Lys 100 105 110 Glu Ala Gln His Lys Asp Gln Thr Ala Ala Leu Pro Leu Ala Ala Glu 115 120 125 Glu Thr Ala Asn Leu Pro Pro Ser Pro Pro Pro Ser Pro Ala Ser Glu 130 135 140 Gln Thr Val Thr Val Glu Glu Asp Leu Leu Thr Ala Ser Lys Met Glu 145 150 155 160 Phe His Asp Gln Gln Glu Leu Thr Pro Ser 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Ser Ile Pro Thr 995 1000 1005 Asp Ala Ser Ser Glu Lys Ala Glu Lys Gly Leu Ser Ser Val Pro Glu 1010 1015 1020 Ile Ala Glu Val Glu Pro Ser Lys Lys Val Glu Gln Gly Leu Asp Phe 1025 1030 1035 1040 Ala Val Gln Gly Gln Leu Asp Val Lys Ile Ser Asp Phe Gly Gln Met 1045 1050 1055 Ala Ser Gly Leu Asn Ile Asp Asp Arg Arg Ala Thr Glu Leu Lys Leu 1060 1065 1070 Glu Ala Thr Gln Asp Met Thr Pro Ser Ser Lys Ala Pro Gln Glu Ala 1075 1080 1085 Asp Ala Phe Met Gly Val Glu Ser Gly His Met Lys Glu Gly Thr Lys 1090 1095 1100 Val Ser Glu Thr Glu Val Lys Glu Lys Val Ala Lys Pro Asp Leu Val 1105 1110 1115 1120 His Gln Glu Ala Val Asp Lys Glu Glu Ser Tyr Glu Ser Ser Gly Glu 1125 1130 1135 His Glu Ser Leu Thr Met Glu Ser Leu Lys Ala Asp Glu Gly Lys Lys 1140 1145 1150 Glu Thr Ser Pro Glu Ser Ser Leu Ile Gln Asp Glu Ile Ala Val Lys 1155 1160 1165 Leu Ser Val Glu Ile Pro Cys Pro Pro Ala Val Ser Glu Ala Asp Leu 1170 1175 1180 Ala Thr Asp Glu Arg Ala Asp Val Gln Met Glu Phe Ile Gln Gly Pro 1185 1190 1195 1200 Lys Glu 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Asn Leu Leu Glu Ser 1795 1800 1805 Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Glu Asp Val Thr Ala Ala Leu Ala Lys 1810 1815 1820 Gln Gly Leu 1825

Claims (26)

  1. (a) 분리된 생물학적 시료로부터 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 단계를 포함하는,
    알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분을 위한 정보의 제공 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머병 조기 진단은 알츠하이머병 잠복기 및 알츠하이머성 경도인지장애의 조기 진단을 포함하고; 알츠하이머병 단계 구분은 알츠하이머병 잠복기 단계, 알츠하이머성 경도인지장애 단계, 및 알츠하이머성 치매 단계 간의 구분을 포함하는 것인, 정보의 제공 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질은 GSK3B (Glycogen synthase kinase 3 beta), NEFM (Neurofilament medium polypeptide), DPYSL2 (Dihydropyrimidinase-related protein 2), MAP1B (Microtubule-associated protein 1B) 및 MAP2 (Microtubule-associated protein 2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질인 것인, 정보의 제공 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 인산화는 GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화인 것인, 정보의 제공 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 GSK3B 단백질에서 Y216, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 NEFM 단백질에서 S837, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 DPYSL2 단백질에서 T509, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 MAP1B 단백질에서 S831;S832, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 MAP2 단백질에서 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 5 내지 30개의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 정보의 제공 방법.
  6. 제1항에 있어서, (c) 상기 정량된 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 정보의 제공 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머병 조기 진단은 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머병 잠복기를 조기 진단하는 것으로서, MAP2 단백질의 T1605 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 상기 정량값이 인지기능이 정상이고 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머병 잠복기인 것으로 판단하는 것인, 정보의 제공 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머병 조기 진단은 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머성 경도인지장애를 조기 진단하는 것으로서, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, 및 MAP1B 단백질의 S831;S832로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 인지기능이 정상이고 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애인 것으로 판단하는 것인, 정보의 제공 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머병 단계 구분은 알츠하이머병 잠복기 단계와 알츠하이머성 경도인지장애 단계를 구분하는 것으로서, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 알츠하이머병 잠복기 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애 단계인 것으로 판단하는 것인, 정보의 제공 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머병 단계 구분은 알츠하이머성 경도인지장애 단계와 알츠하이머성 치매 단계를 구분하는 것으로서, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 알츠하이머성 경도인지장애 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 치매 단계인 것으로 판단하는 것인, 정보의 제공 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드는 분리된 생물학적 시료 내 단백질을, 단백질 분해효소를 이용하여 펩타이드화하여 수득되는 것인, 정보의 제공 방법.
  12. 제11항에 있어서, 단백질 분해효소는 Lys-c, Arg-C, Asp-N, Gluc-C, Lys-N, 서몰리신(thermolysin), 엘라스타제(elastase), Tryp-N, 트립신(trypsin) 및 키모트립신(chymotrypsin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 분해효소인 것인, 정보의 제공 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 수득된 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 인산화 펩타이드 농축법에 의해 농축하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 정보의 제공 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 정보의 제공 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드의 정량은 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS)를 이용한 질량분석법에 의해 수행되는 것인, 정보의 제공 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 질량분석법은 LC-SRM(liquid chromatography-selected reaction monitoring), PRM(Parallel Reaction Monitoring), SIM(Selected Ion monitoring) 또는 MRM(Multiple Reaction Monitoring)인 것인, 정보의 제공 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 정량된 인산화 펩타이드의 양에 대하여 T 검정 p-값 분석, ROC (Receiver-Operating curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석 중 한 가지 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 정량적 프로파일링을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 정보의 제공 방법.
  18. (a) 분리된 생물학적 시료로부터 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 단계를 포함하는,
    뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 정보의 제공 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은 인지기능 정상군 또는 경도인지장애 환자군에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부를 판별하는 것인, 정보의 제공 방법.
  20. 제18항에 있어서, 알츠하이머성 치매 관련 단백질은 MAP1B (Microtubule-associated protein 1B) 및 MAP2 (Microtubule-associated protein 2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질인 것인, 정보의 제공 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 인산화는 MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화인 것인, 정보의 제공 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 MAP1B 단백질에서 S831;S832, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 MAP2 단백질에서 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 5 내지 30개의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 정보의 제공 방법.
  23. 제18항에 있어서, (c) 상기 정량된 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 정보의 제공 방법.
  24. 제18항에 있어서, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은 인지기능 정상군에서 판별하는 것으로서, MAP2 단백질의 T1605 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 뇌의 아밀로이드 베타 축적되지 않은 인지기능 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단하는 것인, 정보의 제공 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은 경도인지장애 환자군에서 판별하는 것으로서, MAP1B 단백질의 S831;S832 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 뇌의 아밀로이드 베타 축적되지 않은 경도인지장애 환자 대조군과 비교하여 낮은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 낮은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단하는 것인, 정보의 제공 방법.
  26. GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화 부위를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분, 또는 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 조성물.
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