KR20210004996A - 부위-특이적 타우 인산화에 기반한 진단 및 치료 방법 - Google Patents

부위-특이적 타우 인산화에 기반한 진단 및 치료 방법 Download PDF

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니콜라스 바텔레미
랜달 존 베이트먼
에릭 맥데이드
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워싱턴 유니버시티
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Abstract

본 개시내용은 특이적 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 정량하여 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애의 발병 시간을 예측하고, 알츠하이머 질환을 단계화하고, 치료 결정을 안내하고, 임상 시험을 위한 대상체를 선별하고, 특정 치료적 개입의 임상 효능을 평가하는 방법을 제공한다.

Description

부위-특이적 타우 인산화에 기반한 진단 및 치료 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 5월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 62/666,504 및 2018년 5월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 62/666,509에 우선권을 주장하며, 그 개시내용은 본원에 참조로 원용된다.
정부의 권리
본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 NS065667 및 NS095773하의 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 발명에 대하여 특정 권리를 갖는다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출되고 그 전체가 본원에 참고로 원용되는 서열 목록을 함유한다. 2019년 5월 3일에 생성된 ASCII 사본은 623217_ST25.txt로 명명되며, 24KB 바이트 크기이다.
미세소관 연관 단백질 타우(MAPT 또는 타우)는 뉴런의 형태학 및 생리학에서 필수적인 역할을 한다. 타우는 전장 단백질의 6개의 상이한 아이소폼을 가지고 있으며, 아세틸화, 글리코실화 및 인산화를 포함하여 다수의 가능한 번역 후 변형을 겪는다. 인산화는 축색돌기의 안정화에서 타우의 정상 기능을 조절하는 데 중요하며, 80개가 넘는 상이한 잔기에서 발생할 수 있다. 그러나, 타우의 과도한 인산화는 주로 과인산화된 타우로 구성되는, 세포 내 불용성 쌍의 나선형 필라멘트(PHF) 및 신경원섬유 엉킴(NFT)으로 타우 응집의 확률을 증가시키는 것으로 보이다.
대뇌 피질의 세포 내 신경원섬유 엉킴은 알츠하이머 질환(AD)의 병리학적 특징을 정의하며, 증상 발병 전 20년에 걸쳐 발생하기 시작하는 세포 외 아밀로이드-β(Aβ) 플라크의 출현 후 오랜 임상 증상의 발병과 관련이 있다. AD에서, 가용성 p-타우 및 비인산화된 타우는 뇌척수액(CSF)에서 2배 증가되었다. 이러한 변화는 타우 및 NFT를 CSF로 수동적으로 방출하는 뉴런의 사멸(신경변성)의 영향을 반영한다고 제안되어 왔다. 그러나, 유의한 NFT 병리 및 신경변성(예컨대, 진행성 핵상 마비, 전두측두엽 변성-타우)가 있는 다른 타우병증에서, 가용성 p-타우 및 총 타우의 CSF 수준은 증가하지 않는다. 이러한 관찰은 Aβ가 세포 및 동물 모델에 의해 지지되는 아이디어인 AD의 고유한 타우병증으로 이어지는 과정을 유발할 수 있음을 시사한다. 이 개념은 인간에서 아밀로이드 플라크의 존재 하에서 가용성 타우의 활성 생산 증가에 의해 더욱 지지된다.
타우는 특징적인 AD 병리를 포함하고 응집된 형태 또는 가용성 형태로 측정될 수 있지만, 이 중요한 뉴런 단백질의 번역 후 변형이 어떻게 인간에서 NFT의 발달 및 신경변성를 유발하는지에 대한 이해에는 중요한 간격이 남아 있다. 예를 들어, 아밀로이드-β 플라크에 대한 타우의 관계는 알려져 있지 않다. 마찬가지로, AD의 전임상 단계 및 임상 단계 동안 타우에 어떤 병리생리학적 변화가 발생하는지는 알려져 있지 않다. 이와 같이, AD와 연관된 증상의 발병 전에 대상체를 단계화시키고 치료 결정을 안내하는 데 타우를 어느 정도까지 사용할 수 있을지는 불분명하다.
따라서, 타우 인산화를 정량하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 당업계에 여전히 남아있다.
발명의 요약
일 양태에서, 본 개시내용은 알츠하이머 질환(AD)으로 인한 경미한 인지 기능장애(MCI)로의 전환 위험이 증가된 것으로서 대상체를 진단하는 방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 단리된 타우 샘플에서 T181, T205 및 T217로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 인산화 수준(들)이 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 AD로 인해 MCI로의 전환 위험이 높은 것으로서 대상체를 진단하는 단계를 포함한다. 대안적으로 또는 임의로 총 타우의 측정과 함께 T181, T205 및/또는 T217에서 타우 인산화의 측정을 사용하는 것에 추가하여, 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율, 또는 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율을 사용할 수 있다. 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율은 p-T181 및 p-T205, p-T217 및 p-T205, 또는 p-T181 및 p-T217 사이의 비율일 수 있다. 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율은 p-T181 및 총 타우, p-T205 및 총 타우, 또는 p-T217 및 총 타우 사이의 비율일 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 알츠하이머 질환(AD)으로 인한 경미한 인지 기능장애(MCI)의 발병 전에 대상체를 단계화시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 단리된 타우 샘플에서 T181, T205 및 T217로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 인산화 수준(들)이 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 AD로 인한 MCI의 발병으로부터 특정 연수인 것으로서 대상체를 진단하는 단계를 포함한다. 대안적으로 또는 임의로 총 타우의 측정과 함께 T181, T205 및/또는 T217에서 타우 인산화의 측정을 사용하는 것에 추가하여, 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율, 또는 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율을 사용할 수 있다. 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율은 p-T181 및 p-T205, p-T217 및 p-T205, 또는 p-T181 및 p-T217 사이의 비율일 수 있다. 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율은 p-T181 및 총 타우, p-T205 및 총 타우, 또는 p-T217 및 총 타우 사이의 비율일 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 알츠하이머 질환(AD) 증상의 발병 후 대상체를 단계화시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 단리된 타우 샘플에서 T181, T205 및 T217로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 인산화 수준(들)이 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 AD로 인한 MCI의 발병 후 특정 연수인 것으로서 대상체를 진단하는 단계를 포함한다. 대안적으로 또는 임의로 총 타우의 측정과 함께 T181, T205 및/또는 T217에서 타우 인산화의 측정을 사용하는 것에 추가하여, 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율, 또는 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율을 사용할 수 있다. 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율은 p-T181 및 p-T205, p-T217 및 p-T205, 또는 p-T181 및 p-T217 사이의 비율일 수 있다. 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율은 p-T181 및 총 타우, p-T205 및 총 타우, 또는 p-T217 및 총 타우 사이의 비율일 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 이를 필요로하는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 단리된 타우 샘플에서 T181, T205 및 T217로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 인산화 수준(들)이 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 대안적으로 또는 임의로 총 타우의 측정과 함께 T181, T205 및/또는 T217에서 타우 인산화의 측정을 사용하는 것에 추가하여, 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율, 또는 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율을 사용할 수 있다. 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율은 p-T181 및 p-T205, p-T217 및 p-T205, 또는 p-T181 및 p-T217 사이의 비율일 수 있다. 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율은 p-T181 및 총 타우, p-T205 및 총 타우, 또는 p-T217 및 총 타우 사이의 비율일 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 대상체를 임상 시험에 등록하는 방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 단리된 타우 샘플에서 T181, T205 및 T217로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 인산화 수준(들)이 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 임상 시험에 대상체를 등록하는 단계를 포함한다. 대안적으로 또는 임의로 총 타우의 측정과 함께 T181, T205 및/또는 T217에서 타우 인산화의 측정을 사용하는 것에 추가하여, 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율, 또는 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율을 사용할 수 있다. 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율은 p-T181 및 p-T205, p-T217 및 p-T205, 또는 p-T181 및 p-T217 사이의 비율일 수 있다. 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율은 p-T181 및 총 타우, p-T205 및 총 타우, 또는 p-T217 및 총 타우 사이의 비율일 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태 및 반복은 하기에 더 자세히 기재된다.
출원 파일은 컬러로 실행된 하나 이상의 사진을 함유한다. 컬러 사진이 포함된 이 특허 출원 공개공보의 사본은 요청 및 필요한 비용의 지불시 특허청에서 제공될 수 있다.
도 1은 가장 긴 인간 타우 아이소폼(2N4R) 및 타우 항체의 에피토프의 개략도이다. N-말단, 중간 도메인, MTBR 및 C-말단은 이 아이소폼에 대해 식별되며 다른 타우 아이소폼(예컨대, 2N3R, 1NR4, 1N3R, 0N4R 및 0N3R)에 대해 예측가능한 방식으로 다양할 수 있다.
도 2는 병렬 반응 모니터링 실험의 원리를 보여주는 개략도이다.
도 3은 103-126(0N 아이소폼)에서 모노-인산화된 타우 서열의 PRM 스크리닝으로부터의 데이터를 도시한다. 변형되지 않은 펩티드 103-126에 가깝게 용리되고 T111(a), S113(b) 또는 T123(c)에서 인산화될 것으로 예상되는 단편 시리즈를 함유하는 고유한 LC-MS/MS 패턴이 식별되었다. 각각의 p-타우 펩티드로부터의 가정의 y 이온 단편은 서열에 밑줄이 그어져 있다. 3개의 추정되는 모노-인산화된 펩티드의 잠재적인 공동-용리는 디콘볼루팅되었다(deconvoluted). 포스페이트가 없는 이온 단편 y15는 잔기 T111 (y15(a))의 인산화된 펩티드에 특이적이고, 포스페이트가 있는 y8 단편은 잔기 T123 (y8(c))의 p-타우 펩티드에 특이적이다. 상응하는 추출된 이온 크로마토그램(XIC)은 검출 한계를 초과하여 낮은 풍부도로 검출되어, 2개의 상응하는 모노-인산화된 타우 펩티드의 식별을 지지한다. 대조적으로, pT111 및 pS113(y15(a+b))에 의해 공유된, 포스페이트가 있는 y15 단편, 및 pS113 및 pT123(y8(b+c))에 의해 공유된, 포스페이트가 없는 y8 단편은 훨씬 더 풍부한다. 이러한 신호 상이함은 패턴의 주요 종으로서 잔기 S113(b)에서 모노-인산화된 타우 펩티드의 존재를 지지한다.
도 4는 6개의 잠재적 인산화 부위를 함유하는 모노-인산화된 타우 서열 68-126(1N 아이소폼)의 PRM 스크리닝으로부터의 데이터를 도시한다. 3개의 인산화 부위는 도 3(d-f)에 기재된 바와 같이 잔기 103-126을 함유하는 펩티드에 의해 공유되었다. 6개의 LC-MS 패턴이 식별되었다. pS68(a) 또는 pT69(b)에 의해 공유된, 포스페이트를 운반하는 Y28 단편은 2개의 LC-MS 패턴 4 및 5에서 발견되었다. 이는 2개의 인산화된 펩티드의 존재를 입증하지만, pS68 및 pT69를 구별하기 위해 이온 단편 y29의 검출 없이 상응하는 LC-MS 패턴을 엄격하게 배정할 수 없다. pT71(c) 및 pT111(d)에 상응하는 특이적 단편은 각각 LC-MS 패턴 6 및 1에서 발견되었다. pS113(e) 및 pT123(f) (포스페이트가 있는 y15)에 대한 특이적 단편은 LC-MS 패턴 2에서 발견되었다. 이 패턴은 포스페이트가 있거나 없는 y10 단편 둘 다를 함유하고있어, 이 2개의 인산화된 펩티드의 공동-용리를 시사한다. 포스페이트가 없는 y10은 포스페이트가 있는 y10에 비해 주요 신호를 가지므로 pT123의 정도는 pS113보다 낮을 가능성이 높다. LC-MS 패턴 3은 인산화되지 않은 펩티드에 대해 발견된 바와 같이 패턴 4로부터의 인산화된 펩티드의 소수의 형태이성질체(conformer) 또는 LC 아티팩트(artifact)에 기인한다.
도 5는 모노-인산화된 타우 서열 45-67(1N 및 2N 아이소폼)의 PRM 스크리닝으로부터의 데이터를 도시한다. 형태이성질체로부터의 강한 신호는 인산화되지 않은 펩티드 LC-MS 패턴의 앞쪽에서 식별되었다. 따라서, 인산화된 펩티드에 대한 상응하는 LC-MS 패턴은 LC에 의해 분리가능한 형태이성질체를 또한 가질 것으로 예측되었다. 실제로, PRM 스캔 해석은 이 서열(패턴 2)의 주요 인산화 부위로서 pT50(b)의 검출로 이어졌다. 유사한 단편화 핑거프린트(fingerprint)를 갖는 패턴 1은 pT50의 형태이성질체에 기인한다. pT50(b)로부터의 신호를 구별할 수 있는 pS46(a)은 검출되지 않았으며, 이는 이 인산화가 부재하거나 낮고 유사한 비-특이적 단편을 공유하는 다른 인산화된 펩티드와 공동-용리될 것임을 시사한다. LC-MS 패턴 3에서, 포스페이트가 없는 y9, y15 및 포스페이트가 있는 y17의 공동-용리는 잔기 T52(c)에서 인산화를 식별하였다. 패턴 4/6 및 5/7은 각각 형태이성질체로서 쌍을 이룬다. 따라서, 2개의 인산화된 펩티드는 분리될 수 없다. 이러한 패턴에서 발견된 단편은 S61(e), T63(f) 및 S64(g) 잔기 중 하나에서의 인산화와 일치하였다. MS/MS 강도는 부위를 식별하기에는 불충분했지만, 이러한 3개의 부위 중 2개 이상은 이 서열에서 인산화되었을 가능성이 있다. 추가적으로, 포스페이트가 없는 소수의 y9 단편이 패턴 7의 숄더(shoulder)에서 발견되었으며, 이는 잔기 S56(d)에서의 소량의 인산화에 기인할 수 있다.
도 6은 모노-인산화된 타우 서열 88-126(2N 아이소폼)의 PRM 스크리닝으로부터의 데이터를 도시한다. 6개의 잠재적 인산화 부위가 이 서열에 위치하고 6개의 LC-MS 패턴이 식별되었다. 패턴 1 및 2에서 발견된 단편은 각각 잔기 T111(d) 및 S113(e)에서의 인산화된 펩티드와 일치하였다. 잔기 T123(f)에서 인산화된 펩티드로부터의 특이적 단편은 발견되지 않았다. 패턴 4 및 6은 잔기 T101(b) 또는 T102(c)에서 인산화와 매칭되는 y29 단편의 낮은 신호를 함유하였지만, 이들을 구별할 수 있는 특이적 단편은 검출되지 않았다. 패턴 3 및 5는 패턴 4 및 6에서 발견된 단편을 공유하지만 더 적은 풍부도로 잔기 G109의 N-말단에서 인산화된 잔기를 위치시킨다. 이는 잔기 T95(a)에 추가 인산화된 펩티드의 존재 또는 패턴 4 및 6에서 발견된 펩티드로부터의 풍부한 형태이성질체를 나타낼 수 있다.
도 7은 4개의 잠재적 인산화 부위를 함유하는 모노-인산화 타우 서열 68-87의 PRM 스캔을 도시한다. 3개의 LC-MS 패턴이 검출되었다. 패턴 2 및 3은 잔기 S68(a) 또는 T69(b)에서의 인산화와 일치하였다. 패턴 1은 T71(c) 및 T76(d)에서 2개의 공동-용리된 인산화된 펩티드의 존재와 호환되는 단편 둘 다를 함유하였다. 패턴 1에서 포스페이트가 있거나 없는 y14 XIC의 비교는 pT71(c)가 pT76(d)보다 더 풍부함을 나타낸다.
도 8a, 도 8b, 도 8c, 도 8d, 도 8e, 도 8f, 도 8g, 도 8h, 도 8i, 도 8j, 도 8k 및 도 8l은 뇌 p-타우 단백질의 중간 도메인 및 C-말단에서 인산화 부위의 검출을 도시한다.
도 9a, 도 9b, 도 9c, 도 9d, 도 89e 및 도 9f는 타우 서열 195-209(서열번호 38) 및 212-221(서열번호 64)로부터의 인산화된 펩티드 프로파일이 가용성 뇌 분획, 정상 CSF 및 AD CSF 타우 단백질 사이에서 가변적임을 도시한다. 뇌 가용성 타우 추출물은 상응하는 CSF 타우 수준과 대략적으로 매칭하도록 표시된 바와 같이 희석되었다. 195-209에서 인산화된 펩티드: 뇌 용해물에서 2개의 인산화된 펩티드 pS199 및 pS202의 공동-용리에 상응하는 하나의 신호가 관찰되었다. CSF에서, 2개의 추가 신호가 관찰되었다. 단편 분석으로 왼쪽의 신호의 pT205로의 배정을 허용하였다. AD CSF에서, 2개의 신호가 증가하여 오른쪽의 신호를 pS208에 배정하는 특이적 단편의 식별을 허용하였다. 212-221에서의 인산화된 펩티드: pT217 및 pS214에 상응하는 유사한 MS 강도를 갖는 2개의 신호가 뇌 용해물에서 식별되었다. CSF에서, pT217에 상응하는 신호는 가장 강렬한 반면 pS214는 검출 한계에 가까워 뇌 추출물과 비교하여 상대적인 풍부도의 극적인 변화를 나타내었다. AD CSF에서, pT217은 특이적 과인산화로 인해 유의하게 증가하였다.
도 10a, 도 10b, 도 10c, 도 10d, 도 10e, 도 10f, 도 10g, 도 10h 및 도 10i는 CSF에서 식별된 pT153, pT175 및 pT231 인산화된 펩티드를 도시한다. AQUA 내부 표준 신호는 pT175 및 pT231에 대해 나타냈다. pT153의 단편화 패턴은 변형되지 않은 것과 유사하다.
도 11은 T111의 인산화 풍부도가 S113 인산화에 비해 뇌보다 CSF에서 더 높다는 것을 도시한다. 뇌 및 CSF 둘 다에서, 타우 서열 103-126의 모든 모노-인산화된 펩티드에 대해 공통적인 MS/MS 단편 y18이 검출되었다. pS113(b)로부터의 y15 단편의 상대적 풍부도는 뇌 추출물과 비교하여 CSF에서 유의적으로 낮았다. 역으로 pT111(a)로부터의 y15 단편은 CSF에 풍부하며 AD CSF 타우 수준과 매칭하도록 희석된 뇌 가용성 추출물에서 검출되지 않았다.
도 12는 타우 인산화의 상대적 풍부도가 생물학적 추출물에 의존하고 단백질 서열에 따라 달라짐을 도시한다. HJ8.5 및 타우1을 사용하여 면역 포획으로 추출한 정상 뇌 용해물, 정상 CSF 및 AD CSF에서 MS에 의해 측정된 타우 인산화 풍부도의 비교. 원 면적은 부위 인산화 풍부도에 비례한다. 적색 및 녹색은 참고(청색)로서 사용된 뇌 가용성 프로파일과 비교하여 각각 증가 또는 감소를 나타낸다. 타우는 CSF에서 C-말단 절단되며, 이는 인산화 부위의 C-말단 클러스터의 검출의 부재를 설명한다. T205 및 S208의 인산화는 CSF에 특이적이다(뇌 가용성에서 적색 X-상단).
도 13은 타우 인산화 부위가 뇌, 정상 CSF 및 AD CSF에서 차별적으로 변형되었음을 도시한다. 측정치는 인산화되지 않은 상응하는 부위(HJ8.5 + 타우1 IP-MS)와 비교하여 인산화된 신호의 상대적 풍부도이다. 뇌 결과는 CSF 타우 수준과 매칭하도록 500x 내지 8000x 인자로 희석된 용해물로부터 수득하였다. T205 및 S208의 인산화는 뇌 조직에서 검출가능하지 않다. T111의 인산화는 500x 희석된 용해물에서 검출가능하지 않지만 10x 희석된 용해물에서 0.02%의 상응하는 풍부도로 검출되었다. 범례: **는 p=0.01 수준에서의 유의성을 나타내고, *는 p=0.05 수준에서의 유의성을 나타낸다.
도 14a, 도 14b, 도 14c 및 도 14d는 IP-MS에 의한 인산화 비율 측정에 대한 항체 효과를 도시한다. 뇌 용해물 풀, 비-AD(n=1) 및 AD CSF(n=1) 풀은 타우 N-말단 투영 도메인(타우13 또는 HJ8.5) 또는 중간 도메인(HJ8.7, 타우1 또는 타우5)에 대한 항체와 병행하여 면역침전되었다. 주요 CSF 부위(log10 척도)에서 측정된 인산화 비율의 레이더 플롯은 뇌 용해물(도 14a, 왼쪽 패널), 비-AD CSF(도 14a, 중간 패널) 및 AD CSF(도 14a, 오른쪽 패널)에서 도시된다. (도 14a) pT181/T181, pT231/T231에 대한 타우 인산화 비율 측정은 시험된 항체 전체에 걸쳐 일치한다. PS199/S199는 다른 항체에 비해 타우1 또는 타우1+HJ8.5를 사용함으로써 감소하였다. (도 14b) 타우1 또는 타우1+HJ8.5 IP에 의한 pS199의 낮은 회수율은 시험된 다른 항체와 비교하여 pS199/S199 비율 측정치를 과소평가한다. 타우13, HJ8.5 및 HJ8.7 항체는 뇌와 CSF 사이에 pS199 인산화 비율의 유의한 변화가 없음을 나타낸다. 뇌와 비교하여, pS202/S202 CSF 저인산화(도 14c) 및 pT217/pT217 과인산화(도 14d)는 IP-MS에 사용된 항체와 무관하게 입증된다. 도 14b-d에 대한 범례는 동일하며 도 14c-뇌(청색), 비 AD CSF(녹색) 및 AD CSF(적색)으로 도시된다.
도 15는 CSF 항온처리가 타우에 대한 인산화율 측정에 영향을 미치지 않음을 도시한다.
도 16a, 도 16b, 도 16c, 도 16d, 도 16e, 도 16f 및 도 16g는 아밀로이드 플라크가 타우 과인산화와 강한 상관 관계가 있지만 인산화 부위에 의해 상이하다는 것을 도시한다. 도 16a 총 타우(청색 선, AUC=0.62) 및 Aβ PiB-PET(SUVR 컷오프 1.25), p-T217(황색 선)을 기반으로 Aß 병리를 갖는 것으로서 참가자를 분류할 때 부위-특이적 인산화 비율에 대한 수신자 조작 특성은 Aβ 병리(AUC=0.97)와 거의 완벽한 연관성을 입증하며, 이어서 p-T181(AUC=0.89) 및 p-T205(AUC=0.74)가 뒤따른다. 표준화된(z-점수) 인산화 비율은 돌연변이 캐리어에 대한 Aβ PiB-PET 사분위수(n=45, 47, 28, 30)에 의해 p-T217(도 16b), p-T181, (도 16c), p-S202(도 16d), p-T205(도 16e) 및 총 타우(도 16f) 수준을 도시하며, Aβ PiB-PET 수준이 증가함에 따라 인산화의 부위-특이적 상이함을 강조한다: p-T217 및 p-T181이 Aβ PiB-PET 양의 초기 증가로 가장 크게 증가하고 Aß PiB-PET의 최고 수준에서 느리게 진행되는 반면, p-T205 및 총 타우는 지속된 증가를 입증한다. p-S202의 경우, 가장 낮은 Aβ PiB-PET 사분위수에 비해 가장 높은 Aβ PiB-PET 사분위수에서 인산화가 유의하게 감소하였다. Wilcoxon 2개의 샘플 테스트에 기반한, ***-p- 값<0.001, **-p-값<0.01; 중간 선은 중앙값을 나타내며, 상부 및 하부 노치=중앙값 +/- 1.58* 사분위수간 범위/제곱근(n-관측값), 상부 및 하부 위스커=상부/하부 힌지보다 크거나/작거나 또는 동등한 최대 관측치+1.58* IQR. 도 16g 무증상적 돌연변이 캐리어(n=139)에 대한 피질 및 피질하 Aβ PiB-PET SUVR 및 부위-특이적 인산화 사이의 이변수 상관 관계. 색상은 양의 상관관계(황색-적색) 및 음의 상관관계(청색)를 포함하는 상관관계를 나타낸다; 모든 상관관계는 허위 발견율(p<0.05)에서 살아남은 통계적으로 유의한 값을 나타내며 상관관계의 강도에 따라 상단에서 하단으로 정렬된다.
도 17a, 도 17b, 도 17c, 도 17d, 도 17e 및 도 17f는 상이한 인산화된 타우 부위의 종 방향 변화가 질환 특이적 단계이고 AD가 진행됨에 따라 반대 방향으로 변화함을 도시한다. 증상 발병에 대한 추정된 연도(EYO)에 걸쳐 돌연변이 캐리어(흑색=무증상적 돌연변이 캐리어, (n=152), 적색=증상적 돌연변이 캐리어(77)) 및 비-캐리어(청색, (n=141))에 대한 (도 17a) p-T217, (도 17b) p-T181 (도 17c) 총 타우, (도 17d) p-T205, 및 (도 17e) p-S202의 인산화 비율의 개별적인 z-형질전환된 종 방향 변화. 수직 점선은 예상된 증상 발병 지점이며, 녹색 선은 각각의 p-타우 아이소폼에 대한 변화율이 비-캐리어에 비해 돌연변이 캐리어에 대해 더 커질 때 모델 추정 시간을 나타낸다. (도 17f) 모델 추정된 비-캐리어의 비율로 표준화되고 아밀로이드 PET(적색) 및 인지 저하(황색)와 함께 EYO 동안에 플롯된 각각의 인산화 부위에 대한 종 방향 변화율; 모두 채워진 원은 각각의 변수에 대한 변화율이 비-캐리어에 비해 돌연변이 캐리어에 대해 처음으로 상이해지는 지점을 나타낸다. 이는 AD 스펙트럼 과정 동안에 p-타우 아이소폼에 대한 변화 패턴, 및 아밀로이드 플라크 성장 및 -21 EYO에서 증가하기 시작하는 플라크와 함께 p-T217의 증가 및 -21 EYO에서 시작하는 p-T217(흑색)의 과인산화 및 인지(황색 선) 저하와 함께 이러한 2개의 부위의 인산화율의 저하 사이의 밀접한 연관성을 강조한다. 대조적으로, p-T205(보라색)는 질환이 진행되는 동안 계속해서 증가하고 총 타우 수준(회색)은 증상 발병 시점 가까이에서 증가된 속도로 증가한다.
도 18a 및 도 18b는 인산화된-타우 부위가 뇌 대사저하 및 위축과 차별적으로 관련되어 있음을 도시한다. 도 18a. 무증상적 돌연변이 캐리어(n=152)에서 피질 및 피질하 위축과 부위-특이적 인산화 비율 간의 이변수 상관관계는 p-T181에 대한 더 작은 연관성과 함께 p-T205 및 p-T217의 인산화 증가를 입증한다. 총 타우 수준은 다중 피질 및 피질하 영역에서 더 큰 위축과 연관된다. 도 18b. FDG-PET에 의해 측정된 피질 및 피질하 뇌 물질대사, 및 무증상적 돌연변이 캐리어(n=143)에서 부위-특이적 인산화 비율 사이의 이변수 상관관계는 p-T205의 인산화 증가가 대부분의 피질 및 피질하 영역에서의 감소와 연관이 있지만 다른 p-타우 부위 또는 타우에 대해서는 그렇지 않음을 입증한다.
도 19a, 도 19b, 도 19c 및 도 19d는 p-T217, p-T181 및 p-T205에서 감소하는 인산화가 치매 및 인지 저하와 연관이 있음을 도시한다. 돌연변이 캐리어에 대한 p-타우 아이소폼 및 총 타우(y-축)의 개별 추정 연간 변화율은 총괄적 인지 기능의 연간 변화와 상관 관계가 있었다; 선은 95% 신뢰 구간을 나타내는 음영 영역이 있는 단순 선형 회귀를 나타낸다. 각각의 지점은 측정치 간의 개별 수준 상관관계를 나타낸다. 선형 회귀는 치매가 없는 사람들(흑색, n=47)과 치매가 있는 사람들(적색, n=25)에게 적합하였다. p-T217(도 19a), r=0.43(p=0.02), p-T181(도 19b), r=0.72(p<.001) 및 p-T205(도 19c), r=0.41(p=0.03) 인산화율의 저하는 증상 발병(적색) 후 인지 저하와 연관되었다. 총 타우의 경우 인지와 역 상관관계를 시사하는 경향이 있었지만 (도 19d) 유의하지 않았다.
도 20은 DIAD 돌연변이 캐리어에서 증상 발병 가까이에서의 타우 PET 증가를 도시한다. 타우-PET 시간 이전에 종 방향 CSF 평가를 받은 참가자들에 대한 증상 발병에 대한 추정된 연도(EYO)인 x 축 동안에 돌연변이 캐리어(적색, n=12) 및 비-캐리어(청색, n=9)에 대한 평균 피질 표준화 단위 값 비율(SUVR)인 y-축. 플롯은 돌연변이 캐리어의 경우 추정된 증상 발병 시점(EYO = 0)까지 타우-PET에서 거의 상승이 없음을 나타낸다. 이 도면은 AV-1451에 의해 검출된 신경원섬유 엉킴(NFT) 병리가 다중 가용성 포스포타우 부위의 증가보다 훨씬 늦게 발생한다는 것을 보여주며 이는 이러한 타우의 가용성 마커가 NFT 병리의 마커일 가능성이 있지만 오히려 AD 병리의 특징인 과인산화된 불용성 타우 침착물을 발생하게 만들 수 있음을 시사한다.
도 21a, 도 21b, 도 21c, 도 21d 및 도 21e는 타우 및 타우 인산화 부위의 종 방향 변화가 우성 유전성 AD에서 신경원섬유 타우(타우-PET)와 차별적으로 관련되어 있음을 도시한다. 타우-PET 스캔(x-축) 시간까지 이어지는 개별의 추정된 인산화 변화율 및 총 타우(y-축). 수직선은 1.22의 SUVR이며 NFT 타우-PET(다중 피질 및 변연 영역의 복합물)가 비-캐리어에 비해 상승된 것으로 간주될 때의 지점의 보존적인 추정치를 나타낸다. 플롯은 가용성 타우 및 p-T205의 증가가 더 높은 수준의 응집된 타우와 연관이 있는 반면, p-T217 및 p-T181에서 인산화율은 응집된 타우 수준이 증가함에 따라 감소함을 시사한다. 이러한 발견은 상이한 부위에서 타우의 증가 수준과 인산화 사이에 상이함이 있음을 시사하며, 일부 경우에 타우 병리의 확산과 함께 과인산화된 응집체의 부담이 증가함에 따라 가용성 p-타우가 격리됨을 나타낼 수 있다. 이들은 또한 응집된 타우의 증가와 함께 응집된 타우 병리의 더 큰 부담과 함께 수동적 또는 능동적 방출을 나타낼 수 있는 가용성 타우 수준의 증가가 있음을 시사한다.
도 22는 타우 병리가 알츠하이머 질환에서 별개의 단계를 통해 진화하는 것을 보여주는 예시이다. 결정론적 알츠하이머 질환 돌연변이가 있는 참가자 그룹에서 4개의 상이한 가용성 타우 종과 불용성 타우를 측정하는 것은 35년 동안(x-축) 타우 관련 변화가 전개되며(y-축), 질환의 단계 및 다른 측정가능한 바이오 마커에 기반하여 다르다. A. 원섬유 아밀로이드 병리의 발생으로 시작하여 위치 217(보라색)과 181(청색)에서 인산화가 증가하기 시작한다. B. (물질대사 변화에 기반한) 뉴런의 기능이상이 증가함에 따라 위치 205(녹색)에서 인산화가 가용성 타우(주황색)와 함께 증가하기 시작한다. C. 마지막으로, (뇌 위축 및 인지 저하에 기반한) 신경변성의 발병과 함께 타우 PET 엉킴(적색)이 발생하기 시작하고 217과 181의 인산화가 감소하기 시작한다. 함께, 이는 질환 과정 동안에 가용성 및 응집된 타우의 역동적 및 발산 패턴 및 아밀로이드 병리와의 밀접한 관계를 강조한다.
도 23a, 도 23b 및 도 23c는 CSF에서 인산화된 타우 아이소폼의 정량을 도시한다. 타우 인산화된 펩티드 및 CSF에서 상응하는 비변형된 펩티드의 병렬 반응 모니터링(PRM) 분석에서 추출된 이온 크로마토그램의 합계이다. 도 23a, 마이크로LC 시스템을 사용한 T181 모니터링. 도 23b. 나노LC 시스템을 사용하여 S199, S202, T205(프레임 신호로 공동용리됨) 및 T217 모니터링. 내인성 신호(전체 청색 선), 15N 표지된 펩티드(청색 점선), AQUA 펩티드(녹색 점선). 도 23c는 펩티드 단편화에 대한 Biemann 명명법에 따른 특이적 PRM 전이를 도시하며, 이는 pS199, pS202 또는 pT205를 운반하는 3개의 공동-용리된 모노인산화된 펩티드의 식별을 허용한다. Cps =초 당 카운트.
도 24a, 도 24b, 도 24c, 도 24d 및 도 24e는 T217에서의 CSF 타우 인산화가 아밀로이드증 상태와 연관되어 있음을 도시한다. 도 24a: T217 인산화는 인지 저하가 없거나 경미한 아밀로이드-음성 대조군과 비교하여 아밀로이드증(PiB-PET 및 CSF Aβ42/40 비율 양성)을 갖는 참가자에서 유의하게 증가한다. 도 24b: MS에 의한 T217, T181 및 ELISA에 의한 T181의 인산화율을 사용하여 아밀로이드-음성 참가자로부터의 아밀로이드-양성 진단을 위한 ROC 곡선. 도 24c: pT217/T217 비율 비교는 아밀로이드증이 있는 참가자의 T217에 대한 특이적 인산화를 나타낸다. 도 24d-e: MS에 의해 측정된 CSF Aβ42/40 변화와 함께 T217 인산화의 비교 및 PiB-PET에 의해 측정된 아밀로이드 플라크 침착의 비교. 도 24d: T217 과인산화의 정도는 Aβ40에 비해 CSF Aβ42의 감소와 상관관계가 없다. 5개의 상반되는 경우(주황색 삼각형, PiB-PET 및 T217 과인산화에 대해 양성이지만 CSF Aβ에 대해 음성)는 모두 아밀로이드 상태를 정의하기 위해 선택된 0.12의 역치보다 약간 높았으며, 이는 CSF 아밀로이드 검정의 불충분한 민감도로 인해 발생할 수 있음을 시사한다. 도 24e: PiB-PET 로딩(FBP 총 피질 평균)은 아밀로이드-양성 참가자에서 T217 인산화 상태와 상관관계가 있다. PiB에 의해 아밀로이드 음성으로부터 아밀로이드 양성을 구별하는 컷오프 값은 0.18이다.
도 25는 T217에 대한 CSF 타우 인산화가 인지 상태와 무관하며 전임상 AD에서 유의하게 변형되었음을 도시한다. 왼쪽 패널: T217 인산화와 임상 치매 척도 박스 총점(clinical dementia rating sum of boxes)(CDR-SB)에 의해 측정된 인지 프로파일 사이에는 상관관계가 없다. 오른쪽 패널: 인지 저하가 없는 참가자(CDR-SB=0) 중에서, T217은 이미 아밀로이드-양성 군에서 유의하게 과인산화되었다.
중추 신경계에서 신경원섬유 엉킴으로의 타우 단백질 응집은 알츠하이머 질환(AD)을 포함하여 특정 신경퇴행성 장애의 병인에 기여한다. 타우 불안정화의 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았지만, 타우 단백질은 타우 응집체에서 과인산화되는 것으로 밝혀졌다. 출원인은 특이적 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 정량하는 특정 방법을 사용하여 전임상 무증상적 단계에서 증상적 단계까지 AD 과정을 추적할 수 있음을 발견하였다. 도 22는 AD로 인한 MCI 발병으로부터 특정 병태생리학적 변화의 발생까지의 연도와 관련하여 출원인의 방법에 의해 생성된 T181, T205 및 T217에서 측정가능한 타우 인산화의 역동적 패턴을 예시한다. 본 개시내용은 특이적 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 정량하여 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애의 발병 시간을 예측하고, 치료 결정을 안내하고, 임상 시험을 위한 대상체를 선별하고, 특정 치료적 개입의 임상 효능을 평가하는 방법의 사용을 포함한다. 본 발명의 다른 양태 및 반복은 하기에 보다 자세히 설명된다.
I. 정의
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 특정 용어를 먼저 정의한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 실시양태가 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나, 변형되거나, 동등한 많은 방법 및 물질이 지나친 실험없이 본 발명의 실시양태의 실시에 사용될 수 있으며, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기재된다. 본 발명의 실시양태를 설명하고 청구함에 있어서, 하기 제시된 정의에 따라 다음의 용어가 사용될 것이다.
본원에 사용된 용어 "약"은 예를 들어, 질량, 부피, 시간, 거리 및 양을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 정량가능한 변수와 관련하여, 전형적인 측정 기술 및 장비를 통해 발생할 수 있는 수치적 정량의 변동을 지칭한다. 또한, 실제 세계에서 사용되는 고체 및 액체 취급 절차를 고려할 때, 조성물을 제조하거나 방법 등을 수행하는 데 사용되는 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 상이함을 통해 발생할 수 있는 특정 의도하지 않은 오류 및 변동이 있을 수 있다. 용어 "약"은 또한 최대 ±5%일 수 있지만, 또한 ± 4%, 3%, 2%, 1% 등일 수 있는 이러한 변동을 포함한다. 용어 "약"에 의해 변형되든 아니든, 청구 범위는 정량에 대한 등가물을 포함한다.
본원에 사용된 항체는 당업계에서 이해되는 완전한 항체, 즉 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 이루어진 완전한 항체일 수 있거나, 항원 결합 영역을 갖고 항체 단편, 예컨대, Fab', Fab, F(ab')2, 단일 도메인 항체, Fv 및 단일쇄 Fv를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 항체-유사 분자일 수 있다. 용어 항체는 또한 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체를 지칭한다. 다양한 항체-기반 구축물 및 단편을 제조하고 사용하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 항체를 제조하고 특성화하기 위한 수단은 또한 당업계에 잘 알려져 있다(예컨대, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988를 참고하며; 그 전문이 본원에 참고로 원용됨).
본원에 사용된 용어 "압타머"는 일반적으로 생화학적 활성, 분자 인식 또는 결합 속성의 측면에서 유용한 생물학적 활성을 갖는 RNA 또는 DNA인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 일반적으로 압타머는 특이적 에피토프(영역)에서 표적 분자에 결합하는 것과 같은 분자 활성을 갖는다. 폴리펩티드에 결합하는 특이적인 압타머는 생체 외 진화 방법에 의해 합성되고/되거나 식별될 수 있다는 것이 일반적으로 인정된다. 생체 외 진화 방법을 포함하여 압타머를 제조하고 특성화하기 위한 수단은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, US 7,939,313을 참고하며, 그 전문이 본원에 참고로 원용된다.
용어 "Aβ"는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로 불리는 더 큰 단백질의 카복시 말단 영역에서 유래된 펩티드를 지칭한다. APP를 코딩하는 유전자는 21번 염색체에 위치한다. 독성 효과를 가질 수 있는 많은 형태의 Aβ가 있다: Aβ 펩티드는 전형적으로 37-43개의 아미노산 서열 길이이지만, 전체 크기를 변화시키는 절단 및 변형을 가질 수 있다. 이들은 가용성 및 불용성 구획, 단량체, 올리고머 및 응집된 형태, 세포 내 또는 세포 외에서 발견될 수 있으며, 다른 단백질 또는 분자와 복합될 수 있다. Aβ의 유해 효과 또는 독성 효과는 임의의 또는 모든 상기 언급된 형태뿐만 아니라 구체적으로 기재되지 않은 다른 형태에 기인할 수 있다. 예를 들어, 2개의 이러한 Aβ 아이소폼은 Aβ40 및 Aβ42를 포함한다; Aβ42 아이소폼은 특히 섬유소 생성 또는 불용성이며 질환 상태와 연관된다. 용어 "Aβ"는 전형적으로 개별 Aβ 종 간의 차별없이 복수의 Aβ 종을 지칭한다. 특이적 Aβ 종, 예컨대, 예컨대, Aβ42, Aβ40, Aβ38 등은 펩티드의 크기에 의해 식별된다.
본원에 사용된 용어 "Aβ42/Aβ40 값"은 동일한 샘플에서 Aβ40의 농도와 비교하여 대상체로부터 수득한 샘플의 Aβ42의 농도의 비율을 의미한다.
"Aβ 아밀로이드증"은 뇌에서 Aβ 침착의 증거로서 임상적으로 정의된다. Aβ 아밀로이드증을 갖는 것으로 임상적으로 결정된 대상체는 본원에 "아밀로이드 양성"으로서 지칭되는 반면, Aβ 아밀로이드증이 없는 것으로 임상적으로 결정된 대상체는 본원에 "아밀로이드 음성"으로서 지칭된다. Aβ 아밀로이드증은 현재 기술에 의해 검출가능하기 전에 존재할 가능성이 있다. 그럼에도 불구하고, 당업계에는 Aβ 아밀로이드증의 허용된 지표가 있다. 본 개시내용의 시점에서, Aβ 아밀로이드증은 전형적으로 아밀로이드 영상화(예컨대, PiB PET, 플루오르베타피르 또는 당업계에 공지된 다른 영상화 방법) 또는 감소된 뇌척수액(CSF) Aβ42 또는 감소된 CSF Aβ42/40 비율에 의해 식별된다. 평균 피질 결합 잠재력(MCBP) 점수>0.18을 갖는 [11C] PIB-PET 영상화는, 면역침전 및 질량 분석법(IP/MS)에 의한 약 1ng/ml의 뇌척수액(CSF) Aβ42 농도와 마찬가지로 Aβ 아밀로이드증의 지표이다). 이와 같은 값 또는 당업계에 공지된 다른 값은 Aβ 아밀로이드증을 임상적으로 확인하기 위해 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, Klunk W E et al. Ann Neurol 55(3) 2004, Fagan A M et al. Ann Neurol, 2006, 59(3), Patterson et. al, Annals of Neurology, 2015, 78(3): 439-453, 또는 Johnson et al., J. Nuc. Med., 2013, 54(7): 1011-1013을 참고하며, 각각은 그 전체가 본원에 참고로 원용된다. Aβ 아밀로이드증이 있는 대상체는 증상이 있거나 없을 수 있으며, 증상이 있는 대상체는 Aβ 아밀로이드증과 연관된 질환에 대한 임상 기준을 충족하거나 충족하지 않을 수 있다. Aβ 아밀로이드증과 연관된 증상의 비-제한적인 예는 손상된 인지 기능, 변경된 행동, 비정상 언어 기능, 정서 조절이상, 발작, 치매 및 손상된 신경계 구조 또는 기능을 포함할 수 있다. Aβ 아밀로이드증과 연관된 질환은 알츠하이머 질환(AD), 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 루이소체 치매 및 봉입체 근염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. Aβ 아밀로이드증이 있는 대상체는 Aβ 아밀로이드증과 연관된 질환이 발생할 위험이 증가한다.
"Aβ 아밀로이드증의 임상 징후"는 당업계에 공지된 Aβ 침착의 척도를 지칭한다. Aβ 아밀로이드증의 임상 징후는 아밀로이드 영상화(예컨대, PiB PET, 플루오르베타피르 또는 당업계에 알려진 다른 영상화 방법) 또는 감소된 뇌척수액(CSF) Aβ42 또는 Aβ42/40 비율에 의해 식별된 Aβ 침착을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Klunk WE et al. Ann Neurol 55(3) 2004, 및 Fagan AM et al. Ann Neurol 59(3) 2006을 참고하며, 각각은 그 전문이 본원에 참고로 원용된다. 각각은 그 전문이 본원에 참고로 원용되는, 미국 특허 일련 번호 14/366,831, 14/523,148 및 14/747,453에 기재된 바와 같이, Aβ 아밀로이드증의 임상 징후는 또한 Aβ의 물질대사 측정, 특히 Aβ42 물질대사 단독 측정 또는 다른 Aβ 변이체(예컨대, Aβ37, Aβ38, Aβ39, Aβ40 및/또는 총 Aβ)의 물질대사 측정과의 비교를 포함할 수 있다. 추가 방법은 Albert et al. Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 170-179; McKhann et al., Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 263-269; 및 Sperling et al. Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 280-292에 기재되어 있으며, 각각은 그 전문이 본원에 참고로 원용된다. 중요한 것은, Aβ 아밀로이드증의 임상 징후가 있는 대상체는 Aβ 침착과 연관된 증상이 있을 수도 있고 없을 수도 있다는 것이다. 그러나 Aβ 아밀로이드증의 임상 징후가 있는 대상체는 Aβ 아밀로이드증과 연관된 질환이 발생할 위험이 증가한다.
"아밀로이드 영상화 후보자"는 아밀로이드 영상화가 임상적으로 보증될 수 있는 개체에서와 같이 임상의에 의해 식별된 대상체를 지칭한다. 비-제한적인 예로서, 아밀로이드 영상화를 위한 후보자는 하나 이상의 Aβ 아밀로이드증의 임상 징후, 하나 이상의 Aβ 플라크 연관 증상, 하나 이상의 CAA 연관 증상, 또는 이들의 조합을 갖는 대상체일 수 있다. 임상의는 그들의 임상 케어를 지시하는 이러한 대상체에게 아밀로이드 영상화를 추천할 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예로서, 아밀로이드 영상화를 위한 후보자는 Aβ 아밀로이드증과 연관된 질환에 대한 임상 시험에 잠재적인 참여자가될 수 있다(대조군 대상체 또는 테스트 대상체).
"Aβ 플라크 연관 증상" 또는 "CAA 연관 증상"은 각각 아밀로이드 원섬유로 불리는 규칙적으로 정렬된 원섬유 응집체로 구성된 아밀로이드 플라크 또는 CAA의 형성에 의해 야기되거나 이와 연관된 임의의 증상을 지칭한다. 예시적인 Aβ 플라크 연관 증상은 뉴런의 변성, 손상된 인지 기능, 손상된 기억력, 변경된 행동, 정서 조절이상, 발작, 손상된 신경계 구조 또는 기능 및 알츠하이머 질환 또는 CAA의 발생 또는 악화의 증가된 위험을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 뉴런의 변성은 뉴런의 구조 변화(분자 변화, 예컨대, 독성 단백질, 단백질 응집체 등의 세포 내 축적 또는 거시적 수준 변화, 예컨대, 엑손 또는 수상돌기의 모양 또는 길이의 변화, 미엘린 수초 구성의 변화, 미엘린 수초의 소실 등), 뉴런의 기능 변화, 뉴런의 기능 소실, 뉴런의 사멸, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 손상된 인지 기능은 기억력, 주의력, 집중력, 언어, 추상적 사고, 창의성, 실행 기능, 계획 및 조직의 어려움을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 변경된 행동은 신체적 또는 언어적 공격, 충동, 감소된 억제, 무관심, 감소된 개시, 성격 변화, 알콜, 담배 또는 약물 남용, 및 기타 중독-관련 행동을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 정서 조절이상은 우울증, 불안, 조증, 과민성 및 정서적 실금을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 발작은 전신성 긴장성 간대성 간질 발작, 복합 부분 발작 및 비-간질성 정신병학적 발작을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 손상된 신경계 구조 또는 기능은 뇌수종, 파킨슨증, 수면 장애, 정신병, 균형 및 조정의 기능장애를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이는 운동 기능장애, 예컨대, 홑팔다리마비, 편측마비, 사지마비, 운동실조, 발리스무스 및 떨림을 포함할 수 있다. 이는 또한 후각, 촉각, 미각, 시각 및 청각 감각을 포함한 감각 소실 또는 기능이상을 포함할 수 있다. 또한, 이는 자율 신경계 기능장애, 예컨대, 장 및 방광 기능이상, 성 기능이상, 혈압 및 체온 조절이상을 포함할 수 있다. 마지막으로, 이는 시상 하부 및 뇌하수체의 기능이상, 예컨대, 성장 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 루텐화 호르몬, 난포 자극 호르몬, 성선 자극 호르몬 방출 호르몬, 프로락틴 및 기타 수많은 호르몬 및 조절인자의 결핍 및 조절이상으로 인한 호르몬 기능장애를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유류, 바람직하게는 인간을 지칭한다. 포유류는 인간, 영장류, 가축, 설치류 및 애완 동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 대상체는 의료 케어 또는 치료를 기다리고 있을 수 있거나, 의료 케어 또는 치료를 받고 있을 수 있거나, 의료 케어 또는 치료를 받았을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "건강한 대조군", "정상 군" 또는 "건강한" 대상체로부터의 샘플은 Aβ 아밀로이드증, 또는 정성적 또는 정량적 테스트 결과에 기반한 Aβ 아밀로이드증(알츠하이머 질환을 포함하되 이에 제한되지 않음)과 연관된 임상 질환을 앓지 않는 것으로서 의사에 의해 진단된/진단된 대상체 또는 군 대상체를 의미한다. "정상" 대상체는 일반적으로 동일한 연령의 대상체 및 5 내지 10세 범위 내의 대상체를 포함하나 이에 제한되지 않는, 평가될 개체와 거의 동일한 연령이다.
본원에 사용된 용어 "혈액 샘플"은 혈액, 바람직하게는 말초 (또는 순환) 혈액으로부터 유래된 생물학적 샘플을 지칭한다. 혈액 샘플은 전혈, 혈장 또는 혈청일 수 있지만, 전형적으로 혈장이 선호된다.
본원에 사용된 용어 "아이소폼"은 단백질을 코딩하는 mRNA의 대안적 스플라이싱, 단백질의 번역 후 변형, 단백질의 단백질분해 가공, 유전적 변이 및 체세포 재조합으로 인해 발생하는 동일한 단백질 변이체의 여러 상이한 형태 중 임의의 것을 지칭한다. 용어 "아이소폼" 및 "변이체"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 달리 언급되지 않는 한, 용어 "타우 단백질" 또는 "타우"는 전장, 절단 또는 번역 후 변형되든지 간에 모든 타우 아이소폼을 포함한다. 인간, 비-인간 영장류, 설치류, 어류, 소, 개구리, 염소 및 닭을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 동물에서, 타우는 MAPT 유전자에 의해 코딩된다. 인간의 경우, MAPT의 엑손 2, 3 및 10의 대안적 스플라이싱에 의해 생성되는 6개의 타우 아이소폼이 있다. 이들 아이소폼은 352 내지 441개의 아미노산 길이로 다양하다. 엑손 2 및 3은 각각 N-말단(N으로 칭함)에서 29개-아미노산 삽입물을 코딩하고, 전장 인간 타우 아이소폼은 삽입물 둘 다(2N), 1개의 삽입물(1N), 삽입물 없음을 가질 수 있다. 모든 전장 인간 타우 아이소폼은 또한 미세소관 결합 도메인(R로 칭함)의 3개의 반복을 가지고 있다. C-말단에 엑손 10을 포함하면 엑손 10에 의해 코딩된 제4 미세소관 결합 도메인의 포함을 야기한다. 따라서, 전장 인간 타우 아이소폼은 미세소관 결합 도메인의 4개의 반복(엑손 10 포함) 또는 미세소관 결합 도메인의 3개의 반복(엑손 10 제외)을 포함할 수 있다. 인간 타우는 번역 후 변형될 수 있거나 변형되지 않을 수 있다. 예를 들어, 타우는 인산화, 유비퀸화, 글리코실화 및 당화될 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "인간 타우"는 (2N, 3R), (2N, 4R), (1 N, 3R), (1 N, 4R), (0N, 3R) 및 (0N, 4R) 아이소폼, N- 및/또는 C-말단 절단된 종인 아이소폼, 및 번역 후 변형된 모든 아이소폼을 포함한다. 타우를 코딩하는 유전자의 대안적 스플라이싱은 다른 동물에서 유사하게 발생한다. 유전자가 MAPT로서 식별되지 않은 동물에서 상동체는 당업계에 잘 알려진 방법으로 식별될 수 있다.
뇌에서 타우 침착과 연관된 질환을 "타우병증"으로서 지칭할 수 있다. 당업계에 공지된 타우병증은 진행성 핵상 마비, 권투 선수 치매, 만성 외상성 뇌병증, 전두측두엽 치매 및 17번 염색체와 관련된 파킨슨증, 리티코-보딕 질환, 괌의 파킨슨-치매 복합증, 엉킴-우세 치매, 신경절신경아교종 및 신경절세포종, 수막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 독성뇌증, 결절성 경화증,할러포르덴-스파츠 질환, 라이포푸신증, 피크 질환, 피질 기저핵 변성, 은친화과립 질환(AGD), 전두측두엽 변성, 알츠하이머 질환, 및 전두측두엽 치매를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"평균으로부터 유의하게 벗어남"은 평균보다 높거나 낮은, 1 표준 편차 이상, 바람직하게는 1.3 표준 편차 이상, 보다 바람직하게는 1.5 표준 편차 이상 또는 더욱 더 바람직하게는 2 표준 편차 이상인 값을 지칭한다.
어구 "Aβ 및 타우 요법"은 집합적으로 Aβ 아밀로이드증 또는 AD 발생 위험이 있는 대상체, Aβ 아밀로이드증을 갖는 것으로서 진단된 대상체, 타우병증을 갖는 것으로서 진단된 대상체, 또는 AD를 갖는 것으로서 진단된 대상체를 위해 고려되거나 이와 함께 사용된 임의의 영상화제 또는 치료제를 지칭한다.
II. 단리된 타우 샘플에서 총 타우 및 타우 인산화 측정
본 개시내용의 방법은 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 하나 이상의 아미노산 잔기 및 임의로 총 타우에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다.
(a) 단리된 타우 샘플
본원에 사용된 단리된 타우 샘플은 타우를 포함하는 조성물을 지칭하며, 여기서 타우는 대상체로부터 수득한 혈액 또는 뇌척수액(CSF)으로부터 정제되었다. 대상체는 포유류, 바람직하게는 인간이다. CSF는 내재 CSF 카테터를 사용하거나 사용하지 않고 요추 천자를 통해 수득할 수 있다. 대상체로부터 동시에 수집된 다중 혈액 또는 CSF 샘플을 풀링할 수 있다. 혈액은 정맥 카테터를 사용하거나 사용하지 않고 정맥-천자 또는 핑거 스틱 (또는 이의 등가물)으로 수집할 수 있다. 일단 수집되면, 혈액 또는 CSF 샘플은 당업계에 알려진 방법에 따라 처리될 수 있다 (예컨대, 전체 세포 및 세포 잔해를 제거하기 위한 원심분리, 분석 테스트 전에 표본을 안정화하고 보존하도록 설계된 첨가제 사용 등). 혈액 또는 CSF 샘플을 즉시 사용하거나 동결하여 무기한 보관할 수 있다.
본 개시내용의 단리된 타우 샘플에서, 타우는 혈액 또는 CSF로부터 부분적으로 또는 완전히 정제되었다. 혈액 또는 CSF로부터 타우를 정제하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 선택적 침전, 크기-배제 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토 그래피 및 친화성 정제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 방법은 혈액 또는 CSF로부터 인산화된 타우 및 비인산화된 타우 둘 다를 농축한다.
예시적인 실시양태에서, 본 개시내용의 단리된 타우 샘플은 친화성 정제에 의해 혈액 또는 CSF로부터 정제된 타우를 포함한다. 친화성 정제는 고정된 리간드에 대한 특이적 결합 특성으로 인해 관심 단백질을 정제하는 방법을 지칭한다. 전형적으로, 고정된 리간드는 고체 지지체, 예컨대, 비드, 수지, 조직 배양 플레이트 등에 부착된 리간드이다. 적합한 리간드는 인산화된 및 비인산화된 타우 둘 다에 특이적으로 결합한다. 한 예에서, 적합한 리간드는 타우의 중간 도메인 내의 에피토프와 결합할 수 있다. 다른 예에서, 적합한 리간드는 타우의 N-말단, 바람직하게는 타우의 아미노산 1 내지 35 내에서 에피토프와 결합할 수 있다. 다른 예에서, 적합한 리간드는 타우의 MTBR 내의 에피토프와 결합할 수 있다. 다른 예에서, 적합한 리간드는 타우의 C-말단 내의 에피토프와 결합할 수 있다. 추가 실시양태에서, 타우는 2개 이상의 고정된 리간드를 사용하여 혈액 또는 CSF로부터 친화성 정제될 수 있다. 한 예에서, 고정화된 리간드는 타우의 N-말단 내의 에피토프와 결합하고 다른 고정화된 리간드는 타우의 중간 도메인 내의 에피토프와 결합한다. 다른 예에서, 고정화된 리간드는 타우의 MTBR 내의 에피토프와 결합하고 다른 고정화된 리간드는 타우의 중간 도메인 내의 에피토프와 결합한다. 다른 예에서, 고정화된 리간드는 타우의 C-말단 내의 에피토프와 결합하고 다른 고정화된 리간드는 타우의 중간 도메인 내의 에피토프와 결합한다. 다른 예에서, 고정화된 리간드는 타우의 C-말단 내의 에피토프와 결합하고 다른 고정화된 리간드는 타우의 N-말단 내의 에피토프와 결합한다. 다른 예에서, 고정화된 리간드는 타우의 MTBR 내의 에피토프와 결합하고 다른 고정화된 리간드는 타우의 N-말단 내의 에피토프와 결합한다. 다른 예에서, 고정된 리간드는 타우의 MTBR 내의 에피토프와 결합하고 다른 고정화된 리간드는 타우의 C-말단 내의 에피토프와 결합한다. 각각의 상기 실시양태에서, 리간드는 항체 또는 압타머일 수 있다. 적합한 항체의 비-제한적인 예는 도 1에 도시되어 있다.
단리된 타우 샘플은 즉시 사용될 수 있거나 당업계에 알려진 방법에 의해 무기한 보관될 수 있다.
(b) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화
타우에서 특이적 아미노산(즉, "부위")의 인산화는 인산화된 타우(p-타우) 아이소폼을 유발한다. 본 개시내용의 방법은 타우의 하나 이상의 특이적 아미노산에서 인산화의 화학양론을 측정하는 수단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원의 방법은 T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 및 T231로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원의 방법은 T111, T181, T205, S208, S214, T217 및 T231로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 T181, S214 및 T217로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 T181, T205 및 T217로부터 선택된 하나 이상의 잔기에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 S199를 포함하는 하나 이상의 잔기에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 S202를 포함하는 하나 이상의 잔기에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 S199를 포함하는 하나 이상의 잔기에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 T181을 포함하는 하나 이상의 잔기에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 T205를 포함하는 하나 이상의 잔기에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 T217을 포함하는 하나 이상의 잔기에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 T153 및 T175를 포함하는 2개 이상의 잔기에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 T181, T205 및 T217로부터 선택된 2개 이상의 잔기에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 T181, T205 및 T217을 포함하는 3개 이상의 잔기에서 타우 인산화를 측정하는 단계를 포함한다.
출원인은 타우 인산화 부위를 발견하고 단리된 타우 단백질에서 인산화 부위의 풍부도를 초기에 정량하기 위해 병렬 반응 모니터링(PRM)을 사용한 고도로 민감하고 및 특이적인 질량 분석법(MS) 방법을 개발하였다. 그러나, 본 개시내용은 타우의 부위-특이적 인산화를 정량적으로 평가하기 위한 임의의 하나의 특정 방법에 제한되지 않는다. 적합한 방법은 단일 아미노산의 인산화 상태만 상이한 타우 아이소폼을 구별하고, 상이한 아미노산에서 인산화되는 p-타우 아이소폼을 구별하고, 총 타우의 총괄적 변화와 독립적으로 특이적 부위에서 발생하는 인산화의 변화를 정량하여야 한다. 총 타우의 총괄적 변화와 독립적으로 특이적 부위에서 발생하는 인산화 화학량론의 변화를 정량하는 세 가지 접근법이 실시예에 자세히 설명되어 있다: 1) 동일한 서열을 공유하는 각각의 인산화된 펩티드의 상대적 풍부도를 추정하는 데 사용될 수 있는 인산화된 펩티드 이성질체 간의 상대적 비교; 2) 참고로서 타우 단백질로부터의 임의의 펩티드를 이용하여 인산화된 펩티드를 정규화하는 것; 및 3) 각각의 인산화된 및 비-인산화된 펩티드에 대한 내부 합성 표지된 표준물질을 사용한 절대 정량, 여기서 각각의 인산화된 펩티드에 대한 절대 정량 값은 타우 단백질로부터의 임의의 모든 펩티드에 대해 수득된 임의의 절대 정량 값으로 정규화된다. 세 가지 접근법 모두 각각의 부위에 대한 상대적 인산화 변화를 비교하기 위해 내부 정규화를 사용한다. 당업계에 공지된 다른 방법이 또한 사용될 수 있다.
예시적인 실시양태에서, 타우의 부위-특이적 인산화는 고분해능 질량 분석법에 의해 측정된다. 적합한 유형의 질량 분석기는 당업계에 알려져 있다. 여기에는 사중극자, 비행시간법(Time-of-Flight), 이온 트랩 및 Orbitrap뿐만 아니라 상이한 유형의 질량 분석기를 하나의 아키텍처로 결합하는 하이브리드 질량 분석기(예컨대, ThermoFisher Scientific의 Orbitrap Fusion™ Tribrid™ 질량 분석기)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 단리된 타우 샘플의 추가 가공은 MS 분석 전에 발생할 수 있다. 예를 들어, 타우는 단백질분해적으로 소화될 수 있다. 적합한 프로테아제는 트립신, Lys-N, Lys-C 및 Arg-N을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 단리된 타우 샘플을 생성하기 위해 친화성 정제를 사용하는 경우, 소화는 고정된 리간드로부터 타우를 용리한 후 또는 타우가 결합된 동안 발생할 수 있다. 하나 이상의 정화 단계 후, 소화된 타우 펩티드는 고분해능 질량 분석기와 인터페이스된 액체 크로마토그래피 시스템에 의해 분리될 수 있다. 크로마토그래피 시스템은 원하는 LC-MS 패턴을 생성하기 위해 일상적인 실험에 의해 최적화될 수 있다. 다양한 LC-MS 기술을 사용하여 부위-특이적 타우 인산화를 정량적으로 분석할 수 있다. 비-제한적인 예는 선별된-반응 모니터링, 병렬 반응 모니터링, 선별된-이온 모니터링 및 데이터 독립적 획득을 포함한다. 상기 언급한 바와 같이, 부위-특이적 타우 인산화에 대한 모든 정량적 평가는 총 타우의 총괄적 변화를 설명해야 한다. 예시적인 실시양태에서, 실시예에 요약된 질량 분석 프로토콜을 사용하였다.
(c) 총 타우
본원에 사용된 "총 타우"는 주어진 샘플에서 모든 타우 아이소폼을 지칭한다. 타우는 가용성 및 불용성 구획, 단량체 및 응집된 형태, 순서가 있거나 무질서한 구조, 세포 내 및 세포 외에서 발견될 수 있으며, 다른 단백질 또는 분자와 복합될 수 있다. 따라서, 생물학적 샘플의 공급원(예컨대, 뇌 조직, CSF, 혈액 등) 및 생물학적 샘플의 임의의 다운스트림 가공은 주어진 샘플에서 타우 아이소폼의 전체에 영향을 미칠 것이다.
총 타우는 비변형된 타우 펩티드의 풍부도를 모니터링함으로써 측정될 수 있다. 각각의 인산화된 타우 부위에 대해, 관심있는 인산화된 펩티드와 공통 아미노산 서열을 공유하는 타우 펩티드를 총 타우 수준을 측정하기 위해 우선적으로 사용할 수 있으나 타우 서열로부터의 임의의 펩티드를 사용할 수 있다. 타우 펩티드 측정은 질량 분석법에 의해 수행할 수 있으며, 표지된 내부 표준물질을 참고로서 사용함으로써 측정의 정확도를 개선시킬 수 있다. 대안적으로, 총 타우는 면역검정 또는 타우 농도를 정량하는 다른 방법에 의해 측정할 수 있다.
III. 대상체의 AD 단계를 진단하기 위해 AD로 인한 MCI 발병 전에 대상체를 진단하는 방법
본 개시내용의 일 양태는 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애로의 전환 위험이 높은 것으로서 대상체를 진단하고, AD로 인한 MCI 발병 연수의 측면에서 대상체를 임의로 단계화하거나 분류하는 방법을 포함한다. 알츠하이머 질환(AD)으로 인한 경미한 인지 기능장애(MCI)는 AD의 증상이 있는 치매 전 단계를 지칭한다. 이러한 인지 기능장애의 정도는 연령에 대해 정상적이 않기 때문에 구성, 예컨대, 연령 연관 기억력 기능장애 및 연령 연관 인지 저하는 적용되지 않는다. AD로 인한 MCI는 임상 진단이며, AD로 인한 MCI의 진단을 위한 임상 기준은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, Albert et al. Alzheimer's & Dementia, 2011, 7(3): 270-279 참고. 인지 테스트는 대상체에 대한 인지 기능장애의 정도를 객관적으로 평가하는 데 최적이다. MCI가 있는 대상체에 대한 인지 테스트 점수는 문화적으로 적절한 규범 데이터(즉, 손상된 도메인(들)에 대해, 가능한 경우)에 대한 연령 및 교육 매칭된 동배의 평균보다 전형적으로 1 내지 1.5 표준 편차가 낮다. MCI의 지정은 종종 임상 치매 평가(CDR) 척도에서 0.5의 총괄적 등급평가에 의해 지지된다. CDR은 치매 증상의 중증도를 정량하는 데 사용되는 숫자 척도이다. 다른 적합한 인지 테스트는 당업계에 알려져 있다. 인지 기능장애의 중증도를 평가하기 위한 적절한 테스트가 존재하지만, AD로 인한 MCI가 발병되기 몇 년 전에 높은 신뢰도를 갖는 대상체를 식별하는 테스트가 당업계에 필요하다.
일 실시양태에서, AD로 인한 MCI로의 전환 위험이 높은 것으로서 대상체를 진단하는 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 단리된 타우 샘플에서 T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 및 T231로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 인산화 수준(들)이 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 AD로 인해 MCI로의 전환 위험이 높은 것으로서 대상체를 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, AD로 인해 MCI로의 전환 위험이 높은 것으로서 대상체를 진단하는 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 제1 및 제2 단리된 타우 샘플을 제공하고, 각각의 단리된 타우 샘플에서 T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 및 T231으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; (b) 측정된 각각의 잔기에서 부위-특이적 인산화의 변화 및 임의로 총 타우의 변화를 계산하는 단계; 및 (c) 계산된 변화(들)가 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균에서 유의하게 벗어나는 경우 AD로 인해 MCI로 전환될 위험이 높은 것으로서 대상체를 진단하는 단계를 포함할 수 있다. "평균으로부터 유의하게 벗어남"은 평균 위 또는 아래로, 1 이상의 표준 편차, 바람직하게는 1.3 이상의 표준 편차, 더 바람직하게는 1.5 이상의 표준 편차 또는 보다 더 바람직하게는 2 이상의 표준 편차인 값(즉, 각각 1σ, 1.3σ, 1.5σ 또는 1.5σ, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차이다)을 지칭한다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 진단하기 위해 사용할 수 있다. 단리된 타우 샘플은 무증상일 수도 있고 아닐 수도 있는 대상체로부터 수득할 수 있다. "무증상적 대상체"는 AD의 임의의 징후 또는 증상을 나타내지 않는 대상체를 지칭한다. 그러나 대상체는 AD의 징후 또는 증상(예컨대, 기억력 소실, 물건을 잘못배치함, 기분 또는 행동의 변화 등)을 나타낼 수 있지만 경미한 인지 기능장애의 임상 진단을 위한 충분한 인지 또는 기능적 기능장애를 나타내지 않을 수 있다. 추가 실시양태에서, 대상체는 우세 유전성 알츠하이머 질환을 유발하는 것으로 알려진 유전자 돌연변이 중 하나를 운반할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 대상체는 우세 유전성 알츠하이머 질환을 유발하는 것으로 알려진 유전자 돌연변이를 운반하지 않을 수 있다. 특이적 패밀리 연결이 없는 알츠하이머 질환을 산발성 알츠하이머 질환으로서 지칭한다.
본 개시내용의 다른 양태는 대상체의 알츠하이머 질환 단계를 진단하는 방법을 포함한다. 다양한 실시양태에서, "AD 단계"는 AD로 인한 MCI 발병 이후 경과된 시간의 양(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 등)으로서 정의될 수 있다. AD의 임상 진단에 대한 기준이 있지만, 임상 환경에서 주어진 대상체에 대한 증상 발병 시기가 알려지지 않았거나 MCI 또는 AD의 의심스러운 진단이 있는 경우가 일반적이다. 따라서, 당업계에서는 대상체의 AD 단계를 객관적으로 진단하는 테스트가 필요하다.
일 실시양태에서, 대상체의 AD 단계를 진단하는 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 단리된 타우 샘플에서 T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 및 T231로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 인산화 수준(들)이 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 대상체의 AD 단계를 진단하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, AD로 인한 MCI 발병 전에 대상체를 진단하는 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 제1 및 제2 단리된 타우 샘플을 제공하고, 각각의 단리된 타우 샘플에서 T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 및 T231로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; (b) 측정된 각각의 잔기에서 부위-특이적 인산화의 변화 및 임의로 총 타우의 변화를 계산하는 단계; 및 (c) 계산된 변화(들)가 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 AD로 인한 MCI 발병으로부터 특정 연수인 것으로서 대상체를 진단하는 단계를 포함할 수 있다. "평균으로부터 유의하게 벗어남"은 평균 위 또는 아래로, 1 이상의 표준 편차, 바람직하게는 1.3 이상의 표준 편차 또는 더 바람직하게는 1.5 이상의 표준 편차 또는 보다 더 바람직하게는 2 이상의 표준 편차인 값(즉, 각각, 1σ, 1.3σ, 1.5σ 또는 1.5σ, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차이다)을 포함한다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 진단하기 위해 사용할 수 있다. 단리된 타우 샘플은 AD로 인한 MCI, 치매 또는 AD의 임상 진단이 있을 수도 있고 없을 수도 있는 대상체로부터 수득할 수 있다. 추가 실시양태에서, 대상체는 우세 유전성 알츠하이머 질환을 유발하는 것으로 알려진 유전자 돌연변이 중 하나를 운반할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 대상체는 우세 유전성 알츠하이머 질환을 유발하는 것으로 알려진 유전자 돌연변이를 운반하지 않을 수 있다.
대안적으로 또는 임의로 총 타우의 측정과 함께 부위-특이적 타우 인산화의 측정을 사용하는 것에 추가하여, 임의의 상기 실시양태에서, 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율, 또는 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율을 사용할 수 있다. 두 접근법 모두 실시예에 자세히 설명되어 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 사용할 수 있다. 예를 들어, 실시예는 기타 알려진 바이오마커(예컨대, APOE ε4 상태, 연령, 성별, 인지 테스트 점수, 기능적 테스트 점수 등)와 함께 다양한 통계 모델(예컨대, 선형 회귀, LME 곡선, LOESS 곡선 등)에서 부위-특이적 타우 인산화 값을 사용한다. 측정의 선별 및 수학적 연산의 선택은 방법의 특이도를 최대화하기 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 진단 정확도는 ROC 곡선 아래 영역에 의해 평가될 수 있으며, 일부 실시양태에서 0.7 이상의 ROC AUC 값이 역치(예컨대, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95 등)로서 설정된다.
인간의 뇌 아밀로이드 플라크는 아밀로이드-양전자방출 단층 촬영(PET)에 의해 일상적으로 측정된다. 예를 들어, 피질 Aβ-플라크의 11C-피츠버그 화합물 B(PiB) PET 영상화는 일반적으로 Aβ-플라크 병리를 검출하는 데 사용한다. 피질 PiB-PET의 표준 섭취 값 비율(SUVR)은 유의한 피질 Aß-플라크를 신뢰가능하게 식별하고 대상체를 PIB 양성(SUVR≥1.25) 또는 음성(SUVR<1.25)으로서 분류하는 데 사용한다. 따라서, 상기 실시양태에서, PET 영상화에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단은 피질 PiB-PET SUVR<1.25를 갖는 대상체 집단을 지칭할 수 있다. PiB 결합의 다른 값(예컨대, 평균 피질 결합 잠재력) 또는 피질 영역 이외의 관심 영역의 분석은 또한 대상체를 PIB 양성 또는 음성으로서 분류하는 데 사용될 수 있다. 다른 PET 영상화제도 또한 사용할 수 있다.
CSF에서 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단은, Patterson et al, Annals of Neurology, 2015에 기재된 바와 같이 질량 분석법에 의해 측정되는 경우 <0.12의 Aβ42/40 측정치를 갖는 대상체 집단을 지칭할 수 있다.
예시적인 실시양태에서, AD로 인한 MCI로의 전환 위험이 높거나 대상체의 AD 단계를 갖는 것으로서 대상체를 진단하는 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 단리된 타우 샘플에서 T181, T205 및 T217로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; 및 (b) AD로 인한 MCI로의 전환 위험이 높은 것으로서, 또는 AD로 인한 MCI의 발병으로부터 특정 연수에 있는 것으로서 대상체를 진단하거나, 측정된 인산화 수준(들)이 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 대상체의 AD를 단계화하는 단계를 포함할 수 있다. 도 22는 AD로 인한 MCI의 발병으로부터의 연도과 관련하여 단리된 타우 샘플에서 T181, T205 및 T217에서 측정가능한 타우 인산화의 역동적 패턴을 예시한다. 평균으로부터 유의하게 벗어나는 T217에서 인산화 수준은 AD로 인한 MCI의 발병으로부터 약 21년에 처음 발생하며; 평균으로부터 유의하게 벗어나는 T181에서 인산화 수준은 AD로 인한 MCI의 발병으로부터 약 19년에 처음 발생하며; 평균으로부터 유의하게 벗어나는 총 타우의 증가는 AD로 인한 MCI 발병으로부터 약 17년에 처음 발생하고; 평균으로부터 유의하게 벗어나는 T205에서 인산화 수준은 AD로 인한 MCI의 발병으로부터 약 13년에 처음으로 발생한다. 증상(예컨대, AD로 인한 MCI) 발병시, T217 및 T181에서 인산화 수준이 정체 상태를 유지한 다음, 감소한다.
상기 언급한 바와 같이, 측정된 인산화 수준(들) 사이의 비율 및 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우 사이의 비율을 포함하나 이에 제한되지 않는, T181, T205 및/또는 T217에서 인산화의 측정으로 추가적인 수학적 연산이 수행될 수 있다. 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율은 p-T181 및 p-T205, p-T217 및 p-T205, 또는 p-T181 및 p-T217 사이의 비율일 수 있다. 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율은 p-T181 및 총 타우, p-T205 및 총 타우, 또는 p-T217 및 총 타우 사이의 비율일 수 있다.
일 예에서, 본 개시내용의 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및 (b) T217 및/또는 T181에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상이고 T205에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이하인 경우 AD로 인한 MCI 발병으로부터 약 10 내지 약 25년, 또는 약 10 내지 약 20년인 것으로서 대상체를 진단하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, T217에서 타우 인산화 및/또는 T181에서 타우 인산화는 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2σ, 또는 2σ 초과일 수 있다. 다른 실시양태에서, T217에서 타우 인산화 및/또는 T181에서 타우 인산화는 약 1.85σ, 약 1.9σ, 약 1.95σ, 약 2σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 초과일 수 있다. 각각의 상기 실시양태에서, T205에서 타우 인산화는 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.51σ, 약 1.55σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2.0σ, 또는 2.0σ 미만일 수 있다. 대안적으로, T205에서 타우 인산화는 약 2.0σ, 약 2.05σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 미만일 수 있다. 추가 예에서, T217에서 타우 인산화 및/또는 T181에서 타우 인산화 약 2σ 이상 및 T205에서 타우 인산화는 약 2σ 이하일 수 있다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 진단하기 위해 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, T205, 및 T181 및/또는 T217에서 측정된 타우 인산화 수준은 각각 그 자체에 비해 예측력을 개선하기 위해 다양한 수학적 연산에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 비율(들)은 측정된 인산화 수준으로부터 계산될 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 총 타우 및 (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및 (b) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율 및/또는 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 약 1.5σ 이상이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 약 1.5σ 이하인 경우 AD로 인한 MCI 발병으로부터 약 10 내지 약 25년, 또는 약 10 내지 약 20년인 것으로서 대상체를 진단하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, 총 타우, 및 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율 및/또는 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율은 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2σ, 또는 2σ 초과일 수 있다. 다른 실시양태에서, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율 및/또는 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율은 약 1.85σ, 약 1.9σ, 약 1.95σ, 약 2σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 초과일 수 있다. 각각의 상기 실시양태에서, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율은 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.50σ, 약 1.55σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2.0σ, 또는 2σ 미만일 수 있다. 대안적으로, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율은 약 2.0σ, 약 2.05σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 미만일 수 있다. 추가의 예에서, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율 및/또는 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율은 약 2σ 이상일 수 있고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율은 약 2σ 이하일 수 있다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 진단하기 위해 사용할 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, (i) T181 및 T205, (ii) T217 및 T205, 또는 (iii) T181, T217 및 T205에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및 (b) (a)(i), (a)(ii) 또는 (a) (iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상인 경우 AD로 인한 MCI의 발병으로부터 약 15년 이하 또는 약 10년 이하인 것으로서 대상체를 진단하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2σ, 또는 2σ 초과일 수 있다. 다른 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 약 1.85σ, 약 1.9σ, 약 1.95σ, 약 2σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 초과일 수 있다. 추가의 예에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 약 2σ 이상일 수 있다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 진단하기 위해 사용할 수 있다. 보다 추가의 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 측정된 타우 인산화 수준은 각각 그 자체에 비해 예측력을 개선하기 위해 다양한 수학적 연산에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 비율(들)은 측정된 인산화 수준으로부터 계산될 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 총 타우 및 (i) T181 및 T205, (ii) T217 및 T205, 또는 (iii) T181, T217 및 T205에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및 (b) 총 타우에 대한 (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화 비율이 약 1.5σ 이상인 경우 AD로 인한 MCI의 발병으로부터 약 15년 이하, 또는 약 10년 이하인 것으로서 대상체를 진단하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, 총 타우, 및 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 총 타우에 대한 (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화의 비율은 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2σ, 또는 2σ 초과일 수 있다. 다른 실시양태에서, 총 타우에 대한 (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화의 비율은 약 1.85σ, 약 1.9σ, 약 1.95σ, 약 2σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 초과일 수 있다. 추가 예에서, 총 타우에 대한 (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화의 비율은 약 2σ 이상일 수 있다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 진단하기 위해 사용할 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 제1 및 제2 단리된 타우 샘플을 제공하며, 여기서 "제1" 및 "제2"는 샘플을 수집하는 순서를 지칭하며, (i) T181 및 T205, (ii) T217 및 T205, 또는 (iii) T181, T217 및 T205에서 타우 인산화를 측정하는 단계; (b) 측정된 각각의 잔기에서 부위-특이적 인산화의 변화 및 임의로 총 타우의 변화를 계산하는 단계; 및 (c) T181 및/또는 T217에서 인산화 수준이 감소하거나 동일하게 유지되고 T205에서 인산화 수준 및 임의로 총 타우가 증가하는 경우 대상체의 AD 단계를 진단하는 단계를 포함한다. 제1 및 제2 단리된 타우 샘플은 며칠, 몇 주 또는 몇 달 간격으로 수집할 수 있다. 전형적으로, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 또한 두 샘플 모두에 대해 약 1.5σ 이상일 것이며, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 정규 분포 타우 인산화에 의해 정의된 표준 편차이다. 보다 추가의 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 측정된 타우 인산화의 수준은 각각 그 자체에 비해 예측력을 개선시키기 위해 다양한 수학적 연산에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 비율(들)은 측정된 인산화 수준으로부터 계산될 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용의 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 제1 및 제2 단리된 타우 샘플을 제공하며, 여기서 "제1" 및 "제2"는 샘플을 수집하는 순서를 지칭하며, 총 타우 및 (i) T181 및 T205, (ii) T217 및 T205, 또는 (iii) T181, T217 및 T205에서 타우 인산화를 측정하는 단계; (b) 측정된 각각의 잔기에서 부위-특이적 인산화의 변화 및 총 타우의 변화를 계산하는 단계; 및 (c) T181 및/또는 T217에서 인산화 수준이 감소하거나 동일하게 유지되고, T205에서 인산화 수준이 감소하거나 동일하게 유지되며, 총 타우가 증가하는 경우 대상체의 AD 단계를 진단하는 단계를 포함한다. 제1 및 제2 단리된 타우 샘플은 며칠, 몇 주 또는 몇 달 간격으로 수집할 수 있다. 전형적으로, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 또한 두 샘플 모두에 대해 약 1.5σ 이상일 것이며, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차이다. 보다 추가의 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 측정된 타우 인산화의 수준은 각각 그 자체에 비해 예측력을 개선시키기 위해 다양한 수학적 연산에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 비율(들)은 측정된 인산화 수준으로부터 계산될 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
타우 인산화 및 총 타우를 측정하는 방법은 섹션 II에 기재되어 있으며, 참고로 이 섹션에 원용된다. 예를 들어, 실시예 5-9에 대해 상세히 설명된 프로토콜을 사용하여, p타우/타우 비율의 백분율로서 표시된 T181, T205 및 T217에서의 타우 인산화는, CSF로부터 정제된 단리된 타우 샘플에서 측정된, PET 영상화에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 각각 21.7±2.3, 0.34±0.13 및 1.2±0.66이다(표 3, 돌연변이 비-캐리어 컬럼 참고). 따라서, p-T181/T181, p-T205/T205 및 p-T217/T217에 대한 돌연변이 비-캐리어 집단에 대해 발견된 평균보다 두 배 높은 표준 편차(즉, 2σ)는 각각 43.4, 0.68 및 2.4이다. 그러나 당업자는 절대 값이 프로토콜 및 절대 정량에 사용되는 내부 표준의 공급원/사양에 따라 달라질 수 있음을 인식할 것이다.
바람직한 실시양태에서, 단리된 타우 샘플은 친화성 정제에 의해 혈액 또는 CSF로부터 정제된 타우를 포함하고 타우 인산화는 질량 분석법에 의해 측정된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 타우 샘플은 타우의 중간 도메인 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 리간드를 사용하고 임의로 타우의 N-말단 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 제2 리간드를 이용하는 친화성 정제에 의해 혈액 또는 CSF로부터 정제된 타우를 포함하고, 타우 인산화는 고분해능 질량 분석법에 의해 측정된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 타우 샘플은 타우의 중간 도메인 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 리간드를 사용하고 임의로 타우의 MTBR 또는 C-말단 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 제2 리간드를 이용하는 친화성 정제에 의해 혈액 또는 CSF로부터 정제된 타우를 포함하고, 타우 인산화는 고분해능 질량 분석법에 의해 측정된다. 예시적인 실시양태에서, 실시예에 요약된 질량 분석법 프로토콜을 사용한다.
IV. 치료 방법
본 개시내용의 또 다른 양태는 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이다. 본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 훈련을 받고 면허를 받은 전문가가 이를 필요로 하는 대상체에 의료 케어를 제공하는 것을 지칭한다. 의료 케어는 진단 테스트, 치료적 치료 및/또는 예방적 또는 예방 조치일 수 있다. 치료적 및 예방적 치료의 목적은 원하지 않는 생리적 변화 또는 질환/장애를 예방하거나 늦추는(경감시키는) 것이다. 치료적 또는 예방적 치료의 유익하거나 원하는 임상 결과는 검출 가능 여부에 관계없이, 증상 완화, 질환 정도의 축소, 질환의 안정화된 상태(즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 늦춰짐, 질환 상태의 향상 또는 일시적 완화, 및 차도(부분적이든 전체적이든)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 사람들은 이미 질환, 병태 또는 장애가 있는 사람들뿐만 아니라 질환, 병태 또는 장애를 가질 경향이 있는 사람들 또는 질환, 병태 또는 장애를 예방해야 하는 사람들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료를 받는 대상체는 무증상이다. 본원에 사용된 "무증상적 대상체"는 AD의 징후 또는 증상을 나타내지 않는 대상체를 지칭한다. 다른 실시양태에서, 대상체는 AD의 징후 또는 증상(예컨대, 기억력 소실, 물건을 잘못배치함, 기분 또는 행동의 변화 등)을 나타낼 수 있지만, 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애의 임상 진단을 위한 충분한 인지 또는 기능적 기능장애를 보이지 않을 수 있다. 어구 "알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애"는 섹션 IV에 정의되어 있다. 증상적 또는 무증상적 대상체는 Aβ 아밀로이드증이 있을 수 있다: 그러나 Aβ 아밀로이드증에 대한 사전 지식은 치료를 위한 필수 조건이 아니다. 보다 추가의 실시양태에서, 대상체는 AD가 있는 것으로서 진단될 수 있다. 전술한 실시양태 중 임의의 것에서, 대상체는 우세 유전성 알츠하이머 질환을 유발하는 것으로 알려진 유전자 돌연변이 중 하나를 운반할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 대상체는 우세 유전성 알츠하이머 질환을 유발하는 것으로 알려진 유전자 돌연변이를 운반하지 않을 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이 대상체를 치료하는 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 단리된 타우 샘플에서 T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 및 T231로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 인산화 수준(들)이 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같이 대상체를 치료하는 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 제1 및 제2 단리된 타우 샘플을 제공하고, 각각의 단리된 타우 샘플에서 T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 및 T231로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; (b) 측정된 각각의 잔기에서 부위-특이적 인산화의 변화 및 임의로 총 타우의 변화를 계산하는 단계; 및 (c) 계산된 변화(들)가 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. "평균으로부터 유의하게 벗어남"은 평균 위 또는 아래로, 1 이상의 표준 편차, 바람직하게는 1.3 이상의 표준 편차, 더 바람직하게는 1.5 이상의 표준 편차 또는 보다 더 바람직하게는 2 이상의 표준 편차인 값(즉, 각각 1σ, 1.3σ, 1.5σ 또는 1.5σ, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차이다)을 지칭한다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 치료하기 위한 기준으로서 사용할 수 있다.
대안적으로 또는 임의로 총 타우의 측정과 함께 부위-특이적 타우 인산화의 측정을 사용하는 것에 추가하여, 임의의 상기 실시양태에서, 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율, 또는 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율을 사용할 수 있다. 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율은 p-T181 및 p-T205, p-T217 및 p-T205, 또는 p-T181 및 p-T217 사이의 비율일 수 있다. 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율은 p-T181 및 총 타우, p-T205 및 총 타우, 또는 p-T217 및 총 타우 사이의 비율일 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 예는 기타 알려진 바이오마커(예컨대, APOE ε4 상태, 연령, 성별, 인지 테스트 점수, 기능적 테스트 점수 등)와 함께 다양한 통계 모델(예컨대, 선형 회귀, LME 곡선, LOESS 곡선 등)에서 부위-특이적 타우 인산화 값을 사용한다.
Aβ 아밀로이드증 또는 AD 발생 위험이 있는 대상체, Aβ 아밀로이드증이 있는 것으로서 진단된 대상체, 타우병증이 있는 것으로서 진단된 대상체, 또는 AD가 있는 것으로서 진단된 대상체를 위해 고려되거나 이와 함께 사용되는 많은 영상화제 및 치료제는 특이적 병태생리학적 변화를 표적으로 한다. 예를 들어, Aβ 표적화 요법은 일반적으로 Aβ 생산을 감소시키거나, Aβ 응집을 길항하거나, 뇌 Aβ 청소율을 증가시키도록 설계되었다; 타우 표적화 요법은 일반적으로 타우 인산화 패턴을 변경하거나, 타우 응집을 길항하거나, NFT 청소율을 증가시키도록 설계되었다; CNS 염증 또는 뇌 인슐린 저항성을 줄이기 위해 다양한 요법이 설계되었다; 등. 이러한 다양한 약제의 효능은 본원에 개시된 방법에 의해 측정된 바와 같이 T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 및 T231에서 특정 타우 인산화 수준을 갖는 대상체에 약제를 투여함으로써 개선될 수 있다.
예시적인 실시양태에서, Aβ 아밀로이드증 또는 AD 발생 위험이 있는 대상체, Aβ 아밀로이드증이 있는 것으로서 진단된 대상체, 타우병증이 있는 것으로서 진단된 대상체, 또는 AD가 있는 것으로서 진단된 대상체에 대해 고려되거나 이와 함께 사용되는 영상화제 및 치료제(본원에 "Aβ 및 타우 요법"으로서 총체적으로 지칭됨)의 효능은 본원에 개시된 방법에 의해 측정된 바와 같이 T181, T205 및/또는 T217에서 특정 타우 인산화 수준을 갖는 대상체에 Aβ 또는 타우 요법을 투여함으로써 개선될 수 있으며, 예를 들어, 도 22에 예시한다. 예를 들어, T217에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상이고 T181 및 T205에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이하인 경우, 바람직한 치료제는 대상체가 아밀로이드 양성이 되는 것을 예방하도록 설계된 것들을 포함할 수 있다 (예컨대, 아밀로이드 표적화 요법은 Aβ 생산을 감소시키고, Aβ 응집을 길항하도록 설계된다 등). 다른 예로서, T217 및/또는 T181에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상이고 T205에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이하인 경우, 바람직한 치료제는 아밀로이드 침착이 대상체의 존재하는 플라크 부하를 증가시키거나 감소시키는 것을 예방하도록 설계된 것을 포함할 수 있다. 다른 예로서, T217, T181 및 T205에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상인 경우, 바람직한 치료제는 아밀로이드 침착이 증가하는 것을 예방하거나, 대상체의 존재하는 플라크 부하를 감소시키거나, 타우 응집을 예방하거나, NFT를 표적화하도록 설계된 것을 포함할 수 있다. 다른 예로서, T217, T181 및 T205에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상이고, T217 또는 T181에서 타우 인산화가 정체 또는 감소하고, 총 타우 및/또는 T205에서 타우 인산화가 증가하는 경우, 바람직한 치료제는 아밀로이드 침착이 증가하는 것을 예방하거나, 대상체의 존재하는 플라크 부하를 감소시키거나, 타우 응집을 예방하거나, NFT를 표적으로 하도록 설계된 것뿐만 아니라 AD가 있는 대상체에 대해 특이적인 것을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 세부 사항은 다음 단락에서 식별된 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 표적(예컨대, CNS 염증, ApoE 등)에 대해 설계된 치료제를 투여하는데 유사하게 사용할 수 있다.
일 예에서, 본 개시내용은 AD로 인한 MCI로의 전환 위험이 증가된 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및 (b) T217 및/또는 T181에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상이고 T205에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이하인 경우 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, T217에서 타우 인산화 및/또는 T181에서 타우 인산화는 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2σ, 또는 2σ 초과일 수 있다. 다른 실시양태에서, T217에서 타우 인산화 및/또는 T181에서 타우 인산화는 약 1.85σ, 약 1.9σ, 약 1.95σ, 약 2σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 초과일 수 있다. 각각의 상기 실시양태에서, T205에서 타우 인산화는 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.51σ, 약 1.55σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2.0σ, 또는 2.0σ 미만일 수 있다. 대안적으로, T205에서 타우 인산화는 약 2.0σ, 약 2.05σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 미만일 수 있다. 추가 예에서, T217에서 타우 인산화 및/또는 T181에서 타우 인산화는 약 2σ 이상이고 T205에서 타우 인산화는 약 2σ 이하일 수 있다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 치료하기 위한 기준으로서 사용할 수 있다. 보다 추가의 실시양태에서, T205, 및 T181 및/또는 T217에서 측정된 타우 인산화 수준은 각각 그 자체에 비해 예측력을 개선하기 위해 다양한 수학적 연산에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 비율(들)은 측정된 인산화 수준으로부터 계산될 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용은 AD로 인한 MCI로의 전환 위험이 증가된 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 총 타우 및 (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및 (b) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율 및/또는 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 약 1.5σ 이상이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 약 1.5σ 이하인 경우 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, 총 타우, 및 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율 및/또는 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율은 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2σ, 또는 2σ 초과일 수 있다. 다른 실시양태에서, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율 및/또는 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율은 약 1.85σ, 약 1.9σ, 약 1.95σ, 약 2σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 초과일 수 있다. 각각의 상기 실시양태에서, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율은 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.50σ, 약 1.55σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2.0σ, 또는 2σ 미만일 수 있다. 대안적으로, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율은 약 2.0σ, 약 2.05σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 미만일 수 있다. 추가의 예에서, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율 및/또는 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율은 약 2σ 이상일 수 있고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율은 약 2σ 이하일 수 있다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 치료하기 위한 기준으로서 사용할 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용은 AD로 인한 MCI로의 전환 위험이 증가된 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, (i) T181 및 T205, (ii) T217 및 T205, 또는 (iii) T181, T217 및 T205에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및 (b) (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상인 경우, 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2σ, 또는 2σ 초과일 수 있다. 다른 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 약 1.85σ, 약 1.9σ, 약 1.95σ, 약 2σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 초과일 수 있다. 추가의 예에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 약 2σ 이상일 수 있다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 치료하기 위한 기준으로서 사용할 수 있다. 보다 추가의 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 측정된 타우 인산화 수준은 각각 그 자체에 비해 예측력을 개선하기 위해 다양한 수학적 연산에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 비율(들)은 측정된 인산화 수준으로부터 계산될 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용은 AD로 인한 MCI로의 전환 위험이 증가된 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 총 타우 및 (i) T181 및 T205, (ii) T217 및 T205, 또는 (iii) T181, T217 및 T205에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및 (b) 총 타우에 대한 (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화의 비율이 약 1.5σ인 경우 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, 총 타우, 및 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 총 타우에 대한 (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서의 타우 인산화의 비율은 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2σ, 또는 2σ 초과일 수 있다. 다른 실시양태에서, 총 타우에 대한 (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화의 비율은 약 1.85σ, 약 1.9σ, 약 1.95σ, 약 2σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 초과일 수 있다. 추가 예에서, 총 타우에 대한 (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화의 비율은 약 2σ 이상일 수 있다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 치료하기 위한 기준으로서 사용할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은 AD의 증상이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 제1 및 제2 단리된 타우 샘플을 제공하며, 여기서 "제1" 및 "제2"는 샘플을 수집하는 순서를 지칭하며, (i) T181 및 T205, (ii) T217 및 T205, 또는 (iii) T181, T217 및 T205에서 타우 인산화를 측정하는 단계; (b) 측정된 각각의 잔기에서 부위-특이적 인산화의 변화 및 임의로 총 타우의 변화를 계산하는 단계; 및 (c) T181 및/또는 T217에서 인산화 수준이 감소하거나 동일하게 유지되고 T205에서 인산화 수준 및 임의로 총 타우가 증가하는 경우 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 제1 및 제2 단리된 타우 샘플은 며칠, 몇 주 또는 몇 달 간격으로 수집할 수 있다. 전형적으로, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 두 샘플 모두에 대해 약 1.5σ 이상일 것이며, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차이다. 보다 추가의 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 측정된 타우 인산화 수준은 각각 그 자체에 비해 예측력을 개선하기 위해 다양한 수학적 연산에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 비율(들)은 측정된 인산화 수준으로부터 계산될 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은 AD의 증상이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 제1 및 제2 단리된 타우 샘플을 제공하며, 여기서 "제1" 및 "제2"는 샘플을 수집하는 순서를 지칭하며, 총 타우 및 (i) T181 및 T205, (ii) T217 및 T205, 또는 (iii) T181, T217 및 T205에서 타우 인산화를 측정하는 단계; (b) 측정된 각각의 잔기에서 부위-특이적 인산화의 변화 및 총 타우의 변화를 계산하는 단계; 및 (c) T181 및/또는 T217에서 인산화 수준이 감소하거나 동일하게 유지되고, T205에서 인산화 수준이 감소하거나 동일하게 유지되고, 총 타우가 증가하는 경우 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 제1 및 제2 단리된 타우 샘플은 며칠, 몇 주 또는 몇 달 간격으로 수집할 수 있다. 전형적으로, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 두 샘플 모두에 대해 약 1.5σ 이상일 것이며, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차이다. 보다 추가의 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 측정된 타우 인산화 수준은 각각 그 자체에 비해 예측력을 개선하기 위해 다양한 수학적 연산에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 비율(들)은 측정된 인산화 수준으로부터 계산될 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
각각의 상기 실시양태에서, 약학 조성물은 영상화제를 포함할 수 있다. 영상화제의 비-제한적인 예는 기능적 영상화제(예컨대, 플루오로데옥시글루코스 등) 및 분자 영상화제(예컨대, 피츠버그 화합물 B, 플로르베타벤, 플로르베타피르, 플루테메타몰, 방사성핵종 표지된 항체 등)를 포함한다.
대안적으로, 약학 조성물은 활성 약학 성분을 포함할 수 있다. 활성 약학 성분의 비-제한적인 예는 콜린에스테라제 억제제, N-메틸 D-아스파테이트(NMDA) 길항제, 항우울제(예컨대, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제, 비정형 항우울제, 아미노케톤, 선택적 세로토닌 및 노르에피네프린 재흡수 억제제, 삼환성 항우울제 등), 감마-세크레타제 억제제, 베타-세크레타제 억제제, 항-Aβ 항체(이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체 포함), 항-타우 항체(이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체 포함), 줄기 세포, 식이 보충제(예컨대, 리튬 물, 리포산을 포함하는 오메가-3 지방산, 장쇄 트리글리세리드, 제니스테인, 레스베라트롤, 커큐민 및 포도씨 추출물 등), 세로토닌 수용체 6의 길항제, p38알파 MAPK 억제제, 재조합 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자, 수동 면역요법, 활성 백신(예컨대, CAD106, AF20513 등), 타우 단백질 응집 억제제(예컨대, TRx0237, 메틸티오니뮴 클로라이드 등), 혈당 제어를 개선하기 위한 요법(예컨대, 인슐린, 엑세나타이드, 리라글루타이드 피오글리타존 등), 항염증제, 포스포디에스테라제 9A 억제제, 시그마-1 수용체 작용제, 키나제 억제제, 포스파타제 활성화제, 포스파타제 억제제, 안지오텐신 수용체 차단제, CB1 및/또는 CB2 엔도칸나비노이드 수용체 부분 작용제, β-2 아드레날린 수용체 작용제, 니코틴 아세틸콜린 수용체 작용제, 5-HT2A 역 작용제, 알파-2c 아드레날린 수용체 길항제, 5-HT 1A 및 1D 수용체 작용제, 글루타미닐-펩티드 사이클로트랜스퍼라제 억제제, APP 생산의 선택적 억제제, 모노아민 산화효소 B 억제제, 글루타메이트 수용체 길항제, AMPA 수용체 작용제, 신경 성장 인자 자극제, HMG-CoA 환원효소 억제제, 신경영양제, 무스카린성 M1 수용체 작용제, GABA 수용체 조절인자, PPAR-감마 작용제, 미세소관 단백질 조절인자, 칼슘 채널 차단제, 항고혈압제, 스타틴 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
다른 대안에서, 약학 조성물은 키나제 억제제를 포함할 수 있다. 적합한 키나제 억제제는 무수한 아미노산 키나제(TAOK), CDK, GSK-3β, MARK, CDK5, Fyn, 5' 아데노신 모노포스페이트 활성화 단백질 키나제(AMPK), 칼슘-칼모듈린 키나제 II, 사이클린-의존성 키나제-5(cdk5), 카세인 키나제 1(CK1), 카세인 키나제 2(CK2), 사이클릭 AMP-의존성 단백질 키나제(PKA), 이중-특이도 티로신-인산화 조절 키나제 1A(DYRK1A), 글리코겐 신타아제 키나제-3(GSK-3), JNK, LRRK2, 미세소관 친화성 조절 키나제(MARK), MSK1, p35/41, p42/p44 미토겐 활성화 단백질 키나제(ERKs1/2), p38 미토겐 활성화 키나제(p38MAPK), p70S6 키나제, 포스포릴라제 키나제, PKB/AKT, 단백질 키나제 C(PKC), 단백질 키나제 N(PKN), 전립선 유래 멸균 20-유사 키나제 1 알파/베타, 90kDa 리보솜 S6 키나제(RSK1/2)(PSK1/TAOK2), 전립선 유래 멸균 20-유사 키나제 2(PSK2/TAOK1), 스트레스 활성화 단백질 키나제(SAPK) 1 감마, SAPK2a, SAPK2b, SAPK3, SAPK4, SGK1, SRPK2 또는 타우-튜불린 키나제 1/2 (TTBK1/2)을 억제할 수 있다.
또 다른 대안에서, 약학 조성물은 포스파타제 활성화제를 포함할 수 있다. 비-제한적인 예로서, 포스파타제 활성화제는 단백질 포스파타제 1, 2A, 2B 또는 5의 활성을 증가시킬 수 있다.
타우 인산화 및 총 타우를 측정하는 방법은 섹션 II에 기재되어 있으며, 이 섹션에 참고로 원용된다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 타우 샘플은 친화성 정제에 의해 혈액 또는 CSF로부터 정제된 타우를 포함하고, 타우 인산화는 질량 분석법에 의해 측정된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 타우 샘플은 타우의 중간 도메인 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 리간드를 사용하고 임의로 타우의 N-말단 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 제2 리간드를 사용하는 친화성 정제에 의해 혈액 또는 CSF로부터 정제된 타우를 포함하며, 타우 인산화는 고분해능 질량 분석법에 의해 측정된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 타우 샘플은 타우의 중간 도메인 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 리간드를 사용하고 임의로 타우의 MTBR 또는 C-말단 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 제2 리간드를 사용하는 친화성 정제에 의해 혈액 또는 CSF로부터 정제된 타우를 포함하며, 타우 인산화는 고분해능 질량 분석법에 의해 측정된다. 예시적인 실시양태에서, 실시예에 요약된 질량 분석법 프로토콜을 사용한다.
V. 임상 시험
본 개시내용의 또 다른 양태는, 임상 시험에 대한 다른 모든 기준이 충족되는 경우 대상체를 임상 시험, 특히 Aβ 또는 타우 요법에 대한 임상 시험에 등록하는 방법이다. 일 실시양태에서, 대상체를 임상 시험에 등록하는 방법에 대한 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 단리된 타우 샘플에서 T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 및 T231로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; 및 (b) 인산화 수준(들)이 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 임상 시험에 대상체를 등록하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 대상체를 임상 시험에 등록하는 방법에 대한 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 제1 및 제2 단리된 타우 샘플을 제공하고, 각각의 단리된 타우 샘플에서 T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 및 T231로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; (b) 측정된 각각의 잔기에서 부위-특이적 인산화의 변화 및 임의로 총 타우의 변화를 계산하는 단계; 및 (c) 계산된 변화(들)가 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 임상 시험에 대상체를 등록하는 단계를 포함할 수 있다. 어구 "CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단"은 섹션 IV에 정의되어 있다. "평균으로부터 유의하게 벗어남"은 평균 위 또는 아래로, 1 이상의 표준 편차, 바람직하게는 1.3 이상의 표준 편차, 더 바람직하게는 1.5 이상의 표준 편차 또는 보다 더 바람직하게는 2 이상의 표준 편차인 값(즉, 각각 1σ, 1.3σ, 1.5σ 또는 1.5σ, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차이다)을 지칭한다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 등록하기 위한 기준으로서 사용할 수 있다.
대안적으로 또는 임의로 총 타우의 측정과 함께 부위-특이적 타우 인산화의 측정을 사용하는 것에 추가하여, 임의의 상기 실시양태에서, 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율, 또는 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율을 사용할 수 있다. 측정된 인산화 수준(들)으로부터 계산된 비율은 p-T181 및 p-T205, p-T217 및 p-T205, 또는 p-T181 및 p-T217 사이의 비율일 수 있다. 측정된 인산화 수준(들) 및 총 타우로부터 계산된 비율은 p-T181 및 총 타우, p-T205 및 총 타우, 또는 p-T217 및 총 타우 사이의 비율일 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 예는 기타 알려진 바이오마커(예컨대, APOE ε4 상태, 연령, 성별, 인지 테스트 점수, 기능적 테스트 점수 등)와 함께 다양한 통계 모델(예컨대, 선형 회귀, LME 곡선, LOESS 곡선 등)에서 부위-특이적 타우 인산화 값을 사용한다.
Aβ 및 타우 요법에 대한 임상 시험의 설계는 본원에 개시된 방법에 의해 크게 도움이될 수 있다. 많은 임상 시험은 AD 증상의 발병 전에 발생하는 특이적 병태생리학적 변화를 표적으로 하는 영상화제 또는 치료제의 효능을 테스트하기 위해 설계되었다. 섹션 V에서 상기 논의된 바와 같이, 이들 다양한 약제의 효능은 본원에 개시되고 예시된 방법에 의해 측정된 바와 같이 특정 부위-특이적 타우 인산화 수준을 갖는 대상체에 약제를 투여함으로써 개선될 수 있다. 마찬가지로, (예컨대, AD로 인한 MCI 발병 후) AD 증상이 있는 대상체를 등록하는 임상 시험도 또한 효능이 AD의 특정 단계와 연관이 있는지 결정하기 위해 등록자의 AD 상태를 정확하게 단계화할 수 있는 이점이 있을 것이다. 따라서, 임상 시험, 특히 임상 시험의 치료 암에 대상체를 등록하기 전에 본원에 기재된 바와 같이 타우 인산화 수준을 측정하는 것은 더 적은 시험 및/또는 개선된 결과를 초래할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 방법은 치료제에 대한 동반 진단으로서 개발되고 사용될 수 있다.
예시적인 실시양태에서, 대상체를 임상 시험에 등록하는 방법에 대한 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 단리된 타우 샘플에서 T181, T205 및 T217로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; 및 (b) 측정된 인산화 수준(들)이 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 임상 시험에 대상체를 등록하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 예시적인 실시양태에서, 대상체를 임상 시험에 등록하는 방법에 대한 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 제 1 및 제2 단리된 타우 샘플을 제공하고, 각각의 단리된 타우 샘플에서 T181, T205 및 T217로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서의 타우 인산화를 측정하고, 임의로 총 타우를 측정하는 단계; (b) 측정된 각각의 잔기에서 부위-특이적 인산화의 변화 및 임의로 총 타우의 변화를 계산하는 단계; 및 (c) 계산된 변화(들)가 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단의 평균으로부터 유의하게 벗어나는 경우 임상 시험에 대상체를 등록하는 단계를 포함할 수 있다. 어구 "CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단"은 섹션 IV에 정의되어 있다. "평균으로부터 유의하게 벗어남"은 평균 위 또는 아래로, 1 이상의 표준 편차, 바람직하게는 1.3 이상의 표준 편차, 더 바람직하게는 1.5 이상의 표준 편차 또는 보다 더 바람직하게는 2 이상의 표준 편차인 값(즉, 각각 1σ, 1.3σ, 1.5σ 또는 1.5σ, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차이다)을 지칭한다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 등록하기 위한 기준으로서 사용할 수 있다.
일 예에서, 본 개시내용은 대상체를 임상 시험에 등록하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및 (b) T217 및/또는 T181에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상이고, T205에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이하인 경우 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, T217에서 타우 인산화 및/또는 T181에서 타우 인산화는 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2σ, 또는 2σ 초과일 수 있다. 다른 실시양태에서, T217에서 타우 인산화 및/또는 T181에서 타우 인산화는 약 1.85σ, 약 1.9σ, 약 1.95σ, 약 2σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 초과일 수 있다. 각각의 상기 실시양태에서, T205에서 타우 인산화는 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.51σ, 약 1.55σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2.0σ, 또는 2.0σ 미만일 수 있다. 대안적으로, T205에서 타우 인산화는 약 2.0σ, 약 2.05σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 미만일 수 있다. 추가 예에서, T217에서 타우 인산화 및/또는 T181에서 타우 인산화 약 2σ 이상 및 T205에서 타우 인산화는 약 2σ 이하일 수 있다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 등록하기 위한 기준으로서 사용할 수 있다. 보다 추가의 실시양태에서, T205, 및 T181 및/또는 T217에서 측정된 타우 인산화 수준은 각각 자체에 비해 예측력을 개선하기 위해 다양한 수학적 연산에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 비율(들)은 측정된 인산화 수준으로부터 계산될 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용은 대상체를 임상 시험에 등록하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 총 타우 및 (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및 (b) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율 및/또는 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 약 1.5σ 이상이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 약 1.5σ 이하인 경우 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, 총 타우, 및 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율 및/또는 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율은 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2σ, 또는 2σ 초과일 수 있다. 다른 실시양태에서, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율 및/또는 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율은 약 1.85σ, 약 1.9σ, 약 1.95σ, 약 2σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 초과일 수 있다. 각각의 상기 실시양태에서, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율은 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.50σ, 약 1.55σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2.0σ, 또는 2σ 미만일 수 있다. 대안적으로, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율은 약 2.0σ, 약 2.05σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 미만일 수 있다. 추가의 예에서, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율 및/또는 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율은 약 2σ 이상일 수 있고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율은 약 2σ 이하일 수 있다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 등록하기 위한 기준으로서 사용할 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용은 대상체를 임상 시험에 등록하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, (i) T181 및 T205, (ii) T217 및 T205, 또는 (iii) T181, T217 및 T205에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및 (b) (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상인 경우, 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서의 타우 인산화는 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2σ, 또는 2σ 초과일 수 있다. 다른 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 약 1.85σ, 약 1.9σ, 약 1.95σ, 약 2σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 초과일 수 있다. 추가의 예에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 약 2σ 이상일 수 있다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 등록하기 위한 기준으로서 사용할 수 있다. 보다 추가의 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 측정된 타우 인산화 수준은 각각 자체에 비해 예측력을 개선하기 위해 다양한 수학적 연산에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 비율(들)은 측정된 인산화 수준으로부터 계산될 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은 대상체를 임상 시험에 등록하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 총 타우 및 (i) T181 및 T205, (ii) T217 및 T205, 또는 (iii) T181, T217 및 T205에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및 (b) 총 타우에 대한 (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서의 타우 인산화의 비율이 약 1.5σ 이상인 경우 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, 총 타우, 및 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 총 타우에 대한 (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서의 타우 인산화의 비율은 약 1.3σ, 약 1.35σ, 약 1.4σ, 약 1.45σ, 약 1.5σ, 약 1.6σ, 약 1.7σ, 약 1.8σ, 약 1.9σ, 약 2σ, 또는 2σ 초과일 수 있다. 다른 실시양태에서, 총 타우에 대한 (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서의 타우 인산화의 비율은 약 1.85σ, 약 1.9σ, 약 1.95σ, 약 2σ, 약 2.1σ, 약 2.2σ, 약 2.3σ, 약 2.4σ, 약 2.5σ, 또는 2.5σ 초과일 수 있다. 추가의 예에서, 총 타우에 대한 (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서의 타우 인산화의 비율은 약 2σ 이상일 수 있다. 역치(예컨대, 평균 위 또는 아래로 1 이상의 표준 편차)를 사용하는 것에 추가하여, 일부 실시양태에서 평균 위 또는 아래로 변화의 정도는 대상체를 등록하기 위한 기준으로서 사용할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 개시내용은 대상체를 임상 시험에 등록하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 제1 및 제2 단리된 타우 샘플을 제공하며, 여기서 "제1" 및 "제2"는 샘플을 수집하는 순서를 지칭하며, (i) T181 및 T205, (ii) T217 및 T205, 또는 (iii) T181, T217 및 T205에서 타우 인산화를 측정하는 단계; (b) 측정된 각각의 잔기에서 부위-특이적 인산화의 변화 및 임의로 총 타우의 변화를 계산하는 단계; 및 (c) T181 및/또는 T217에서 인산화 수준이 감소하거나 동일하게 유지되고 T205에서 인산화 수준 및 임의로 총 타우가 증가하는 경우 임상 시험에 대상체를 등록하는 단계를 포함한다. 제1 및 제2 단리된 타우 샘플은 며칠, 몇 주 또는 몇 달 간격으로 수집할 수 있다. 전형적으로, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 두 샘플 모두에 대해 약 1.5σ 이상일 것이며, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차이다. 보다 추가의 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 측정된 타우 인산화 수준은 각각 그 자체에 비해 예측력을 개선하기 위해 다양한 수학적 연산에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 비율(들)은 측정된 인산화 수준으로부터 계산될 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
다른 예에서, 본 개시내용은 대상체를 임상 시험에 등록하는 방법을 제공하며, 방법은 (a) 대상체로부터 수득한 제1 및 제2 단리된 타우 샘플을 제공하며, 여기서 "제1" 및 "제2"는 샘플을 수집하는 순서를 지칭하며, 총 타우 및 (i) T181 및 T205, (ii) T217 및 T205, 또는 (iii) T181, T217 및 T205에서 타우 인산화를 측정하는 단계; (b) 측정된 각각의 잔기에서 부위-특이적 인산화의 변화 및 총 타우의 변화를 계산하는 단계; 및 (c) T181 및/또는 T217에서 인산화 수준이 감소하거나 동일하게 유지되고, T205에서 인산화 수준이 감소하거나 동일하게 유지되고, 총 타우가 증가하는 경우 임상 시험에 대상체를 등록하는 단계를 포함한다. 제1 및 제2 단리된 타우 샘플은 며칠, 몇 주 또는 몇 달 간격으로 수집할 수 있다. 전형적으로, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 타우 인산화는 두 샘플 모두에 대해 약 1.5σ 이상일 것이며, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된, T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차이다. 보다 추가의 실시양태에서, (a)(i), (a)(ii) 또는 (a)(iii)에 언급된 특이적 부위에서 측정된 타우 인산화 수준은 각각 그 자체에 비해 예측력을 개선하기 위해 다양한 수학적 연산에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 비율(들)은 측정된 인산화 수준으로부터 계산될 수 있다. 비율 이외의 수학적 연산도 또한 사용할 수 있다.
타우 인산화 및 총 타우를 측정하는 방법은 섹션 II에 기재되어 있으며, 이 섹션에 참고로 원용된다. 예를 들어, 실시예 5-9에 대해 상세히 설명된 프로토콜을 사용하면, T181, T205 및 T217에서 타우 인산화는, CSF로부터 정제된 단리된 타우 샘플에서 측정된, PET 영상화에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 각각 21.7±2.3, 0.34±0.13 및 1.2±0.66이다(표 3, 돌연변이 비-캐리어 컬럼 참고). 따라서, p-T181, p-T205 및 p-T217에 대한 돌연변이 비-캐리어 집단에 대해 발견된 평균보다 두 배 높은 표준 편차(즉, 2σ)는 각각 43.4, 0.68 및 2.4이다. 그러나 당업자는 절대 값이 프로토콜에 따라 달라질 수 있음을 인식할 것이다.
바람직한 실시양태에서, 단리된 타우 샘플은 친화성 정제에 의해 혈액 또는 CSF로부터 정제된 타우를 포함하고, 타우 인산화는 질량 분석법에 의해 측정된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 타우 샘플은 타우의 중간 도메인 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 리간드를 사용하고 임의로 타우의 N-말단 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 제2 리간드를 사용하는 친화성 정제에 의해 혈액 또는 CSF로부터 정제된 타우를 포함하고, 타우 인산화는 고분해능 질량 분석법에 의해 측정된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 타우 샘플은 타우의 중간 도메인 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 리간드를 사용하고 임의로 타우의 MTBR 또는 C-말단 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 제2 리간드를 사용하는 친화성 정제에 의해 혈액 또는 CSF로부터 정제된 타우를 포함하고, 타우 인산화는 고분해능 질량 분석법에 의해 측정된다. 예시적인 실시양태에서, 실시예에 요약된 질량 분석법 프로토콜을 사용한다.
각각의 상기 실시양태에서, 대상체는 임상 시험의 치료 암에 등록될 수 있다. "치료"는 섹션 V에 정의되어 있다. 임상 시험의 치료 암에 등록된 대상체에 약학 조성물을 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물은 영상화제를 포함할 수 있다. 영상화제의 비-제한적인 예는 기능적 영상화제(예컨대, 플루오로데옥시글루코스 등) 및 분자 영상화제(예컨대, 피츠버그 화합물 B, 플로르베타벤, 플로르베타피르, 플루테메타몰, 방사성핵종 표지된 항체 등)를 포함한다. 대안적으로, 약학 조성물은 활성 약학 성분을 포함할 수 있다. 활성 약학 성분의 비-제한적인 예는 콜린에스테라제 억제제, N-메틸 D-아스파테이트(NMDA) 길항제, 항우울제(예컨대, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제, 비정형 항우울제, 아미노케톤, 선택적 세로토닌 및 노르에피네프린 재흡수 억제제, 삼환성 항우울제 등), 감마-세크레타제 억제제, 베타-세크레타제 억제제, 항-Aβ 항체(이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체 포함), 항-타우 항체(이의 항원-결합 단편, 변이체 또는 유도체 포함), 줄기 세포, 식이 보충제(예컨대, 리튬 물, 리포산을 포함하는 오메가-3 지방산, 장쇄 트리글리세리드, 제니스테인, 레스베라트롤, 커큐민 및 포도씨 추출물 등), 세로토닌 수용체 6의 길항제, p38알파 MAPK 억제제, 재조합 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자, 수동 면역요법, 활성 백신(예컨대, CAD106, AF20513 등), 타우 단백질 응집 억제제(예컨대, TRx0237, 메틸티오니뮴 클로라이드 등), 혈당 제어를 개선하기 위한 요법(예컨대, 인슐린, 엑세나타이드, 리라글루타이드 피오글리타존 등), 항염증제, 포스포디에스테라제 9A 억제제, 시그마-1 수용체 작용제, 키나제 억제제, 포스파타제 활성화제, 포스파타제 억제제, 안지오텐신 수용체 차단제, CB1 및/또는 CB2 엔도칸나비노이드 수용체 부분 작용제, β-2 아드레날린 수용체 작용제, 니코틴 아세틸콜린 수용체 작용제, 5-HT2A 역 작용제, 알파-2c 아드레날린 수용체 길항제, 5-HT 1A 및 1D 수용체 작용제, 글루타미닐-펩티드 사이클로트랜스퍼라제 억제제, APP 생산의 선택적 억제제, 모노아민 산화효소 B 억제제, 글루타메이트 수용체 길항제, AMPA 수용체 작용제, 신경 성장 인자 자극제, HMG-CoA 환원효소 억제제, 신경영양제, 무스카린성 M1 수용체 작용제, GABA 수용체 조절인자, PPAR-감마 작용제, 미세소관 단백질 조절인자, 칼슘 채널 차단제, 항고혈압제, 스타틴 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 약학 조성물은 키나제 억제제를 포함할 수 있다. 적합한 키나제 억제제는 무수한 아미노산 키나제(TAOK), CDK, GSK-3β, MARK, CDK5 또는 Fyn을 억제할 수 있다.다른 예시적인 실시양태에서, 약학 조성물은 포스파타제 활성화제를 포함할 수있다. 비-제한적인 예로서, 포스파타제 활성화제는 단백질 포스파타제 2A의 활성을 증가시킬 수 있다.
각각의 상기 실시양태에서, 대상체는 증상이 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 본원에 사용된 "무증상적 대상체"는 AD의 임의의 징후 또는 증상을 나타내지 않는 대상체를 지칭한다. 대안적으로, 대상체는 AD의 징후 또는 증상(예컨대, 기억력 소실, 물건을 잘못배치함, 기분 또는 행동의 변화 등)을 나타낼 수 있지만 경미한 인지 기능장애의 임상 진단을 위한 충분한 인지 또는 기능적 기능장애를 나타내지 않을 수 있다. 증상적 또는 무증상적 대상체는 Aβ 아밀로이드증이 있을 수 있다; 그러나 Aβ 아밀로이드증에 대한 사전 지식은 치료를 위한 필수 조건이 아니다. 보다 추가의 실시양태에서, 대상체는 AD가 있을 수 있다. 전술한 실시양태 중 임의의 것에서, 대상체는 우세 유전성 알츠하이머 질환을 유발하는 것으로 알려진 유전자 돌연변이 중 하나를 운반할 수 있다. 대안적 실시양태에서, 대상체는 우세 유전성 알츠하이머 질환을 유발하는 것으로 알려진 유전자 돌연변이를 운반하지 않을 수 있다.
다음 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 입증하기 위해 포함된다. 다음의 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타낸다는 것을 당업자는 인식해야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어 볼 때, 개시된 특이적 실시양태에서 변화가 이루어질 수 있고 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있음을 인식해야 한다. 따라서, 첨부된 도면에 제시되거나 도시된 모든 사항은 제한적인 의미가 아니라 예시적인 것으로서 해석되어야 한다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 다양한 반복을 설명한다.
실시예 1 - 정상 비-AD 인간 뇌에서 타우 단백질의 인산화 부위
정상적인 가용성 뇌 타우의 인산화 부위를 결정하기 위해, 건강한 대조군으로부터의 추출물을 인산화된 및 비인산화된 타우 모두를 농축하는 타우-1 및 HJ8.5 타우 항체를 사용하여 면역포획에 의해 정제하였다. 뇌 타우 아이소폼의 트립신 소화는 LC-MS에 의해 검출될 수 있을 만큼 길고 소수성인 27개의 비변형된 펩티드를 생성하였다(Barth
Figure pct00001
lemy et al., 2016). 25개의 펩티드는 잠재적 인산화 부위로서 세린 및/또는 트레오닌을 함유하였다. 여러 개의 펩티드는 다중 잠재적 인산화 부위(4-9)를 함유하고 있어, LC 분리 동안에 상이한 모노-인산화된 펩티드가 잠재적으로 함께 공동-용리되는 것을 고려하게 된다. 이 후, 상기 기재된 PRM 스크리닝 방법을 이러한 펩티드에 적용하였다.
타우 서열(103-126)에서 투영 도메인의 분석 결과는 중첩하는 복합 LC-MS/MS 패턴으로 용리되는 다중 p-타우 펩티드를 나타냈다(도 3-7). 본 발명자들은 타우 단백질의 가장 짧은 아이소폼인 0N 아이소폼으로부터 3개의 인산화 부위를 식별하였다. LC 시스템은 3개의 인산화된 펩티드를 구별하기 위한 분해능이 없었지만, 단편 식별 및 상응하는 세기를 사용하여 잔기 S113에서 하나의 주요 인산화 부위와 잔기 T111 및 T123에서 2개의 소량의 인산화 부위로 구성된 신호를 디콘볼루팅하기 위해 사용되었다(도 3). 대조적으로, PRM이 더 긴 1N 및 2N 아이소폼으로부터 타우 서열을 스크리닝하는 경우, 인산화된 펩티드 용리 패턴을 단순화하기 위해 추가 크로마토그래피 분리가 필요하였으며, 특히 동일한 펩티드 서열 내에서 다중 잠재적인 모노-인산화 부위를 예측하는 경우에 필요하였다(도 4-6). LC 분리를 통해 차등적으로 인산화된 잔기를 함유하는 공동-용리된 반-특이적 MS/MS 단편을 식별할 수 있었다. 그러나, 본 발명자들은 용액에서 동일한 펩티드의 이중 입체구조로 인해 LC 아티팩트에서 발생할 수 있는 몇 가지 신호를 또한 식별하였다(도 5). 이 효과는 비변형된 펩티드와 인산화된 펩티드 둘 다에 대해 (0N 아이소폼에서) 아미노산 잔기 45-67을 함유하는 펩티드 서열의 경우 중요하고(도 5), 서열 68-126(1N) 및 88-126(2N)의 경우는 덜 일반적이다(도 4 및 6).
잔기 S113, T111 및 T123에서의 인산화는 펩티드 서열 68-126(1N) 및 88-126(2N)에서 확인되었다. 모든 경우에서, S113 신호는 0.2-0.5%의 인산화율로 3개의 신호 중 가장 풍부하였다(도 4 및 도 6, 표 1). 잔기 T50, T52 및 S56에서의 인산화는 펩티드 서열 45-67(1N 및 2N 아이소폼에 의해 공유됨)에서 명확하게 식별되었다. 동일한 펩티드에서, LC-MS 신호는 3개의 잔기(S61, T63 및 S64) 중 2개 이상이 인산화되었음을 나타낸다(도 5). 잔기 S46에서 잠재적 인산화를 식별하는 특이적 신호는 발견되지 않았다. 잔기 S68 및 T69에서의 인산화는 서열 68-126(1N) 및 68-87(2N)에서 입증되었지만 LC-MS 패턴을 구별하기 위한 특이적 단편이 검출되지 않았다. 동일한 1N 및 2N 펩티드 서열에서, 더 낮은 인산화 수준이 T71에서 검출되었다. T76, T101 및 T102 잔기에 대한 2N 특이적 인산화는 또한 식별되었다(도 8에 요약됨).
트립신 누락된 분열의 유도는 또한 이전에 보고된 바와 같이 트립신 부위 뒤에 위치된 인산화된 잔기(부위 T175, T181, S212, T231 및 S396)의 스크리닝에 대해 고려되었다(Hanger et al. 1998). 본 발명자들의 PRM 스크리닝은 Hanger et al에 의해 정상 뇌 조직에서 이미 기재된 인산화된 타우 펩티드에 상응하는 LC-MS 패턴을 성공적으로 검출하였다(T181, S199, S202 및 S404. 도 8). 상응하는 LC-MS 신호는 높았으며, 이는 정상 인간 뇌에서 이전에 보고된 p-타우 펩티드가 가장 풍부할 가능성이 있음을 시사한다. S199 및 S202 인산화의 비교는 S202에서 훨씬 더 우세한 풍부도의 인산화를 나타냈다(도 8). 192-199 아미노산 서열에서 인산화되지 않은 에피토프와 연관된, 타우 추출을 위한 항-타우1 항체의 사용은 추출물에서 S199 인산화의 낮은 회수율을 설명할 수 있다. 추출물에서 S202 및 S404 인산화의 풍부도를 고려하여, 본 발명자들은 서열 195-209 및 386-406으로부터 디-인산화된 펩티드의 존재를 검색하였다. 본 발명자들은 S202/S199 및 S202/S198에서 이중 인산화에 상응하는 특이적 단편을 가진 2개의 LC-MS 패턴과 396/404에서 이중 인산화에 상응하는 하나의 LC-MS 패턴을 검출하였다(도 8).
뇌 추출물에서 가용성 타우의 추가 스크리닝은 T175, S214, T217, T231 및 S396에서 인산화된 잔기에 상응하는 기타 덜 풍부한 모노-인산화된 펩티드를 입증하였다. S184 또는 S185에서 인산화된 펩티드에 상응하는 단편으로부터의 신호는 또한 모노-인산화된 펩티드 서열 181-190이 스크리닝되었을 때 낮은 수준으로 검출되었다(도 8). 긴 서열 407-438에서 모노-인산화에 대한 검색은 잔기 S409 및 S416에서의 인산화 및 잔기 S412/S413/T414 군에서의 하나 이상의 인산화와 일치하는 패턴을 발견하였다.
전반적으로, 본 발명자들은 PRM 스크리닝 방법을 사용하여 정상 비-AD 뇌로부터 추출된 가용성 타우 분획에서 검출가능한 최소 29개의 고유한 인산화 부위를 식별하였다(표 1). 이들 중 25개는 고유한 LC-MS 신호에 명료하게 배정될 수 있으며, 정확한 LC-MS 패턴에 배정함없이 4개의 추가 인산화 부위가 입증되었다. 이들 부위는 3개의 클러스터에 위치하였다: 최소 14개의 인산화된 부위가 N-말단 투영 도메인에, 10개는 서열 중간에 프롤린-풍부 도메인에, 6개는 C-말단에 위치하였다(도 14).
표 1 - 뇌/CSF 풀 인산화율 비교 (HJ8.5+타우1 IP-MS).
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 2 - CSF에서 타우 단백질의 인산화 부위
뇌 타우 소화와 비교하여, 타우-특이적 항체 및 소화를 사용한 CSF 타우 정제는 주로 단백질 서열의 중간 도메인(잔기 150-221)으로부터 검출가능한 펩티드를 생성하였다. 펩티드는 N-말단으로부터 더 적은 정도로 검출가능하였고, 미세소관 결합 반복(MTBR) 도메인 또는 타우의 C-말단으로부터 거의 어떤 서열도 검출가능하지 않았다(Barth
Figure pct00004
lemy et al., 2016; Sato et al., 2018). 신호 회수율의 이러한 상이함은 뉴런으로부터의 방출 동안에 타우 절단으로 인해 발생할 수 있다(Sato et al., 2018). 이 중간 도메인의 펩티드 회수율는 현재 PRM 방법을 사용하여 상응하는 소량의 인산화된 아이소폼을 모니터링하기에 충분하였다. 반대로, MTBR 및 C-말단 도메인에서 인산화된 펩티드를 검출하기 위해 MS 방법의 유의한 기술 발전이 필요할 것이다.
정상 대조군 CSF로부터의 타우 포스포펩티드의 PRM 스크리닝은 T181(미도시), S199, S202 및 T217에서 뇌 가용성 타우와 공통되는 여러 인산화 부위를 식별하였다(도 9). pS214에 상응하는 낮은 신호도 또한 검출되었다(도 9). CSF 추출물에서 pT205에 상응하는 특이적 단편화 패턴이 식별되었고, pS199/pS202 신호로부터 크로마토그래피에 의해 분리되었다(도 9).
CSF 타우에서 추가적인 인산화된 부위를 검출할 확률을 높이기 위해, 본 발명자들은 경미한 내지 중등도 치매가 있는 AD 환자로부터의 CSF 풀을 분석하였다. 본 발명자들은 AD CSF 풀이 타우의 증가된 농도 및 인산화된 타우의 증가된 수준을 함유할 것으로 예상하였다. 정상 CSF에서 발견된 동일한 인산화된 잔기(T181, S199, S202, T217 및 T231)가 AD CSF에서 검출되었다. 또한, 뇌의 타우에서 이전에 발견되었지만 정상 CSF에서는 발견되지 않은 pS113 및 pT175에 상응하는 신호가 AD CSF에서 검출되었다(도 9, 도 10). S202/S199 인산화된 펩티드로부터의 특이적 단편 및 뚜렷한 체류 시간을 함유하는 LC-MS/MS 패턴을 통해 S208에서 새로운 인산화된 펩티드를 식별할 수 있었다. 정상 CSF에서 pS208을 재검토하였을 때, 본 발명자들은 낮은 풍부도의 상응하는 신호를 검출하였다. 잔기 T153에서 새로운 인산화된 펩티드와 매칭하는 LC-MS/MS 패턴은 상응하는 비인산화된 펩티드의 수준에 가깝게 검출되었다(도 10). 뇌 추출 데이터를 주의 깊게 재검토한 결과 이 부위에 상응하는 낮은 풍부도의 신호의 존재를 시사하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 AD CSF의 0N 아이소폼으로부터의 103-126 아미노산 서열의 인산화에 상응하는 특이적 신호를 발견하여, T111이 이 펩티드의 주요 인산화 부위인 반면 S113은 거의 인산화되지 않음을 나타냈다 (도 11). 전체적으로, 12개의 인산화 부위가 CSF 타우에서 검출되었으며, 이중 2개는 뇌 용해물에서 검출되지 않았다(도 12).
실시예 3 - CSF p-타우 풍부도 측정은 뇌의 p-타우 풍부도와 비교하여 상이함을 강조한다
뇌에서, S404는 검토된 인산화 부위 중 가장 고도로 인산화된 부위였다(pS404/S404=110%, 즉 S404의 52%가 인산화됨). 따라서, S202 및 T181의 기타 고도로 인산화된 부위(각각 9.7% 및 9.5%)에 비해 뇌 타우의 절반 이상이 S404에서 인산화되었다. 1.3%의 S199가 인산화되었지만 추출에 사용된 타우1 항체가 상응하는 인산화된 에피토프와 결합할 수 없기 때문에 과소평가될 수 있다(Liu et al., 1993). S404 이외의 C-말단 부위의 인산화는 약 1%인 것으로 밝혀졌다. N-말단에서, T52, S68/T69, T50 및 S113은 또한 약 0.5% 내지 2% 범위의 풍부도로 인산화되었다. 다른 검출된 부위는 훨씬 낮은 수준(<0.5%)에서 인산화되는 것으로 나타났다.
뇌가 아닌 CSF 타우에서 pT205 및 pS208의 고유한 검출에 추가하여, 뇌 타우에서 검출된 특정 기타 인산화 부위의 상대적 인산화 풍부도는 대조군 CSF 타우와 비교하여 변경되었다(도 13). 뇌에 비해, CSF 타우 인산화는 부위 pS199(6배 감소, p=0.008), pS202(5배 감소, p=0.016) 및 pS214(2배 감소, p=0.016)에서 유의하게 낮았다. 반대로, CSF 타우 인산화는 부위 pT217(4배 증가, p=0.016), pT231(7배 증가, p=0.016) 및 0N으로부터의 pT111(16배 증가)에서 유의하게 높았다. PT181 풍부도는 CSF와 뇌에서 유사하였다(~10%). AD CSF에서 측정했을 때, pT175는 낮게 유지되었다(뇌의 0.1%에 비해 0.1-0.2%).
뇌 및 CSF 타우는 상이한 절단 패턴을 갖는다: 뇌 타우 아이소폼은 주로 전장인 반면 CSF 타우 아이소폼은 절단된다. IP 후 회수된 뇌 및 CSF 타우 아이소폼 및 상응하는 펩티드는 면역침전에 사용되는 항체에 따라 달라진다(Sato et al., 2018). 유사하게, 타우를 면역침전시키는 데 사용된 항체는 타우 인산화 회수율에 영향을 미칠 수 있다. p-타우 회수율에 대한 이러한 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 타우1+HJ8.5 조합에 추가하여 상이한 항체(타우13, HJ8.5, HJ8.7, 타우1 및 타우5)를 사용하여 인산화율에 대한 IP-MS 결과를 비교하였다(도 14). 타우1 또는 타우1+HJ8.5를 뇌와 CSF에 사용하는 경우 pS199/S199 비의 유의한 감소가 관찰되었다. 이는 N-말단과 중간 도메인 사이의 CSF 절단이 뇌에 비해 pS199 인산화 측정에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 다른 항체와 함께 뇌와 CSF에서 측정된 PS199/S199 비는 비교적 유사한 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 뇌 추출물에서 pS199에 대해 일부 반응성이 여전히 관찰되고 CSF에서 더 적은 정도로 관찰되어, 보고된 타우1 에피토프(192-199)의 말단에 S199 인산화가 존재하지만 타우1의 비특이적 결합을 시사한다.
부검 전 사후 간격(PMI) 동안의 포스파타제 활성은 뇌 추출물에서 측정된 타우 인산화를 감소시킬 수 있기 때문에, 본 발명자들은 CSF 및 뇌 추출물에서 일반적으로 발견되는 인산화율에 대한 PMI의 영향을 조사하였다. 5 내지 16시간 범위의 PMI를 갖는 참가자로부터 수집된 타우 병리가 없는 10개의 뇌 샘플(중 전두엽)을 분석하였다. 본래 분석된 뇌 추출물 중 16시간 초과의 PMI를 갖는 것은 없었다. 본 발명자들은 T181, S199, S202, S214, T217, T231 및 S404 부위에서 측정된 PMI와 인산화율 사이에 유의한 연관성(스피어만 테스트, 95% 신뢰 구간, 도시되지 않음)을 발견하지 못하였다.
실시예 4 - CSF에서 AD 특이적 p-타우 변화
AD에서 일반적으로 보고되는 증가된 CSF p-타우는 다음 2개의 잠재적 영향의 결과일 수 있다: 1) 인산화 상태에 관계없이 타우의 총괄적 증가 또는 2) 특이적 부위에서 과인산화 증가. 인산화되지 않은 타우를 사용하여 p-타우 신호 또는 수준을 정규화하면 총 타우의 총괄적 변화와 독립적으로 특이적 부위에서 발생하는 인산화 화학량론(즉, 정상 CSF 또는 뇌 타우에 비해 과인산화 또는 저인산화)의 변화를 정량할 수 있다. 본 발명자들이 최근에 입증한 바와 같이, 가용성 타우 생산은 AD에서 증가하고 아밀로이드 플라크와 관련이 있다. 따라서, 양뿐만 아니라 인산화율을 제어하는 것이 이해의 핵심이다. pT181, pT217, pT231, pT205, pS208 및 pS214는 0N-특이적 pT111과 마찬가지로 AD CSF에서 과인산화되었다(도 13). pT153과 pT175는 비-AD에서 검출되지 않았으며, AD에서 약간 증가하였을 가능성이 있다. 비-AD에 비해 유의한 과인산화를 보이는 부위는 pT181(p=0.010), pS214(p=0.005) 및 pT217(p=0.003)이었다. pT181, pS214 및 pT217은 각각 대략 1.2배, 1.6배 및 4배의 인산화 증가를 나타냈다. 흥미롭게도, 모든 모니터링 부위가 과인산화된 것은 아니었다: pS199/S199는 유의하게 변하지 않았고, pS202/S202는 대략 1.2배 감소하면서 유의하게 낮았다(p=0.030).
인산화 비율의 강도는 CSF를 16시간 동안 항온처리함으로써 평가하였다. 항온처리는 비-AD 및 AD CSF 사이에서 관찰된 타우 인산화 비율 상이함에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 15). 더욱이, CSF 타우에 대한 키나제 활성의 부재는 항온처리 후 CSF에 스파이킹된 재조합 15N-타우에 대한 인산화의 비-검출성에 의해 확인되었다(도시되지 않음).
실시예 1-4에 대한 논의
p-타우 측정에 대한 PRM의 기술적 진보 - 본 발명자들은 지금까지 정상 뇌 조직 및 CSF에서 p-타우의 가장 포괄적인 정성 및 정량 분석을 보고한다. 본 발명의 접근법은 잠재적인 소수의 인산화 부위를 포착하지 못하였을 수 있는 타우 인산화에 대한 이전 DDA 연구와 대조된다. 그러나, 본 발명의 접근법은 PRM 모드에서 고도로 민감한 표적-MS를 사용하여 소수의 인산화를 검출하고 정량한다. 인산화 부위 식별은 LC-MS/MS 패턴의 신중한 수동 해석에 의존하여, 검사된 각각의 포스포펩티드에 대한 특이적 이온 단편의 공동-용리를 식별한다. 이전 연구에서, 뇌 타우 인산화는 PHF로부터의 과인산화된 타우가 농축된 불용성 추출물에서 주로 조사되었으며, 현재까지 가장 상세한 연구는 정상 인간 타우 단백질에서 9개의 인산화 부위를 보고하였다(Hanger et al. 2007). 본 발명자들의 심층적인 PRM 데이터 분석은 대부분은 매우 낮은 풍부도를 갖는 29개 초과의 인산화된 잔기를 검출하였다. 실제로, 이전에 보고된 9개의 부위는 단백질에서 가장 풍부한 변형 중 하나였다. 뇌에 비해 훨씬 적은 풍부도로 존재하는 정상 CSF 타우에 대한 PRM 분석의 적용으로 초기에 9개의 인산화 부위의 검출을 이끌었으며 AD CSF에서 3개의 추가 부위를 검출하였다.
검출된 인산화 부위의 유의하게 증가된 수에 추가하여, 본 발명자들은 민감한 PRM 스크리닝이 총괄적 타우 농도와 무관하게 타우 인산화율 또는 화학양론을 정량적으로 평가할 수 있는 방법을 입증하였다. 이 개념은 빈번하게 간과되지만, 절대 CSF p-타우 농도가 총괄적 타우 아이소폼 농도의 증가로 인해 단독으로 증가할 수 있고 상대적 인산화된 타우 풍부도의 변화로 인해 증가하지 않는 경우 AD의 변화를 평가하는 데 중요한다. 이 연구의 인산화율 측정으로 상이한 구획(세포 내 뇌 vs 세포 외 CSF) 및 상이한 병리학적 병태(AD vs 비-AD)에서 단백질에 걸쳐 인산화율 변화(고인산화 vs 저인산화)의 정도와 분포를 처음으로 비교할 수 있었다.
PRM 스크리닝 과정의 일부 주의사항은 발견을 위한 낮은 처리량과 연구에서 가정되지 않은 p-타우 종 또는 기타 번역 후 변형(PTM)이 누락될 위험이 있다는 것이다. MS 데이터의 식별은 대규모 검증 또는 임상 코호트에서 추가로 사용되어 예정된 LC-MS 방법을 설계하여 다중화 및 처리량을 증가시킬 수 있다(Gillette and Carr, 2013). 기타 프로테아제, 예컨대, AspN은 트립신 소화와 상이한 타우 및 p-타우 펩티드 세트를 제공하여, 타우, 즉 C-말단 도메인의 더 많은 적용범위에 대해 허용한다(Hanger et al. 1998; Sato et al. 2018). 이 연구에서 고려되지 않은 추가 이중- 또는 삼중-인산화된 타우 펩티드를 스크리닝하여 검색을 추가로 세분화할 수 있지만, 부위 인산화의 생물학적 조정이 없는 한 이들의 풍부도는 최소화될 수 있다.
타우 투영 도메인의 인산화 부위 클러스터의 식별 - 본 발명자들은 대안적인 스플라이싱 의존성 펩티드를 함유하는 타우의 N-말단 투영 도메인에서 이전에 기재되지 않은 인산화된 잔기의 클러스터를 발견하였다. 흥미롭게도,이 도메인은 불용성 인간 뇌 분획에서 PHF에서 광범위하게 인산화되는 것으로 이전에는 발견되지 않았다(Funk et al., 2014; Hanger et al., 2007; Russell et al., 2016; Thomas et al., 2012). 이 클러스터는 뮤린 뇌의 마우스 타우 단백질에서 수행된 최근의 포괄적인 연구에서 또한 광범위하게 특성화되지 않았다(Morris et al., 2015). 이러한 불일치는 인산화된 펩티드의 복잡한 혼합물을 특성화하기 어렵기 때문일 수 있으며, 적은 특이적 MS/MS 단편 및/또는 LC에서 감지하기 힘든 체류 시간 이동으로만 구별할 수 있다. 예를 들어, S46은 정상 인간 타우의 이 도메인에서 이전에 보고된 유일한 인산화 부위이다(Hanger et al. 1998). 그러나, 본 발명자들은 밀접한 조각화 패턴을 공유하는, T50 또는 T52에서 인접한 인산화된 부위와의 검색 알고리즘에 의해 혼동될 수 있는 이 종에 대한 특이적 신호를 검출하지 못하였다. 이와 관련하여, 각각의 인산화된 부위에 대해 상응하는 LC-MS/MS 패턴을 명확하게 해석하고 해독하기 위해 수동 검사가 필수적이다. 이러한 불일치에 대한 다른 가능한 설명은 MTBR 도메인, 중간 도메인 및 C-말단에 비해 PHF에서 N-말단 도메인이 상대적으로 낮은 풍부도일 수 있다(Mair et al., 2016).
이러한 N-말단 투영 도메인은 최근에 인접한 미세소관(MTBR 도메인을 통해 타우에 연관됨)이 서로 가까워지는 것을 예방하는 반발 장벽의 우세 구성요소의 일부로서 배정되었다(Chung et al., 2016). 이 서열은 수 많은 산성 잔기를 함유하며 인산화의 증가는 총괄적 산성도를 증가시켜 반발 장벽을 강화하는 데 기여할 수 있다. 엑손 2-3에 대한 대안적 스플라이싱에 의해 유도된 다양한 양의 N-말단 확장과 함께, 타우 인산화는 타우/타우 N-말단 상호작용 및 미세소관 분자간 거리를 조절할 수 있다.
뇌 vs CSF에서 상이한 p-타우 프로파일의 생물학적 함축 - 타우는 주로 미세소관 안정성에서 기능하는 세포 내 단백질이며, 전통적으로 신경 손상 또는 세포 사멸시에만 세포 외로 방출되는 것으로 간주되었다. 그러나, 최근 연구에 따르면 타우는 생리적 및 병리학적 조건 하에서 조절된 방식으로 분비된다고 제안한다(Karch et al. 2012; Yamada et al. 2014). 가용성 뇌 타우 및 CSF 타우 프로파일을 뉴런 모델에서 세포 내 및 세포 외 타우 프로파일 및 물질대사와 병렬적으로 비교함으로써, 본 발명자들은 최근에 타우 분비가 절단된 타우 및 p-타우를 포함한 타우 아이소폼의 상이한 대사회전율을 포함하는 활성 과정임을 보여주었다(Sato et al., 2018). 뇌와 CSF p-타우 프로파일 간의 비교를 통해 이 활성 분비와 타우의 인산화 사이의 연관성을 이해하는 것은 AD 병인에 대한 잠재적인 통찰력을 제공한다.
본 발명자들은 CSF에서 농축된 p-타우 아이소폼이 미세소관에 대한 친화성이 적고 분비될 가능성이 더 높다고 추측하였다. 역으로, CSF에서 빈곤한 p-타우 아이소폼은 뉴런 내부에 머무르고/거나 분열을 피하는 경향이 더 많을 수 있다. 본 발명자들의 결과는 뇌 추출물에 비해 CSF에서 여러 인산화된 잔기, 예컨대, T217, T231, T153 및 T111이 유의하게 농축되었음을 보여준다. 모두 프롤린-지향 부위이며, GSK-3β 단백질 키나제의 잠재적 기질이며, 키나제 의존적 조절의 대상이 될 수 있다. pT217과 달리, pS214는 뇌에 비해 CSF에서 상승하지 않았다. pS214에 대한 pT217의 이러한 세포 외 농축은 이러한 아이소폼에 대해 세포 내에서 이전에 식별된 동적 상이함과 일치하였으며(Sato et al., 2018), pT217은 비인산화된 타우 및 타우-pS214보다 대사회전율이 더 짧았다. 대안적으로, CSF와 비교하여 뇌 추출물의 일부 타우 부위에서 관찰된 감소된 인산화는 PMI 동안 발생하는 부분적 탈인산화로 인해 또한 발생할 수 있다(Matsuo et al., 1994). 이러한 감소는 5-16시간의 PMI 범위 내에서 관찰되지 않았지만, 사망과 이 조사 간격 사이의 인산화 비율의 변경을 배제할 수 없다. 질량 분석법에 의해 뇌 생검으로부터 이러한 타우 부위의 탈인산화의 동역학을 평가하면 향후 CSF/뇌 비교 결과에 대한 이 현상의 영향을 해결하는 데 도움이 될 것이다. 뇌 타우 인산화 측정에 영향을 미치는 잠재적인 뇌 포스파타제 편향의 고려는 CSF 타우 인산화 상태가 사후 수집된 뇌 추출물보다 뉴런의 생체 내 타우 인산화 상태를 반영할 가능성이 더 높다는 것을 지지할 것이다. 그러나, CSF에서의 생체 내 타우 인산화 모니터링은 CSF 타우 절단으로 인해 주로 타우 중간 도메인에서 검출된 부위로 제한될 것이다.
반대로, pS202는 CSF에서 유의하게 낮았고, pS199 및 pS202는 AD에서 상승하지 않았으며, 이는 이러한 인산화가 뉴런 내부의 타우 격리를 촉진할 수 있음을 나타낸다. T181은 CSF와 뇌에서 동등하게 인산화된다. pT205 및 pS208은 뇌의 가용성 타우 단백질에서가 아닌 CSF 타우에서만 독점적으로 검출되었다. 이는 S202, T205 및 S208에서의 삼중 인산화가 뇌에서 타우 응집의 Braak 단계를 특성화하는 데 일반적으로 사용되는 항-AT8 항체(Malia et al., 2016)에 의해 인식된다는 점을 고려할 때 흥미롭다(Braak and Braak, 1995). 실제로, pS208은 PHF에서 MS에 의해 검출되었다(Hanger et al. 1998). pT205와 pS208은 본 발명자들의 연구에서 정상 가용성 뇌 타우에는 부재하였으며, 이는 정상 뇌 타우에서 AT8의 면역반응성을 검출할 가능성이 없음을 확인하였다. 더욱이, 최근 연구는 pS202와 함께 타우의 자가-응집을 유도하는 조합 인산화 패턴으로서 pT205와 pS208을 연루시킨다(Despres et al., 2017). CSF에서 pT205 및 pS208의 독점적 존재 및 AD의 두 부위에서 추가로 증가된 인산화율은 세포로부터 이러한 병리학적-경향이 있는 p-타우 종을 제거하기 위한 뉴런의 잠재적인 보호 청소율 메커니즘을 나타낼 수 있다. AD CSF에서 pS202의 동시 감소는 또한 AD 뇌의 농축된 AT8-양성 엉킴에서 pT205 및 pS208과 응집될 때 연관된 아이소폼의 증가된 격리에 상응할 수 있다. 대안적으로, 뇌 추출물에서 pT205 및 pS208에 대한 인산화의 부재는 PMI 동안 발생하는 포스파타제에 의한 특이적 분해로 인한 것일 수 있다. 뇌 생검으로부터 수집된 타우에 대해 보고된 AT8 반응성의 급속한 소멸(<3시간)은 이러한 아이디어를 지지한다(Matsuo et al., 1994). 따라서, pT205 및 pS208을 효율적으로 표적화하는 이러한 포스파타제 활성은 뉴런에서 AT8-양성 물질의 긴 반감기를 예방하는 추가 메커니즘으로서 또한 볼 수 있다. 이 후, AD CSF에서 발견된 pT205 및 pS208의 증가는 잠재적으로 이 보호 메커니즘의 병리학적 감소를 나타낼 것이다. 마지막으로, AD CSF에서 pS202의 동시 감소는 또한 AD 뇌의 농축된 AT8-양성 엉킴에서 pT205 및 pS208과 응집될 때 연관된 아이소폼의 증가된 격리와 상응할 수 있다.
정상 뇌의 가용성 분획에서 MTBR 도메인으로부터의 인산화된 잔기의 확실한 검출을 제공할 수 없었다. MTBR 도메인의 인산화 부위는 미세소관에 대한 타우의 친화성을 감소시키는 것으로 알려져 있다(Biernat et al., 1993). 정상 타우에서 이러한 인산화의 부재는 PHF에서 발견된 이러한 변형의 이상을 지지할 수 있다(Hanger et al. 2007). CSF 타우 절단은 MTBR 도메인이 타우 절단 후 세포 내에서 분해될 가능성이 높으므로(Kanmert et al., 2015), 이 연구에서 사용된 면역-포획 방법으로 회수되지 않았기 때문에 생체 내 인산화 변화의 검사를 제한한다.
AD 바이오마커로서 CSF p-타우 비 - 검출된 인산화된 부위의 유의하게 증가된 수에 추가하여, 본 발명자들은 타우 인산화율 또는 화학양론을 총괄적 타우 농도와 무관하게 정량할 수 있는 방법을 입증하였다. 이 개념은 빈번하게 간과되지만, 절대 CSF p-타우 농도가 총 타우 농도의 증가로 인해 단독으로 증가할 수 있고(즉, pT181), 상대적 인산화율 자체의 증가로 인해 증가하지 않는 경우 AD에서 CSF 타우 인산화 변화를 평가하는 데 중요한다. 이 연구의 인산화율 측정으로 상이한 구획(세포 내 뇌 vs 세포 외 CSF) 및 상이한 병리학적 병태(AD vs 비-AD)에서 단백질에 걸쳐 인산화율 변화(고인산화 vs 저인산화)의 정도와 분포를 처음으로 비교할 수 있었다. 이 방법은 최근 면역화학을 사용하여 수행된 바와 같이 뇌 영역 및 Braak 단계에 걸쳐 수많은 부위에서 AD 뇌 인산화의 변형을 살펴보기 위해 향후에 사용할 수 있다(Neddens et al. 2018).
이 연구에서, 본 발명자들은 AD CSF의 타우가 일반적으로 비-AD CSF와 비교하여 과인산화됨을 입증하였다. 그러나, 과인산화의 정도는 부위 의존적이다. T111, T205, S208 및 T217은, AD에 대한 p-타우 바이오마커로서 사용되는 가장 일반적으로 측정된 표적인 T181보다 더 과인산화되었다(Fagan et al. 2009). 본 발명자들은 또한 AD CSF에서 독점적으로 발견되는 T153 인산화를 식별하였다. 흥미롭게도, AD CSF에서 과인산화된 부위는 뇌에 비해 정상 CSF에서 이미 유의하게 증가된 부위(즉, T111, T205, S208 및 T217, 및 T231 정도는 적음)에 상응한다. 이는 AD 병리가 CSF로의 타우의 방출 동안에 특이적 p-타우 아이소폼 농축에 기여하는 세포 메커니즘을 악화시킨다는 것을 나타낸다. 전반적으로, 이러한 부위에서 발견된 큰 변화 규모는 AD를 검출하기 위한 민감한 바이오마커로서의 사용을 상상할 수 있게 한다. 본 발명자들의 연구는 제한된 수의 CSF 풀에 의존하였으며, 더 큰 CSF 코호트에 대한 미래의 연구는 질환 과정에 걸쳐 p-타우 변화 및 뇌 아밀로이드증 및 타우 응집 사이의 잠재적인 관계를 더 잘 확립할 것이다. 본 발명자들은 또한 PSP, CBD 및 FTD와 같은 다른 비-AD 타우병증에서 임의의 특이적 p-타우 프로파일 변화가 있는지 여부를 물을 수 있다. 대안적으로, 이 방법은 생체 내 및 생체 외에서 상이한 키나제 활성을 추적하는 데 사용될 수 있으며, 또한 비정상적인 타우 물질대사를 표적으로 하는 새로운 약물을 평가하는 유망한 도구를 제공할 수 있다.
실시예 1-4의 방법
뇌 가용성 타우 추출 - 참가자를 포함하는 뇌 및 CSF 연구는 워싱턴 대학 인간 연구 위원회 및 일반 임상 연구 센터에 의해 승인받았다. 연구에 포함되기 전에 모든 참가자로부터 서면 동의를 얻었다. 뇌 가용성 타우는 이전에 기재된 바와 같이 추출하였다(Sato et al., 2018). 간단히 말해서, 전에 기재된 바와 같이 아밀로이드 및 타우 병리가 없는 대조군으로부터 냉동된 인간 뇌 조직(Sato et al., 2018)은 워싱턴 대학교 의과 대학(St. Louis, MO)의 나이트 알츠하이머 질환 연구 센터(ADRC)로부터 수득하였다. 사르코실-가용성 타우는 문헌(Hanger et al. 1998)에보고된 바와 같이 초원심분리에 의해 추정 타우 응집체로부터 분리하고 풀링하였다. 동결된 인간 뇌(200-400mg, 전두부 영역)를 얼음에서 Tris-HCl 완충액(25mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 10mM EDTA, 10mM EGTA, 1mMDTT, 포스파타제 억제제 칵테일(Cocktail) 3, Roche 프로테아제 억제제, pH 7.4. 최종 3.25mL/mg 조직)에서 균질화하였다. 균질현탁액을 11,000xg에서 60분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 1% 사르코실에 60분 동안 용해시키고 100,000xg에서 2시간 동안 원심분리하였다. 사르코실 가용성 분획을 풀링하고 50uL 분획을 면역침전 전에 0.5% 인간 혈장으로 10배 희석하였다. 뇌/CSF 비교를 위해, 뇌 용해물 풀을 CSF 타우 수준과 매칭하도록 면역정제 전에 500 내지 8000배로 희석하였다.
CSF 타우 추출 - 인간 CSF를, 아밀로이드 음성 및 인지 정상(CDR=0) 대조군(n=47, 연령 60세+) 및 아밀로이드 양성 및 CDR>0 AD 환자(n=33, 연령 60세+)를 포함하는, 80명의 참가자의 코호트로부터 풀링하였다. 500uL CSF 분취량의 5개 및 7개의 풀을 각각 대조군 및 AD 군으로부터 생성하였다. 초기 수집시, CSF를 1,000xg에서 10분 동안 스핀 다운시켜 세포 잔해를 제거하고 즉시 -80℃에서 냉동하였다. 프로테아제 억제제 칵테일을 실험 동안 첨가하였다. 타우를 이전에 일부 변형과 함께 기재되 바와 같이 면역침전 및 탈염하였다(Sato et al., 2018). 간략히, CNBr-활성화된 세파로스 비드(GE Healthcare 17-0430-01)를 비드 g 당 3mg 항체의 농도로 개별적으로 항체 타우1 및 HJ8.5에 가교결합시켰다. 샘플을 샘플 mL 당 각각의 관심 서열에 대해 10fmol의 인산화된 타우 및 100fmol의 비인산화된 타우에 상응하는 AQUA 펩티드(ThermoFisher Scientific)로 스파이킹하였다. 타우 및 p-타우 농도를 이러한 내부 표준을 사용하여 계산하였다. 가용성 타우를 세제(1% NP-40), 카오트로픽 시약(5mM 구아니딘) 및 프로테아제 억제제(Roche 완전 프로테아제 억제제 칵테일)에서 면역침전시켰다. 세파로스 비드에 접합된 항-타우1 및 HJ8.5 항체를 불활성화된 세파로스 비드에서 각각 10배 및 5배 희석하고, 항체 비드의 50% 슬러리 30uL를 실온에서 90분 동안 용액과 함께 회전시켰다. 비드를 25mM 트리에틸 암모늄 바이카보네이트 완충액(TEABC, Fluka 17902)에서 3회 세척하였다. 결합된 타우는 37℃에서 16시간 동안 400ng MS 등급 트립신(Promega, V5111)으로 비드-상에서 소화하였다. 소화물을 TopTip C18(Glygen, TT2C18.96)에 로딩하고, 제조업체의 지침에 따라 탈염 및 용리하였다. 용리된 펩티드를 진공 원심분리 (CentriVap Concentrator Labconco)로 건조하고 MS 등급 물 중 2% 아세토니트릴과 0.1% 포름산 용액 25uL에 재현탁하였다.
질량 분석법 - 펩티드 재현탁액의 5uL 분취량을 MS 분석을 위해 나노-Acquity LC에 주입하였다. 나노-Acquity LC(Waters Corporation, Milford, MA)에 HSS T3 75um x 100um, 1.8um 컬럼을 장착하고, 용액 A 및 B 구배의 0.5uL/분의 유속을 사용하여 펩티드를 분리하였다. 용액 A는 MS 등급 물 중 0.1% 포름산으로 구성되었고, 용액 B는 아세토니트릴 중 0.1% 포름산으로 구성되었다. 펩티드는 28분 안에 용액 B의 2% 내지 20%의 구배로 컬럼으로부터 용리되었고, 그 다음 추가 13분 동안 용액 B의 20% 내지 40%의 구배로 용리된 후, 컬럼을 청소하기 위해 추가 3분 안에 최대 85%의 용액 B로 램핑하였다. Orbitrap Fusion Lumos에 Nanospray Flex 전기분무 이온 공급원(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)를 장착하였다. 10um SilicaTip 방출기(New Objective, Woburn, MA)로부터 이온-공급원으로 분무된 펩티드 이온을 사중극자에서 표적화하고 단리하였다. 그런 다음 이들을 HCD에 의해 단편화하였고 이온 단편을 Orbitrap(분해능 60,000, 질량 범위 150-1200m/z)에서 검출하였다. 펩티드 프로파일링을 위한 친수성 펩티드(SSRcalc<9, 모두 류신 없음)의 모니터링은 HSS T3 300um x 100um, 1.8mm 컬럼에서 4ul/분의 유속으로 수행되었으며 용리는 2% 내지 12%의 용액 B 구배로 발생하였고, 분무는 30mm SilicaTip 방출기에서 작동하였다.
p-타우 펩티드 발견을 위한 PRM의 원리 - 가정된 인산화 부위를 함유하는 타우 펩티드는 인간 뇌 가용성 분획과 같은 타우-농축된 생물학적 추출물로부터 단백질을 소화하여 생성하였다. 이러한 펩티드는 Thermo Fisher Orbitrap Lumos와 같은 사중극자-궤도 장비를 사용하여 표적화된 MS 분석에 의해 스크리닝하였다. 각각의 인산화된 펩티드에 대해, 표적화된 MS 매개변수, 예컨대, 전구체 질량, 충돌 에너지 또는 예상된 체류 시간의 선별은 인실리코(in silico)에서 수행하였고 샘플에 훨씬 더 풍부한 상응하는 비변형된 펩티드에 대해 측정된 생물물리학적 특성을 사용하여 정화하였다. 인산화된 펩티드를 검출하기 위해, 사중극자는 가정된 전구체 질량을 포함하는 질량 윈도우를 선별하도록 설정된다. 전구체 충돌 후, 생성된 모든 단편은 크로마토그래피 용리 시간 동안 Orbitrap에서 동시에 측정하였다. 잠재적으로 인산화된 펩티드는 생성된 데이터의 후 분석에서 검색할 수 있다. Skyline 소프트웨어(MacCoss Lab, University of Washington, WA)를 사용하여 LC-MS/MS 데이터를 추출하였다. 스크리닝되는 가정의 펩티드는 예측된 MS/MS 단편으로부터 추출된 질량의 엄격한 공동-용리에 의해 이루어진 LC-MS/MS 핑거프린트로서 검출된다 (도 2). 기존 DDA 또는 표적된 MS 방법에 비해 PRM 방법의 이점은 가능한 가장 민감한 구성에서 MS 기기를 사용하고 발견 능력을 보존할 수 있다는 것이다.
스크리닝 동안 사중극자-Orbitrap 기기의 최대 민감도는 소량의 이온 단편을 검출하는 데 필수적이며 인산화된 부위의 국소화와 함께 인산화된 펩티드의 식별을 용이하게 한다. PRM 측정의 민감도는 주로 관심 표적으로부터 Orbitrap 분석기로 전송된 이온 수에 따라 달라진다. 이 숫자는 MS/HRMS 스캔을 한 번 획득하는 데 사용되는 충전 시간을 증가시킴으로써 향상되었다. 충전 시간은 이온 빔으로부터 이온 트랩 장치로 표적화된 전구체 질량을 축적하는 데 소요되는 시간에 상응한다. 이 후 축적된 전구체는 단편화되고 생성물 단편은 분석되기 위해 Orbitrap으로 전송된다. 따라서, 충전 시간은 크로마토그램 신호를 기재하기에 충분한 데이터 지점을 획득할 수 있는 충분한 MS 스캔 속도(즉, 크로마토그래피 피크 당 8-15 스캔)에 대한 필요에 의해 제한된 최대로 설정된다. 조사된 각각의 인산화된 펩티드에 대한 PRM 스크리닝을 위한 충전 시간은 전형적으로 1초로 설정되었다.
충전 시간은 또한 트랩 포화의 위험에 의해 제한된다. 이는 동일한 스캔 내에서 너무 많은 이온이 샘플링되고 Orbitrap으로 전송되어 공간 전하 효과로 인해 부정확한 질량 측정으로 이어질 때 발생한다. 이러한 포화를 피하기 위해, 매트릭스보다 표적을 농축시키는 적절한 샘플 정제(면역 정제)와 함께 좁은 전구체 단리(0.7Da)를 선택하여 잠재적인 거의-등비의 간섭의 기여도를 감소시켰다.
PRM 발견 실험의 특이도는 LC-Q Orbitrap 시스템의 분해 능력에 따라 달라진다. 분해 능력은 상이한 분석적 매개변수에 의해 개선될 수 있으며, 궁극적인 목표는 표적 펩티드에 대해 간섭이 없는 LC-MS/MS 핑거프린트를 수득하는 것이다. 이는 위양성 신호로 인한 모호한 단편 배정의 위험을 제한한다. p-타우를 우선적으로 농축하는 샘플 정제는 또한 소량의 인산화된 타우 펩티드의 발견에서 특이도를 개선할 수 있다. 높은 크로마토그래피 피크 용량 및 분해능은 공동-용리 가능성을 제한한다. 전구체에 대한 좁은 사중극자 단리 윈도우는 위에서 상기 기재된 바와 같이 트랩 포화의 위험을 제한함과 함께 MS/MS 스펙트럼에 대한 간섭의 확률을 줄인다. 높은 Orbitrap 분해능 및 분석기 보정은 데이터 처리 제한, 전환 간섭 위험 동안 질량 단편의 정확한 추출을 허용한다(Gallien et al., 2012; Peterson et al., 2012). Orbitrap 분해능(60k)의 선택은 더 많은 획득 시간이 필요한 고해상도와 크로마토그래피 수집과 호환되는 합리적인 스캔 속도 간의 균형이다.
타우의 부위 특이적 인산화율의 정량적 평가 - 뇌 및 CSF로부터 타우의 특이적 부위의 상대적 인산화의 풍부도를 정량적으로 평가하기 위해, 검출된 각각의 부위에서 인산화 정도를 측정하였다. 이를 위해 3개의 방법을 사용하였다: 1) 인산화된 펩티드 이성질체 간의 상대적 비교: 전이 이온으로부터의 신호 비교를 사용하여 각각의 인산화된 부위를 식별하였다. 이는 동일한 서열을 공유하는 각각의 인산화된 펩티드의 상대적인 풍부도를 추정할 수 있다. 2) 인산화된 펩티드는 참고로서 인산화되지 않은 펩티드로 정규화된다: 각각의 인산화된 펩티드에 대해 특이적인 LC-MS/MS 전이는 인산화되지 않은 펩티드로부터의 상응하는 전이와 비교된다. 수득한 각각의 인산화된 부위 비율을 단백질 서열 전체에 걸쳐 비교할 수 있다. 이 전략은 인산화되지 않은 펩티드 및 인산화된 펩티드 사이의 단편화 효율의 상이함에 의해 편향될 수 있다. 이 방법은 인산화된 부위가 트립신 누락된 분열의 일부인 경우 적용할 수 없다. 3) 각각의 인산화된 펩티드 및 인산화되지 않은 펩티드에 대해 내부 합성 표지된 표준물질(예컨대, AQUA)을 사용한 절대 정량: 인산화된 표준물질 및 인산화되지 않은 표준물질로부터의 신호를 사용하여 내부 비율을 정의하였다. 이 전략은 비교된 각각의 펩티드의 단편화 특이도를 고려하지만 모니터링된 각각의 종에 대한 펩티드 합성이 필요하다.
본 연구에서, 누락된 트립신 분열을 포함하는 것을 제외하고 제2 방법을 사용하여 인산화율을 계산하였다. 본 발명자들은 또한 합성 인산화된 펩티드를 이용할 수 있는 경우 뇌와 CSF 추출물 둘 다에서 발견되는 제한된 인산화된 부위 세트(즉, T175, T181, S199, S202, T205, T217 및 T231)에 대해 제3 방법(AQUA 정규화)을 적용하였고, 하나의 부위(S404)가 뇌에서만 발견되었다(표 1). AQUA 측정을 위해, 뇌 추출물을 CSF 타우 수준과 비교할 수 있도록 500 내지 8000배 희석하였다. 이 희석은 CSF에 비해 뇌에서 타우 펩티드 수준에 대한 AQUA 내부 표준물질의 유의하게 상이한 비율로 인해 발생할 수 있는 매트릭스 영향을 최소화하였다. 제1 방법을 수많은 인산화된 잔기를 함유하는 p-타우 서열로부터 복잡한 LC-MS/MS 패턴의 초기 해석에 사용하였다.
통계 - 데이터는 달리 명시되지 않는 한, 평균±SD로 표시된다. 데이터의 정규 분포를 확인한 후, 타우 인산화율을 비교하기 위해 일원 분산분석에 이어 사후 분석(Tukey 테스트)을 수행하였다. 추가 통계 분석은 GraphPad Software Inc.의 GraphPad 버전 8.0.1(244)을 사용하여 완료하였다. 관련 군 간의 통계적 유의성은 양측(2-tailed), 독립(unpaired), Mann-Whitney t-테스로로 결정하였다. 유의성은 0.01 및 0.05 수준에서 평가하였다.
실시예 1-4에 대한 참고
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실시예 5: 대뇌 아밀로이드 병리는 타우 과인산화에서 부위-특이적 상이함과 연관된다
피질 PiB-PET의 표준 섭취 값 비율(SUVR)은 유의한 피질 Aß-플라크를 확실하게 식별하고 대상체를 PIB 양성(아밀로이드+, SUVR≥1.25) 또는 음성(아밀로이드-, SUVR<1.25)으로서 분류하는 데 사용된다. 아밀로이드 플라크 및 가용성 타우 종의 관계를 조사하기 위해, 본 발명자들은 피질 PiB-PET의 SUVR을 CSF 총 타우 및 다중 부위에서 CSF 타우의 인산화와 비교하였다(즉, 타우의 인산화되지 않은 부위에 대한 인산화된 부위의 비율). (도 16a) Thr217에서 타우의 인산화(p-T217)는 97.2%의 곡선 아래 면적(AUC)(0.94, 0.99의 95% 신뢰 구간(CI))을 가졌으며; Thr181에서 타우의 인산화(p-T181)는 89.1%의 AUC(Cl 0.83, 0.94)를 가졌으며; Thr205에서 타우의 인산화(p-T205)는 74.5%의 AUC(Cl 0.69, 0.82)를 가졌으며; 총 타우는 피질 Aβ-플라크(즉, 아밀로이드+)를 갖는 것으로서 돌연변이 캐리어(MC)를 분류하기 위해 72% AUC(CI 0.65, 0.79)를 가졌다. 이러한 데이터는 유의한 원섬유 Aβ 양성 플라크의 초기 단계에서 인산화의 증가가 이미 이들 두 과정을 적시에 연결하는 특이적 부위에서 시작되었음을 나타낸다. 이러한 데이터는 또한 T217의 비인산화에 대한 인산화의 비율의 증가가 원섬유 Aβ 플라크 병리에 대한 민감한 진단 마커로서 역할을 할 수 있음을 입증하였다.
그 다음, 본 발명자들은 총 Aβ-플라크 부하와 인산화 사이의 관계를 조사하기 위해 PiB-PET SUVR 사분위수에 의해 4개의 인산화 부위의 평균, 표준화된 인산화 비율 및 총 타우 수준을 비교하였다. 도 16b. Ser202(p-S202)를 제외한 모든 인산화 부위는 더 큰 Aβ-플라크 병리와 함께 증가된 인산화를 나타냈다. 다른 3개의 부위 간의 상이함도 또한 발견하였다. p-T217 및 p-T181은 플라크가 시작된 후 가장 큰 증가를 보였지만(사분위수 2-3), 이러한 증가의 규모는 플라크 부담이 더 커짐에 따라 감소하였다; 대조적으로, p-T205에서 인산화 및 총 타우 수준의 증가는 Aβ 플라크와 함께 계속 성장하였다. 이러한 결과는 초기에 AD에서 증가된 타우 인산화를 유도하는 사건이 잠재적으로 인산화 부위 특이적인 별개의 키나제 및 포스파타제의 조절을 통해 Aβ-플라크 병리와 관련이 있을 가능성이 있음을 시사한다. 또한, 데이터는 p-T217이 원섬유 Aβ-플라크 병리학에 대한 대용 바이오마커로서 역할을 할 수 있어, Aβ-관련 타우 가공의 잠재적으로 고유한 시그니처를 식별할 수 있음을 시사한다. 중요한 것은 돌연변이 비-캐리어(NC) 중 T217에서 인산화의 증가를 나타내는 유일한 참가자는 PiB+(SUVR>1.25, n=4)인 사람들이었다.
다음으로 본 발명자들은 특이적 타우 인산화 부위와 PiB-PET SUVR에 의해 측정된 아밀로이드 플라크 침착의 피질 및 피질하 영역 사이의 상관관계를 조사함으로써 부위-특이적 타우 인산화가 대뇌 Aβ-플라크 병리의 해부학적 분포와 연관이 있는지 여부를 평가하였다, 도 16c. T217, T181 및 T205에서의 인산화는 뇌 전체의 Aβ-플라크와 양의 상관관계가 있었지만 S202에서의 인산화는 음의 상관관계를 있었다. 초기 아밀로이드 플라크 침착 영역인 쐐기앞소엽에서, 타우 아이소폼과의 상관관계는 연령, 성별 및 증상 발병에 대한 추정된 연도(EYO)에 대해 제어하는 이변수 회귀의 강도를 기반으로 비교하고 다중 비교를 위해 조정하였다. 본 발명자들은 Aβ-플라크와 양의 상관관계를 갖는 p-T217(β=0.68, p<10-30), p-T181(β=0.46, p<10-6), p-T205(β=0.41, p<10-5) 및 총 타우(β=0.35, p<0.001)의 상관관계의 순서를 매겼다. 대조적으로, p-S202는 역 상관관계(β=-0.47, p<10-7)를 가졌으며, 이는 Aβ 병리가 증가함에 따라 이 부위에서의 인산화가 적어짐을 시사한다. 이러한 관계는 신경변성의 증거가 거의 없는 경우 증상-전 MC에서 나타났으며, 이는 CSF에서 인산화된 타우의 증가가 죽어가는 뉴런에서 수동 방출의 결과가 아니라 Aβ-플라크 병리22의 존재와 관련된 활성 과정일 가능성이 더 높다는 것을 시사한다.
실시예 6: 질환 단계 및 진행은 타우 과인산화의 부위-특이적 상이함 및 종 방향 변화율과 연관된다.
질환 발병의 확실성 및 DIAD의 증상 발병의 예측가능성은 EYO9,10,30에 기반한 개인의 단계화(즉, 돌연변이가 있는 다른 사람의 발병 연령에 대한 평가 시점의 개인의 연령)를 가능하게 한다. 본 발명자들은 다음으로 CSF 타우의 인산화 패턴에 시간적 상이함이 있는지 여부를 결정하였다. 이는 EYO를 기반으로 MC와 NC 사이의 시간 경과에 따른 양의 상이함 및 인산화의 변화율을 추정하였다. 두 가지 중요한 발견이 있었다. 첫째, 총 타우 및 특이적 부위에서 인산화의 증가가 분별 있는 순서로 발생하였다는 증거가 있었다: T217의 인산화는 약 -21 EYO에서 발생하고, 이어서 T181의 인산화는 약 -19 EYO에서 발생하고, 그 다음 총 타우는 약 -17 EYO에서 증가한 다음, T205의 인산화는 약 -13 EYO에서 발생하였다(도 17a-f). T217에서 인산화의 초기 증가, 및 T181에서 더 적은 정도로, Aβ-플라크가 증가하기 시작한 시기(-19 EYO)와 비슷한 시기에 발생하였다. 둘째, T217 및 T181의 인산화 비율은 증상 발병의 시기와 가까워져 유의하게 저하하기 시작한 반면, T205에서의 인산화는 상승된 상태로 유지하였으며 총 타우 수준은 계속하여 증가하였다. 참고로, 모든 비인산화된 펩티드의 농도는 질환이 진행됨에 따라 증가하였으며(데이터는 도시되지 않음), 이는 T217 및 T181에 대한 인산화 비율의 감소가 이러한 부위를 특이적으로 스패닝하는 비인산화된 펩티드의 불균형적인 상승의 결과가 아니었다는 것을 시사한다. S202의 경우, 질환 진행 동안 인산화에 유의한 변화가 없었다, 도 17e. 이러한 결과는 타우의 인산화가 각각의 부위에 대해 구별하여 발생하여, 질환 단계에 따라 특이적 부위에서 증가 또는 감소함을 나타낸다. 이러한 부위 특이적 변화는 이전에 실현된 것보다 더 역동적이고 타우가 인산화 상태 또는 비율에서 단조롭게 증가하지 않는 가용성 타우의 연속적인 변화를 시사한다. 20년 간격으로 분리되는, Aβ 아밀로이드 플라크의 출현 및 임상 저하의 발병은 가용성 타우 인산화가 변화하는 단계의 두 가지 중요한 경계를 표시한다.
실시예 7: 질환 진행의 신경영상화 마커는 타우 과인산화에서 부위-특이적 상이함과 연관된다
가족력을 사용하여 증상의 발병을 추정하는 것(EYO) 외에도, DIAD의 질환 진행은 또한 질환 진행의 다양한 구성요소, 예컨대, 뇌 위축 및 물질대사 저하를 추적하는 신경영상화 측정을 사용하여 추정할 수 있다. 이러한 측정은 증상 발병 전에 상이한 기간에 변화하는 것으로 나타났으며, 증상 발병28,31-33 전에, 대뇌 물질대사 저하([F18] 플루오로데옥시글루코스 [FDG]-PET에 의해 측정됨)는 최대 18년에 발생하고 뇌 위축 (MRI에 의해 결정됨)은 최대 13년에 발생하였다. 이는 이러한 바이오마커가 특이적 부위에서 타우 인산화와 마찬가지로 상관관계가 있는지 여부에 대한 의문을 제기한다. 이를 검토하기 위해, 본 발명자들은 성별, 연령 및 EYO를 제어하는 34개의 피질 및 6개의 피질하 뇌 영역에서 영상화 측정을 통해 인산화 부위와 총 타우 사이의 이변수 단면 상관관계를 수행하였다. 질환 진행의 초기 단계에서 임의의 연관성을 식별하기 위해 무증상적 MC에 대한 분석에 집중하였다. S202에서 타우의 인산화 상태는 질환 진행에 대한 변화의 결여로 이러한 분석에 포함되지 않았다.
MRI - 과인산화는 무증상적 MC에서 피질 두께와 역으로 연관된다: p-T205는 뇌 전체에서 피질 및 피질하 두께의 감소와 가장 강하게 연관되어 있는 반면, 도 18a, p-T217 및 총 타우 수준은 적은 영역적 연관성 및 약한 상관관계를 나타냈다. p-T181에서의 과인산화는 내측 및 외측 두정엽 및 내측 등측-내측 전두엽으로 제한되는 피질 위축과 전반적인 상관관계가 가장 낮았다. 이는 -13 EYO에서 p-T205의 초기 상승이 피질 위축의 근본적인 병인과 관련이 있을 수 있음을 시사하며, 이는 이전에 쐐기앞소엽28에서 대략 -13 EYO에 시작하는 것으로 나타났다.
FDG PET - 피질 위축 이외에, 뉴런 및 신경교에서 글루코스 물질대사의 저하는 AD의 질환 진행과 연관된다. 따라서, 본 발명자들은 피질 또는 피질하 물질대사 기능장애와 타우 인산화 사이에 뚜렷한 연관성이 있는지 여부를 테스트하였다. 무증상적 MC에서, T205에서의 인산화는 FDG-PET에 의해 측정된 바와 같이 피질 및 피질하 영역 전체에 걸쳐 글루코스 저-물질대사와 상관관계가 있었다, 도 18b. 무증상적 MC에서 기타 p-타우 부위 또는 총 타우 수준에 대해 최소한의 연관성이 식별되었다.
이와 함께, 이러한 결과는 신경영상화에 의해 측정된 바와 같이 무증상 질환 진행 동안 뉴런 손상 및 신경변성로 이어지는 근본적인 과정이 p-T205와 가장 밀접한 상관관계가 있음을 나타낸다. 최근 연구는 fyn-키나제 경로를 통한 Aß-유도된 시냅스 후 세포독성34에 대한 반응으로 시냅스 후 말단에서 p-T205에 대한 보호 역할을 식별하였다. 여기서 발견된 연관성이 시냅스 기능이 저하할 때 T205에서 인산화를 증가시키는 보호 과정을 나타낼 수 있음이 가능하다. 그러나, 시간이 지남에 따라 과인산화는 타우가 응집하는 경향을 갖게 할 수 있다. 반면, T181 및 T217에서의 인산화는 피질 Aß-플라크 병리의 존재와 더 강하게 연관되어 있는 것으로 보이며, 잠재적으로 T205 과인산화의 업스트림 및 가용성 비인산화된 타우 수준의 상승을 발생한다.
실시예 8 - 인지 저하는 타우 과인산화의 부위-특이적 상이함과 특이적이고 차별적으로 연관된다
이전 연구는 AD 치매가 신피질 Aβ 병리35보다 신피질 NFT 병리와 더 밀접하게 관련되어 있음을 나타내지만, 가용성 타우와 인지 사이의 관계는 여전히 불확실한 상태로 남아있다. 따라서, 본 발명자들은 임상 결과36와 비교하여 시간에 따른 가용성 타우 인산화 비율과 총 타우 수준의 종 방향 변화를 평가하였다. 본 발명자들은 신경심리학적 복합에 대한 종 방향적 인지 성능을 결과로서 갖는 혼합된 효과 모델을 수행하고, CSF 타우 측정치(개별 선형 혼합 효과 모델로부터 유래됨), 시간 및 이들의 상호작용을 예측변수로서 변화시켜, 연령, 성별, 교육 및 가족 관계을 조정하였다. 본 발명자들은 이 분석을 위해 모든 MC(증상적 및 무증상적)를 테스트하였으며 인산화 부위와 임상 및 인지 저하 사이에 상이한 효과를 발견하였다. 인산화되지 않은 타우는 인지가 악화됨에 따라 단조적으로 증가하고, T217 및 T181에서 인산화는 인지가 악화됨에 따라 감소하는 반면, pT205는 인지 저하에 비해 변화가 없음을 보여주었다.
T217 및 T181의 인산화율이 감소함에 따라, 인지 저하가 가속화되었다(t값 2.35, p=0.02 및 2.11, p=0.04), 표 3 및 도 19. 이는 증가된 가용성 타우보다 T217 및 T181의 감소된 인산화가 인지 저하의 중요한 마커를 제시함을 시사한다.
이러한 발견은 CSF p-타우의 지속적인 상승이 인지 기능이상과 연관된다는 현재의 패러다임에 도전한다. 이 연구에서, 본 발명자들은 두 가지 일반적인 패턴을 발견하였다: 일부 부위의 경우, 인지 저하가 시작됨에 따라 인산화가 유의하게 감소한 반면, 다른 부위는 질환 진행에 따라 지속적인 증가를 나타내거나 변화가 없었다(도 19의 증가 vs. 감소 비 참고). 또한, 질환 진행의 다른 마커 (Aβ-플라크, 뇌 위축 및 대사)와 본 발명자들이 식별한 총 타우 수준 및 상이한 부위에서의 인산화 사이의 연관성은 AD에서 타우 인산화로 이어지는 과정이 다인성일 가능성이 높으며 동등하지 않다는 것을 더욱 강조하였다.
실시예 9 - 비인산화된 타우의 증가는 타우 PET에 의한 피질 NFT와 상관관계가 있지만 정규 포스포-타우 종은 그렇지 않다
DIAD 참가자를 대상으로 한 최근의 타우-PET(18F AV-1451 또는 플로르타우시피르) 연구는 NFT 증가가 임상 증상의 발병 후에만 발생한다고 제안하였다37,38. 본 발명자들은 가용성 p-타우가 NFT 병리의 마커인 반면 가용성 비인산화된 타우는 신경변성의 척도로서 죽어가는 뉴런14에서 수동적으로 방출된다는 가설을 테스트하였다. 본 발명자들은 타우-PET가 수행된 시점까지 CSF 타우와 p-타우 아이소폼의 종 방향 변화 사이의 관계를 조사하였다. 제한된 수의 참가자(MC 10명 및 NC 4명)에서, CSF 샘플을 수득한 지 72시간 이내에 단일 타우-PET 스캔을 수행하였다. 이들 개인의 경우, CSF 샘플을 또한 이전 방문(1-3년 이내)에서 수득하여, 타우-PET 수준을 예측하는 가용성 타우 측정의 종 방향 변화 능력을 평가할 수 있었다.
먼저, MC에서 피질 NFT 수준 만이 증상 발병의 시점 가까이에서 증가함을 확인하였으며, 도 20, 이는 DIAD MC에서 타우 응집체가 증가하기 시작할 때 임상 저하가 시작됨을 시사한다. 둘째로, CSF 비인산화된 타우의 종 방향 증가가 상승된 피질 타우-PET(p=0.03) 값과 연관됨을 발견하였다, 표 4. T205에 대한 인산화의 증가가 더 높은 수준의 타우-PET와 연관되고, 반대로 T217, T181 및 S202의 인산화 감소가 타우-PET의 수준 증가와 연관되는 경향이 있었다, 도 21. 이와 함께, 이러한 결과는 p-타우보다는 CSF에서 비인산화된 타우를 증가시키는 것이 NFT 병리의 확산과 더 밀접하게 연결되어 있음을 시사한다. 대조적으로, 가용성 p-타우 종은 응집된 타우가 증가할 때 저하하며, 이는 과인산화된 응집체에 의한 격리 과정을 나타낼 수 있다.
표 2. 돌연변이 캐리어와 비-캐리어에 대한 인구통계학적, 뇌척수액, 신경영상화 및 인지 측정.
Figure pct00010
표 3 돌연변이 캐리어에서 인산화된-타우 부위 및 총 타우 수준의 종 방향 변화에 의해 예측된 총괄적 인지의 종 방향 변화.
Figure pct00011
표 4 추적검사 뇌척수액 검사시 타우-PET 스캔을 수행한 각각의 개인에 대해 인산화 비율 및 총 타우의 종 방향 변화를 예측하였다 (n=14(10명의 돌연변이 캐리어, 4명의 비-캐리어)를 사용하여 피질 타우 표준화 단위 값 비율 (SUVR)을 예측하였다. 이 표는 이 제한된 집단에서 타우-PET의 증가에 대한 예측변수 만이 CSF에서 가용성 타우 수준을 증가시켰으며, 1 단위 피질 SUVR의 증가와 함께 연관된 36ng/ml의 증가를 나타낸다.
Figure pct00012
실시예 5-9에 대한 논의
타우는 특징적인 AD 병리를 포함하고 응집된 형태 또는 가용성 형태로 측정될 수 있지만, 이 중요한 뉴런 단백질의 번역 후 변형이 어떻게 인간에서 NFT2 및 신경변성의 발생으로 이어지는 지에 대한 이해에 중요한 격차가 남아 있다. 여기서 본 발명자들은 CSF에서 타우의 인산화 패턴이 AD 진행 과정에서 어떻게 달라지는 지 입증하였다. 본 발명자들은 기존 임상 문헌에, DIAD에서 타우 인산화 과정 및 중추 신경계로의 방출 과정이 다음과 같은 역동적 과정이라는 입증을 첨가한다: 1) Aβ-플라크 부담(PiB-PET에 의해 측정됨)이 확립되면(증상 전 수십 년) 시작되고, 이후 거의 20년에 걸쳐 전개되며, 이 기간 동안 타우 단백질의 상이한 인산화 부위가 질환 진행의 상이한 마커와 연관된 별개의 단계에서 인산화됨; 및 2) 인지 저하 및 응집된 타우의 상승(타우-PET에 의해 측정됨)의 시기 가까이에서 부위-의존적 방식으로 유의하게 감소함. 이와 함께, 이러한 결과는 가용성 인산화된/비인산화된 타우 펩티드를 정량화하는 이 방법이 전임상 단계 내지 증상 단계에 걸쳐 AD 과정을 추적하여, 이 질환에서 포스포-타우 병리의 시그니처를 제공할 수 있음을 나타낸다. 더욱이, 이들은 DIAD, 및 일반적으로 아마도 AD에서 알려진 타우/p-타우의 역할에 도전하고, Aβ 병리를 죽어가는 뉴런의 방출의 결과보다는 타우 과인산화21,23,25,39 및 활성 세포 방출과 연결시키는 동물 연구로부터의 연구결과를 인간에서 재현한다.
비록 인과관계는 향후 연구에서 다루어져야 하지만, p-T217, p-T181 및 PiB-PET의 동시적 증가는 AD에서 타우 수준의 광범위한 인산화가 Aβ 병리와 밀접하게 연결되어 있음을 시사한다. 이 가설은 AD 트랜스제닉 마우스20,21,23,34,40 및 Stable Isotope Labeling Kinetics(SILK)의 최근 연구와 일치하며, 이는 p-타우 아이소폼이 활성 과정에서 세포로부터 방출되며 Aβ-플라크22의 존재가 증가됨을 입증한다. 본 발명자들의 결과는 Aβ 병리를 가용성 타우 펩티드 농도 및 인산화 패턴의 뚜렷한 변화와 연결하여, AD에서 p-타우의 유의한 상승이 발생하지만 다른 신경퇴행성 타우병증에서는 발생하지 않는 현상을 조명한다.16,17 이러한 발견은 또한 임상 증상의 발병 전에 초기 AD 병리의 바이오마커뿐만 아니라 잠재적인 치료적 표적에 대한 중요한 통찰력을 제공한다.
최근 연구는 Aβ 트랜스제닉 마우스에서 AD 뇌로부터 NFT 단리물에 의해 유도된 신경성 타우 응집체(위축성 신경돌기의 쌍을 이룬 나선 필라멘트)의 증가 및 확산을 보여주었으며, 확립된 체세포 NFT20보다 훨씬 전에 발생하였다. p-T217 및 p-T181의 초기 증가는 Aβ-플라크에 대한 반응으로 이러한 "초기" 타우 응집을 반영할 수 있으며 본 발명자들이 식별한 이러한 아이소폼과 PiB PET의 총괄적 연관성을 설명할 수 있음을 가능하게 하였다. 또한, 이는 유의한 신경변성 발생 몇 년 전에 발생하기 때문에 p-타우의 초기 상승 동안 나타나는 임상 증상의 결여를 보다 잘 설명할 수 있다. 이 연구는 또한 p-T217을 아밀로이드 표적화 요법에서 치료적 반응의 지표로서 유망한 적용과 함께 극초기 바이오마커로서 제안한다. 이는 질환 진행의 대용 마커가 효과적인 요법을 식별하는 데 필수적인 예방 연구에서 특히 중요할 수 있다.
가용성 타우 및 p-타우의 진단적 역할에 대한 일부 일반적인 가정이 여기서 의문을 제기한다. 특이적으로, AD의 현재 진단적 프레임워크는 AD 특이적 및 비특이적 병리를 나타내는 바이오마커(예컨대, Aβ, p-타우 및 타우)14의 존재를 강조한다. 이 진단적 프레임워크 내에서, 가용성 p-타우 및 비인산화된 타우는 종종 변성하는 뉴런에서 수동적으로 방출되는 것으로 추정되며, p-타우는 응집된 NFT와 연관되고 비인산화된 타우는 축삭 변성과 연관된다. 대안적으로, DIAD에서 본 발명자들의 결과는 AD 타우병증이 가용성 타우 인산화 상태(인산화 비율)의 변형으로서 정의될 수 있음을 시사한다. 더욱이, 특이적 인산화 부위의 상태 변화의 시기를 고려할 때(추정된 증상 발병 21 내지 13년 전), 이는 또한 증가된 인산화가 병리의 마커이지만 반드시 타우-관련된 독성 또는 세포체 NFT의 마커가 아님을 시사한다. 사실, 본 발명자들의 결과는 pT217 및 pT181의 경우 NFT 병리가 급격히 증가할 때 계속 증가하는 것이 아니라37, 인산화의 극적인 감소가 있음을 나타낸다. 이에 대한 한 가지 가능한 설명은 가용성/응집된 Aβ41에서 관찰된 것과 유사하다: 응집된 타우 격리의 극적인 증가가 뇌에서 타우42를 인산화하여 CSF 수준을 감소시킨다는 것이다. 그러나, 단백질 항상성 메커니즘을 통한 타우 감소는 배제할 수 없다. 두 경우 모두에서, T217 또는 T181의 인산화 비율과 종 방향 인지 저하 사이의 음의 상관관계의 본 발명의 실험결과는 질환 진행에서 이 사건의 중요성을 강조한다. 이 저하의 원인을 밝히는 것은 AD 예후에서 CSF p-타우/타우의 사용과 가용성 타우와 뉴런 기능이상 사이의 연관성에 대한 더 나은 이해로 이어질 수 있다.
타우의 인산화에서 키나제의 역할을 감안할 때, 이 효소 군은 현재 AD 치료제의 잠재적 표적으로서 간주된다43. 본 발명자들이 본원에서 모든 형태의 p-타우가 질환 진행의 마커와 연관된 것은 아니며 일부는 실제로 이것에 대해 작용할 수 있음을 입증했듯이, p-타우 변경을 초래하는 특정 키나제/포스파타제 활성은 질환 과정에서 적어도 초기에 해롭지 않을 수 있다.
요약하면, 본 발명자들은 지금 상염색체 우성 돌연변이와 연관된 AD에서 CSF 타우 과인산화가 극초기에 발생하고 질환의 상이한 단계에서 부위-특이적 변화의 패턴을 나타냄을 입증하였다. 이러한 발견 뒤에 숨겨진 근본적인 메커니즘은 질환 및 AD를 위한 타우-지향 요법을 이해하는 중요한 의미를 가질 것이다.
실시예 5-9의 물질 및 방법
참가자 - PSEN1, PSEN2 또는 APP에서 확인된 유전적 돌연변이를 가진 가족으로부터 DIAD 돌연변이를 물려받을 위험이 50% 이상인 참가자를 Dominantly Inherited Alzheimer Network 연구(DIAN, NIA U19 AG032438)에 등록하였다(dian.wustl.edu; clinicaltrials.gov 번호 NCT00869817)44. 모든 절차는 워싱턴 대학의 기관 검토위원회(IRB)의 승인을 받았으며 연구가 수행된 곳의 지역 IRB 및 윤리위원회를 준수하였다. DIAD 돌연변이의 존재 또는 부재는 적절한 엑손의 PCR-기반 증폭에 이어 Sanger 시퀀싱을 사용하여 결정하였다. 각각의 연구 방문에서, 참가자는 포괄적인 임상 평가, 인지 테스트, 신경영상화 및 CSF 연구를 받았다; 그러나, 각각의 방문에서, 각각의 참가자는 모든 연구 절차를 완료하지 않았을 수 있다. 연구 구조 및 평가에 대한 자세한 내용은 이전 공개물10,44에서 찾을 수 있다. 추적검사 간격은 각각의 참가자의 임상 상태(정상 또는 손상됨)와 이들의 증상 발병에 대한 추정된 연도(EYO)에 따라 결정되었으며 범위는 매년 내지 3년 마다이다. 데이터는 품질-관리 데이터(2009년 1월 26일부터 2017년 6월 30일까지의 불규칙한 결과 및 누락된 데이터에 대한 연간 품질 평가)로부터 수득되었으며, 참가자 370명(2.8년의 방문 간 중앙값 시간을 갖는 종 방향 CSF 평가의 경우 n=150)을 포함하였다.
증상 발병에 대한 추정된 연도(EYO) - 우성 유전성 AD에서 거의 100% 침투도이며, 돌연변이 캐리어의 증상 발병 연령은 각각의 돌연변이 및 각각의 가족 내에서 비교적 일관되었다. 이는 증상 발병에 대한 추정된 연도(EYO)의 지정을 허용한다. EYO는 다음과 같이 정의되었다: 반-구조화된 인터뷰를 통해 각각의 참가자에 대해 가장 이른 증상 발병에서의 부모 연령을 설정하였다. 이어서, 각각의 돌연변이에 대한 발병시 부모 연령을 DIAN 및 DIAD 코호트의 이전 공개물로부터 조합된 증상 발병 값으로 이루어진 데이터베이스에 입력하였다. 이들을 각각의 돌연변이에 대해 특이적인 평균 발병 연령을 산출하는 데 사용하였다29. 개인의 EYO를 정의하기 위해 임상 평가의 시기에 각각의 참가자의 연령에서 돌연변이-특이적 발병 연령을 뺀다. 특이적 돌연변이 평균 발병 연령이 알려지지 않은 경우 부모 또는 대리인 발병 연령을 사용하여 EYO를 정의하였다29. CDR>0에 의해 평가된 바와 같이 기준선에서 증상이 있었던 참가자의 경우, EYO를 정의하기 위해 보고된 실제 증상 발병 연령을 각각의 임상 평가에서의 연령에서 뺀다.
임상 평가 - 연구 파트너의 사용을 포함하여 표준화된 임상 평가를 각각의 참가자에 대해 수행하였다. 임상 치매 등급 척도(CDR)는 치매 단계를 나타내기 위해 사용하였다. 참가자를 인지적으로 정상(CDR=0) 또는 매우 경미한 치매(CDR=0·5), 경미한 치매(CDR=1) 또는 중등도 치매(CDR=2)가 있는 것으로서 평가하였다45. 평가하는 임상의는 유전적 상태에 대해 몰랐다. 일반적인 인지 기능, 기억력, 주의력, 실행 기능, 시공간 기능 및 언어를 평가하는 포괄적인 신경심리학적 배터리는 각각의 방문에서 수행하였다46. 이 테스트를 통해 본 발명자들은 EYO 및 CDR 범위에 걸쳐 저하를 확실하게 검출하는 인지 복합을 개발하였다47. 이 복합은 에피소드 기억력, 복잡한 주의력, 처리 속도 및 일반적인 인지 스크린(최소 정신 상태 검사)을 포함한 테스트에서 얻은 z 점수의 평균을 나타낸다.
CSF 타우 분석 - CSF를 비외상성 Sprotte 척추 바늘(22Ga)을 사용하는 표준 요추 천자 절차(L4/L5)를 통해 2개의 13ml 폴리프로필렌 튜브에 수집하였다. CSF는 드라이 아이스 위에서 수직으로 급속 냉동되었다. 미국에서 수집된 샘플은 미국 미주리주 세인트루이스에 있는 워싱턴 대학의 DIAN 바이오마커 코어 실험실로 드라이 아이스 상에서 밤새 배송한 반면, 국제적인 현장에서 수집된 샘플은 -80℃에 보관하고 분기별로 드라이 아이스 상에서 배송되었다. 도착시, 이후에 각각의 샘플을 해동하고, 단일 폴리프로필렌 튜브에 합하고, 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브(#05-538-69C, Corning Life Science, Corning, NY, USA)에 분취(각각 500μl)한 후, 드라이 아이스에서 재-급속 냉동하고 -80℃에 보관하였다.
각각의 해동된 CSF 샘플을 15N-441 타우 내부 표준물질(샘플 당 2.5ng), 50mM 구아니딘, 10% NP-40 및 10X 프로테아제 억제제 칵테일(Roche)을 함유하는 용액 25μl와 혼합하였다. 타우는 타우1(타우 에피토프 192-199) 및 HJ8.5(타우 에피토프 27-35) 항체에 가교된 20μl의 세파로스 비드와 함께 2시간 동안 실온에서 회전 하에서 항온처리를 사용하는 면역 포획에 의해 추출하였다. 비드를 원심분리에 의해 스핀시킨 다음, 1ml의 25mM TEABC로 3회 헹구었다. 샘플을 400ng의 트립신 Gold(Promega, Madison, WI)로 37℃에서 밤새 소화하였다. AQUA 펩티드(Life Technologies, Carlsbad, CA)를 스파이크하여 각각의 샘플에서 표지된 인산화된 펩티드 당 5fmol 및 표지된 비변형된 펩티드 당 50fmol의 양을 수득하였다. 펩티드 혼합물을 TopTip C18 팁에 로딩하고, 0.1% 포름산(FA) 용액으로 세척하고, 60% ACN 0.1% FA 용액으로 용리하였다. 용리액을 Speedvac을 사용하여 건조하고 건조된 샘플은 분석 전에 -80℃에서 보관하였다. 샘플을 25μl의 2% ACN 0.1% FA에 재현탁하였다. 추출물을 HCD 단편화를 사용한 병렬 반응 모니터링을 사용하여 나노LC-MS/HRMS로 분석하였다. 나노LC-MS/MS 실험을 Fusion Tribrid 질량 분석기(Thermo Scientific, San Jose, California)와 결합된 나노Acquity UPLC 시스템(Waters, Mildford, Massachusetts)을 사용하여 수행하였다. 각각의 샘플에 대해 5μl를 주입하였다. Waters HSS T3 컬럼(75μm x 100mm, 1.8μm)에서 60℃에서 24분 동안에 펩티드 분리가 이루어졌다. 이동상은 (A) 물 중 0.1% 포름산 및 (B) 아세토니트릴 중 0.1% 포름산이었다. 사용된 구배는 다음과 같다: 0분-0.5% B; 7.5분-5% B; 22분-18% B; 이어서 컬럼을 95% B로 2분 헹구었다. 유속은 7.5분 동안 700nl/분으로 설정한 다음 나머지 분석 동안 400nl/분으로 설정하였다. 데이터는 2200V의 분무 전압(Nanospray Flex Ion Source, Thermo Scientific) 및 270℃로 설정된 이온 전달 튜브에서 양이온 모드에서 획득하였다. S-렌즈 RF 전압은 60V로 설정하였다. MS/HRMS 전이는 Skyline 소프트웨어(워싱턴 대학의 MacCoss 실험실)를 사용하여 추출하였다. CSF 타우 인산화 수준을 내인성 인산화되지 않은 펩티드의 MS/HRMS 전이와 단백질 내부 표준물질에서 얻은 15N 표지된 펩티드 사이의 측정된 비율을 사용하여 계산하였다. T181, S202, T205 및 T217에 대한 인산화 비율은 인산화된 펩티드 및 상응하는 비인산화된 펩티드로부터의 MS/HRMS 전이 비율을 사용하여 측정하였다. 각각의 인산화된/비인산화된 펩티드 내인성 비율은 상응하는 AQUA 인산화된/비인산화된 펩티드 내부 표준물질의 MS/HRMS 전이에서 측정된 비율을 사용하여 정규화하였다.
뇌 영상화 - 아밀로이드 침착, 글루코스 물질대사, 타우(NFT) PET 및 피질 두께/피질하 부피를 11C-PiB-PET, 18F-FDG-PET, 18F-AV-1451(일명 플로르타우시피르) 및 부피측정 T1-강조 MRI 스캔을 각각 사용하여 평가하였다. 모든 DIAN 부위의 데이터 수집에서 일관성을 보장하기 위해 표준 절차를 사용하였다28. 11C-PiB-PET 스캔은 40-70분 시간프레임에서 결정된 영역 표준 섭취 비율(SUVR)과 함께 ~13mCi의 PiB의 볼루스 주입 후 70분의 역동적 스캐닝으로 이루어졌다. 18F-FDG-PET 스캔은 ~5mCi 볼루스 주입 후 30분에 시작하였고 30분 동안 지속되었다. 18F-AV-1451 데이터를 볼루스 주입 후 80-100분 윈도우에서 수집하였으며 SUVR로 변환하였다. T1 MR 시퀀스는 3T 스캐너(매개변수: TR=23000, TE=2.95 및 1.0 x 1.0 x 1.2mm3 분해능)에서 획득한 구배 에코(MPRAGE)를 사용하여 가속된 자화-준비된 빠른 획득이었다.
34개의 피질 및 6개의 피질하 관심 영역(ROI)으로부터의 PIB 및 FDG SUVR은 FreeSurfer 소프트웨어(surfer.nmr.mgh.harvard.edu/)를 사용하여 수득하였다. SUVR은 회색 소뇌를 이용하여 참고 영역으로서 처리하였으며 ROI 데이터는 기하학적 전달 매트릭스 프레임워크에서 영역 지점 확산 함수(RSF)48를 사용하여 부분 부피 효과에 대해 수정하였다.
통계 분석 - 참가자의 기준선 특성을 연속 변수에 대한 평균±SD 및 범주 변수에 대한 n(컬럼 백분율)으로서 요약하였다. 기준선에서 정의된 무증상적 MC, 증상적 MC 및 NC 간의 상이함을 비교하기 위한 p-값은 연속 변수에 대한 일반 선형 혼합 효과 모델(LME) 및 범주 변수에 대한 로지스틱 링크를 사용하여 수득하였다. 모든 모델은 무작위 가족 효과를 통합하여 동일한 가족 내 참가자 간의 결과 측정에 대한 상관관계를 설명하였다. 기준선 피질 PiB PET SUVR의 컷 포인트는 MC와 NC 사이의 피질 PiB PET의 종 방향 변화율에서의 상이함이 처음 0과 유의하게 상이하기 시작하도록 선택하였다.
PiB, FDG 및 피질 두께/피질하 부피를 갖는 상이한 타우 인산화 부위의 단면 관계는 각각의 ROI에 대한 이변수 LME를 사용하여 모든 무증상적 MC(CDR=0, n=152)에서 평가하였다. 모델은 EYO, 교육, 성별 및 가족 수준의 무작위 절편의 고정된 영향을 포함하였다. 단순 상관관계 추정 방법(피어슨 또는 스피어만 상관관계)과 비교하여, 이변수 LME는 EYO와 같은 공동변수를 조정할 수있을뿐만 아니라 가족 클러스터 내의 상관관계를 설명할 수 있다49,50. 다중 테스트로 인한 허위 발견율을 제어하기 위해 Benjamini Hochberg 방법51을 사용하여 상관관계 테스트를 위한 p-값을 수정하였다.
종 방향 추적검사에 대한 개인 내 연간 변화율에 대하여, 각각의 바이오마커에 대한 최상의 선형 비편향된 예측변수를 LME를 사용하여 추정한 다음, 바이오마커 궤도를 조사하기 위해 기준선 EYO에 대해 플롯팅하였다. 그런 다음 적절한 경우, 선형 또는 선형 스플라인 혼합 효과 모델을 사용하여 MC가 기준선 수준 및 각각의 바이오마커에 대한 변화율에서 NC와 유의하게 상이한 기준선 EYO 지점을 결정하였다. 선형 스플라인 혼합 효과 모델에 대한 자세한 내용은 최근 공개물9에서 찾을 수 있다. 선형 또는 선형 스플라인 혼합 효과 모델은 돌연변이 군(MC 또는 NC), 기준선 EYO, 기준선 이후 시간 및 이들 중의 가능한 모든 양방향 또는 3-방향 상호작용의 고정된 영향을 포함하였다. 성별, 교육 연수 및 APOE ε4 상태는 공동변수로서 간주되었지만 유의한 영향만 모델에서 유지되었다. 모델에 포함된 무작위 효과는 반복된 측정으로 인한 대상체-내 상관관계를 설명하기 위해 가족 클러스터에 대한 무작위 절편, 개별 랜덤 절편 및 구조화되지 않은 공분산 매트릭스를 사용하는 무작위 기울기를 포함하였다. 그런 다음, 기준선에서 평균 수준의 조정된 상이함 및 MC와 NC 간의 변화율의 상이함을 모델에서 유래된 대략적인 t-테스트를 사용하여 테스트하여 상이함이 유의한 제1 EYO 지점을 결정하였다.
총 타우, 타우 인산화 부위, 피질 PiB 및 EYO 범위 전반에 걸친 총괄적 인지 간의 변화율의 상이함을 시각화하기 위해, 먼저 NC의 평균 및 표준 편차를 사용하여 MC 측정을 표준화하였다. 그런 다음, 각각의 MC에 대한 각각의 측정치의 변화율을 LME를 사용하여 계산하고, LOESS 곡선을 맞춰 EYO에 대한 표준화된 변화율의 궤도를 시각적으로 나타냈다.
LME를 사용하여 평가되는 종 방향 인지 저하를 예측하는 것에서의 기준선 총 타우 및 p-타우의 유용성을 평가하였다. 모델의 고정된 영향은 돌연변이 군, 기준선 연령, 성별, APOE ε4 상태, 시간 및 이들 중의 가능한 모든 양방향 또는 3-방향 상호작용을 포함하였다. 모델의 무작위 효과는 가족 클러스터에 대한 무작위 절편, 개별 랜덤 절편 및 구조화되지 않은 공분산 매트릭스가 있는 무작위 기울기를 포함하였다.
선형 회귀를 사용하여, 타우 PET를 수행한 시점을 포함하여 이어지는, MC 및 NC에 대한 타우 및 포스포-타우 위치의 연간 변화율이 연령의 효과를 제어하면서 타우 PET SUVR을 예측할 수 있는지 여부를 조사하였다. 제한된 참가자 수로 인해, 가족 클러스터는 포함하지 않았다.
모든 분석은 SAS 9.4(SAS Institute Inc., Cary, NC)를 사용하여 수행하였다. p-값<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 5-9에 대한 참고
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실시예 10
알츠하이머 질환(AD)은 전세계적으로 치매의 주요 원인이다. 이의 진단과 치료는 특이적 및 초기 바이오마커의 부재시에 여전히 극도로 어렵다. 뇌척수액(CSF) 바이오마커 및 뇌 양전자 방출 단층 촬영(PET) 영상화의 최근 발전은 아밀로이드-Aβ 플라크 및 신경원섬유 과인산화된 타우 엉킴의 병리학적 AD 뇌 병리를 검출하는 귀중한 도구를 제공하였다. 현재, AD 환자의 CSF 프로파일은 표준 면역-검정으로 측정된 아밀로이드-베타 42(Aβ42) 감소와 총 타우 및 인산화된 타우(p-타우 181) 증가를 특징으로 한다. 이 프로파일을 통해 AD 대 비-AD 병리를 구별하고, 인지 증상이나 불평이 있기 수년 전에 AD 과정을 검출할 수 있다. 그러나, CSF 타우 및 p-타우의 변화는 AD에만 특이적이지 않다. 증가된 p-타우181은 엉킴 형성으로 인한 과인산화의 결과로서 해석되었지만, CSF p-타우는 총 타우와 함께 증가하였다. 뇌 연구는 수많은 부위에서 타우 인산화를 나타내지만 CSF에서 이러한 추가 인산화 부위의 진단 관련성은 완전히 다루어지지 않았다. 질량 분석법(MS)-기반 방법은 인산화된 펩티드 및 이의 상응하는 비변형된 대응물을 독립적으로 정량할 수 있으므로 총 타우 수준과 무관하게 특이적 부위의 인산화 수준의 변화를 평가하는 면역검정보다 더 관련이 있다. 따라서, 인산화율을 평가하기 위해 포스포펩티드 및 비인산화된 펩티드 기울기 사이의 상관관계를 비교할 수 있다. CSF에서 인산화된 타우 아이소폼을 정량하기 위해 본 발명자들은 단백질 서열의 중간 도메인에 있는 타우 인산화된 펩티드를 표적으로 하는 혁신적인 표적화된 고분해능 MS(HRMS) 방법을 사용하였으며, 이는 CSF에서 가장 풍부한 도메인이며 뇌 타우 및 AD 타우 응집체의 수많은 부위에서 인산화된다.
본 발명자들은 CSF Aβ42/40 비율 및 PET-PIB 영상화를 기반으로 아밀로이드 상태로 계층화된 인지적으로 정상인 개인 및 경미한 인지 기능장애가 있는 환자를 포함하는 코호트를 사용하여 CSF에서 T181, S199, S202, T205 및 T217에 대한 타우 인산화를 분석하였다. 이 검증을 통해 AD 진단을 위한 CSF pT217의 잠재력을 강조하고 질환의 초기 단계에서 타우 변형의 근본이 되는 pT217과 아밀로이드증 사이의 상관관계를 확립할 수 있었다.
참가자 - 인지적으로 정상(CDR=0) 또는 경미한 인지 기능장애가 있는 86명의 참가자를 CSF 및 아밀로이드 PiB-PET 데이터가 이용가능한 Patterson et al.에 의해 이전에 보고된 Saint Louis ADRC 연구 중인 워싱턴 대학교에서 모집하였다. 이 코호트는 PiB-PET 결과(컷오프로서 사용된 0.18 초과를 양성으로 간주함) 및 MS로 측정된 CSF Aβ42/Aβ40 비율(컷오프로서 사용된 0.12 미만을 병리학적으로 간주함)에 따라 29명의 아밀로이드 양성 및 47명의 아밀로이드 음성 참가자 및 PET-PIB와 CSF 프로파일 사이에 상반되는 결과가 있는 10건의 경우(5건의 PiB-PET(+)/CSF(-), 5건의 PiB-PET(-)/CSF(+) 아밀로이드증 프로파일)를 포함하였다. 가변성을 평가하기 위해 7개의 CSF 샘플을 2회 반복 및 3회 반복으로 추출하였다.
면역침전을 이용한 CSF 타우 정제 - Aβ 면역-침전 및 -80C에서 보관한 후 수득한 800μl의 CSF 상청액을 타우 분석에 사용하였다. 해동된 상청액을 15N 타우 내부 표준물질(샘플 당 5ng)로 스파이킹하고 타우1 면역침전을 사용하여 추출하였다. 5mM 구아니딘, 1% NP-40 및 프로테아제 억제제 칵테일을 샘플에 첨가한 다음, 샘플을 타우1 항체에 가교된 20μl의 세파로스 비드와 실온에서 3시간 동안 혼합하였다. 비드를 침전시킨 다음 0.5M 구아니딘 및 TEABC 25mM으로 헹구었다. 샘플을 400ng의 트립신으로 소화시켰다. AQUA 펩티드(Life Technologies, Carlsbad, California)를 스파이킹하여 표지된 포스포펩티드 당 10fmol 및 샘플 당 표지된 펩티드 당 100fmol의 개별 정량을 달성하였다. AQUA TPSLPpTPPTR(pT217)은 발견 코호트에서 사용된 누락된 분열 버전을 대체하였다. 트립신 펩티드를 TopTip C18 팁에 로딩하고, 0.1% FA 용액으로 세척하고, 60% ACN 0.1% FA 용액으로 용리하였다. 용리액을 speedvac에서 건조하였다. 샘플을 -80C에서 보관하였다. LC-MS 분석 전에, 샘플을 25μl 2% ACN 0.1% FA에 재현탁하였다. 추출물을 나노LC-MS/HRMS로 분석하였다.
타우 펩티드 및 인산화된 펩티드 정량(검증) - 15N 표지된 펩티드를 사용한 안정한 동위원소 희석 MS 정량을 사용하여 비변형된 펩티드의 절대 수준을 계산하였다. 각각의 부위에 대한 인산화율은 AQUA 비인산화된 및 인산화된 펩티드 대응물로부터 수득된 면적 비율과 상응하는 내인성 펩티드에 대해 측정된 면적 비율을 비교하여 단일 지점 보정에 의해 계산하였다. 인산화된 펩티드 수준은 비변형된 펩티드 수준 대응물과 상응하는 부위의 인산화율을 합하여 계산하였다.
통계 - 회귀선의 기울기 비교를 포함한 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어(7.0)를 사용하여 수행하였다. 조사된 군 전체에 걸쳐 수득한 값 간의 통계적 유의성은 비모수 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 계산하였다. 비모수 스피어만의 rho 순위 상관계수를 사용하여 두 값 시리즈 간의 상관관계를 평가하였다. 통계적 유의성은 p<0.05로 정의하였다.
CSF 타우 인산화된 펩티드의 정량화 (결과) - AD의 T217에서 타우의 증가된 인산화를 인지 기능장애가 없거나 경미한 인지 기능장애가 있는 86명의 참가자를 포함하는 세인트 루이스의 워싱턴 대학에 있는 Knight AD 연구 센터(ADRC)의 코호트에서 검출하였다. MS에 의해 측정된 PiB-PET 및 CSF Aβ42/Aβ40 비율의 결과와 일치하여, 참가자를 29명의 아밀로이드 양성, 47명의 아밀로이드 음성 참가자 및 PET-PIB와 CSF 프로파일 간에 상반되는 결과가 있는 10건의 경우로 계층화하였다. 검정 민감도를 개선시키기 위해, 타우1 항체를 사용한 면역정제를 수행하였다. 인산화된 펩티드 및 비인산화된 펩티드 둘 다의 동위원소 표지된 버전을 사용하여 부위 인산화 비율을 측정하였다. 표적화된 모든 인산화된 펩티드는 타우1 항체에 의해 회수되지 않은 펩티드를 함유하는 pS199를 제외하고 모든 샘플에서 검출되었다. 이 코호트에서, 본 발명자들은 질환의 초기 단계에서 pT217 바이오마커의 양성 진단 관련성을 확인하였다. pT217/T217 비율은 아밀로이드 양성 군 및 음성 군을 명확하게 분리하였다(도 24b 및 도 24c, AUC 0.999). 또한, pT181/T181 비율의 측정은 아밀로이드-양성 군 및 아밀로이드-음성 군을 구별하였다(도 24b, AUC 0.956). T217 및 T181 인산화 비율은 또한 상관관계가 있으며(r=0.524, p=0.0002), 이는 이러한 부위의 인산화가 공통 경로에서 발생할 수 있음을 시사한다. 그러나, pT181의 진단 민감도는 pT217보다 낮았다. 인산화 비율 둘 다는 ELISA(각각 AUC 0.874 및 0.932)에 의해 측정된 p-타우(181) 및 t-타우 수준보다 더 나은 판별기이었다.
T217 과인산화, 아밀로이드 병리 및 인지 상태 사이의 상관관계 (결과) - 본 발명자들은 다음으로 이 새로운 바이오마커와 아밀로이드 과정 사이의 상관관계를 결정하였다. ADRC 코호트의 결과는 T217 과인산화와 아밀로이드 상태 사이의 강한 관계를 시사하였다. 중요한 것은 T217 인산화율이 FBP 총 피질 평균(도 24e, r=0.60, p=0.001)에 의해 측정된 PiB-PET의 정도와 유의한 상관관계가 있다는 것이다. 더욱이, PiB-PET(+)/CSF(-) 아밀로이드증 프로파일을 갖는 5개의 상반되는 모든 경우는 T217에서 과인산화되었다(도 24d, e). 대조적으로, T217 인산화와 CSF Aβ42/Aβ40 비율 사이에는 유의한 상관관계가 발견되지 않았다. PiB-PET와 CSF Aβ42/Aβ40 사이의 불일치는 CSF 아밀로이드 검정의 불충분한 민감도에 기인할 수 있는데, 이는 상응하는 CSF Aβ42/Aβ40 MS 비율이 정량화 역치에 가깝기 때문이다(0.12±0.02, 도 24e). 반대의 PiB-PET(-)/CSF(+) 아밀로이드증을 갖는 5명의 참가자 중 2명은 과인산화된 T217을 나타냈다(도 24d, e). 이는 높은 타우 과인산화로 강조된 이러한 경우가 아밀로이드 플라크 침착물 검출 전에 유의한 CSF Aβ 변화를 가질 수 있음을 시사한다. CSF Aβ42/Aβ40 비율과 T217 인산화율의 조합은 역치(0.12±20%)보다 약간 높은 중간 범위의 CSF Aβ42/Aβ40 비율 값으로도 PiB-PET 데이터가 없는 아밀로이드-양성 참가자를 확실하게 식별한다. 인지적 불평이 없는 참가자(CDR-SB=0) 중에서, T217 인산화는 아밀로이드-양성(n=9)을 아밀로이드-음성 참가자(n=26, AUC 1.00, 도 25)와 완전히 구별할 수 있었으며, 추가로 전임상 AD 참가자를 확신있게 식별하는 이 마커의 능력을 지지하였다. 그러나, 이 집단에서 CDR-SB 및 T217 인산화 비율로 측정된 총괄적 인지 성능 사이에는 상관관계가 관찰되지 않았다(도 25).
논의 - CSF에서 낮은 풍부도의 인산화된 타우 펩티드 및 이들의 비변형된 대응물을 동시에 측정하는 혁신적인 표적화된-HRMS 방법을 사용하여, 본 발명자들은 아밀로이드- 변화를 수반하고 증가된 CSF 타우 농도와 구별되는 CSF 타우 인산화율의 변화에 대한 최초의 직접적인 증거를 제공한다. 이 접근법은 근본적인 비정상적인 물질대사를 나타내기 위해 과인산화 및 저인산화를 평가하는 AD-특이적 타우 인산화율을 연구할 수 있게 한다.
현재 연구의 가장 놀라운 결과는 2개의 독립적이고 잘 특성화된 코호트에서 조사된 전임상, 경미한 및 중등도 AD 참가자로부터 CSF 타우에서 T217의 고도로 특이적인 과인산화이다. AD 타우병증 이전에 발생할 가능성이 있는 아밀로이드 병리 및 T217에 대한 타우 과인산화는 질환 단계 전반에 걸쳐 강하게 연관되어 있다. 이는 아밀로이드증이 타우 인산화 변화와 관련될 수 있다는 가설을 지지한다. 이 연구에서 Aβ-아밀로이드증 및 정상 T217 인산화를 가진 참가자의 부재는 이 타우 인산화 부위가 아밀로이드 과정을 따를 수 있음을 시사한다. T217의 과인산화는 AD 병태생리학적 과정의 핵심 역할을 할 수 있으며 그 역할은 기타 타우 바이오마커와는 상이하였다. 본 발명의 코호트에서, ELISA에 의해 평가된 CSF 타우 또는 p-타우 수준의 증가는 pT217/T217 비율보다 아밀로이드증 상태를 식별하는 데 덜 효과적이었다. 이러한 AD 타우 바이오마커의 특이도는 궁극적으로 임상 AD로 진행하는 개인의 인지 저하 위험에 대한 예측을 개선시킬 수 있다. 따라서, 아밀로이드증 바이오마커와 pT217/T217 비율 측정을 합하여 AD를 검출하면, 전임상 AD의 진단을 극적으로 개선시킬 수 있다. T217 과인산화는 CSF의 아밀로이드 마커보다 PiB-PET 부하로 측정된 아밀로이드 플라크와 높은 상관 관계가 있지만, 타우 변형은 원섬유성 플라크의 존재에 의해서만 독점적으로 발생하는 것은 아니다. 뇌 아밀로이드 부하가 없는 T217 과인산화 및 낮은 CSF Aβ 42/40을 갖는 2명의 참가자의 경우(도 24e), 이들은 PiB-PET에 의해 검출되지 않지만 CSF Aβ42 수준을 감소시키는 데 기여하는, 확산 플라크 또는 Aβ 올리고머 형성만 있는 경우일 수 있다.
임상에서 AD 마커로서 pT181의 광범위한 사용은 높은 수준의 검출가능성 때문일 가능성이 높지만 반드시 높은 특이도는 아니다. pT181의 측정은 비-AD 치매와 비교하여 AD에서 인산화 화학량론의 약간의 변화를 강조한다. T181의 증가된 인산화율은 검증 코호트에서 조사된 잘 특성화된 아밀로이드 양성 군에서 훨씬 더 명백하였다. 두 연구 모두에서, ELISA t-타우 및 p-타우181을 합한 비율은 T181에서 발생하는 인산화율의 변화를 입증하지 못하여, 이러한 변화를 정확하게 모니터링하기 위한 ELISA의 한계를 강조하였다. 따라서, AD CSF에서 광범위하게 보고된 pT181의 증가는 주로 T181 인산화 화학량론의 유의한 변화보다는 타우 아이소폼 수준의 수반되는 증가에 기인한다. 아밀로이드-Aβ 병리는 T181에서 과인산화를 유도하지만, 결과적인 변형은 T217에서 관찰된 상대적 증가에 비해 덜 특이적이거나 유의해 보인다.
AD CSF에서의 S199, S202 및 T205에서 관찰된 인산화 화학양론의 변형은 AD 뇌에서 이전에 관찰된 타우 인산화의 특이적 변화를 반영할 가능성이 높다. 실제로, pS202 및 pT205는 AT8 항체에 의해 인식되는 이중 인산화된 에피토프의 일부이다. AT8은 AD 뇌 부검에서 발견된 타우 응집체에 결합하며, AT8-면역반응성 응집체의 정도는 타우병증의 중증도(Braak 단계)와 관련이 있다. AT8은 CSF에서 측정된 정상 타우 또는 AD와 관련된 타우에 대한 반응성이 없다. 더욱이, S199를 함유하는 인산화되지 않은 에피토프에서 정상 타우에 결합하는 타우1 항체는 AD 타우 응집체에 대한 친화성이 없다. 이와 함께, 이러한 발견은 AD 뇌의 타우 응집체에서 S199, S202 및 T205의 수반되고 풍부한 과인산화를 지지한다. 그러나, AD에서 타우 응집을 촉진하기 위한 이러한 인산화된 타우 아이소폼의 고유 특성에 대한 논란이 존재한다. 경미한 및 중등도의 AD CSF에서 관찰된 S199 및 S202 인산화의 감소된 양은 응집체에서 상응하는 인산화된 타우 아이소폼의 축적과 일치한다. 또한, 주로 중등도 AD CSF에서 T205 인산화의 검출은 아밀로이드 관련 타우병증의 기저에 있는 병리학적 메커니즘에서 이 부위의 중요한 역할을 시사한다. S202/T205 인산화의 변형은 전임상 및 경미한 AD 참가자로 구성된 제2 코호트에서 검출되지 않았으며(데이터는 도시되지 않음), 이는 질환 진행 동안 특이적 부위에서 타우 인산화의 역동적 과정을 시사한다.
본 발견은 AD 아밀로이드증 및 T217에 대한 타우의 과인산화 및 T181에 대한 적은 정도의 과인산화 사이의 상호작용을 제안할 수 있다. 이들 부위는 세린/트레오닌 프롤린-지향된 키나제 GSK-3에 대한 두 기질이며, Aβ 올리고머에 의한 GSK-3의 활성화는 아밀로이드 펩티드와 타우 인산화 사이의 링크로서 제안되었다. 아밀로이드증 환자에서 이 두 GSK-3 부위에서 일반적이고 상대적으로 잘 관련된 과인산화는 이러한 메커니즘과 일치할 수 있다. 타우 PET에 의해 측정된 타우 응집체를 포함하여 CSF와 뇌에서 타우 인산화율을 비교하기 위해 설계된 추가 연구는 AD 병리생리학에 대한 신규 통찰력을 제공할 가능성이 높으며 신규 치료적 접근법을 식별할 수 있다. 이러한 발견은 AD에서 아밀로이드 플라크와 타우병증 사이의 특이적 을 링크를 암시하며 AD로 이어지는 일련의 분자 사건에서 잠재적인 링크를 제공한다. 따라서, AD 과정 내에서 pT217의 특이도를 고려할 때, 향후 치료적 개발을 위한 중요한 표적이 될 수 있으며 이러한 비정상적인 타우 물질대사를 제한하는 데 있어 항-아밀로이드 약물의 잠재적 효과를 따르는 흥미로운 도구를 나타낼 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Washington University Barthelemy, Nicolas Bateman, Randall <120> METHODS OF DIAGNOSING AND TREATING BASED ON SITE-SPECIFIC TAU PHOSPHORYLATION <130> 047563-623217 <150> 62/666,509 <151> 2018-05-03 <150> 62/666,504 <151> 2018-05-03 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 1 Lys Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu 1 5 10 15 Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met 20 25 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 2 Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala 1 5 10 15 Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg 20 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTEHSIZED <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> PHOSPHORYLATION <400> 3 Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala 1 5 10 15 Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg 20 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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His 1 5 10 <210> 50 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> PHOSPHORYLATION <400> 50 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 1 5 10 15 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His 20 <210> 51 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> PHOSPHORYLATION <400> 51 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 1 5 10 15 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His 20 <210> 52 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> PHOSPHORYLATION <400> 52 Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp 1 5 10 15 Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Lys Gln <210> 53 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> PHOSPHORYLATION <400> 53 Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp 1 5 10 15 Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Lys Gln <210> 54 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> PHOSPHORYLATION <400> 54 Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp 1 5 10 15 Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala 20 25 30 Lys Gln <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 55 Ile Ala Thr Pro Arg 1 5 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> PHOSPHORYLATION <400> 56 Ile Ala Thr Pro Arg 1 5 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 57 Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr 1 5 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 58 Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 59 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser 1 5 10 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 60 Thr Pro Pro Ala Pro Lys 1 5 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 61 Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys 1 5 10 <210> 62 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> PHOSPHORYLATION <400> 62 Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys 1 5 10 15 <210> 63 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 63 Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 1 5 10 <210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> PHOSPHORYLATION <400> 64 Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 1 5 10 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 65 Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 10 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> PHOSPHORYLATION <400> 66 Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 10 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> PHOSPHORYLATION <400> 67 Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg 1 5 10 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> PHOSPHORYLATION <400> 68 Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys 1 5 10 <210> 69 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> PHOSPHORYLATION <400> 69 Glu Ser Pro Leu Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly 1 5 10 15 Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys 20 <210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <400> 70 Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser 1 5 10 <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> PHOSPHORYLATION <400> 71 Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg 1 5 10 15 Ser <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHESIZED <400> 72 Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu 1 5 10

Claims (137)

  1. 알츠하이머 질환의 발병 전에 대상체를 진단하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및
    (b) T217 또는 T181에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상이고 T205에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이하인 경우 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애로의 전환 위험이 증가된 것으로서 대상체를 진단하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 T217에서 타우 인산화가 1.5σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 대상체가 (i) T217에서 타우 인산화가 1.75σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.75σ 미만이고, (ii) T217에서 타우 인산화가 1.8σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.8σ 미만이거나, (iii) T217에서 타우 인산화가 1.9σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.9σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 대상체가 T217에서 타우 인산화가 2σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 2σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 T181에서 타우 인산화가 1.5σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 대상체가 (i) T181에서 타우 인산화가 1.75σ 초과이고 T205에서의 타우 인산화가 1.75σ 미만이고, (ii) T181에서 타우 인산화가 1.8σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.8σ 미만이거나, (iii) T181에서 타우 인산화가 1.9σ 초과이고 T205에서의 타우 인산화가 1.9σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 대상체가 T181에서 타우 인산화가 2σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 2σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 대상체가 T181 및 T217에서 타우 인산화가 1.5σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 대상체가 (i) T181 및 T217에서 타우 인산화가 1.75σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.75σ 미만이거나, (ii) T181 및 T217에서 타우 인산화가 1.8σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.8σ 미만이거나, (iii) T181 및 T217에서 타우 인산화가 1.9σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.9σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 대상체가 T181 및 T217에서 타우 인산화가 2σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 2σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진단이 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애의 발병으로부터 약 10 내지 약 25 년 동안의 대상체의 식별을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 진단이 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애의 발병으로부터 약 10 내지 약 20 년 동안의 대상체의 식별을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  13. 알츠하이머 질환의 발병 전에 대상체를 진단하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 총 타우를 측정하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및
    (b) 총 타우에 대한 T217 또는 T181에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 미만인 경우 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애로의 전환 위험이 증가된 것으로서 대상체를 진단하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 총 타우, 및 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 대상체가 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 대상체가 (i) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 미만이거나, (ii) 총 타우 T217에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우 T205에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 미만이거나, 또는 (iii) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 이상이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 대상체가 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 대상체가 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 대상체가 (i) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 미만이거나, (ii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 미만이거나, (iii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 대상체가 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 대상체가 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 대상체가 (i) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 미만이거나, (ii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 미만이거나, (iii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 대상체가 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 T205에서의 타우 인산화가 2σ 미만인 경우 진단되는 것인, 방법.
  23. 제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진단이 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애의 발병으로부터 약 10 내지 약 25 년 동안의 대상체의 식별을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 진단이 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애의 발병으로부터 약 10 년 내지 약 20 년 동안의 대상체의 식별을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  25. 알츠하이머 질환의 발병 전에 대상체를 진단하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및
    (b) (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상인 경우 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애로의 전환 위험이 증가된 것으로서 대상체를 진단하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 대상체가 T217 및 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 대상체가 T217 및 T205에서 타우 인산화가 1.75σ 초과, 1.8σ 초과 또는 1.9σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 대상체가 T217 및 T205에서 타우 인산화가 2σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 대상체가 T181 및 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 대상체가 T181 및 T205에서 타우 인산화가 1.75σ 초과, 1.8σ 초과 또는 1.9σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 대상체가 T181 및 T205에서 타우 인산화가 2σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  32. 제25항에 있어서, 상기 대상체가 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화가 1.5σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 대상체가 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화가 1.75σ 초과, 1.8σ 초과 또는 1.9σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 대상체가 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화가 2σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  35. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진단이 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애의 발병으로부터 약 15 년 이하로 대상체의 식별을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 진단이 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애의 발병으로부터 약 10 년 이하로 대상체의 식별을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  37. 알츠하이머 질환의 발병 전에 대상체를 진단하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 총 타우를 측정하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및
    (b) 총 타우에 대한 (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서의 타우 인산화 비율이 약 1.5σ 이상인 경우 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애로의 전환 위험이 증가된 것으로서 대상체를 진단하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 총 타우 및 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 대상체가 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 대상체가 (i) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이며, (ii) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고, (iii) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 대상체가 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  41. 제37항에 있어서, 상기 대상체가 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 대상체가 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이며, (ii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화가 1.8σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이며, (iii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 대상체가 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  44. 제37항에 있어서, 상기 대상체가 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 대상체가 (i) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이며, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고, (ii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이며, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고, (iii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이며, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 대상체가 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과인 경우 진단되는 것인, 방법.
  47. 제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진단이 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애의 발병으로부터 약 15 년 이하로 대상체의 식별을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 진단이 알츠하이머 질환으로 인한 경미한 인지 기능장애의 발병으로부터 약 10 년 이하로 대상체의 식별을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  49. 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및
    (b) T217 또는 T181에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상이고 T205에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이하인 경우 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함하는 방법.
  50. 제48항에 있어서, 상기 대상체에, T217에서 타우 인산화가 1.5σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 대상체에, (i) T217에서의 타우 인산화가 1.75σ 초과이고 T205에서의 타우 인산화가 1.75σ 미만이거나, (ii) T217에서 타우 인산화가 1.8σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.8σ 미만이거나, (iii) T217에서 타우 인산화가 1.9σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.9σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 대상체에, T217에서 타우 인산화가 2σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 2σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  53. 제49항에 있어서, 상기 대상체에, T181에서 타우 인산화가 1.5σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 대상체에, (i) T181에서의 타우 인산화가 1.75σ 초과이고 T205에서의 타우 인산화가 1.75σ 미만이거나, (ii) T181에서 타우 인산화가 1.8σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.8σ 미만이거나, (iii) T181에서 타우 인산화가 1.9σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.9σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 대상체에, T181에서 타우 인산화가 2σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 2σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  56. 제49항에 있어서, 상기 대상체에, T181 및 T217에서 타우 인산화가 1.5σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 대상체에, (i) T181 및 T217에서 타우 인산화가 1.75σ 초과이고 T205에서 타우 인산화는 1.75σ 미만이거나, (ii) T181 및 T217에서 타우 인산화가 1.8σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.8σ 미만이거나, (iii) T181 및 T217에서 타우 인산화가 1.9σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.9σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  58. 제56항에 있어서, 상기 대상체에, T181 및 T217에서 타우 인산화가 2σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 2σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  59. 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 총 타우를 측정하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및
    (b) 총 타우에 대한 T217 또는 T181에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 미만인 경우, 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 총 타우, 및 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 대상체에, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 대상체에, (i) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 미만이거나, (ii) 총 타우 T217에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우 T205에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 미만이거나, (iii) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  62. 제60항에 있어서, 상기 대상체에, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  63. 제59항에 있어서, 상기 대상체에, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 대상체에, (i) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과아ㅣ고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 미만이거나, (ii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 미만이거나, (iii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  65. 제63항에 있어서, 상기 대상체에, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  66. 제59항에 있어서, 상기 대상체에, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 대상체에, (i) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 미만이거나, (ii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 미만이거나, (iii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 대상체에, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 T205에서의 타우 인산화가 2σ 미만인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  69. 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및
    (b) (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상인 경우 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 대상체에, T217 및 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 대상체에, T217 및 T205에서 타우 인산화가 1.75σ 초과, 1.8σ 초과, 또는 1.9σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 대상체에, T217 및 T205에서 타우 인산화가 2σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  73. 제69항에 있어서, 상기 대상체에, T181 및 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 대상체에, T181 및 T205에서 타우 인산화가 1.75σ 초과, 1.8σ 초과 또는 1.9σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 대상체에, T181 및 T205에서 타우 인산화가 2σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  76. 제69항에 있어서, 상기 대상체에, T181, T205 및 T217에서 타우 인산화가 1.5σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 대상체에, T181, T205 및 T217에서 타우 인산화가 1.75σ 초과, 1.8σ 초과 또는 1.9σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  78. 제76항에 있어서, 상기 대상체에, T181, T205 및 T217에서 타우 인산화가 2σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  79. 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 총 타우를 측정하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및
    (b) 총 타우에 대한 (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 비율이 약 1.5σ 이상인 경우, 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 총 타우, 및 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 대상체에, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 대상체에, (i) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이며, (ii) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고, (iii) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  82. 제80항에 있어서, 상기 대상체에, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  83. 제79항에 있어서, 상기 대상체에, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 대상체에, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이며, (ii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고, (iii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  85. 제83항에 있어서, 상기 대상체에, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  86. 제79항에 있어서, 상기 대상체에, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 대상체에, (i) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이며, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고, (ii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이며, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고, (iii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이며, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  88. 제86항에 있어서, 상기 대상체에, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과인 경우 약학 조성물을 투여하는 것인, 방법.
  89. 임상 시험에 대상체를 등록하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및
    (b) T217 또는 T181에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상이고 T205에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이하인 경우 임상 시험에 대상체를 등록하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함하는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 대상체가, T217에서 타우 인산화가 1.5σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 대상체가, (i) T217에서 타우 인산화가 1.75σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.75σ 미만이거나, (ii) T217에서 타우 인산화가 1.8σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.8σ 미만이거나, (iii) T217에서 타우 인산화가 1.9σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.9σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  92. 제90항에 있어서, 상기 대상체가, T217에서 타우 인산화가 2σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 2σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  93. 제89항에 있어서, 상기 대상체가, T181에서 타우 인산화가 1.5σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 대상체가, (i) T181에서 타우 인산화가 1.75σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.75σ 미만이거나, (ii) T181에서 타우 인산화가 1.8σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.8σ 미만이거나, (iii) T181에서 타우 인산화가 1.9σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.9σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  95. 제93항에 있어서, 상기 대상체가, T181에서 타우 인산화가 2σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 2σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  96. 제89항에 있어서, 상기 대상체가, T181 및 T217에서 타우 인산화가 1.5σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 대상체가, (i) T181 및 T217에서 타우 인산화가 1.75σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.75σ 미만이거나, (ii) T181 및 T217에서 타우 인산화가 1.8σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.8σ 미만이거나, (iii) T181 및 T217에서 타우 인산화가 1.9σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 1.9σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  98. 제96항에 있어서, 상기 대상체가, T181 및 T217에서 타우 인산화가 2σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 2σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  99. 임상 시험에 대상체를 등록하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 총 타우를 측정하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및
    (b) 총 타우에 대한 T217 또는 T181에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 미만인 경우 대상체를 임상 시험에 등록하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42 /40 측정으로 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 총 타우, 및 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인 경우 임상 시험에 대상체를 등록하는, 단계를 포함하는 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 대상체가, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 대상체가, (i) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 미만이거나, (ii) 총 타우 T217에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우 T205에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 미만이거나, (iii) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  102. 제100항에 있어서, 상기 대상체가, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  103. 제99항에 있어서, 상기 대상체가, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  104. 제103항에 있어서, 상기 대상체가, (i) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 미만이거나, (ii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 미만이거나, (iii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  105. 제103항에 있어서, 상기 대상체가, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  106. 제99항에 있어서, 상기 대상체가, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서 타우 인산화의 비율이 1.5σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 대상체가, (i) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 미만이거나, (ii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 미만이거나, (iii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  108. 제106항에 있어서, 상기 대상체가, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율 및 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 T205에서 타우 인산화가 2σ 미만인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  109. 임상 시험에 대상체를 등록하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및
    (b) (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화가 약 1.5σ 이상인 경우 임상 시험에 대상체를 등록하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함하는 방법.
  110. 제109항에 있어서, 상기 대상체가, T217 및 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  111. 제110항에 있어서, 상기 대상체가, T217 및 T205에서 타우 인산화가 1.75σ 초과, 1.8σ 초과 또는 1.9σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  112. 제110항에 있어서, 상기 대상체가, T217 및 T205에서 타우 인산화가 2σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  113. 제109항에 있어서, 상기 대상체가, T181 및 T205에서 타우 인산화가 1.5σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 대상체가, T181 및 T205에서 타우 인산화가 1.75σ 초과, 1.8σ 초과 또는 1.9σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  115. 제113항에 있어서, 상기 대상체가, T181 및 T205에서 타우 인산화가 2σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  116. 제109항에 있어서, 상기 대상체가, T181, T205 및 T217에서 타우 인산화가 1.5σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 대상체가, T181, T205 및 T217에서 타우 인산화가 1.75σ 초과, 1.8σ 초과 또는 1.9σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  118. 제116항에 있어서, 상기 대상체가, T181, T205 및 T217에서의 타우 인산화가 2σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  119. 임상 시험에 대상체를 등록하는 방법으로서,
    (a) 대상체로부터 수득한 단리된 타우 샘플을 제공하고, 총 타우를 측정하고, (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화를 측정하는 단계; 및
    (b) 총 타우에 대한 (i) T217 및 T205, (ii) T181 및 T205, 또는 (iii) T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 비율이 약 1.5σ 이상인 경우 임상 시험에 대상체를 등록하는 단계이되, 여기서 σ는 CSF에서 PET 영상화 및/또는 Aβ42/40 측정에 의해 측정된 바와 같이 뇌 아밀로이드 플라크가 없는 대조군 집단에서 측정된 총 타우, 및 T217 및 T205, T181 및 T205, 또는 T181, T205 및 T217에서 타우 인산화의 정규 분포에 의해 정의된 표준 편차인, 단계를 포함하는 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 대상체가, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 대상체가, (i) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이며, (ii) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고, (iii) 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  122. 제120항에 있어서, 상기 대상체가, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  123. 제119항에 있어서, 상기 대상체가, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  124. 제123항에 있어서, 상기 대상체가, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이며, (ii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고, (iii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  125. 제123항에 있어서, 상기 대상체가, T181에서 타우 인산화 대 총 타우의 비율이 2σ 초과이고 T205에서 타우 인산화의 총 타우에 대한 비율이 2σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  126. 제119항에 있어서, 상기 대상체가, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.5σ 초과이고, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화 비율이 1.5σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 대상체가, (i) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이며, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.75σ 초과이고, (ii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이며, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.8σ 초과이고, (iii) 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과이며, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 1.9σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  128. 제126항에 있어서, 상기 대상체가, 총 타우에 대한 T181에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고, 총 타우에 대한 T205에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과이고, 총 타우에 대한 T217에서의 타우 인산화의 비율이 2σ 초과인 경우 임상 시험에 등록되는 것인, 방법.
  129. 제89항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 임상 시험의 치료 암(arm)에 등록되는 것인, 방법.
  130. 제129항에 있어서, 상기 임상 시험의 치료 암이, 대상체에 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  131. 제49항 내지 제89항 또는 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물이 Aβ 또는 타우 요법을 포함하는 것인, 방법.
  132. 제131항에 있어서, 상기 Aβ 또는 타우 요법이 아밀로이드 베타 표적 요법, 키나제, 키나제 억제제 또는 포스파타제인 것인, 방법.
  133. 제1항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 우세 유전성 알츠하이머 질환을 유발하는 것으로 알려진 유전자 돌연변이를 갖는 것인, 방법.
  134. 제1항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 우세 유전성 알츠하이머 질환을 유발하는 것으로 알려진 유전자 돌연변이를 갖지 않는 것인, 방법.
  135. 제1항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 타우 샘플이 친화성 정제에 의해 혈액 또는 CSF로부터 정제된 타우를 포함하는 것인, 방법.
  136. 제135항에 있어서, 상기 단리된 타우 샘플이 타우의 중간 도메인 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 리간드 및 임의로 타우의 N-말단 내의 에피토프와 특이적으로 결합하는 제2 리간드를 사용하여 친화성 정제에 의해 혈액 또는 CSF로부터 정제된 타우를 포함하는 것인, 방법.
  137. 제1항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타우 인산화가 질량 분석법에 의해 측정되는 것인, 방법.
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