WO2024005592A1 - 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 이용한 알츠하이머병 조기 진단, 단계 구분 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법 - Google Patents
알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 이용한 알츠하이머병 조기 진단, 단계 구분 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a method for early diagnosis of Alzheimer's disease using phosphorylated peptides, and more specifically, to a method for early diagnosis or stage classification of Alzheimer's disease by measuring the phosphorylation level of Alzheimer's disease-related proteins in biological samples, and for determining amyloid beta accumulation in the brain. It's about method.
- Alzheimer's disease is one of the biggest causes of dementia, and interest is growing as the number of patients is increasing. However, until now, the exact cause has not been identified and no cure has been found.
- MRI magnetic resonance imaging
- SPECT single-photon emission computed tomography
- PET positron emission tomography
- a diagnosis of Alzheimer's disease is made by observing the symptoms and combining observations of changes in behavior and perception through questionnaires such as MMSE (mini mental status examination).
- Alzheimer's disease has two stages: a "preclinical” stage in which the patient's behavior appears normal but pathological changes occur in the brain before the symptoms of the disease appear, and a “mild cognitive impairment (MCI)” stage in which mild cognitive decline occurs.
- MCI mimild cognitive impairment
- the differentiation of amyloid beta accumulation in the brain which is the causative agent of Alzheimer's dementia and has a significant correlation with the progression of the disease, is the basis for subclassifying patients with Alzheimer's disease and non-Alzheimer's disease even in patients at different stages of dementia with the same degree of cognitive function. It can be used for customized treatment for each patient and for additional diagnosis in the future.
- cerebrospinal fluid is painful during the sample collection process, is not easy to collect, has concerns about medical side effects, and is particularly difficult to collect from elderly patients with Alzheimer's disease, so it cannot be easily used as a general diagnostic method.
- blood is considered to be a suitable sample for developing an effective Alzheimer's disease biomarker based on the fact that it is easier to collect than cerebrospinal fluid and research showing that 500 ml of cerebrospinal fluid is absorbed into the blood every day.
- amyloid beta and tau proteins in the blood as early diagnosis markers.
- amyloid beta completely conflicting results were obtained for each research group, and in the case of tau protein, the results showed that the concentration ranges of tau protein in the Alzheimer's disease patient group and the normal control group overlapped greatly, so its utility as an indicator for early diagnosis seemed to be very low.
- tau protein the results showed that there is a high correlation between the mechanisms of dementia onset/progression and hyperphosphorylation of abnormal brain proteins, so phosphorylation of proteins rather than entire proteins is attracting attention as a new blood indicator for diagnosing Alzheimer's disease.
- phosphorylated Alzheimer's disease-related proteins in the blood comprehensively reflect not only passive release due to death (neurodegeneration) of neurons from brain tissue but also active release of Alzheimer's disease-related proteins depending on the phosphorylation site, they are released from blood, not brain tissue. It is essential to directly measure the phosphorylation level of Alzheimer's disease-related proteins present in the body and use it as an indicator for early diagnosis, stage classification, and differentiation of amyloid beta accumulation in the brain.
- phosphorylated proteins account for less than ⁇ 20% of the total protein amount compared to other tissue samples.
- the method of diagnosis is limited to the quantification of hyperphosphorylation of tau protein by Digital ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay), an ultra-sensitive immunoassay technology that digitally measures enzyme single molecule activity using a microwell array with a size of several tens of microns. . Since the above method has the problems of immunoassay (low throughput, affinity and specificity that varies depending on the sample and epitope, and the need for an antibody for the epitope to be quantified), an alternative method is needed for early diagnosis of Alzheimer's disease that can be used in actual clinical practice. .
- the present inventors used an efficient phosphorylated peptide concentration method and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to determine the presence of amyloid beta in the blood.
- LC-MS liquid chromatography-mass spectrometry
- One object of the present invention is to provide a method for early diagnosis of Alzheimer's disease, stage classification, and discrimination of amyloid beta accumulation in the brain by obtaining and quantitatively analyzing phosphorylated peptides derived from proteins related to Alzheimer's disease in biological samples including blood and cerebrospinal fluid. .
- Another object of the present invention is to provide a biomarker and composition for early diagnosis of Alzheimer's disease, classification of stages, and discrimination of amyloid beta accumulation in the brain.
- Figure 1 shows representative Alzheimer's brain tissue-specific phosphorylated proteins and phosphorylation sites identified in plasma for selection of dementia-related phosphorylated peptides of the present invention.
- FIG. 2 shows an overall schematic diagram for carrying out the method of the present invention.
- FIG. 3 shows specific steps for carrying out the method of the present invention.
- Figure 4 is a diagram showing the quantitative quantification of the phosphorylated peptide of the present invention in numerical terms.
- Figure 5 is a histogram diagram showing the quantification of phosphorylated peptides of the present invention.
- Figure 6 is a diagram illustrating the quantification of phosphorylated peptides of the present invention as a heatmap.
- Figure 7 shows the results of quantifying phosphorylated peptides that can determine mild cognitive impairment of Alzheimer's disease according to the present invention.
- Figure 8 is a schematic diagram of phosphorylation sites that show a specific increase according to the stage of Alzheimer's disease according to the present invention or show a specific change according to amyloid accumulation in the brain at the same stage.
- the present invention includes the steps of (a) obtaining a phosphorylated peptide derived from an Alzheimer's dementia-related protein from an isolated biological sample; and (b) quantifying the phosphorylated peptide derived from the protein related to Alzheimer's disease. It provides a method for early diagnosis or stage classification of Alzheimer's disease.
- the method may refer to a method of providing information for early diagnosis or stage classification of Alzheimer's disease.
- the present invention includes the steps of (a) obtaining a phosphorylated peptide derived from an Alzheimer's dementia-related protein from an isolated biological sample; and (b) quantifying the phosphorylated peptide derived from the Alzheimer's dementia-related protein. It provides a method for determining amyloid beta accumulation in the brain.
- the method may refer to a method of providing information for determining amyloid beta accumulation in the brain.
- the method may further include the step of (c) comparing the quantified phosphorylated peptide derived from an Alzheimer's dementia-related protein with a control group.
- the method of the present invention for early diagnosis of Alzheimer's disease, classification of stages, and determination of amyloid beta accumulation in the brain includes the steps of peptideting a protein in a separated biological sample using a proteolytic enzyme; Concentrating phosphorylated peptides derived from Alzheimer's disease-related dementia proteins by applying a phosphorylated peptide concentration method to the obtained peptides; Quantifying the concentrated phosphorylated peptides derived from the Alzheimer's dementia-related protein using mass spectrometry using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS); and comparing the quantified amount of phosphorylated peptide with a control group.
- LC-MS liquid chromatography-mass spectrometry
- the basic feature of the present invention is to develop a test method for effective early diagnosis of Alzheimer's disease, classification of stages, and discrimination of amyloid beta accumulation in the brain, for patients who have not yet reached Alzheimer's disease, in the latent stage.
- MCI Alzheimer's mild cognitive impairment
- This may be to differentiate beta accumulation.
- Alzheimer's disease dementia patients many studies were conducted showing significant differences between actual Alzheimer's disease dementia patients and normal people, but there was no significant difference between the preclinical AD and/or Alzheimer's mild cognitive impairment (MCI) stage, which is the stage before the symptoms of the disease appear, and normal people. Early diagnosis was difficult as no differences were observed. However, the present invention has developed a method for early diagnosis using blood samples and differentiation of amyloid beta accumulation in the brain through quantification of peptides derived from various Alzheimer's dementia-related proteins that are phosphorylated at specific positions.
- MCI Alzheimer's mild cognitive impairment
- each stage of Alzheimer's disease can be determined and amyloid beta accumulation in the brain can be distinguished from a group of patients at the same cognitive function stage.
- the early diagnosis of Alzheimer's disease may include early diagnosis of Alzheimer's disease latency and Alzheimer's mild cognitive impairment, and the Alzheimer's disease stages are divided into Alzheimer's disease latency stage, Alzheimer's mild cognitive impairment stage, and May include distinction between stages of Alzheimer's dementia.
- the Alzheimer's dementia-related proteins include GSK3B (Glycogen synthase kinase 3 beta), NEFM (Neurofilament medium polypeptide), DPYSL2 (Dihydropyrimidinase-related protein 2), MAP1B (Microtubule-associated protein 1B), and MAP2 (Microtubule-associated protein 2). It may be one or more proteins selected from the group consisting of GSK3B (Glycogen synthase kinase 3 beta), NEFM (Neurofilament medium polypeptide), DPYSL2 (Dihydropyrimidinase-related protein 2), MAP1B (Microtubule-associated protein 1B), and MAP2 (Microtubule-associated protein 2). It may be one or more proteins selected from the group consisting of
- phosphorylation of Alzheimer's disease-related proteins quantified for early diagnosis or stage classification of Alzheimer's disease is Y216 of GSK3B protein, S837 of NEFM protein, T509 of DPYSL2 protein, S831;S832 of MAP1B protein, and T1605 of MAP2 protein. It may be phosphorylation at one or more positions selected from the group consisting of.
- the phosphorylated peptide derived from an Alzheimer's dementia-related protein for early diagnosis or stage classification of Alzheimer's disease is Y216 in the GSK3B protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, S837 in the NEFM protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, At least one selected from the group consisting of T509 in the DPYSL2 protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, S831;S832 in the MAP1B protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and T1605 in the MAP2 protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. It may be composed of a 3 to 50 amino acid sequence including phosphorylation at the position, specifically, it may be composed of a 5 to 30 amino acid sequence, and more specifically, it may be composed of an 11 to 25 amino acid sequence. there is.
- the early diagnosis of Alzheimer's disease may be an early diagnosis of the latent period of Alzheimer's disease by distinguishing the patient from a normal control group.
- a method for early diagnosis of Alzheimer's disease latency by distinguishing it from normal controls is to quantify phosphorylated peptides derived from proteins containing phosphorylation at the T1605 position of MAP2 protein, and the quantitative value is similar to that of normal controls with normal cognitive function and no brain amyloid plaques. If it is higher in comparison, or if it is higher than the standard set by the quantitative value of the control group, it can be judged to be Alzheimer's disease incubation period.
- the quantified protein-derived phosphorylated peptide is at least 2 times, preferably at least 3 times, more preferably at least 4 times, and even more preferably at least 5 times compared to the normal control group with normal cognitive function and no brain amyloid plaques. If it is higher than this, it can be judged to be in the Alzheimer's disease incubation period, and if it is higher than the standard set by the quantitative value of the control group, it can be judged to be in the Alzheimer's disease incubation period.
- the early diagnosis of Alzheimer's disease may be an early diagnosis of Alzheimer's mild cognitive impairment by distinguishing it from a normal control group.
- a method for early diagnosis of Alzheimer's mild cognitive impairment by distinguishing it from normal controls is phosphorylation of one or more positions selected from the group consisting of Y216 of GSK3B protein, S837 of NEFM protein, T509 of DPYSL2 protein, and S831;S832 of MAP1B protein. It quantifies protein-derived phosphorylated peptides, and if the quantitative value is higher than that of a normal control group with normal cognitive function and no brain amyloid plaques, or if it is higher than the standard set by the quantitative value of the control group, it is judged to be Alzheimer's mild cognitive impairment.
- the quantified protein-derived phosphorylated peptide is at least 2 times, preferably at least 3 times, more preferably at least 4 times, and even more preferably at least 5 times compared to the normal control group with normal cognitive function and no brain amyloid plaques. If it is higher than this, it can be judged to be Alzheimer's mild cognitive impairment, and if it is higher than the standard set by the quantitative value of the control group, it can be judged to be Alzheimer's mild cognitive impairment.
- the classification of Alzheimer's disease stages may be divided into an Alzheimer's disease latent stage and an Alzheimer's mild cognitive impairment stage.
- the method for distinguishing between the latent stage of Alzheimer's disease and the mild cognitive impairment stage of Alzheimer's disease is one selected from the group consisting of Y216 of GSK3B protein, S837 of NEFM protein, T509 of DPYSL2 protein, S831;S832 of MAP1B protein, and T1605 of MAP2 protein.
- the classification of the stages of Alzheimer's disease may be divided into a stage of mild cognitive impairment of Alzheimer's disease and a stage of Alzheimer's dementia.
- the method for distinguishing between the mild cognitive impairment stage of Alzheimer's disease and the stage of Alzheimer's dementia is one selected from the group consisting of Y216 of the GSK3B protein, S837 of the NEFM protein, T509 of the DPYSL2 protein, S831;S832 of the MAP1B protein, and T1605 of the MAP2 protein.
- phosphorylation selected from the group consisting of Y216 of GSK3B protein, S837 of NEFM protein, T509 of DPYSL2 protein, and T1605 of MAP2 protein. This is to quantify tau protein-derived phosphorylated peptides, and if the quantitative value is higher than that of the mild cognitive disorder control group for Alzheimer's disease or is higher than the standard value set by the quantitative value of the control group, it can be judged to be in the stage of Alzheimer's dementia.
- Alzheimer's dementia it can be judged to be in the stage of Alzheimer's dementia if it is higher than the standard set by the quantitative value of the control group.
- the biological sample is characterized in that it is one or more selected from the group consisting of whole blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, saliva, urine, sputum, lymph fluid, and cells.
- the phosphorylated peptide derived from an Alzheimer's dementia-related protein may be obtained by converting a protein in an isolated biological sample into a peptide using a proteolytic enzyme.
- the proteolytic enzymes include Lys-c, Arg-C, Asp-N, Gluc-C, Lys-N, thermolysin, elastase, Tryp-N, trypsin, and It may be one or more proteolytic enzymes selected from the group consisting of chymotrypsin.
- the phosphorylated Alzheimer's dementia-related protein or protein fragment may be obtained by a phosphorylated protein or phosphorylated peptide concentration method.
- the quantification of the phosphorylated peptide derived from the Alzheimer's dementia-related protein may be performed by mass spectrometry using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
- the mass spectrometry method may be liquid chromatography-selected reaction monitoring (LC-SRM), parallel reaction monitoring (PRM), selected ion monitoring (SIM), or multiple reaction monitoring (MRM).
- the quantified amount of phosphorylated peptide may be a ratio to the total protein.
- the step of performing quantitative profiling on the quantified amount of phosphorylated peptide may be further included.
- a quantitative profile characterized in that one or more of T test p-value analysis, ROC (Receiver-Operating curve), and AUC (Area under the ROC curve) analysis is selected and performed on the quantified amount of phosphorylated peptide.
- An additional step of performing a ring may be included.
- the quantitative profiling is performed by injecting an isotope-substituted protein standard (stable isotope labeled protein standard) or a peptide standard (stable isotope labeled peptide standard) before or after peptidation of proteins, and phosphorylation obtained using synthetic labeled peptides.
- the absolute quantification value can be compared as a ratio to the total protein amount, where the amount of total protein is also determined by isotope substituted protein standard (stable isotope labeled protein standard) or peptide standard (stable isotope labeled peptide standard). It may be an absolute quantitative value obtained.
- the relevant standard can be implemented by setting an appropriate standard according to specific embodiments. For example, by determining the threshold (cutoff) of the control range (upper limit if it increases / lower limit if it decreases), if the amount of fragment peptides of the phosphorylated protein fluctuates more than the threshold, “significantly compared to the average” It can be judged as “high”.
- the absolute quantitative value corresponding to the control group is 2 times or more, preferably 3 times or more, more preferably 4 times or more, and even more preferably 5 times or more. If it is high, it can be judged to be each stage.
- early diagnosis of Alzheimer's disease may include identifying a subject for subsequent onset.
- early diagnosis of Alzheimer's disease latent period may further include identifying a subject approximately 5 to 25 years or less from the onset of Alzheimer's disease mild cognitive impairment
- early diagnosis of Alzheimer's disease mild cognitive impairment may include Alzheimer's dementia. It may further include identifying the subject as approximately 5 to 25 years or less from onset.
- the classification of Alzheimer's disease stages refers to the purpose of selecting only subjects corresponding to the Alzheimer's disease stage targeted by the actual treatment in clinical trials for subjects, or to provide pharmaceutical compositions corresponding to each stage. It may be for selecting subjects for administration.
- the determination of amyloid beta accumulation in the brain may be to determine amyloid beta accumulation in the brain in a normal cognitive function group, a patient group with mild cognitive impairment, or a patient group with dementia.
- the Alzheimer's dementia-related protein quantified to determine amyloid beta accumulation in the brain may be one or more proteins selected from the group consisting of MAP1B (Microtubule-associated protein 1B) and MAP2 (Microtubule-associated protein 2).
- the phosphorylation of the Alzheimer's dementia-related protein quantified to determine amyloid beta accumulation in the brain may be phosphorylation at one or more positions selected from the group consisting of S831;S832 of the MAP1B protein and T1605 of the MAP2 protein.
- the phosphorylated peptide derived from an Alzheimer's dementia-related protein for determining amyloid beta accumulation in the brain is S831;S832 in the MAP1B protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and T1605 in the MAP2 protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10.
- phosphorylated peptide containing phosphorylation at one or more positions selected from the group consisting of, and the phosphorylated peptide may be composed of a 3 to 50 amino acid sequence including phosphorylation at the positions listed above, specifically 5 to 30 amino acid sequences. It may be composed of an amino acid sequence, and more specifically, it may be composed of an amino acid sequence of 11 to 25 amino acids.
- the determination of amyloid beta accumulation in the brain may be made in a group with normal cognitive function. Determination of amyloid beta accumulation in the brain in the cognitively normal group involves quantifying phosphorylated peptides derived from proteins containing phosphorylation at the T1605 position of the MAP2 protein, and the quantitative value is higher compared to the cognitively normal control group without amyloid beta accumulation in the brain. If it is higher than the standard set by the quantitative value of the case or control group, it can be judged that amyloid beta has accumulated in the brain.
- the quantified protein-derived phosphorylated peptide is at least 2 times, preferably at least 3 times, more preferably at least 4 times, and even more preferably at least 5 times compared to the group with normal cognitive function without amyloid beta accumulation in the brain. If it is high, it can be judged as amyloid beta accumulation in the brain, and if it is higher than the standard set by the quantitative value of the control group, it can be judged as amyloid beta accumulation in the brain.
- the determination of amyloid beta accumulation in the brain may be made in a group of patients with mild cognitive impairment.
- Determination of brain amyloid beta accumulation in the mild cognitive impairment patient group involves quantifying phosphorylated peptides derived from proteins containing phosphorylation at the S831; If it is lower than the reference value set by the quantitative value of the control group, it can be judged that amyloid beta has accumulated in the brain.
- the quantified protein-derived phosphorylated peptide is at least 2 times, preferably at least 3 times, more preferably at least 4 times, and even more preferably at least 5 times compared to the mild cognitive impairment patient group without amyloid beta accumulation in the brain. If it is low, it can be judged as amyloid beta accumulation in the brain, and if it is lower than the standard set by the quantitative value of the control group, it can be judged as amyloid beta accumulation in the brain.
- the determination of brain amyloid beta accumulation refers to the purpose of selecting only subjects corresponding to the brain amyloid beta accumulation targeted by the actual treatment in clinical trials targeting subjects, or the brain amyloid beta accumulation at each stage. It may be for selecting subjects to administer the corresponding pharmaceutical composition.
- the brain amyloid beta accumulation is used to diagnose diseases related to brain amyloid beta accumulation, or to determine whether an amyloid beta-related PET test is necessary.
- the brain amyloid beta accumulation diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, dementia, Lewy body dementia, and hunting disorder. This may be for the purpose of determining brain amyloid accumulation, including Ton's disease dementia, preclinical Alzheimer's disease, Down syndrome, or cognitive impairment.
- the present invention provides a phosphorylation site at one or more positions selected from the group consisting of Y216 of GSK3B protein, S837 of NEFM protein, T509 of DPYSL2 protein, S831;S832 of MAP1B protein, and T1605 of MAP2 protein.
- a composition for early diagnosis or stage classification of Alzheimer's disease, or for determining amyloid beta accumulation in the brain including an agent capable of detecting.
- the phosphorylation site and early diagnosis or stage classification of Alzheimer's disease, or discrimination of amyloid beta accumulation in the brain are the same as described above.
- the present invention can provide a phosphorylated peptide for early diagnosis or stage classification of Alzheimer's disease, or for determining amyloid beta accumulation in the brain.
- Y216 in the GSK3B protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 S837 in the NEFM protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, T509 in the DPYSL2 protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and amino acid of SEQ ID NO: 8.
- It is a phosphorylated peptide containing phosphorylation at positions S831;S832 in the MAP1B protein shown in the sequence and T1605 in the MAP2 protein shown in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and consists of a 3 to 50 amino acid sequence containing phosphorylation at each position. It may be composed of 5 to 30 amino acid sequences, and more specifically, it may be composed of 11 to 25 amino acid sequences.
- it may be a phosphorylated peptide derived from a protein containing phosphorylation at the T1605 position of the MAP2 protein for early diagnosis of Alzheimer's disease latency by distinguishing it from a normal control group.
- it may be a phosphorylated peptide of SEQ ID NO: 9. Not limited.
- Y216 of GSK3B protein, S837 of NEFM protein, T509 of DPYSL2 protein, S831;S832 of MAP1B protein, and T1605 of MAP2 protein for early diagnosis of Alzheimer's mild cognitive impairment by distinguishing it from normal control group.
- It may be a phosphorylated peptide derived from a protein containing phosphorylation at one or more positions selected from the group consisting of, and specifically, it may be a phosphorylated peptide of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, and/or SEQ ID NO: 9.
- SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3
- SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7
- SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 9
- Y216 of the GSK3B protein, S837 of the NEFM protein, T509 of the DPYSL2 protein, S831;S832 of the MAP1B protein, and T1605 of the MAP2 protein to distinguish between the latent stage of Alzheimer's disease and the mild cognitive impairment stage of Alzheimer's disease.
- It may be a phosphorylated peptide derived from a protein containing phosphorylation at one or more positions selected from the group consisting of, and specifically, it may be a phosphorylated peptide of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, and/or SEQ ID NO: 9.
- SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3
- SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7
- SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 9
- Y216 of GSK3B protein, S837 of NEFM protein, T509 of DPYSL2 protein, S831;S832 of MAP1B protein, and T1605 of MAP2 protein to distinguish between Alzheimer's mild cognitive impairment stage and Alzheimer's dementia stage.
- It may be a phosphorylated peptide derived from a protein containing phosphorylation at one or more positions selected from the group consisting of, and specifically, it may be a phosphorylated peptide of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, and/or SEQ ID NO: 9.
- SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3
- SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7
- SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 9
- it may be a phosphorylated peptide derived from a protein containing phosphorylation at the T1605 position of the MAP2 protein for determining amyloid beta accumulation in the brain in a group with normal cognitive function, and specifically, it may be the phosphorylated peptide of SEQ ID NO: 9. It is not limited to this.
- it may be a phosphorylated peptide derived from a protein containing phosphorylation at positions S831;S832 of the MAP1B protein for determining amyloid beta accumulation in the brain in a group of patients with mild cognitive impairment, and specifically, it may be a phosphorylated peptide of SEQ ID NO: 7. may, but is not limited to this.
- the hyperphosphorylation of Alzheimer's dementia-related proteins is measured to enable early diagnosis and stage classification of Alzheimer's disease and differentiation of amyloid beta accumulation in the brain, and this hyperphosphorylation of Alzheimer's dementia-related proteins is associated with tauopathy ( tauopathy), so it is not only Alzheimer's disease, but also progressive supranuclear palsy (PSP), corticobasal degeneration (CBD), Pick's disease, FTDP-17 (frontotemporal dementias with parkinsonism liked to It can also be applied to degenerative brain diseases related to tauopathy, including chromosome 17) and chronic traumatic encephalopathy (CTE).
- tauopathy tauopathy
- PPSP progressive supranuclear palsy
- CBD corticobasal degeneration
- Pick's disease FTDP-17 (frontotemporal dementias with parkinsonism liked to It can also be applied to degenerative brain diseases related to tauopathy, including chromosome 17) and chronic traumatic encephalopathy (CTE).
- Diagnosing Alzheimer's disease through blood has advantages in many aspects such as non-invasiveness, cost, and facilities, but since blood exchanges substances with various tissues, including the brain, the specificity of the diagnosis through blood indicators is low. There are many cases of falling. In addition, in existing cases using the immunoassay method, there were limitations due to the availability, specificity, and sensitivity of antibodies.
- various pretreatment methods are used to solve problems caused by the characteristics of blood samples that interfere with blood sample analysis, such as immunodepletion method to remove a small number of high-concentration proteins, and various peptides as a method to reduce the dynamic range of protein concentration.
- Methods such as diluting high-concentration protein concentration and concentrating low-concentration phosphorylated proteins using a bead library of ligand combinations, and fractionation methods to reduce complexity were attempted, but each had limitations.
- the present invention sought to optimize the phosphorylated peptide concentration method for blood samples without depletion with high complexity and wide dynamic range and to develop a method with the highest phosphorylated peptide concentration efficiency. Accordingly, even though the same amount of plasma sample was used, it was found that the number of identified phosphorylated peptides, phosphorylated proteins, phosphorylated sites, and spectra corresponding to phosphorylated peptides varied greatly depending on the type of phosphorylated peptide concentration method or buffer composition.
- the method of the present invention can use a concentration method with high phosphorylated peptide concentration efficiency, but is not limited to this.
- Example 1 Selection of phosphorylated peptides derived from proteins related to Alzheimer's disease in blood
- Alzheimer's disease For early diagnosis of Alzheimer's disease, we attempted to select phosphorylated peptides derived from proteins related to Alzheimer's disease from the phosphorylated proteome of blood. For this purpose, we conducted a large-scale analysis of the plasma phosphoproteome in the collective plasma samples of eight healthy participants, and then analyzed the Alzheimer's dementia reported in the existing large-scale Alzheimer's dementia brain tissue phosphoproteome study (Dammer. et. al., Proteomics, 2015). It was compared with 141 brain tissue-specific phosphorylated proteins, and 44 phosphorylated proteins were confirmed to be identified in plasma.
- the Alzheimer's brain tissue-specific hyperphosphorylation of the above 44 phosphorylated proteins was additionally reported in a separate study other than the large-scale phosphorylated proteome study, including GSK3B (Glycogen synthase kinase 3 beta) and NEFM (Neurofilament medium polypeptide).
- GSK3B Glycogen synthase kinase 3 beta
- NEFM Neuroofilament medium polypeptide
- DPYSL2 Dihydropymidinase-related protein 2
- MAP1B Microtubule-associated protein 1B
- MAP2 Microtubule-associated protein 2
- Alzheimer's dementia brain tissue-specific phosphorylation sites in dementia-related proteins were identified in Figure 1. It was compared as follows. Specifically, the overlapping phosphorylation sites in the plasma phosphorylated proteome and the Alzheimer's brain tissue-specific phosphorylated protein, that is, the Alzheimer's dementia brain tissue-specific phosphorylation sites identified in the plasma, are indicated in red.
- Example 2 Quantification of phosphorylated peptides derived from Alzheimer's dementia-related proteins
- GSK3B Generic kinase 3 beta
- NEFM Neurofilament medium polypeptide
- DPYSL2 Densihydropyrimidinase-related protein 2
- MAP1B Microtubule-associated protein 1B
- MAP2 Microtubule-associated protein 2
- FIG. 2 A schematic diagram of the overall experiment is shown in Figure 2, and the specific experimental method is as shown in Figure 3. Specifically, the plasma for each group used in the experiment was obtained from blood samples obtained from the same amount of 10 patients in each group and combined.
- each group means:
- Normal- A group with normal cognitive ability and no amyloid deposition.
- MCI- Group with mild cognitive impairment but without amyloid deposition
- AD- A group in which cognitive decline occurred to the extent of being diagnosed as dementia but no amyloid deposition occurred.
- AD+ (Dementia-AD): A group diagnosed with Alzheimer's dementia due to a decline in cognitive ability sufficient to be diagnosed as dementia and amyloid deposition discovered.
- Plasma samples were lysed with lysis buffer (50mM Tris HCl pH 8.0, 8M urea, 25x Complete (protease inhibitor), 10X phosphatase inhibitor).
- the dissolved sample was subjected to a disulfide reduction reaction at 37°C by adding DTT (final concentration 20mM) for 30 minutes to 1 hour at room temperature, and then adding iodoacetamide (final concentration 50mM) and setting it for 30 minutes in the dark at room temperature.
- DTT final concentration 20mM
- iodoacetamide final concentration 50mM
- the treated sample was diluted with 50mM NH 4 HCO 3 so that the final concentration of urea was 2M or less, trypsinized at a ratio of trypsin to sample of 1:50, and reacted at 37°C for 18 hours. Afterwards, it was desalted using C-18 Reverse Phase to obtain a peptide mixture.
- Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) was performed using a Fe-IMAC column adsorbed with iron ions (Fe 3+ ) as a ligand. The obtained peptide mixture was dissolved in a loading buffer solution and then injected into a Fe-IMAC column equilibrated with the same loading buffer solution.
- the Fe-IMAC column loaded with the sample was washed with a loading buffer solution, and then an eluate in which phosphorylated peptides were concentrated by the elution buffer solution was obtained.
- the obtained eluate was quantified through mass spectrometry using liquid chromatography-parallel reaction monitoring (LC-PRM).
- the list of phosphorylated peptides quantified here is as shown in Table 2 below. Specifically, the numbered phosphorylation sites from the entire amino acid sequence of GSK3B (SEQ ID NO: 2), NEFM (SEQ ID NO: 4), DPYSL2 (SEQ ID NO: 6), MAP1B (SEQ ID NO: 8), and MAP2 (SEQ ID NO: 10) were described, and each The phosphorylation site of the peptide is underlined and bolded.
- Example 3 Confirmation of quantitative results of phosphorylated peptides derived from proteins related to Alzheimer's disease
- Example 4 Quantitative result analysis of phosphorylated peptides capable of early diagnosis at the MCI-AD stage
- Example 3 Through the results of Example 3, it was confirmed that some phosphorylated peptides already increased in the early stages of Alzheimer's dementia, and the specific increase according to each stage was confirmed in more detail.
- Figure 7 shows the results of quantifying phosphorylated peptides. Although no significant increase was observed in the Normal+ group, it was confirmed that the phosphorylated peptide measurement values of the MCI+ group, that is, the group with mild cognitive impairment and in which amyloid deposition was discovered, increased more than two-fold.
- the quantification of the phosphorylated peptide can be used to diagnose subjects who not only have mild cognitive impairment but are also likely to develop dementia in the future.
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Abstract
본 발명은 인산화 펩타이드를 이용한 알츠하이머병 조기 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생물학적 시료 내 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 인산화 수준 측정을 통한 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분 방법, 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드 정량 방법을 통해 알츠하이머병을 효과적으로 조기 진단하거나 단계를 구분하고 뇌의 아밀로이드 베타의 축적을 판별할 수 있다.
Description
본 발명은 인산화 펩타이드를 이용한 알츠하이머병 조기 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생물학적 시료 내 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 인산화 수준 측정을 통한 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분 방법, 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법에 관한 것이다.
알츠하이머병은 치매를 일으키는 가장 큰 원인의 하나로 환자의 수가 점점 증가하고 있어 관심이 높아지고 있다. 그러나 지금까지 정확한 원인이 규명되지 않고 있으며 치료제 또한 발견되지 않고 있다. 현재 임상적으로 사용되는 알츠하이머병의 진단은 자기공명영상법 (MRI), SPECT (single-photon emission computed tomography), positron emission tomography (PET) 등을 이용하여 특정 뇌조직 (해마, 피질 등)의 변화양상을 관찰하고, MMSE (mini mental status examination)와 같은 문진을 통하여 행동과 지각능력의 변화 관찰을 종합하여 알츠하이머병으로서 진단을 내리게 된다.
그러나, 상기 방법들은 비용이 많이 들거나 대부분의 방법이 질환이 진행되어 증상이 나타난 이후에 진단이 가능하다는 한계점을 가진다. 현재 진단을 확증할 수 있는 유일한 방법은 환자가 사망한 후 부검을 통해 뇌 조직을 검사하는 사후 분석으로 아밀로이드 베타 플라크(amyloid beta plaque)의 뇌세포에서의 침착 여부와 타우 단백질의 과인산화로 형성된 신경섬유다발(neurofibrillary tangles)을 확인하는 것이다. 이처럼 확진이 어렵고 경도의 인지기능장애 단계를 지나 치매에 이른 환자들의 치료 방법이 없기 때문에 초기 환자들을 대상으로 한 약물 개발의 필요성과 그를 위한 초기 환자들의 선별 및 정확한 조기진단의 중요성이 부각되고 있다. 알츠하이머병은 대부분 질환의 증상이 나타나기 이전 단계에 환자의 행동은 정상적으로 보이나 뇌에서는 병리학적인 변화가 일어나는 “잠복기(preclinical)” 단계와 경도의 인지능력저하가 일어난 “경도인지장애(MCI)” 단계가 존재하기 때문에 이러한 조기 단계에 알츠하이머병 진단이 이루어질 수 있다면 보다 효과적인 치료가 가능할 것이다. 또한 알츠하이머성 치매의 원인물질이며 질병의 진행과 큰 연관성을 갖는 뇌의 아밀로이드 베타 축적의 감별은 동일한 정도의 인지기능을 가진 치매 단계별 환자군에서도 알츠하이머성 질환과 비알츠하이머성 질환을 갖는 환자군으로 세분류하는 근거가 되어 환자개인별 맞춤치료 및 향후 추가진단에 활용할 수 있다.
현재 증상이 나타나기 이전의 알츠하이머병 환자의 혈액이나 뇌척수액에서 특이하게 증가하거나 감소하는 단백질 수준을 측정하여 알츠하이머병을 조기에 진단하고 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적을 감별하는 방법에 대한 연구들이 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 뇌척수액은 시료 채취 과정에 있어서 고통을 수반하며 채취가 용이하지 않고 의학적 부작용 등이 우려되며 특히 고령의 알츠하이머병 환자로부터 채취가 어려워 실제 일반적 진단방법으로는 용이하게 사용될 수 없는 문제점이 있다. 반면 혈액의 경우 뇌척수액에 비해 채취가 용이하다는 점과 매일 500 ml의 뇌척수액이 혈액으로 흡수된다는 연구결과 등을 바탕으로 효과적인 알츠하이머병 바이오마커 개발에 적합한 시료로 여겨진다.
그에 따라, 혈액 내 아밀로이드 베타와 타우 단백질을 조기진단 마커로서 사용하고자 많은 연구가 이루어졌다. 그러나 아밀로이드 베타의 경우 연구그룹마다 전혀 상반된 결과들이 나왔고 타우 단백질의 경우 알츠하이머병 환자군와 정상 대조군의 타우 단백질의 농도범위가 많이 겹치는 결과가 나왔기 때문에 조기진단을 위한 지표로서의 활용도가 매우 떨어지는 것으로 보였다. 치매 발생/진행 기전과 비정상적인 뇌단백질들의 과인산화 현상은 높은 연관성을 보이는 것으로 알려져 있어 전체 단백질이 아닌 단백질의 인산화 현상이 알츠하이머병 진단의 새로운 혈액 내 지표로 주목을 받고 있다. 특히 대표적인 치매 특이적 과인산화 현상인 타우 단백질의 인산화 현상을 정상 및 알츠하이머병 환자들의 혈액에서 정량한 연구결과들에서도 기존 타우 전체 단백질보다 타우 단백질의 인산화 현상이 알츠하이머병에 특이적이고 뇌의 아밀로이드베타 병변 및 타우 병변과의 연관성도 더 높은 것으로 드러났다. 이는 치매 발생/진행 기전과 관련된 타우 이외의 치매 관련 인자들의 과인산화 현상들도 알츠하이머병 진단을 위한 뛰어난 혈액 내 지표가 될 수 있음을 시사한다. 그러나 그러나 혈액 내 인산화된 알츠하이머병 관련 단백질은 뇌조직으로부터 뉴런의 사멸(신경변성)에 의한 수동적 방출뿐만 아니라 인산화 위치에 따른 알츠하이머병 관련 단백질의 능동적 방출을 종합적으로 반영하기 때문에, 뇌조직이 아닌 혈액 내 존재하는 알츠하이머병 관련 단백질의 인산화 수준을 직접적으로 측정하여 조기진단, 단계 구분 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 감별을 위한 지표로 이용하는 것이 필수적이다. 하지만 혈액 시료의 경우 소수의 혈액 기능 관련 단백질들이 전체 단백질 양의 90% 이상을 차지하고 있는데 반해 인산화된 단백질들은 다른 조직 시료들에 비해 ~20% 정도에 미치지 못하는 특수성 때문에 현재 혈액 내 단백질의 인산화를 정량하고 진단하는 방법은 수십 마이크로 크기의 마이크로웰 어레이를 이용, 효소 단일 분자 활동을 디지털방식으로 측정하는 초고감도 면역분석기술인 Digital ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay)에 의한 타우 단백질의 과인산화 정량에 국한되어 있다. 상기 방법은 immunoassay의 문제점(low throughput, 시료와 epitope마다 달라지는 친화도와 특이성, 정량하려는 epitope에 대한 antibody의 필요성)을 가지고 있기 때문에 실제 임상에서 사용이 가능한 알츠하이머병 조기진단을 위해서는 대체적인 방법이 필요하다. 진단 분야에서 가장 궁극적인 목적인 높은 정확도와 민감도를 통해 질병을 진단하기 위해서 종래의 타우 단백질의 과인산화을 대상으로 한 단일 검출방법의 대체제로서 치매 발생/진행 기전과 높은 연관성을 갖는 타우 이외의 다양한 치매 관련 인자들의 비정상적인 과인산화 현상을 대상으로 한 다중검출기술이 필요하다.
본 발명자들은 알츠하이머병의 효과적인 조기진단 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 감별을 위한 검사방법을 개발하고자 연구 노력한 결과, 효율적인 인산화 펩타이드 농축 방법과 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS)를 이용하여 혈액 내에 존재하는 다양한 알츠하이머성 치매 관련 단백질로부터 유래된 인산화 펩타이드의 양을 측정함으로서 알츠하이머병 특이적인 단백질 인산화위치들과 이들의 인산화 정도 차이를 이용하여 알츠하이머병의 조기진단과 단계 구분을 가능하게 하고 뇌의 아밀로이드 베타 축적을 감별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은, 혈액과 뇌척수액을 포함한 생물학적 시료 내 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 수득하고 정량 분석함으로써 알츠하이머병의 조기 진단, 단계 구분과 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은, 상기 알츠하이머병 조기 진단, 단계 구분과 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 바이오마커 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드 정량 방법을 통해 알츠하이머병을 효과적으로 조기 진단하거나 단계를 구분하고 뇌의 아밀로이드 베타의 축적을 판별할 수 있다.
도 1은 본 발명의 치매 관련 인산화 펩타이드의 선정을 위한 혈장에서 동정된 대표적 알츠하이머성 뇌조직 특이적 인산화 단백질과 인산화 위치를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 전체적인 모식도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 구체적인 단계를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 인산화 펩타이드의 정량을 수치로 기재한 도이다.
도 5는 본 발명의 인산화 펩타이드의 정량을 히스토그램으로 도식화한 도이다.
도 6은 본 발명의 인산화 펩타이드의 정량을 히트맵(heatmap)으로 도식화한 도이다.
도 7은 본 발명의 알츠하이머성 경도인지장애를 판단할 수 있는 인산화 펩타이드를 정량한 결과이다.
도 8은 본 발명의 알츠하이머병 단계에 따른 특이적 증가를 보이거나 동일 단계에서 뇌의 아밀로이드 축적에 따른 특이적 변화를 보이는 인산화 위치들을 도식화한 도이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분 방법을 제공한다.
상기 방법은 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분을 위한 정보의 제공 방법을 의미할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 분리된 생물학적 시료로부터 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 단계를 포함하는, 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법을 제공한다.
상기 방법은 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 정보의 제공 방법을 의미할 수 있다.
상기 방법에 있어서, (c) 상기 정량된 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 상기 알츠하이머병 조기 진단, 단계 구분 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법은, 분리된 생물학적 시료 내 단백질을 단백질 분해효소를 이용하여 펩타이드화하는 단계; 상기 수득된 펩타이드에 인산화 펩타이드 농축법을 적용하여 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 농축하는 단계; 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS)를 이용한 질량분석법을 이용하여 상기 농축된 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 단계; 및 상기 정량된 인산화 펩타이드의 양을 대조군과 비교하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명의 기본적인 특징은, 알츠하이머병의 효과적인 조기 진단, 단계 구분 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 검사방법을 개발하고자 하는 데에 있는 것으로서, 알츠하이머병에 아직 도달하기 이전의 환자에 대하여, 잠복기 단계(preclinical AD, 전임상 알츠하이머병) 및/또는 알츠하이머성 경도인지장애(MCI) 여부를 조기에 알 수 있고 동일한 정도의 인지기능을 가진 인지기능 정상군, 경도인지장애군 또는 치매군에서의 뇌의 아밀로이드 베타 축적 감별을 하는 것일 수 있다.
기존에는 실제 알츠하이머병 치매 환자와 정상인 간의 유의미한 차이를 보이는 연구는 다수 진행되었으나, 질환의 증상이 나타나기 이전 단계인 잠복기 단계(preclinical AD) 및/또는 알츠하이머성 경도인지장애(MCI) 단계와 정상인 간에는 유의미한 차이가 나타나지 않아 조기 진단이 어려웠다. 그러나, 본 발명에서는 특정 위치에서 인산화가 일어난 다양한 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 펩타이드를 통한 정량을 통해 혈액 시료를 이용한 조기 진단 및 뇌의 아밀로이드 베타 축적 감별 방법을 개발한 것이다.
구체적으로는 상기 인산화 펩타이드의 종류에 따라 알츠하이머병의 각 단계를 판단하고 동일 인지기능 단계에 있는 환자군으로부터 뇌의 아밀로이드 베타 축적을 감별할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 알츠하이머병 조기 진단은 알츠하이머병 잠복기 및 알츠하이머성 경도인지장애의 조기 진단을 포함할 수 있으며, 알츠하이머병 단계 구분은 알츠하이머병 잠복기 단계, 알츠하이머성 경도인지장애 단계, 및 알츠하이머성 치매 단계 간의 구분을 포함할 수 있다.
상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질은 GSK3B (Glycogen synthase kinase 3 beta), NEFM (Neurofilament medium polypeptide), DPYSL2 (Dihydropyrimidinase-related protein 2), MAP1B (Microtubule-associated protein 1B) 및 MAP2 (Microtubule-associated protein 2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질일 수 있다.
또한, 상기 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분을 위하여 정량되는 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 인산화는 GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화일 수 있다. 구체적으로, 상기 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분을 위한 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 GSK3B 단백질에서 Y216, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 NEFM 단백질에서 S837, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 DPYSL2 단백질에서 T509, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 MAP1B 단백질에서 S831;S832, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 MAP2 단백질에서 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 3 내지 50개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있고, 구체적으로는 5 내지 30개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 11 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태로서, 상기 알츠하이머병 조기 진단은 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머병 잠복기를 조기 진단하는 것일 수 있다. 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머병 잠복기를 조기 진단하는 방법은, MAP2 단백질의 T1605 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 인지기능이 정상이고 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머병 잠복기인 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 정량된 단백질 유래 인산화 펩타이드가 인지기능이 정상이고 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 정상 대조군과 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 높은 경우 알츠하이머병 잠복기인 것으로 판단할 수 있으며, 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머병 잠복기인 것으로 판단할 수 있다.
다른 일 실시양태로서, 상기 알츠하이머병 조기 진단은 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머성 경도인지장애를 조기 진단하는 것일 수 있다. 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머성 경도인지장애를 조기 진단하는 방법은, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, 및 MAP1B 단백질의 S831;S832로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 인지기능이 정상이고 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애인 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 정량된 단백질 유래 인산화 펩타이드가 인지기능이 정상이고 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 정상 대조군과 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애인 것으로 판단할 수 있으며, 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태로서, 상기 알츠하이머병 단계 구분은 알츠하이머병 잠복기 단계와 알츠하이머성 경도인지장애 단계를 구분하는 것일 수 있다. 알츠하이머병 잠복기 단계와 알츠하이머성 경도인지장애 단계를 구분하는 방법은, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 알츠하이머병 잠복기 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애 단계인 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 정량된 단백질 유래 인산화 펩타이드가 알츠하이머병 잠복기 대조군과 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애 단계인 것으로 판단할 수 있으며, 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애 단계인 것으로 판단할 수 있다.
다른 일 실시양태로서, 상기 알츠하이머병 단계 구분은 알츠하이머성 경도인지장애 단계와 알츠하이머성 치매 단계를 구분하는 것일 수 있다. 알츠하이머성 경도인지장애 단계와 알츠하이머성 치매 단계를 구분하는 방법은, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 보다 바람직하게는 GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, 및 MAP2 단백질의 T1605로 구성된 군에서 선택되는 인산화를 포함하는 타우 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 알츠하이머성 경도인지장애 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 치매 단계인 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 정량된 단백질 유래 인산화 펩타이드가 알츠하이머성 경도인지장애 대조군과 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 높은 경우 알츠하이머성 치매 단계인 것으로 판단할 수 있으며, 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 치매 단계인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에서, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드는 분리된 생물학적 시료 내 단백질을 단백질 분해효소를 이용하여 펩타이드화하여 수득되는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 단백질 분해효소는 Lys-c, Arg-C, Asp-N, Gluc-C, Lys-N, 서몰리신(thermolysin), 엘라스타제(elastase), Tryp-N, 트립신(trypsin) 및 키모트립신(chymotrypsin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 분해효소일 수 있다. 또한, 상기 인산화된 알츠하이머성 치매 관련 단백질 또는 단백질의 단편은 인산화 단백질 또는 인산화 펩타이드 농축법에 의해 수득되는 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드의 정량은 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS)를 이용한 질량분석법에 의해 수행되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 질량분석법은 LC-SRM(liquid chromatography-selected reaction monitoring), PRM(Parallel Reaction Monitoring), SIM(Selected Ion monitoring) 또는 MRM(Multiple Reaction Monitoring)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 정량된 인산화 펩타이드의 양은 총 단백질에 대한 비율일 수 있다.
본 발명에서, 상기 정량된 인산화 펩타이드의 양에 대하여 정량적 프로파일링을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 정량된 인산화 펩타이드의 양에 대하여 T 검정 p-값 분석, ROC (Receiver-Operating curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석 중 한 가지 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 정량적 프로파일링을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 정량적 프로파일링은 동위원소로 치환된 단백질 표준물(stable isotope labeled protein standard) 또는 펩타이드 표준물(stable isotope labeled peptide standard)을 단백질들의 펩타이드화 이전 또는 이후에 주입하여 합성 표지 펩타이드를 이용하여 구한 인산화 펩타이드의 절대 정량값을 이용하여 얻어지는 것일 수 있다. 상기 절대 정량값은 총 단백질양에 대한 비율로서 비교될 수 있고, 여기서 총 단백질의 양도 동위원소로 치환된 단백질 표준물(stable isotope labeled protein standard) 또는 펩타이드 표준물(stable isotope labeled peptide standard)에 의해 구해진 절대 정량값일 수 있다. 해당 기준치는 구체적인 실시양태에 따라 적절한 기준치를 설정하여 실시할 수 있다. 그 예로 대조군 범위의 임계값 (cutoff) (증가하는 경우에는 상한치 / 감소하는 경우에는 하한치)을 결정하여, 인산화가 일어난 단백질의 단편 펩타이드의 양이 임계값보다 변동한 경우, “평균에 비해 유의하게 높은 경우”로 판단할 수 있다. 상기 정량된 인산화 펩타이드의 절대 함량값을 이용하여 대조군에 해당하는 절대 정량값 참조 정보와 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 높은 경우 각각의 단계인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에서 상기 알츠하이머병 조기 진단이라 함은, 이후의 발병에 대하여 대상체를 식별하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 알츠하이머병 잠복기의 조기 진단은 알츠하이머성 경도인지장애의 발병으로부터 약 5 년 내지 25 년 이하로 대상체를 식별하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 알츠하이머성 경도인지장애의 조기 진단은 알츠하이머성 치매 발병으로부터 약 5 년 내지 25 년 이하로 대상체를 식별하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 알츠하이머병 단계 구분이라 함은, 피험자를 대상으로 임상시험에서 실제 치료제가 목표로 하는 알츠하이머병 단계에 해당하는 대상만으로 선별하기 위한 것이거나, 또는 각 단계에 해당하는 약학 조성물을 투여하기 위한 대상을 선별하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시양태에서, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군 또는 치매 환자군에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부를 판별하는 것일 수 있다.
상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위하여 정량되는 알츠하이머성 치매 관련 단백질은 MAP1B (Microtubule-associated protein 1B) 및 MAP2 (Microtubule-associated protein 2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질일 수 있다.
또한, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위하여 정량되는 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 인산화는 MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화일 수 있다. 구체적으로 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 MAP1B 단백질에서 S831;S832, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 MAP2 단백질에서 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 인산화 펩타이드일 수 있으며, 상기 인산화 펩타이드는 상기 나열된 위치의 인산화를 포함하는 3 내지 50개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있고, 구체적으로는 5 내지 30개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 11 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태로서, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은 인지기능 정상군에서 판별하는 것일 수 있다. 인지기능 정상군에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은, MAP2 단백질의 T1605 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 뇌의 아밀로이드 베타 축적되지 않은 인지기능 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 정량된 단백질 유래 인산화 펩타이드가 뇌의 아밀로이드 베타 축적되지 않은 인지기능 정상군과 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 높은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단할 수 있으며, 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단할 수 있다.
다른 일 실시양태로서, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은 경도인지장애 환자군에서 판별하는 것일 수 있다. 경도인지장애 환자군에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은, MAP1B 단백질의 S831;S832 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 뇌의 아밀로이드 베타 축적되지 않은 경도인지장애 환자 대조군과 비교하여 낮은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 낮은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단할 수 있다. 구체적으로, 정량된 단백질 유래 인산화 펩타이드가 뇌의 아밀로이드 베타 축적되지 않은 경도인지장애 환자군과 비교하여 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 보다 바람직하게는 4배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 낮은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단할 수 있으며, 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 낮은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에서 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별이라 함은, 피험자를 대상으로 임상시험에서 실제 치료제가 목표로 하는 뇌 아밀로이드 베타 축적에 해당하는 대상만으로 선별하기 위한 것이거나, 또는 각 단계에서 뇌 아밀로이드 베타 축적에 해당하는 약학 조성물을 투여하기 위한 대상을 선별하기 위한 것일 수 있다. 또한 상기 뇌 아밀로이드 베타 축적은 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단, 또는 아밀로이드 베타 관련 PET 검사가 필요한지 여부의 판단으로 사용되며, 상기 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환은 알츠하이머병 파킨슨병 치매, 루이소체 치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함하는 것인 뇌 아밀로이드 축적 여부의 판단을 위한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화 부위를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분, 또는 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 조성물을 제공한다.
상기 인산화 부위 및 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분, 또는 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분, 또는 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 인산화 펩타이드를 제공할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 GSK3B 단백질에서 Y216, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 NEFM 단백질에서 S837, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 DPYSL2 단백질에서 T509, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 MAP1B 단백질에서 S831;S832, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 MAP2 단백질에서 T1605 위치의 인산화를 포함하는 인산화 펩타이드로서, 각각의 위치의 인산화를 포함하는 3 내지 50개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있고, 구체적으로는 5 내지 30개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로는 11 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
일 실시양태로서, 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머병 잠복기를 조기 진단하기 위한, MAP2 단백질의 T1605 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 9의 인산화 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 일 실시양태로서, 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머성 경도인지장애를 조기 진단하기 위한, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 및/또는 서열번호 9의 인산화 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 일 실시양태로서, 알츠하이머병 잠복기 단계와 알츠하이머성 경도인지장애 단계를 구분하기 위한, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 및/또는 서열번호 9의 인산화 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 일 실시양태로서, 알츠하이머성 경도인지장애 단계와 알츠하이머성 치매 단계를 구분하기 위한, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 및/또는 서열번호 9의 인산화 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 일 실시양태로서, 인지기능 정상군에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한, MAP2 단백질의 T1605 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 9의 인산화 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다른 일 실시양태로서, 경도인지장애 환자군에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한, MAP1B 단백질의 S831;S832 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 7의 인산화 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 전술한 바와 같이 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 과인산화를 측정하여 알츠하이머병의 조기 진단 및 단계 구분과 뇌내 아밀로이드 베타 축적 감별을 가능하게 하며, 이러한 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 과인산화는 타우병증(tauopathy)의 주된 특징이기 때문에 알츠하이머병 뿐만 아니라, 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy, PSP), 피질기저핵변성(Corticobasal degeneration, CBD), 피크병(Pick's disease), FTDP-17(frontotemporal dementias with parkinsonism liked to chromosome 17), 만성 외상성 뇌병증(Chronic traumatic encephalopathy, CTE)을 비롯한 타우병증과 관련된 퇴행성 뇌질환에도 적용이 가능하다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.
혈액을 통해 알츠하이머병을 진단하는 것은 비침습성, 비용, 시설 등 여러 측면에 있어서 장점이 있지만 혈액은 뇌를 포함한 다양한 조직들과 물질교환이 이루어지기 때문에 혈액 내 지표를 통한 진단에 있어 지표로서의 특이성이 떨어지는 경우가 많다. 아울러, Immunoassay 방법을 이용하는 기존의 사례에서는, 항체의 가용도, 특이도, 민감도 등에 의해 제한이 존재하였다.
그에 따라, 혈액시료를 분석하는데 방해가 되는 혈액시료의 특성에서 기인한 문제점들을 해결하기 위한 다양한 전처리 방법, 예컨대, 소수의 고농도 단백질들을 제거하는 immunodepletion 방법, 단백질 농도의 dynamic range를 줄이는 방법으로서 다양한 펩타이드 리간드 조합의 bead library를 이용하여 고농도의 단백질 농도를 희석시키고 저농도의 인산화 단백질을 농축시키는 방법, complexity를 낮추기 위해 fractionation하는 방법 등이 시도되었으나, 각각의 한계점이 존재하였다.
이러한 혈액시료의 특성을 극복하기 위한 많은 연구들이 있었음에도 불구하고 혈액 인산화 단백질의 분석은 조직이나 세포시료에 비해 현저히 낮은 인산화 펩타이드 농축효율과 선택성으로 고통받고 있다.
이에, 본 발명에서는 높은 complexity와 넓은 dynamic range를 가진 depletion이 시행되지 않은 혈액 시료를 대상으로 인산화 펩타이드 농축법을 최적화하고 가장 높은 인산화 펩타이드 농축효율을 가진 방법을 개발하고자 하였다. 그에 따라, 동일한 양의 혈장시료를 사용했음에도 불구하고 인산화 펩타이드 농축법의 종류나 버퍼조성에 따라서 동정된 인산화 펩타이드, 인산화단백질, 인산화 위치, 인산화 펩타이드에 해당하는 spectra의 수가 크게 달라지는 것을 알 수 있었으며, 본 발명의 방법은 높은 인산화 펩타이드 농축효율을 가진 농축법을 이용할 수 있으나 이에 한정되지 아니한다.
실시예 1: 혈액 내 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드의 선정
알츠하이머병 조기 진단을 위하여 혈액의 인산화 단백질체에서 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 선정하고자 하였다. 이를 위해 8명의 건강한 참여자의 혈장 집합시료를 대상으로 혈장 인산화 단백질체를 대규모 분석한 후 기존의 대규모 알츠하이머성 치매 뇌조직 인산화 단백질체 연구(Dammer. et. al., Proteomics, 2015)에서 보고된 알츠하이머성 치매 뇌조직 특이적 인산화 단백질 141개와 비교하였고 44개의 인산화 단백질이 혈장에서 동정된 것을 확인하였다. 상기 44개의 인산화 단백질의 알츠하이머성 뇌조직 특이적 과인산화 현상에 대해 해당 대규모 인산화 단백질체 연구가 아닌 별도의 연구로도 추가로 보고된 단백질인 GSK3B (Glycogen synthase kinase 3 beta), NEFM (Neurofilament medium polypeptide), DPYSL2 (Dihydropyrimidinase-related protein 2), MAP1B (Microtubule-associated protein 1B) 및 MAP2 (Microtubule-associated protein 2)를 바이오마커로 이용할 혈액 내 치매 관련 인산화 단백질로 선정하였다 (Vanleuven. et. al., Frontiers in molecular neuroscience,4, 17, (2011); Gu. et. al., Biochemistry 39, 4267-4275 (2000); Rudrabhatla. et. al., The FASEB Journal 25, 3896-3905 (2011); Kang. et. al., Analytical and bioanalytical chemistry 406, 5433-5446 (2014)). 혈장에서 동정된 알츠하이머성 치매 뇌조직 특이적 인산화 위치를 포함하는 혈액 내 치매 관련 인산화 펩타이드 마커를 선정하기 위하여 치매 관련 단백질에서 혈장에서 동정된 인산화 위치와 알츠하이머성 치매 뇌조직 특이적 인산화 위치들을 도 1과 같이 비교하였다. 구체적으로, 혈장 인산화 단백질체와 알츠하이머성 뇌조직 특이적 인산화 단백질에서 중복되는 인산화 위치, 즉 혈장에서 동정된 알츠하이머성 치매 뇌조직 특이적 인산화 위치를 붉은 색으로 표시하였다.
실시예 2: 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드의 정량
알츠하이머병 조기 진단을 위하여 GSK3B (Glycogen synthase kinase 3 beta), NEFM (Neurofilament medium polypeptide), DPYSL2 (Dihydropyrimidinase-related protein 2), MAP1B (Microtubule-associated protein 1B) 및 MAP2 (Microtubule-associated protein 2) 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하여 이를 토대로 알츠하이머 조기 진단, 구체적으로는 알츠하이머성 경도인지장애(MCI-AD)를 판단하고자 하였다.
전체적인 실험의 모식도는 도 2에 나타내었고 구체적인 실험 방법은 도 3에 도시된 바와 같다. 구체적으로, 실험에 이용한 그룹별 혈장은 각 그룹에 해당하는 환자 10명으로부터 동일한 양을 얻어 합쳐진 혈액샘플로부터 얻었다.
여기에서 각 그룹은 다음을 의미한다.
Normal-: 인지능력도 정상이고 아밀로이드(amyloid) 침착이 일어나지 않은 그룹
Normal+ (preclinical AD): 인지능력은 정상이지만 아밀로이드 침착이 발견된 그룹
MCI-: 경도인지장애를 가지고 있지만 아밀로이드 침착이 일어나지 않은 그룹
MCI+ (MCI-AD): 경도인지장애를 가지고 있고 아밀로이드 침착이 발견된 그룹
AD-: 치매로 진단될 정도의 인지능력 저하가 일어났지만 아밀로이드 침착이 일어나지 않은 그룹
AD+ (Dementia-AD): 치매로 진단될 정도의 인지능력 저하가 일어났고 amyloid 침착이 발견되어 알츠하이머성 치매로 진단된 그룹
혈장 샘플을 용해 버퍼 (50mM Tris HCl pH 8.0, 8M urea, 25x Complete (protease inhibitor), 10X phosphatase inhibitor)로 용해(lysis)시켰다. 상기 용해된 샘플을 37℃에서 DTT(최종 농도 20mM)를 첨가하여 실온에서 30분 내지 1시간 동안 디설파이드 환원반응 시키고, 이오도아세트아미드(최종 농도 50mM)를 첨가하여 실온에서 암조건으로 30분간 설프히드릴기 알킬화 반응을 수행하였다. 처리된 샘플을 50mM NH4HCO3 를 이용하여 우레아의 최종 농도가 2M 이하가 되도록 희석하였고, 트립신과 샘플의 비율을 1:50으로 트립신 처리하여 37℃에서 18시간 반응시켰다. 그 후 C-18 Reverse Phase로 탈염화 하여 펩타이드 혼합물을 수득하였다. 리간드로 철 이온(Fe3+)이 흡착된 Fe-IMAC column을 사용하여 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피 (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography, IMAC)를 수행하였다. 수득된 펩타이드 혼합물을 로딩 버퍼 용액에 용해시킨 후 동일한 로딩 버퍼 용액으로 평형화 시켜놓은 Fe-IMAC column에 주입하였다. 샘플이 로딩된 Fe-IMAC column을 로딩 버퍼 용액으로 세척된 후 용출 버퍼 용액에 의해 인산화 펩타이드가 농축된 용출액을 수득하였다. 수득한 용출액을 액체크로마토그래피-병행 반응 모니터링(liquid chromatography-parallel reaction monitoring: LC-PRM)을 이용한 질량분석법을 통해 정량하였다.
여기에서 정량된 인산화 펩타이드의 목록은 하기 표 2에 기재된 바와 같다. 구체적으로, GSK3B (서열번호 2), NEFM (서열번호 4), DPYSL2 (서열번호 6), MAP1B (서열번호 8), MAP2 (서열번호 10) 전체 아미노산 서열로부터 넘버링된 인산화 위치를 기재하였으며, 각 펩타이드의 인산화 위치를 밑줄 및 볼드로 표시하였다.
추가로, 인산화 펩타이드 중에서, NEFM 단백질의 832번째 위치에는 deamidation이, MAP1B 단백질의 830번째 위치에는 oxidation이 존재함을 확인하였다(밑줄로 위치 표시).
| 일련번호 | 단백질 | 아미노산 서열 | 인산화 위치 | 서열목록 |
| #1 | GSK3B | GEPNVS Y ICSR | Y216 | 서열번호 1 |
| #2 | NEFM | GVVTNGLDL S PADEK | S837 | 서열번호 3 |
| #3 | DPYSL2 | GLYDGPVCEVSV T PK | T509 | 서열번호 5 |
| #4 | MAP1B | SLM SS PEDLTK | S831;S832 | 서열번호 7 |
| #5 | MAP2 | SGTSTPTTPGSTAITPG T PPSYSSR | T1605 | 서열번호 9 |
실시예 3: 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드의 정량결과 확인
상기 실시예 2의 방법을 통하여 각 그룹 별로 인산화 펩타이드를 정량한 결과를 나타내었다.
구체적으로, 도 4에서 인산화 펩타이드의 정량을 수치로 기재하였으며, 이를 히스토그램(도 5)과 히트맵(heatmap)(도 6)을 이용하여 도식화하였다. 히트맵에서는 대조군 대비 fold change로 도식화하였다.
도 4 내지 도 6에서 보는 바와 같이, 각각의 단백질로부터 유래된 인산화 펩타이드들이 알츠하이머병 특이적으로 증가된 것이 확인되었으며, 특히 대부분의 인산화 펩타이드들은 알츠하이머성 치매 초기, 즉 이전 단계인 MCI-AD에서 이미 2배 이상으로 증가한 것이 확인되었다.
실시예 4: MCI-AD 단계에서 조기 진단이 가능한 인산화 펩타이드의 정량결과 분석
상기 실시예 3의 결과를 통하여, 일부 인산화 펩타이드들이 알츠하이머성 치매 초기에 이미 증가한 것을 확인하였는바, 각 단계에 따른 특이적 증가를 보다 상세하게 확인하였다.
도 7은 인산화 펩타이드를 정량한 결과를 나타낸다. Normal+ 그룹에서는 별다른 증가를 확인할 수 없으나, MCI+ 그룹, 즉 경도인지장애를 가지고 있고 아밀로이드 침착이 발견된 그룹의 인산화 펩타이드 측정값이 2배 이상 증가한 것을 확인하였다.
이를 통해, 상기 인산화 펩타이드의 정량을 통해 경도인지장애가 있을 뿐 아니라 추후 치매로 발전될 수 있는 가능성이 있는 피검체를 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 도 4의 결과를 통해 치매 단계에 따른 인산화 펩타이드의 정량 결과가 인산화 펩타이드별로 양상이 달라진다는 것을 확인하였다. 이는 혈액 내 인산화된 알츠하이머병 관련 단백질은 뇌조직으로부터 뉴런의 사멸(신경변성)에 의한 수동적 방출뿐만 아니라 단백질의 종류와 인산화 위치에 따른 알츠하이머병 관련 단백질의 능동적 방출을 종합적으로 반영하는 것으로 보인다.
구체적으로 Normal-와 Normal+ 그룹에서 다른 인산화 펩타이드들은 전체적으로 큰 변화가 없지만 서열번호 9에 해당하는 MAP2 단백질 유래 인산화 펩타이드는 Normal+에서만 검출이 되는 것을 확인하였고, 해당 인산화 펩타이드의 정량을 통해 정상군과 구분하여 알츠하이머병 잠복기를 조기 진단할 수 있음을 확인할 수 있었다.
MCI-과 MCI+ 그룹의 구분에 있어서도 다른 펩타이드들은 최소 3배에서 7배 가량 증가하는 양상을 보인 반면, 서열번호 7번에 해당하는 MAP1B 단백질 유래 인산화 펩타이드는 오히려 약 2배 가량 감소하는 것을 확인하였다.
따라서 본 연구에서 확인한 치매 단계에 따른 인산화 펩타이드별 정량 결과를 통해, 도 8에서 제시한 바와 같이, 알츠하이머 특이적 인산화 잔기들의 다양한 조합을 이용하여 알츠하이머성 치매의 조기진단 및 단계구분, 또는 뇌 아밀로이드 베타 축적의 판별이 가능함을 확인할 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (26)
- (a) 분리된 생물학적 시료로부터 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 수득하는 단계; 및(b) 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 단계를 포함하는,알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머병 조기 진단은 알츠하이머병 잠복기 및 알츠하이머성 경도인지장애의 조기 진단을 포함하고; 알츠하이머병 단계 구분은 알츠하이머병 잠복기 단계, 알츠하이머성 경도인지장애 단계, 및 알츠하이머성 치매 단계 간의 구분을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질은 GSK3B (Glycogen synthase kinase 3 beta), NEFM (Neurofilament medium polypeptide), DPYSL2 (Dihydropyrimidinase-related protein 2), MAP1B (Microtubule-associated protein 1B) 및 MAP2 (Microtubule-associated protein 2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 인산화는 GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 GSK3B 단백질에서 Y216, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 NEFM 단백질에서 S837, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 DPYSL2 단백질에서 T509, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 MAP1B 단백질에서 S831;S832, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 MAP2 단백질에서 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 5 내지 30개의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, (c) 상기 정량된 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머병 조기 진단은 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머병 잠복기를 조기 진단하는 것으로서, MAP2 단백질의 T1605 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 상기 정량값이 인지기능이 정상이고 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머병 잠복기인 것으로 판단하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머병 조기 진단은 정상 대조군과 구분하여 알츠하이머성 경도인지장애를 조기 진단하는 것으로서, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, 및 MAP1B 단백질의 S831;S832로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 인지기능이 정상이고 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애인 것으로 판단하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머병 단계 구분은 알츠하이머병 잠복기 단계와 알츠하이머성 경도인지장애 단계를 구분하는 것으로서, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 알츠하이머병 잠복기 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 경도인지장애 단계인 것으로 판단하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머병 단계 구분은 알츠하이머성 경도인지장애 단계와 알츠하이머성 치매 단계를 구분하는 것으로서, GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 알츠하이머성 경도인지장애 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 알츠하이머성 치매 단계인 것으로 판단하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드는 분리된 생물학적 시료 내 단백질을, 단백질 분해효소를 이용하여 펩타이드화하여 수득되는 것인, 방법.
- 제11항에 있어서, 단백질 분해효소는 Lys-c, Arg-C, Asp-N, Gluc-C, Lys-N, 서몰리신(thermolysin), 엘라스타제(elastase), Tryp-N, 트립신(trypsin) 및 키모트립신(chymotrypsin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 분해효소인 것인, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 수득된 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 인산화 펩타이드 농축법에 의해 농축하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드의 정량은 액체크로마토그래피-질량분석기(LC-MS)를 이용한 질량분석법에 의해 수행되는 것인, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 질량분석법은 LC-SRM(liquid chromatography-selected reaction monitoring), PRM(Parallel Reaction Monitoring), SIM(Selected Ion monitoring) 또는 MRM(Multiple Reaction Monitoring)인 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 정량된 인산화 펩타이드의 양에 대하여 T 검정 p-값 분석, ROC (Receiver-Operating curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석 중 한 가지 이상을 선택하여 수행함을 특징으로 하는 정량적 프로파일링을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
- (a) 분리된 생물학적 시료로부터 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 수득하는 단계; 및(b) 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 단계를 포함하는,뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은 인지기능 정상군 또는 경도인지장애 환자군에서 뇌의 아밀로이드 베타 축적 여부를 판별하는 것인, 방법.
- 제18항에 있어서, 알츠하이머성 치매 관련 단백질은 MAP1B (Microtubule-associated protein 1B) 및 MAP2 (Microtubule-associated protein 2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질인 것인, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질의 인산화는 MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화인 것인, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 MAP1B 단백질에서 S831;S832, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 MAP2 단백질에서 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화를 포함하는 5 내지 30개의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 방법.
- 제18항에 있어서, (c) 상기 정량된 알츠하이머성 치매 관련 단백질 유래 인산화 펩타이드를 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은 인지기능 정상군에서 판별하는 것으로서, MAP2 단백질의 T1605 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 뇌의 아밀로이드 베타 축적되지 않은 인지기능 정상 대조군과 비교하여 높은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 높은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단하는 것인, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별은 경도인지장애 환자군에서 판별하는 것으로서, MAP1B 단백질의 S831;S832 위치의 인산화를 포함하는 단백질 유래 인산화 펩타이드를 정량하는 것이며, 정량값이 뇌의 아밀로이드 베타 축적되지 않은 경도인지장애 환자 대조군과 비교하여 낮은 경우 또는 대조군의 정량값으로 정해진 기준치보다 낮은 경우 뇌의 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단하는 것인, 방법.
- GSK3B 단백질의 Y216, NEFM 단백질의 S837, DPYSL2 단백질의 T509, MAP1B 단백질의 S831;S832, 및 MAP2 단백질의 T1605로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 위치의 인산화 부위를 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 알츠하이머병 조기 진단 또는 단계 구분, 또는 뇌의 아밀로이드 베타 축적 판별을 위한 조성물.
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