BR112020021782A2 - métodos de diagnóstico e tratamento com base em fosforilação de tau específica de sítio - Google Patents

Abstract

“métodos de diagnóstico e tratamento com base em fosforilação de tau específica de sítio” a presente invenção refere-se a métodos para quantificar a fosforilação de tau em resíduos de aminoácidos específicos para prever o tempo até o início do comprometimento cognitivo leve devido à doença de alzheimer, informar o estágio da doença de alzheimer, orientar as decisões de tratamento, selecionar indivíduos para ensaios clínicos e avaliar a eficácia clínica de certas intervenções terapêuticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTO- DOS DE DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO COM BASE EM FOSFORI- LAÇÃO DE TAU ESPECÍFICA DE SÍTIO”.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório U.S. 62/666.504, depositado em 3 de maio de 2018, e do Pedido Provisório U.S. 62/666.509, depositado em 3 de maio de 2018, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência.

DIREITOS GOVERNAMENTAIS

[0002] A presente invenção foi feita com o apoio do governo sob NS065667 e NS095773 concedido pelo Instituto Nacional de Saúde. O governo tem determinados direitos sobre a invenção.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0003] Este pedido contém uma Listagem de Sequência que foi en- viada em formato ASCII via EFS-Web e é incorporada por meio deste por referência em sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 3 de maio de 2019, chama-se 623217_ST25.txt e tem 24 KB de tamanho.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] A proteína tau associada ao microtúbulo (MAPT ou tau) de- sempenha um papel essencial na morfologia e fisiologia dos neurônios. Tau tem seis isoformas diferentes da proteína de comprimento total e sofre uma série de modificações pós-tradução possíveis, incluindo ace- tilação, glicosilação e fosforilação. A fosforilação é importante para re- gular a função normal de tau na estabilização axonal e pode ocorrer em mais de 80 resíduos diferentes. No entanto, a fosforilação excessiva de tau parece aumentar a probabilidade de tau de se agregar em filamentos helicoidais emparelhados insolúveis intracelulares (PHF) e emaranha- dos neurofibrilares (NFT), que são compostos principalmente de tau hi- perfosforilada.

[0005] Emaranhados neurofibrilares intracelulares no córtex cere- bral são uma característica patológica definidora da doença de Alzhei- mer (AD) e se correlacionam com o início dos sintomas clínicos muito depois do aparecimento de placas extracelulares de amiloide-β (Aβ), que começam a se desenvolver duas décadas antes do início dos sin- tomas. Na AD, a p-tau solúvel e a tau não fosforilada são duas vezes aumentadas no líquido cefalorraquidiano (CSF). Foi proposto que essas alterações refletem os efeitos da morte neuronal (neurodegeneração), liberando passivamente tau e NFT no CSF. No entanto, em outras tauo- patias com patologia NFT significativa e neurodegeneração (por exem- plo, paralisia supranuclear progressiva, degeneração lobar frontotempo- ral-tau), os níveis de CSF de p-tau solúvel e tau total não aumentam. Essas observações sugerem que Aβ pode desencadear um processo que leva à tauopatia única de AD, uma ideia que é apoiada por modelos celulares e animais. Este conceito é ainda apoiado por um aumento na produção ativa de tau solúvel na presença de placas amiloides em seres humanos.

[0006] Embora a tau compreenda uma patologia característica de AD e possa ser medida em formas agregadas ou solúveis, lacunas im- portantes permanecem na compreensão de como as modificações pós- translacionais desta proteína neuronal crítica levam ao desenvolvimento de NFT e neurodegeneração em seres humanos. Por exemplo, a rela- ção de tau com placas β-amiloide é desconhecida. Da mesma forma, não se sabe quais alterações fisiopatológicas ocorrem na tau, se hou- ver, durante os estágios pré-clínicos e clínicos de AD. Como tal, não está claro até que ponto, se houver, tau pode ser usado para preparar os indivíduos antes do início dos sintomas associados à AD e orientar as decisões de tratamento.

[0007] Consequentemente, permanece uma necessidade na téc- nica de métodos melhorados para quantificar a fosforilação de tau.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] Em um aspecto, a presente invenção abrange um método para diagnosticar um indivíduo como tendo um risco aumentado de con- versão para comprometimento cognitivo leve (MCI) devido à doença de Alzheimer (AD). O método compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, na amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos de T181, T205 e T217 e, opcionalmente, medir a tau total; e (b) diag- nosticar o indivíduo como tendo um risco aumentado de conversão em MCI devido à AD quando o(s) nível(is) de fosforilação medido(s) se des- viam significativamente da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição Aβ42/40 em CSF. Alternativamente, ou além de, usando uma medição de fosforilação de tau em T181, T205 e/ou T217, opcio- nalmente com uma medição de tau total, uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) ou uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) e tau total, podem ser usados. Uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) pode ser uma razão entre p-T181 e p-T205, p-T217 e p-T205, ou p-T181 e p-T217. Uma razão calculada a partir dos níveis de fosforilação medi- dos e tau total pode ser uma razão entre p-T181 e tau total, p-T205 e tau total, ou p-T217 e tau total. Operações matemáticas diferentes de uma razão também podem ser usadas.

[0009] Em outro aspecto, a presente invenção abrange um método para preparar um indivíduo antes do início do comprometimento cogni- tivo leve (MCI) devido à doença de Alzheimer (AD). O método compre- ende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, na amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos de T181, T205 e T217 e, opcional- mente, medir a tau total; e (b) diagnosticar o indivíduo como sendo um certo número de anos a partir do início de MCI devido à AD quando o(s) nível(is) de fosforilação medido(s) se desviam significativamente da mé- dia em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais con- forme medido por imageamento PET e/ou medição Aβ42/40 em CSF. Alternativamente, ou além de, usando uma medição de fosforilação de tau em T181, T205 e/ou T217, opcionalmente com uma medição de tau total, uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação me- dido(s) ou uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) e tau total, podem ser usados. Uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) pode ser uma razão entre p- T181 e p-T205, p-T217 e p-T205, ou p-T181 e p-T217. Uma razão cal- culada a partir dos níveis de fosforilação medidos e tau total pode ser uma razão entre p-T181 e tau total, p-T205 e tau total, ou p-T217 e tau total. Operações matemáticas diferentes de uma razão também podem ser usadas.

[0010] Em outro aspecto, a presente invenção abrange um método para preparar um indivíduo após o início dos sintomas da doença de Alzheimer (AD). O método compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, na amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos de T181, T205 e T217 e, opcionalmente, medir a tau total; e (b) diag- nosticar o indivíduo como sendo um certo número de anos após o início de MCI devido à AD quando o(s) nível(is) de fosforilação medido(s) se desviam significativamente da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição Aβ42/40 em CSF. Alternativamente, ou além de, usando uma medição de fosforilação de tau em T181, T205 e/ou T217, opcionalmente com uma medição de tau total, uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) ou uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) e tau total, podem ser usa- dos. Uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação me- dido(s) pode ser uma razão entre p-T181 e p-T205, p-T217 e p-T205, ou p-T181 e p-T217. Uma razão calculada a partir dos níveis de fosfori- lação medidos e tau total pode ser uma razão entre p-T181 e tau total, p-T205 e tau total, ou p-T217 e tau total. Operações matemáticas dife- rentes de uma razão também podem ser usadas.

[0011] Em outro aspecto, a presente invenção abrange um método para tratar um indivíduo em necessidade do mesmo. O método compre- ende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, na amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos de T181, T205 e T217 e, opcional- mente, medir a tau total; e (b) administrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando o(s) nível(is) de fosforilação medido(s) se desviam significativamente da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou me- dição Aβ42/40 em CSF. Alternativamente, ou além de, usando uma me- dição de fosforilação de tau em T181, T205 e/ou T217, opcionalmente com uma medição de tau total, uma razão calculada a partir do(s) ní- vel(is) de fosforilação medido(s) ou uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) e tau total, podem ser usados. Uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) pode ser uma razão entre p-T181 e p-T205, p-T217 e p-T205, ou p-T181 e p- T217. Uma razão calculada a partir dos níveis de fosforilação medidos e tau total pode ser uma razão entre p-T181 e tau total, p-T205 e tau total, ou p-T217 e tau total. Operações matemáticas diferentes de uma razão também podem ser usadas.

[0012] Em outro aspecto, a presente invenção abrange um método para inscrever um indivíduo em um ensaio clínico. O método compre- ende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, na amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos de T181, T205 e T217 e, opcional- mente, medir a tau total; e (b) inscrever o indivíduo em um ensaio clínico quando o(s) nível(is) de fosforilação medido(s) se desviam significativa- mente da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição Aβ42/40 em CSF. Alternativamente, ou além de, usando uma medição de fosforilação de tau em T181, T205 e/ou T217, opcionalmente com uma medição de tau total, uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) ou uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) e tau total, podem ser usados. Uma razão cal- culada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) pode ser uma razão entre p-T181 e p-T205, p-T217 e p-T205, ou p-T181 e p-T217. Uma razão calculada a partir dos níveis de fosforilação medidos e tau total pode ser uma razão entre p-T181 e tau total, p-T205 e tau total, ou p-T217 e tau total. Operações matemáticas diferentes de uma razão também podem ser usadas.

[0013] Outros aspectos e iterações da invenção são descritos mais detalhadamente abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0014] Este arquivo de pedido contém pelo menos uma fotografia executada em cor. Cópias dessa publicação de pedido de patente com fotografias coloridas serão providas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.

[0015] FIG. 1 é um esquema da isoforma de tau humana mais longa (2N4R) e epítopos de anticorpos tau. O terminal N, domínio médio, MTBR e terminal C são identificados para esta isoforma e irão variar de forma previsível para outras isoformas tau (por exemplo, 2N3R, 1NR4, 1N3R, 0N4R e 0N3R).

[0016] FIG. 2 é um esquema que mostra o princípio do experimento de Monitoramento da Reação Paralela.

[0017] FIG. 3 mostra os dados de uma rastreio PRM da sequência tau monofosforilada em 103-126 (isoforma 0N). Foi identificado um pa- drão único de LC-MS/MS eluindo estreitamente com o peptídeo não mo- dificado 103-126 e contendo a série de fragmentos esperada para fos- forilação em T111 (a), S113 (b) ou T123 (c). Fragmentos hipotéticos de íons de cada peptídeo p-tau estão sublinhados nas sequências. A coe- luição potencial dos três peptídeos monofosforilados putativos foi de- convoluída. O fragmento iônico y15 sem fosfato é específico para o pep- tídeo fosforilado no resíduo T111 (y15 (a)) e o fragmento y8 com fosfato é específico para o peptídeo p-tau no resíduo T123 (y8 (c)). Os croma- togramas de íons extraídos correspondentes (XIC) são detectados em baixa abundância acima do limite de detecção, apoiando a identificação dos dois peptídeos tau monofosforilados correspondentes. Em con- traste, o fragmento y15 com fosfato, compartilhado por pT111 e pS113 (y15 (a+b)), e o fragmento y8 sem fosfato, compartilhado por pS113 e pT123 (y8(b+c)), são muito mais abundantes. Estas diferenças de sinal suportam a existência do peptídeo tau monofosforilado no resíduo S113 (b) como a principal espécie do padrão.

[0018] FIG. 4 mostra os dados de um rastreio PRM da sequência tau monofosforilada 68-126 (isoforma 1N) contendo seis sítios de fosfo- rilação potenciais. Três sítios de fosforilação são compartilhados por peptídeos contendo os resíduos 103-126 conforme descrito na FIG. 3 (d-f). Seis padrões LC-MS foram identificados. O fragmento Y28 carre- gando fosfato, compartilhado por pS68 (a) ou pT69 (b), é encontrado nos dois padrões LC-MS 4 e 5. Isto demonstra a existência dos dois peptídeos fosforilados, mas os padrões LC-MS correspondentes não podem ser estritamente atribuídos sem a detecção do fragmento de íon y29 para diferenciar pS68 e pT69. Fragmentos específicos correspon- dentes a pT71 (c) e pT111 (d) são encontrados nos padrões de LC-MS

6 e 1, respectivamente. Fragmentos específicos para pS113 (e) e pT123 (f) (y15 com fosfato) são encontrados no padrão 2 de LC-MS. Este pa- drão continha fragmentos de y10 com e sem fosfato, sugerindo a coe- luição desses dois peptídeos fosforilados. Uma vez que y10 sem fosfato tem o sinal principal em comparação com y10 com fosfato, o grau de pT123 é provavelmente menor do que pS113. O padrão 3 de LC-MS é atribuído a um conformador menor ou artefato de LC do peptídeo fosfo- rilado do padrão 4, conforme encontrado para o peptídeo não fosfori- lado.

[0019] FIG. 5 mostra os dados de um rastreio PRM da sequência de tau monofosforilada 45-67 (isoformas 1N e 2N). Um sinal forte de um conformador foi identificado na frente de um padrão LC-MS de peptídeo não fosforilado. Assim, foi previsto que os padrões de LC-MS corres- pondentes para peptídeos fosforilados também teriam conformadores separáveis por LC. Na verdade, a interpretação da varredura PRM levou à detecção de pT50 (b) como o principal sítio de fosforilação nesta se- quência (padrão 2). O padrão 1, com uma impressão digital de fragmen- tação semelhante, foi atribuído a um conformador de pT50. O pS46 (a), capaz de diferenciar sinais de pT50 (b), não foi detectado, sugerindo que esta fosforilação estaria ausente ou baixa e coeluída com outros peptídeos fosforilados compartilhando fragmentos não específicos se- melhantes. A coeluição de y9, y15 sem fosfato e y17 com fosfato no padrão LC-MS 3 identificou uma fosforilação no resíduo T52 (c). Os pa- drões 4/6 e 5/7 foram pareados como conformadores, respectivamente. Assim, dois peptídeos fosforilados não puderam ser separados. Os fra- gmentos encontrados nestes padrões eram consistentes com a fosfori- lação em um dos resíduos S61 (e), T63 (f) e S64 (g). As intensidades de MS/MS foram insuficientes para identificar os sítios, mas pelo menos 2 desses 3 sítios provavelmente foram fosforilados nesta sequência.

Além disso, um fragmento y9 menor sem fosfato foi encontrado no om- bro do padrão 7, o que pode ser atribuído à fosforilação menor no resí- duo S56 (d).

[0020] FIG. 6 mostra os dados de um rastreio PRM da sequência tau monofosforilada 88-126 (isoforma 2N). 6 sítios de fosforilação po- tenciais estão localizados nesta sequência e 6 padrões de LC-MS foram identificados. Os fragmentos encontrados nos padrões 1 e 2 eram con- sistentes com os peptídeos fosforilados nos resíduos T111 (d) e S113 (e), respectivamente. Nenhum fragmento específico do peptídeo fosfo- rilado no resíduo T123 (f) foi encontrado. Os padrões 4 e 6 continham um sinal baixo do fragmento y29 correspondendo à fosforilação no resí- duo T101 (b) ou T102 (c), mas nenhum fragmento específico capaz de diferenciá-los foi detectado. Os padrões 3 e 5 compartilham fragmentos encontrados nos padrões 4 e 6, mas em menor abundância, localizando o resíduo fosforilado no N-terminal do resíduo G109. Isso poderia indicar a presença de um peptídeo fosforilado adicional, provavelmente no re- síduo T95 (a) ou conformadores abundantes de peptídeos encontrados nos padrões 4 e 6.

[0021] FIG. 7 mostra uma varredura de PRM da sequência de mo- nofosforilação de tau 68-87, contendo 4 sítios de fosforilação potenciais. 3 padrões LC-MS foram detectados. Os padrões 2 e 3 foram consisten- tes com a fosforilação nos resíduos S68 (a) ou T69 (b). O padrão 1 con- tinha ambos os fragmentos compatíveis com a presença de dois peptí- deos fosforilados coeluídos em T71 (c) e T76 (d). A comparação de y14 XIC com e sem fosfato no padrão 1 indica que pT71 (c) é mais abun- dante do que pT76 (d).

[0022] FIG. 8A, FIG. 8B, FIG. 8C, FIG. 8D, FIG. 8E, FIG. 8F, FIG. 8G, FIG. 8H, FIG. 8I, FIG. 8J, FIG. 8K, e FIG. 8L mostram a detecção de sítios de fosforilação no domínio médio e no terminal C da proteína p-tau do cérebro.

[0023] FIG. 9A, FIG. 9B, FIG. 9C, FIG. 9D, FIG. 89E, e FIG. 9F mostram perfis de peptídeos fosforilados das sequências tau 195-209 (SEQ ID NO: 38) e 212-221 (SEQ ID NO: 64) são variáveis entre a fra- ção solúvel do cérebro, CSF normal e proteína tau CSF AD. Os extratos de tau solúveis no cérebro são diluídos conforme indicado para corres- ponder aproximadamente ao nível de tau no CSF correspondente. Pep- tídeos fosforilados em 195-209: no lisado cerebral, um sinal correspon- dente à coeluição de dois peptídeos fosforilados pS199 e pS202 é ob- servado. No CSF, dois sinais adicionais são observados. A análise de fragmentos permitiu a atribuição do sinal à esquerda ao pT205. No CSF AD, os dois sinais são aumentados permitindo a identificação de frag- mentos específicos atribuindo o sinal à direita ao pS208. Peptídeos fos- forilados em 212-221: dois sinais com intensidades de MS semelhantes correspondentes a pT217 e pS214 são identificados no lisado cerebral. No CSF, o sinal correspondente a pT217 é o mais intenso, enquanto o pS214 está próximo do limite de detecção, indicando uma mudança dra- mática em sua abundância relativa em comparação com o extrato cere- bral. No CSF AD, o pT217 está significativamente aumentado devido à hiperfosforilação específica.

[0024] FIG. 10A, FIG. 10B, FIG. 10C, FIG. 10D, FIG. 10E, FIG. 10F, FIG. 10G, FIG. 10H, e FIG. 10I mostram os peptídeos fosforilados pT153, pT175 e pT231 identificados em CSF. Os sinais de padrão in- terno AQUA são mostrados para pT175 e pT231. O padrão de fragmen- tação de pT153 é semelhante ao não modificado.

[0025] FIG. 11 mostra que a abundância de fosforilação em T111 é maior no CSF do que no cérebro em relação à fosforilação de S113. No cérebro e no CSF, o fragmento y18 de MS/MS comum a todos os pep- tídeos monofosforilados na sequência de tau 103-126 é detectado. A abundância relativa do fragmento y15 de pS113 (b) é significativamente menor no CSF em comparação com o extrato do cérebro. Inversamente,

o fragmento y15 de pT111 (a) é abundante no CSF e não é detectável no extrato solúvel do cérebro diluído para corresponder ao nível de tau de CSF AD.

[0026] FIG. 12 mostra a abundância relativa de fosforilação de tau que depende do extrato biológico e varia ao longo da sequência da pro- teína. Comparação da abundância de fosforilação de tau medida por MS em lisado de cérebro normal, CSF normal e CSF AD extraído por cap- tura imunológica usando HJ8.5 e Tau1. A área do círculo é proporcional à abundância de fosforilação do sítio. As cores vermelha e verde indi- cam aumento ou diminuição, respectivamente, em comparação ao perfil solúvel do cérebro tomado como referência (azul). Tau é truncada no terminal C no CSF, o que explica a ausência de detecção do agrupa- mento do terminal C de sítios de fosforilação. A fosforilação em T205 e S208 é específica para CSF (X vermelho em Brain Soluble - topo).

[0027] FIG. 13 mostra os sítios de fosforilação de tau são diferenci- almente modificados no cérebro, CSF normal e CSF AD. As medições são as abundâncias relativas do sinal fosforilado em comparação com o sítio não fosforilado correspondente (HJ8.5 + Tau1 IP-MS). Os resul- tados do cérebro são obtidos a partir de lisados diluídos de fatores de 500x a 8000x para corresponder ao nível de tau no CSF. As fosforila- ções em T205 e S208 são indetectáveis no tecido cerebral. A fosforila- ção em T111 é indetectável em lisado diluído 500x, mas foi detectada em lisado diluído 10x com uma abundância correspondente de 0,02%. Legenda: ** indica significância no nível p = 0,01 e * indica significância no nível p = 0,05.

[0028] FIG. 14A, FIG. 14B, FIG. 14C e FIG. 14D mostram o efeito do anticorpo na medição da razão de fosforilação por IP-MS. Pool de lisado de cérebro, pools de não AD (n = 1) e CSF AD (n = 1) foram imunoprecipitados em paralelo com anticorpos contra o domínio de pro- jeção do terminal N de tau (Tau13 ou HJ8.5) ou domínio médio (HJ8.7,

Tau1 ou Tau5). Os gráficos de radar das razões de fosforilação medidas nos principais sítios do CSF (escala log10 ) são mostrados no lisado de cérebro (FIG. 14A, painel esquerdo), CSF não AD (FIG. 14A, painel do meio) e CSF AD (FIG. 14A, painel direito) (FIG. 14A) As medições da razão de fosforilação de tau em pT181/T181, pT231/T231 são con- sistentes entre os anticorpos testados. PS199/S199 é diminuído usando Tau1 ou Tau1 + HJ8.5 em comparação com outros anticorpos. (FIG. 14B) A baixa recuperação de pS199 por Tau1 ou Tau1 + HJ8.5 IP su- bestima as medições da razão pS199/S199 em comparação com outros anticorpos testados. Os anticorpos Tau13, HJ8.5 e HJ8.7 não indicam alterações significativas na razão de fosforilação de pS199 entre o cé- rebro e o CSF. Em comparação com o cérebro, a hipofosforilação de pS202/S202 CSF (FIG. 14C) e a hiperfosforilação de pT217/pT217 (FIG. 14D) são evidenciadas independentemente do anticorpo usado para IP- MS. A legenda da FIG. 14B-D é a mesma e mostrada na FIG. 14C - Cérebro (azul), CSF não AD (verde) e CSF AD (vermelho).

[0029] FIG. 15 mostra que a incubação de CSF não afeta a medição da taxa de fosforilação em tau.

[0030] FIG. 16A, FIG. 16B, FIG. 16C, FIG. 16D, FIG. 16E, FIG. 16F, e FIG. 16G mostram que as placas amiloides estão fortemente correla- cionadas com a hiperfosforilação de tau, mas diferem pelo sítio de fos- forilação. FIG. 16A As características operacionais do receptor para tau total (linha azul, AUC = 0,62) e taxas de fosforilação específicas do sítio na classificação de participantes como tendo patologia Aß com base em Aβ PiB-PET (corte SUVR de 1,25), p-T217 (linha amarela) demonstra um associação quase perfeita com a patologia Aβ (AUC = 0,97), seguida por p-T181 (AUC = 0,89) e p-T205 (AUC = 0,74). As razões de fosfori- lação padronizadas (pontuação z) são mostradas para p-T217 (FIG. 16B), p-T181, (FIG. 16C), p-S202 (FIG. 16D), p-T205 (FIG. 16E) e tau total (FIG. 16F) os níveis de Aβ PiB-PET quartis (n = 45, 47, 28, 30)

para portadores de mutação destacam as diferenças específicas do sítio na fosforilação com níveis crescentes de Aβ PiB-PET: p-T217 e p-T181 aumentam mais com o aumento inicial na quantidade de Aβ PiB-PET e lento com os níveis mais altos de Aß PiB-PET, enquanto p-T205 e tau total demonstram um aumento contínuo. Para p-S202, houve uma dimi- nuição significativa na fosforilação nos quartis de Aβ PiB-PET mais altos em relação ao mais baixo; *** - valor de p &lt;<0,001, ** - valor de p <0,01 com base no teste de duas amostras de Wilcoxon; a linha do meio representa a mediana, e o entalhe superior e inferior = mediana +/- 1,58 * faixa interquartil/raiz quadrada (n-observações), a apara superior e in- ferior = maior observação maior/menor ou igual à dobradiça superior/in- ferior + 1,58 * IQR. FIG. 16G Correlações bivariadas entre Aβ PiB-PET SUVR cortical e subcortical e a fosforilação específica do sítio para por- tadores de mutação assintomáticos (n = 139). As cores representam a correlação com correlações positivas (amarelo-vermelho) e correlações negativas (azul); todas as correlações representam valores estatistica- mente significativos que sobrevivem a uma taxa de descoberta falsa (p <0,05) e são organizadas pela força das correlações de cima para baixo.

[0031] FIG. 17A, FIG. 17B, FIG. 17C, FIG. 17D, FIG. 17E, e FIG. 17F mostram mudanças longitudinais de diferentes sítios de tau fosfo- rilada, são específicos do estágio da doença e mudam em direções opostas conforme a AD progride. Mudanças longitudinais individuais, transformadas em z na razão de fosforilação de (FIG. 17A) p-T217, (FIG. 17B) p-T181 (FIG. 17C) tau total, (FIG. 17D) p-T205, e (FIG. 17E) p-S202 para portadores de mutação (preto = portadores de mutação as- sintomáticos, (n = 152), vermelho = portadores de mutação sintomática (77)) e não portadores (azul, (n = 141))ao longo dos anos estimados para início dos sintomas (EYO). A linha tracejada vertical é o ponto de início dos sintomas esperado, a linha verde representa o tempo esti- mado do modelo em que a taxa de mudança para cada isoforma p-tau se torna maior para portadores de mutação em comparação com não portadores. (FIG. 17F) Modelo estimado, taxas longitudinais de mu- dança para cada sítio de fosforilação onde padronizado para as taxas de não portadores e representado sobre EYO juntamente com PET ami- loide (vermelho) e declínio cognitivo (amarelo); os círculos sólidos re- presentam o ponto em que a taxa de mudança para cada variável pri- meiro se torna diferente para portadores de mutação em comparação com não portadores. Isso destaca o padrão de mudança para as isofor- mas p-tau ao longo do espectro de AD e a estreita associação entre o crescimento da placa amiloide e o aumento em p-T217 com as placas começando a aumentar em -21 EYO e a hiperfosforilação de p-T217 (preto) começando em -21 EYO e o declínio na taxa de fosforilação des- ses dois sítios com um declínio na cognição (linha amarela). Em con- traste, p-T205 (roxo) continua aumentando ao longo da progressão da doença e os níveis de tau total (cinza) aumentam em uma taxa aumen- tada perto do momento do início dos sintomas.

[0032] FIG. 18A e FIG. 18B mostra que os sítios de tau fosforilada estão relacionados de forma diferente ao hipometabolismo e atrofia do cérebro. FIG. 18A. Correlações bivariadas entre atrofia cortical e sub- cortical e taxas de fosforilação específicas do sítio em portadores de mutação assintomáticos (n = 152) demonstram aumentos na fosforila- ção de p-T205 e p-T217, com associações menores para p-T181. Os níveis totais de tau estão associados a uma maior atrofia em várias re- giões corticais e subcorticais. FIG. 18B. As correlações bivariadas entre o metabolismo cerebral cortical e subcortical medido por FDG-PET e as razões de fosforilação específicas do sítio em portadores de mutação assintomáticos (n = 143) demonstram que um aumento na fosforilação de p-T205 está associado a uma diminuição na maioria das regiões cor- ticais e subcorticais, mas não a outros sítios p-tau ou tau.

[0033] FIG. 19A, FIG. 19B, FIG. 19C, e FIG. 19D mostra que a di- minuição da fosforilação em p-T217, p-T181 e p-T205 está associada com demência e declínio cognitivo. As taxas anuais estimadas individu- ais de mudança de isoformas p-tau e tau total (eixo y) para portadores de mutação foram correlacionadas com a mudança anual na função cognitiva global; as linhas representam a regressão linear simples com a área sombreada representando o intervalo de confiança de 95%. Cada ponto representa uma correlação de nível individual entre as medidas. A regressão linear foi ajustada para aqueles sem demência (preto, n = 47) e demência (vermelho, n = 25). Um declínio nas taxas de fosforila- ção p-T217 (FIG. 19A), r = 0,43 (p = 0,02), p-T181 (FIG. 19B), r = 0,72 (p <,001) e p-T205 (FIG. 19C), r = 0,41 (p = 0,03) foi associado ao de- clínio cognitivo após o início dos sintomas (vermelho). Para tau total, houve uma tendência sugerindo uma correlação inversa com a cognição (FIG. 19D), mas não foi significativa.

[0034] FIG. 20 mostra que a tau PET aumenta próximo ao início dos sintomas em portadores de mutação DIAD. A razão de valor unitário padronizado cortical médio (SUVR), eixo y, para portadores de mutação (vermelho, n = 12) e não portadores (azul, n = 9) ao longo dos anos estimados para o início dos sintomas (EYO), eixo x, para os participan- tes com avaliação longitudinal do CSF antes do momento do tau-PET. O gráfico mostra que, para portadores de mutação, há pouca elevação no tau-PET até o ponto estimado do início dos sintomas (EYO = 0). Esta figura mostra que a patologia do emaranhado neurofibrilar (NFT) detec- tada por AV-1451 ocorre muito mais tarde do que o aumento em vários sítios de fosfotau solúveis, sugerindo que esses marcadores solúveis de tau são provavelmente um marcador de patologia de NFT, mas podem predispor ao desenvolvimento dos depósitos de tau hiperfosforilados e insolúveis, característicos da patologia da AD.

[0035] FIG. 21A, FIG. 21B, FIG. 21C, FIG. 21D, e FIG. 21E mostram que a mudança longitudinal nos sítios de fosforilação de tau e tau estão diferencialmente relacionados à tau neurofibrilar (tau-PET) na AD her- dada de forma dominante. Taxas individuais estimadas de mudança de fosforilação e tau total (eixo y) que conduzem ao momento da varredura tau-PET (eixo x). A linha vertical é um SUVR de 1,22 e representa uma estimativa conservadora do ponto em que o NFT tau-PET (um composto de várias regiões corticais e límbicas) é considerado elevado em com- paração com os não portadores. Os gráficos sugerem que aumentos em tau solúvel e p-T205 estão associados a níveis mais elevados de tau agregada, enquanto a taxa de fosforilação em p-T217 e p-T181 diminui conforme os níveis de tau agregada aumentam. Essas descobertas su- gerem que há diferenças entre níveis crescentes de tau e fosforilação em sítios diferentes e podem indicar que, em alguns casos, p-tau solúvel é sequestrado conforme a carga de agregados hiperfosforilados au- menta com a disseminação da patologia tau. Eles também sugerem que, com o aumento na tau agregada, há um aumento nos níveis de tau solúvel que pode representar uma liberação passiva ou ativa com maior carga de patologia da tau agregada.

[0036] FIG. 22 é uma ilustração que mostra a evolução da patologia tau por meio de fases distintas na doença de Alzheimer. Medindo quatro espécies diferentes de tau solúvel e tau insolúvel em um grupo de par- ticipantes com mutações determinísticas da doença de Alzheimer, foi mostrado ao longo de 35 anos (eixo x) que mudanças relacionadas à tau se desdobram (eixo y) e diferem com base no estágio da doença e outros biomarcadores mensuráveis. A. Começando com o desenvolvi- mento da fosforilação da patologia amiloide fibrilar na posição 217 (roxo) e 181 (azul) começa a aumentar. B. Com o aumento da disfunção neu- ronal (alterações metabólicas baseadas), a fosforilação na posição 205 (verde) começa a aumentar junto com a tau solúvel (laranja). C. Por úl- timo, com o início da neurodegeneração (com base na atrofia do cérebro e declínio cognitivo), os emaranhados de tau PET (vermelho) começam a se desenvolver enquanto a fosforilação de 217 e 181 começa a dimi- nuir. Juntos, isso destaca os padrões dinâmicos e divergentes de tau solúvel e agregada ao longo do curso da doença e a estreita relação com a patologia amiloide.

[0037] FIG. 23A, FIG. 23B, e FIG. 23C mostram a quantificação de isoformas de tau fosforiladas no CSF. Soma dos cromatogramas de íons extraídos da análise de monitoramento da reação paralela (PRM) de peptídeos fosforilados de tau e os peptídeos não modificados corres- pondentes no CSF. FIG. 23A, monitoramento de T181 usando um sis- tema microLC. FIG. 23B, S199, S202, T205 (coeluído em sinal enqua- drado) e monitoramento de T217 usando um sistema nanoLC. Sinais endógenos (linha azul completa), peptídeos marcados com 15N (linha pontilhada vermelha), peptídeos AQUA (linha pontilhada verde). FIG. 23C mostra transições PRM específicas, de acordo com a nomenclatura de Biemann para fragmentação de peptídeo, que permitiu a identifica- ção dos três peptídeos monofosforilados coeluídos carregando pS199, pS202 ou pT205. Cps = Contagem por segundo.

[0038] FIG. 24A, FIG. 24B, FIG. 24C, FIG. 24D e FIG. 24E mostra, que a fosforilação de tau no CSF em T217 está associada ao estado de amiloidose. FIG. 24A: fosforilação de T217 aumenta significativamente em participantes com amiloidose (razão PiB-PET e CSF Aβ42/40 posi- tiva) em comparação com controles amiloide-negativos com nenhum ou leve declínio cognitivo. FIG. 24B: Curvas ROC para o diagnóstico de amiloide-positivo de participantes amiloide-negativo usando a taxa de fosforilação de T217, T181 por MS e T181 por ELISA. FIG. 24C: A com- paração da razão pT217/T217 demonstra a fosforilação específica em T217 em participantes com amiloidose. FIG. 24D-E: Comparação da fosforilação de T217 com alterações de Aβ42/40 no CSF medidas por MS e com a deposição de placa amiloide medida por PiB-PET. FIG.

24D: A extensão da hiperfosforilação T217 não está correlacionada com a diminuição de Aβ42 no CSF em relação a Aβ40. Os cinco casos con- flitantes (triângulos laranja, positivos para PiB-PET e hiperfosforilação T217, mas negativos para CSF Aβ), estavam todos ligeiramente acima do limiar de 0,12 escolhido para definir o estado amiloide, sugerindo que eles podem resultar de sensibilidade insuficiente do ensaio de CSF ami- loide. FIG. 24E: O carregamento de PiB-PET (média cortical total de FBP) está correlacionado com o estado de fosforilação T217 em partici- pantes amiloide-positivos. O valor de corte que diferencia amiloide po- sitivo de amiloide negativo por PiB é 0,18.

[0039] FIG. 25 mostra que a fosforilação de tau no CSF em T217 é independente do estado cognitivo e é significativamente modificada na AD pré-clínica. Painel esquerdo: Não existe correlação entre a fosforila- ção de T217 e o perfil cognitivo medido pela soma das caixas de classi- ficação de demência clínica (CDR-SB). Painel direito: Entre os partici- pantes sem declínio cognitivo (CDR-SB = 0), o T217 já está significati- vamente hiperfosforilado no grupo amiloide-positivo.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0040] A agregação da proteína tau em emaranhados neurofibrila- res no sistema nervoso central contribui para a etiologia de certas do- enças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD). Em- bora o mecanismo de desestabilização da tau ainda não seja totalmente compreendido, descobriu-se que a proteína tau está hiperfosforilada em agregados de tau. Os requerentes descobriram que certos métodos para quantificar a fosforilação de tau em resíduos de aminoácidos es- pecíficos podem ser usados para rastrear o processo de AD através de seus estágios pré-clínicos assintomáticos a estágios sintomáticos. FIG. 22 ilustra o padrão dinâmico de fosforilação de tau mensurável em T181, T205 e T217 criado pelo método do requerente em relação aos anos desde o início de MCI devido a AD e ao desenvolvimento de certas al- terações fisiopatológicas. A presente invenção abrange o uso dos mé- todos para quantificar a fosforilação de tau em resíduos de aminoácidos específicos para prever o tempo até o início do comprometimento cog- nitivo leve devido à doença de Alzheimer, orientar as decisões de trata- mento, selecionar indivíduos para ensaios clínicos e avaliar a eficácia clínica de certas intervenções terapêuticas. Outros aspectos e iterações da invenção são descritos mais detalhadamente abaixo. I. Definições

[0041] Para que a presente invenção possa ser mais facilmente en- tendida, certos termos são primeiro definidos. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste docu- mento têm o mesmo significado como comumente entendido por al- guém versado na técnica ao qual as modalidades da invenção se refe- rem. Muitos métodos e materiais semelhantes, modificados ou equiva- lentes aos descritos neste documento podem ser usados na prática das modalidades da presente invenção sem experimentação indevida, os materiais e métodos preferidos são descritos neste documento. Ao des- crever e reivindicar as modalidades da presente invenção, a seguinte terminologia será usada de acordo com as definições estabelecidas abaixo.

[0042] O termo "cerca de", conforme usado neste documento, re- fere-se à variação da quantidade numérica que pode ocorrer, por exem- plo, por meio de técnicas e equipamentos de medição típicos, com res- peito a qualquer variável quantificável, incluindo, mas não se limitando a, massa, volume, tempo, distância e quantidade. Além disso, dados os procedimentos de manuseio de sólidos e líquidos usados no mundo real, há certo erro inadvertido e variação que é provável por meio de diferenças na fabricação, origem ou pureza dos ingredientes usados para fazer as composições ou realizar os métodos e semelhantes. O termo "cerca de" também abrange essas variações, que podem ser de até ± 5%, mas também podem ser de ± 4%, 3%, 2%, 1%, etc. Modifica- das ou não pelo termo "cerca de", as reivindicações incluem equivalen- tes às quantidades.

[0043] Um anticorpo, como utilizado neste documento, pode ser um anticorpo completo conforme entendido na técnica, isto é, consistindo em duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, ou pode ser qualquer molécula semelhante a um anticorpo que tem uma região de ligação ao antígeno e inclui, mas é não limitado a fragmentos de anticorpos, tais como Fab', Fab, F(ab')2, anticorpos de domínio único, Fv e Fv de cadeia simples. O termo anticorpo também se refere a um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico e um anticorpo hu- manizado. As técnicas de preparação e usando vários construtos base- ados nos anticorpos e fragmentos são bem conhecidas na técnica. Os meios para preparar e caracterizar anticorpos também são bem conhe- cidos na técnica (ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; aqui incorporado por referência na sua totalidade).

[0044] Com utilizado neste documento, o termo "aptâmero" refere- se a um polinucleotídeo, geralmente um RNA ou DNA que tem uma ati- vidade biológica útil em termos de atividade bioquímica, reconheci- mento molecular ou atributos de ligação. Normalmente, um aptâmero tem uma atividade molecular, como binging para uma molécula alvo em um epítopo (região) específico. É geralmente aceito que um aptâmero, que é específico na sua ligação a um polipeptídeo, pode ser sintetizado e/ou identificado por métodos de evolução in vitro. Os meios para pre- parar e caracterizar aptâmeros, incluindo por métodos de evolução in vitro, são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, U.S. 7.939.313, aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[0045] O termo "Aβ" refere-se a peptídeos derivados de uma região no terminal carbóxi de uma proteína maior chamada proteína precursora de amiloide (APP). O gene que codifica APP está localizado no cromos- somo 21. Existem muitas formas de Aβ que podem ter efeitos tóxicos: Os peptídeos Aβ têm tipicamente sequências de 37-43 aminoácidos de comprimento, embora possam ter truncamentos e modificações alte- rando seu tamanho geral. Eles podem ser encontrados em comparti- mentos solúveis e insolúveis, em formas monoméricas, oligoméricas e agregadas, intracelularmente ou extracelularmente, e podem ser com- plexados com outras proteínas ou moléculas. Os efeitos adversos ou tóxicos de Aβ podem ser atribuídos a qualquer uma ou todas as formas mencionadas acima, bem como a outras não descritas especificamente. Por exemplo, duas dessas isoformas Aβ incluem Aβ40 e Aβ42; com a isoforma Aβ42 sendo particularmente fibrilogênica ou insolúvel e asso- ciada a estados de doença. O termo "Aβ" normalmente se refere a uma pluralidade de espécies Aβ sem discriminação entre as espécies Aβ in- dividuais. As espécies específicas de Aβ são identificadas pelo tamanho do peptídeo, por exemplo, Aβ42, Aβ40, Aβ38 etc.

[0046] Como usado neste documento, o termo "valor de Aβ42/Aβ40" significa a razão da concentração de Aβ42 em uma amos- tra obtida de um indivíduo em comparação com a concentração de Aβ40 na mesma amostra.

[0047] A “amiloidose Aβ” é clinicamente definida como evidência de deposição de Aβ no cérebro. Um indivíduo que é clinicamente determi- nado como tendo amiloidose Aβ é referido neste documento como "ami- loide positivo", enquanto um indivíduo que é clinicamente determinado como não tendo amiloidose Aβ é referido neste documento como "ami- loide negativo". Provavelmente, Aβamiloidose existe antes de ser de- tectada pelas técnicas atuais. No entanto, existem indicadores aceitos de amiloidose Aβ na técnica. No momento desta descrição, a amiloidose Aβ é tipicamente identificada por imagem de amiloide (por exemplo, PiB

PET, fluorbetapir ou outros métodos de imageamento conhecidos na técnica) ou por líquido cefalorraquidiano (CSF) Aβ42 diminuído ou uma razão Aβ42/40 de CSF diminuída. O imageamento [11C]PIB-PET com pontuação de potencial de ligação cortical médio (MCBP) > 0,18 é um indicador de Aβamiloidose, assim como a concentração de Aβ42 no líquido cefalorraquidiano (CSF) de cerca de 1 ng/ml por imunoprecipita- ção e espectrometria de massa (IP/MS)). Valores como estes, ou outros conhecidos na técnica, podem ser usados sozinhos ou em combinação para confirmar clinicamente aamiloidose Aβ. Ver, por exemplo, Klunk W E et al. Ann Neurol 55(3) 2004, Fagan A M et al. Ann Neurol, 2006, 59(3), Patterson et. al, Annals of Neurology, 2015, 78(3): 439-453, or Johnson et al., J. Nuc. Med., 2013, 54 (7): 1011-1013, cada um aqui incorporado por referência em sua totalidade. Os indivíduos com amiloi- dose Aβ podem ou não ser sintomáticos, e os indivíduos sintomáticos podem ou não satisfazer os critérios clínicos para uma doença associ- ada à amiloidose Aβ. Exemplos não limitativos de sintomas associados à amiloidose Aβ podem incluir função cognitiva prejudicada, comporta- mento alterado, função de linguagem anormal, desregulação emocional, convulsões, demência e estrutura ou função do sistema nervoso preju- dicada. As doenças associadas à amiloidose Aβ incluem, mas não estão limitadas a, doença de Alzheimer (AD), angiopatia amiloide cerebral, de- mência de corpos de Lewy e miosite de corpos de inclusão. Os indiví- duos com amiloidose Aβ têm um risco aumentado de desenvolver uma doença associada à amiloidose Aβ.

[0048] Um "sinal clínico de amiloidose Aβ" refere-se a uma medida de deposição de Aβ conhecida na técnica. Os sinais clínicos de amiloi- dose Aβ podem incluir, mas não estão limitados a, deposição de Aβ identificada por imageamento de amiloide (por exemplo, PiB PET, fluo- rbetapir ou outros métodos de imageamento conhecidos na técnica) ou por redução do líquido cefalorraquidiano (CSF) Aβ42 ou razão Aβ42/40.

Ver, por exemplo, Klunk WE et al. Ann Neurol 55(3) 2004, e Fagan AM et al. Ann Neurol 59 (3) 2006, cada uma aqui incorporada por referência em sua totalidade. Os sinais clínicos de amiloidose Aβ também podem incluir medições do metabolismo de Aβ, em particular medições do me- tabolismo de Aβ42 sozinho ou em comparação com medições do meta- bolismo de outras variantes de Aβ (por exemplo, Aβ37, Aβ38, Aβ39, Aβ40 e/ou Aβ total), conforme descrito nas Patentes U.S. 14/366.831, 14/523.148 e 14/747.453, cada uma aqui incorporada por referência em sua totalidade. Métodos adicionais são descritos em Albert et al. Alzhei- mer’s & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 170-179; McKhann et al., Alzheimer’s & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 263-269; e Sperling et al. Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 280-292, cada uma aqui incorporada por re- ferência na sua totalidade. É importante ressaltar que um indivíduo com sinais clínicos de amiloidose Aβ pode ou não ter sintomas associados à deposição de Aβ. Ainda assim, os indivíduos com sinais clínicos de ami- loidose Aβ têm um risco aumentado de desenvolver uma doença asso- ciada à amiloidose Aβ.

[0049] Um "candidato para imageamento amiloide" refere-se a um indivíduo que foi identificado por um clínico como um indivíduo para o qual imageamento amiloide pode ser clinicamente justificado. Como um exemplo não limitativo, um candidato para imageamento de amiloide pode ser um indivíduo com um ou mais sinais clínicos de amiloidose Aβ, um ou mais sintomas associados à placa Aβ, em um ou mais sintomas associados a CAA, ou combinações dos mesmos. Um médico pode re- comendar imageamento de amiloide para tal indivíduo para direcionar seu cuidado clínico. Como outro exemplo não limitativo, um candidato ao imageamento de amiloide pode ser um participante potencial em um ensaio clínico para uma doença associada à amiloidose Aβ (um indiví- duo de controle ou um indivíduo de teste).

[0050] Um “sintoma associado à placa Aβ” ou um “sintoma associ- ado a CAA” refere-se a qualquer sintoma causado por ou associado à formação de placas amiloides ou CAA, respectivamente, sendo com- posto de agregados fibrilares regularmente ordenados chamados fibri- las amiloides.

Os exemplos de sintomas associados à placa Aβ podem incluir, mas não estão limitados a, degeneração neuronal, função cog- nitiva prejudicada, memória prejudicada, comportamento alterado, des- regulação emocional, convulsões, estrutura ou função do sistema ner- voso prejudicada e um risco aumentado de desenvolvimento ou agrava- mento da doença de Alzheimer ou CAA.

A degeneração neuronal pode incluir uma mudança na estrutura de um neurônio (incluindo mudanças moleculares, como o acúmulo intracelular de proteínas tóxicas, agrega- dos de proteínas, etc. e mudanças no nível macro, como mudança na forma ou comprimento dos axônios ou dendritos, mudança na composi- ção da bainha de mielina, perda da bainha de mielina, etc.), uma mu- dança na função de um neurônio, uma perda da função de um neurônio, morte de um neurônio ou qualquer combinação dos mesmos.

A função cognitiva prejudicada pode incluir, mas não se limita a, dificuldades com memória, atenção, concentração, linguagem, pensamento abstrato, cri- atividade, função executiva, planejamento e organização.

O comporta- mento alterado pode incluir, mas não está limitado a, agressão física ou verbal, impulsividade, diminuição da inibição, apatia, diminuição da ini- ciação, mudanças na personalidade, abuso de álcool, tabaco ou drogas e outros comportamentos relacionados ao vício.

A desregulação emoci- onal pode incluir, mas não está limitada a, depressão, ansiedade, ma- nia, irritabilidade e incontinência emocional.

As convulsões podem in- cluir, mas não estão limitadas a convulsões tônico-clônicas generaliza- das, convulsões parciais complexas e convulsões psicogênicas não epi- lépticas.

Estrutura ou função do sistema nervoso prejudicada pode in- cluir, mas não está limitada a, hidrocefalia, parkinsonismo, distúrbios do sono, psicose, deficiência de equilíbrio e coordenação. Isso pode incluir deficiências motoras, como monoparesia, hemiparesia, tetraparesia, ataxia, balismo e tremor. Isso também pode incluir perda ou disfunção sensorial, incluindo sensação olfatória, tátil, gustativa, visual e auditiva. Além disso, isso pode incluir deficiências do sistema nervoso autônomo, como disfunção intestinal e da bexiga, disfunção sexual, pressão san- guínea e desregulação da temperatura. Finalmente, isso pode incluir deficiências hormonais atribuíveis à disfunção do hipotálamo e da glân- dula pituitária, como deficiências e desregulação do hormônio do cres- cimento, hormônio estimulador da tireoide, hormônio lutenizante, hor- mônio folículo estimulante, hormônio liberador de gonadotrofina, prolac- tina e vários outros hormônios e moduladores.

[0051] Como utilizado neste documento, o termo "indivíduo" se re- fere a um mamífero, de preferência um humano. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a, humanos, primatas, gado, roedores e ani- mais de estimação. Um indivíduo pode estar esperando por cuidados médicos ou tratamento, pode estar sob cuidados médicos ou trata- mento, ou pode ter recebido cuidados médicos ou tratamento.

[0052] Como utilizado neste documento, o termo "grupo de controle saudável", "grupo normal" ou uma amostra de um indivíduo "saudável" significa um indivíduo, ou indivíduos do grupo, que é/são diagnosticados por um médico como não sofrendo de amiloidose Aβ, ou um doença clínica associada à amiloidose Aβ (incluindo, mas não se limitando à doença de Alzheimer) com base em resultados de testes qualitativos ou quantitativos. Um indivíduo “normal” geralmente tem aproximadamente a mesma idade que o indivíduo a ser avaliado, incluindo, mas não se limitando, indivíduos da mesma idade e indivíduos dentro de uma faixa de 5 a 10 anos.

[0053] Como usado neste documento, o termo "amostra de sangue" refere-se a uma amostra biológica derivada de sangue, de preferência sangue periférico (ou circulante). A amostra de sangue pode ser sangue total, plasma ou soro, embora o plasma seja tipicamente preferido.

[0054] O termo "isoforma", como usado neste documento, refere-se a qualquer uma das várias formas diferentes das mesmas variantes de proteína, surgindo devido à emenda alternativa do mRNA que codifica a proteína, modificação pós-tradução da proteína, processamento pro- teolítico da proteína, variações genéticas e recombinação somática. Os termos “isoforma” e “variante” são usados indistintamente.

[0055] Salvo indicação em contrário neste documento, o termo "pro- teína tau" ou "tau" abrange todas as isoformas de tau, sejam de compri- mento total, truncadas ou modificadas pós-tradução. Em muitos ani- mais, incluindo, mas não se limitando a humanos, primatas não huma- nos, roedores, peixes, gado, rãs, cabras e galinhas, a tau é codificada pelo gene MAPT. Em seres humanos, existem seis isoformas de tau que são geradas por emenda alternativa dos éxons 2, 3 e 10 do MAPT. Es- sas isoformas variam em comprimento de 352 a 441 aminoácidos. Os éxons 2 e 3 codificam insertos de 29 aminoácidos cada no terminal N (denominado N), e as isoformas de tau humana de comprimento total podem ter ambas os insertos (2N), 1 um inserto (1 N) ou nenhum inserto. Todas as isoformas de tau humana de comprimento total também têm três repetições do domínio de ligação do microtúbulo (denominado R). A inclusão do éxon 10 no terminal C leva à inclusão de um quarto domí- nio de ligação de microtúbulo codificado pelo éxon 10. Portanto, isofor- mas de tau humana de comprimento total podem ser constituídas por quatro repetições do domínio de ligação de microtúbulo (éxon 10 inclu- ído) ou três repetições do domínio de ligação de microtúbulo (éxon 10 excluído). A tau humana pode ou não ser modificada pós-tradução. Por exemplo, é conhecido na técnica que a tau pode ser fosforilada, ubiqui- nada, glicosilada e glicosada. Consequentemente, o termo "tau hu- mana" abrange as isoformas (2N, 3R), (2N, 4R), (1 N, 3R), (1 N, 4R),

(0N, 3R) e (0N, 4R), isoformas que são espécies truncadas no terminal N e/ou C das mesmas, e todas as isoformas modificadas pós-tradução. A emenda alterativa do gene que codifica tau ocorre de forma seme- lhante em outros animais. Em animais onde o gene não é identificado como MAPT, um homólogo pode ser identificado por métodos bem co- nhecidos na técnica.

[0056] Uma doença associada à deposição de tau no cérebro pode ser referida como "tauopatia". As tauopatias conhecidas na técnica in- cluem, mas não estão limitadas a, paralisia supranuclear progressiva, demência pugilística, encefalopatia traumática crônica, demência fron- totemporal e parkinsonismo ligado ao cromossomo 17, doença de Lytico-Bodig, complexo Parkinson-demência de Guam, demência com predominância de emaranhado, ganglioglioma e gangliocitoma, menin- gioangiomatose, panencefalite esclerosante subaguda, encefalopatia por chumbo, esclerose tuberosa, doença de Hallervorden-Spatz, lipo- fuscinose, doença de Pick, degeneração corticobasal, doença argirofí- lica dos grãos, doença de progressão temporal frontal, doença de tem- porização frontotemporal (AGD).

[0057] "Desvio significativo da média" refere-se a valores que são pelo menos 1 desvio padrão, de preferência pelo menos 1,3 desvios padrão, mais preferencialmente pelo menos 1,5 desvios padrão ou ainda mais preferencialmente pelo menos 2 desvios padrão, acima ou abaixo da média.

[0058] A frase "terapias Aβ e tau" coletivamente refere-se a qual- quer agente de imageamento ou agente terapêutico contemplado para, ou usado com, indivíduos em risco de desenvolver amiloidose Aβ ou AD, indivíduos diagnosticados como tendo amiloidose Aβ, indivíduos di- agnosticados como tendo uma tauopatia, ou indivíduos diagnosticados como tendo AD.

II. Medição de tau total e fosforilação de tau em uma amostra iso- lada de tau

[0059] Os métodos da presente invenção compreendem fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir a fosforila- ção de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos e, opcionalmente, a tau total. (a) amostra de tau isolada

[0060] Uma amostra de tau isolada, como usado neste documento, refere-se a uma composição compreendendo tau, em que a tau foi pu- rificada a partir de sangue ou líquido cefalorraquidiano (CSF) obtido de um indivíduo. Um indivíduo é um mamífero, de preferência um humano. O CSF pode ser obtido por punção lombar com ou sem cateter perma- nente no CSF. Múltiplas amostras de sangue ou CSF coletadas contem- poraneamente do indivíduo podem ser agrupadas. O sangue pode ser coletado por punção venosa com ou sem cateter intravenoso, ou por punção digital (ou equivalente). Uma vez coletadas, as amostras de san- gue ou CSF podem ser processadas de acordo com métodos conheci- dos na técnica (por exemplo, centrifugação para remover células intei- ras e detritos celulares, uso de aditivos projetados para estabilizar e pre- servar a amostra antes do teste analítico, etc.). Amostras de sangue ou CSF podem ser usadas imediatamente ou podem ser congeladas e ar- mazenadas indefinidamente.

[0061] Em amostras de tau isoladas da presente invenção, a tau foi parcial ou completamente purificada do sangue ou CSF. Os métodos para purificar tau do sangue ou CSF são conhecidos na técnica e in- cluem, mas não estão limitados a, precipitação seletiva, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica e purificação por afinidade. Os métodos adequados concentram tau fosforilada e tau não fosforilada do sangue ou CSF.

[0062] Em uma modalidade exemplificativa as amostras de tau iso- ladas da presente invenção compreendem tau que foi purificada do san- gue ou CSF por purificação de afinidade.

A purificação por afinidade se refere a métodos que purificam uma proteína de interesse em virtude de suas propriedades de ligação específicas a um ligando imobilizado.

Nor- malmente, um ligando imobilizado é um ligando fixado a um suporte só- lido, como um grânulo, resina, placa de cultura de tecido, etc.

Os ligan- dos adequados ligam especificamente tau fosforilada e não fosforilada.

Em um exemplo, um ligando adequado pode se ligar a um epítopo den- tro do domínio médio de tau.

Em outro exemplo, um ligando adequado pode se ligar a um epítopo dentro do N-terminal de tau, de preferência dentro dos aminoácidos 1 a 35 de tau.

Em outro exemplo, um ligando adequado pode se ligar a um epítopo dentro do MTBR de tau.

Em outro exemplo, um ligando adequado pode se ligar a um epítopo dentro do terminal C de tau.

Em ainda outras modalidades, a tau pode ser purifi- cada por afinidade a partir do sangue ou CSF usando dois ou mais li- gandos imobilizados.

Em um exemplo, um ligando imobilizado se liga a um epítopo dentro do terminal N de tau e outro ligando imobilizado se liga a um epítopo dentro do domínio intermediário de tau.

Em outro exemplo, um ligando imobilizado se liga a um epítopo dentro do MTBR de tau e outro ligando imobilizado se liga a um epítopo dentro do domí- nio intermediário de tau.

Em um outro exemplo, um ligando imobilizado se liga a um epítopo dentro do terminal C de tau e outro ligando imobili- zado se liga a um epítopo dentro do domínio intermediário de tau.

Em outro exemplo, um ligando imobilizado se liga a um epítopo dentro do terminal C de tau e outro ligando imobilizado se liga a um epítopo dentro do terminal N de tau.

Em outro exemplo, um ligando imobilizado se liga a um epítopo dentro do MTBR de tau e outro ligando imobilizado se liga a um epítopo dentro do terminal N de tau.

Em outro exemplo, um ligando imobilizado se liga a um epítopo dentro do MTBR de tau e outro ligando imobilizado se liga a um epítopo dentro do terminal C de tau. Em cada uma das modalidades acima, o ligando pode ser um anticorpo ou um aptâmero. Exemplos não limitativos de anticorpos adequados são mos- trados na FIG. 1.

[0063] Uma amostra de tau isolada pode ser usada imediatamente ou pode ser armazenada indefinidamente por métodos conhecidos na técnica. (b) fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos

[0064] A fosforilação de aminoácidos específicos (ou seja, "sítios") em tau resulta em isoformas de tau fosforilada (p-tau). Os métodos da presente invenção fornecem meios para medir a estequiometria de fos- forilação em um ou mais aminoácidos específicos de tau. Em algumas modalidades, os métodos aqui compreendem medir a fosforilação de tau em um ou mais resíduos escolhidos de T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 e T231. Em algumas mo- dalidades, os métodos aqui compreendem medir a fosforilação de tau em um ou mais resíduos escolhidos de T111, T181, T205, S208, S214, T217 e T231. Em outras modalidades, os métodos aqui compreendem medir a fosforilação de tau em um ou mais resíduos escolhidos de T181, S214 e T217. Em outras modalidades, os métodos aqui compreendem medir a fosforilação de tau em um ou mais resíduos escolhidos de T181, T205 e T217. Em outras modalidades, os métodos aqui compreendem medir a fosforilação de tau em um ou mais resíduos que incluem S199. Em outras modalidades, os métodos aqui compreendem medir a fosfo- rilação de tau em um ou mais resíduos que incluem S202. Em outras modalidades, os métodos aqui compreendem medir a fosforilação de tau em um ou mais resíduos que incluem S199. Em outras modalidades, os métodos aqui compreendem medir a fosforilação de tau em um ou mais resíduos que incluem T181. Em outras modalidades, os métodos aqui compreendem medir a fosforilação de tau em um ou mais resíduos que incluem T205. Em outras modalidades, os métodos aqui compreen- dem medir a fosforilação de tau em um ou mais resíduos que incluem T217. Em outras modalidades, os métodos aqui compreendem medir a fosforilação de tau em dois ou mais resíduos que incluem T153 e T175. Em outras modalidades, os métodos aqui compreendem medir a fosfo- rilação de tau em dois ou mais resíduos escolhidos de T181, T205 e T217. Em outras modalidades, os métodos aqui compreendem medir a fosforilação de tau em três ou mais resíduos que incluem T181, T205 e T217.

[0065] Os requerentes desenvolveram um método de espectrome- tria de massa (MS) altamente sensível e específico usando monitora- mento de reação paralela (PRM) para descobrir sítios de fosforilação de tau e quantificar inicialmente a abundância de sítios de fosforilação em proteínas tau isoladas. No entanto, a presente invenção não está limi- tada a qualquer método particular para avaliar quantitativamente a fos- forilação específica do sítio de tau. Os métodos adequados devem dis- criminar as isoformas de tau que diferem apenas no estado de fosforila- ção de um único aminoácido, discriminar as isoformas de p-tau que são fosforiladas em diferentes aminoácidos e quantificar as mudanças na fosforilação que ocorrem em sítios específicos, independentemente da mudança global na tau total. Três abordagens para quantificar mudan- ças na estequiometria de fosforilação que ocorrem em sítios específi- cos, independentemente da mudança global na tau total, são detalha- das nos exemplos: 1) comparação relativa entre isômeros de peptídeo fosforilado, que pode ser usado para estimar a abundância relativa de cada peptídeo fosforilado que compartilha a mesma sequência; 2) nor- malização dos peptídeos fosforilados com qualquer peptídeo da prote- ína tau como referência; e 3) quantificação absoluta usando padrões internos marcados sintéticos para cada peptídeo fosforilado e não fos- forilado, onde os valores de quantificação absoluta para cada peptídeo fosforilado são normalizados com qualquer valor de quantificação abso- luto obtido para qualquer peptídeo da proteína tau. Todas as três abor- dagens usam normalização interna para comparar as alterações de fos- forilação relativas para cada sítio. Outros métodos conhecidos na téc- nica também podem ser usados.

[0066] Em uma modalidade exemplificativa, a fosforilação especí- fica do sítio de tau é medida por espectrometria de massa de alta reso- lução. Tipos adequados de espectrômetros de massa são conhecidos na técnica. Estes incluem, mas não estão limitados a, quadrupolo, tempo de voo, armadilha de íons e Orbitrap, bem como espectrômetros de massa híbridos que combinam diferentes tipos de analisadores de massa em uma arquitetura (por exemplo, Orbitrap Fusion™ Tribrid™ Mass Spectrometer da ThermoFisher Científico). O processamento adi- cional de uma amostra de tau isolada pode ocorrer antes da análise de MS. Por exemplo, a tau pode ser digerida proteoliticamente. As protea- ses adequadas incluem, mas não estão limitadas a, tripsina, Lys-N, Lys- C e Arg-N. Quando a purificação por afinidade é usada para produzir uma amostra de tau isolada, a digestão pode ocorrer após a eluição da tau do ligando imobilizado ou enquanto a tau está ligada. Após uma ou mais etapas de limpeza, os peptídeos de tau digeridos podem ser sepa- rados por um sistema de cromatografia líquida com interface com um espectrômetro de massa de alta resolução. O sistema de cromatografia pode ser otimizado por experimentação de rotina para produzir um pa- drão LC-MS desejado. Uma ampla faixa de técnicas de LC-MS pode ser usada para analisar quantitativamente a fosforilação de tau específica de sítio. Exemplos não limitativos incluem monitoramento de reação se- lecionada, monitoramento de reação paralela, monitoramento de íon se- lecionado e aquisição independente de dados. Como afirmado acima, todas as avaliações quantitativas da fosforilação de tau específica do sítio devem levar em conta as mudanças globais na tau total. Em uma modalidade exemplificativa, um protocolo de espectrometria de massa delineado nos Exemplos é usado. (c) tau total

[0067] "Tau total", conforme usado neste documento, refere-se a to- das as isoformas de tau em uma determinada amostra. A tau pode ser encontrada em compartimentos solúveis e insolúveis, em formas mono- méricas e agregadas, em estruturas ordenadas ou desordenadas, intra- celularmente e extracelularmente, e pode ser complexada com outras proteínas ou moléculas. Consequentemente, a fonte da amostra bioló- gica (por exemplo, tecido cerebral, CSF, sangue, etc.) e qualquer pro- cessamento posterior da amostra biológica afetará a totalidade das iso- formas de tau em uma determinada amostra.

[0068] A tau total pode ser medida monitorando a abundância de peptídeos tau não modificados. Para cada sítio de tau fosforilado, um peptídeo tau que compartilha a sequência de aminoácidos comum com o peptídeo fosforilado de interesse pode ser usado preferencialmente para medir o nível de tau total, mas qualquer peptídeo da sequência de tau pode ser usado. A medição de peptídeos tau pode ser realizada por espectrometria de massa e a precisão da medição pode ser melhorada usando padrões internos marcados como referência. Alternativamente, a tau total pode ser medida por imunoensaios ou outro método de quan- tificação da concentração de tau. III. Métodos para diagnosticar indivíduos antes do início de MCI de- vido à AD para diagnosticar o estágio de AD de um indivíduo

[0069] Um aspecto da presente invenção abrange métodos para di- agnosticar indivíduos como tendo um alto risco de conversão em com- prometimento cognitivo leve devido à doença de Alzheimer e, opcional- mente, organizar ou classificar o indivíduo em termos do número de anos de início do MCI devido à AD. O comprometimento cognitivo leve (MCI) devido à doença de Alzheimer (AD) refere-se à fase sintomática de pré-demência da AD. Esse grau de comprometimento cognitivo não é normal para a idade e, portanto, construtos como comprometimento de memória associado à idade e declínio cognitivo associado à idade não se aplicam. MCI devido à AD é um diagnóstico clínico e os critérios clínicos para o diagnóstico de MCI devido à AD são conhecidos na téc- nica. Ver, por exemplo, Albert et al. Alzheimer’s & Dementia, 2011, 7(3): 270-279. O teste cognitivo é ideal para avaliar objetivamente o grau de comprometimento cognitivo de um indivíduo. As pontuações em testes cognitivos para indivíduos com MCI são normalmente de 1 a 1,5 des- vios-padrão abaixo da média para seus pares de idade e escolaridade em dados normativos culturalmente apropriados (ou seja, para o(s) do- mínio(s) com deficiência, quando disponíveis). A designação de MCI é frequentemente apoiada por uma classificação global de 0,5 na escala Clinical Dementia Rating (CDR). A CDR é uma escala numérica usada para quantificar a gravidade dos sintomas de demência. Outros testes cognitivos adequados são conhecidos na técnica. Embora existam tes- tes adequados para avaliar a gravidade do comprometimento cognitivo, existe uma necessidade na técnica de um teste que identifique indiví- duos com um alto grau de confiança anos antes do início de MCI devido à AD.

[0070] Em uma modalidade, um método para diagnosticar um in- divíduo como tendo um alto risco de conversão em MCI devido à AD pode compreender (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, na amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácido escolhidos de T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 e T231 e, op- cionalmente, medir a tau total; e (b) diagnosticar o indivíduo como tendo um alto risco de conversão em MCI devido à AD quando o(s) nível(is) de fosforilação medido se desviam significativamente da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

Em outra modalidade, um método para diagnosticar um indivíduo como tendo um alto risco de conversão em MCI devido à AD pode compreender (a) for- necer uma primeira e uma segunda amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, em cada amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos de T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 e T231 e, op- cionalmente, medir a tau total; (b) calcular a mudança na fosforilação específica de sítio em cada resíduo medido e, opcionalmente, a mu- dança na tau total; e (c) diagnosticar o indivíduo como tendo um alto risco de conversão em MCI devido à AD quando a(s) mudança(ões) cal- culada(s) significativamente se desviam da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por ima- geamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. "Desvio significativo da média" refere-se a valores que são pelo menos 1 desvio padrão, de preferência pelo menos 1,3 desvios padrão, mais preferencialmente pelo menos 1,5 desvios padrão ou ainda mais preferencialmente pelo menos 2 desvios padrão, acima ou abaixo da média (ou seja, 1σ, 1,3σ, 1,5σ ou 1,5σ, respectivamente, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais, conforme medido por imageamento PET e/ou me- dição de Aβ42/40 em CSF). Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas moda- lidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada para diagnosticar um indivíduo.

Uma amostra de tau isolada pode ser obtida de um indivíduo que pode ou não ser assintomático.

Um “in- divíduo assintomático” refere-se a um indivíduo que não mostra quais- quer sinais ou sintomas de AD.

Um indivíduo pode, entretanto, apresen- tar sinais ou sintomas de AD (por exemplo, perda de memória, perder coisas, mudanças no humor ou comportamento, etc.), mas não mostrar prejuízo cognitivo ou funcional suficiente para um diagnóstico clínico de prejuízo cognitivo leve. Em outras modalidades, um indivíduo pode ser portador de uma das mutações genéticas conhecidas por causar a do- ença de Alzheimer hereditária dominante. Em modalidades alternativas, um indivíduo pode não ser portador de uma mutação genética conhe- cida por causar a doença de Alzheimer hereditária dominante. A doença de Alzheimer sem vínculo familiar específico é chamada de doença de Alzheimer esporádica.

[0071] Outro aspecto da presente invenção abrange métodos para diagnosticar o estágio de doença de Alzheimer de um indivíduo. Em vá- rias modalidades, um "estágio de AD" pode ser definido como um perí- odo de tempo (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses, etc.) que decorreu desde o início de MCI devido à AD. Embora existam critérios para um diagnóstico clínico de AD, é comum no ambiente clí- nico que o momento do início dos sintomas seja desconhecido para um determinado indivíduo ou que haja um diagnóstico questionável de MCI ou AD. Como tal, há uma necessidade na técnica de um teste que diag- nostique objetivamente o estágio de AD de um indivíduo.

[0072] Em uma modalidade, um método para diagnosticar um es- tágio de AD de um indivíduo pode compreender (a) fornecer uma amos- tra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, na amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos a partir de T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 e T231 e, opcionalmente, medir a tau total; e (b) diagnosticar o estágio da AD do indivíduo quando o(s) nível(is) de fosforilação medido se desviam significativamente da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais, conforme me- dido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em ou- tra modalidade, um método para diagnosticar um indivíduo antes do iní- cio de MCI devido à AD pode compreender (a) fornecer uma primeira e uma segunda amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, em cada amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos de T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 e T231 e, opcionalmente, medir a tau total; (b) calcular a mudança na fosforilação específica de sítio em cada resíduo medido e, opcionalmente, a mudança na tau total; e (c) diagnosticar o indivíduo como tendo um certo número de anos a partir do início de MCI devido à AD quando a(s) mudança(ões) calculada(s) significativamente se desviam da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. "Desvio significativo da média" inclui valores que são pelo menos 1 desvio padrão, de preferência pelo menos 1,3 desvios padrão ou mais preferencialmente pelo menos 1,5 desvios padrão ou ainda mais preferencialmente pelo menos 2 desvios padrão, acima ou abaixo da média (ou seja, 1σ, 1,3σ, 1,5σ ou 1,5σ, res- pectivamente, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição nor- mal medida em uma população de controle sem placas amiloides cere- brais, conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF). Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada para diagnosticar um indivíduo. Uma amostra de tau isolada pode ser obtida de um indivíduo que pode ou não ter um diagnóstico clínico de MCI de- vido à AD, demência ou AD. Em outras modalidades, um indivíduo pode ser portador de uma das mutações genéticas conhecidas por causar a doença de Alzheimer hereditária dominante. Em modalidades alternati- vas, um indivíduo pode não ser portador de uma mutação genética co- nhecida por causar a doença de Alzheimer hereditária dominante.

[0073] Alternativamente ou além de usar uma medição de fosfori- lação de tau específica do sítio, opcionalmente com uma medição de tau total, em qualquer uma das modalidades acima, uma razão calcu- lada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido ou uma razão calcu- lada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) e tau total, pode ser usada. Ambas as abordagens são detalhadas nos exemplos. Ope- rações matemáticas diferentes de uma razão também podem ser usa- das. Por exemplo, os exemplos usam valores de fosforilação de tau es- pecíficos do sítio em vários modelos estatísticos (por exemplo, regres- sões lineares, curvas LME, curvas LOESS, etc.) em conjunto com outros biomarcadores conhecidos (por exemplo, estado APOE ε4, idade, sexo, resultados de testes cognitivos, pontuações de testes funcionais, etc.). A seleção de medições e escolha de operações matemáticas podem ser otimizadas para maximizar a especificidade do método. Por exemplo, a precisão do diagnóstico pode ser avaliada pela área sob a curva ROC e em algumas modalidades, um valor ROC AUC de 0,7 ou mais é definido como um limiar (por exemplo, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, etc.).

[0074] As placas amiloides cerebrais em seres humanos são roti- neiramente medidas por tomografia por emissão de pósitrons amiloide (PET). Por exemplo, o imageamento de 11C-Pittsburgh composto B (PiB) PET de placas Aβ corticais é comumente usada para detectar a patolo- gia da placa Aβ. A taxa de valor de captação padrão (SUVR) do PiB- PET cortical identifica de forma confiável placas Aß corticais significati- vas e é usada para classificar os indivíduos como PIB positivo (  SUVR 1,25) ou negativo (SUVR  1,25). Por conseguinte, nas modalidades acima, uma população de controle sem placas amiloides cerebrais, con- forme medido por imageamento PET, pode se referir a uma população de indivíduos que têm um PiB-PET SUVR cortical <1,25. Outros valores de ligação PiB (por exemplo, potencial de ligação cortical médio) ou aná- lises de regiões de interesse diferentes da região cortical também po- dem ser usados para classificar os indivíduos como PIB positivo ou ne-

gativo. Outros agentes de imageamento PET também podem ser usa- dos.

[0075] Uma população de controle sem placas amiloides cerebrais medida pela medição de Aβ42/40 no CSF pode se referir a uma popu- lação de indivíduos que tem uma medição de Aβ42/40 de <0,12 quando medida por espectrometria de massa, conforme descrito em Patterson et al, Annals of Neurology, 2015

[0076] Em uma modalidade exemplificativa, um método para diag- nosticar um indivíduo como tendo um alto risco de conversão em MCI devido à AD ou estágio de AD de um indivíduo pode compreender (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, na tau isolada amostra, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos de T181, T205 e T217 e, opcionalmente, medir a tau total; e (b) diagnosticar o indivíduo como tendo um alto risco de conversão em MCI devido à AD, ou como tendo um certo número de anos desde o início de MCI devido à AD, ou informar o estágio de AD do indivíduo quando o(s) nível(is) de fosforilação medido(s) significati- vamente desviarem da média em uma população de controle sem pla- cas amiloides cerebrais, conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. FIG. 22 ilustra o padrão dinâmico de fos- forilação de tau mensurável em T181, T205 e T217 em uma amostra de tau isolada em relação aos anos desde o início de MCI devido à AD. Os níveis de fosforilação em T217 que se desviam significativamente da média ocorrem pela primeira vez cerca de 21 anos após o início de MCI devido à AD; os níveis de fosforilação em T181 que se desviam signifi- cativamente da média ocorrem pela primeira vez cerca de 19 anos após o início de MCI devido à AD; um aumento na tau total que se desvia significativamente da média ocorre primeiro cerca de 17 anos após o início de MCI devido à AD; e os níveis de fosforilação em T205 que se desviam significativamente da média ocorrem primeiro cerca de 13 anos após o início de MCI devido à AD. Após o início dos sintomas (por exem- plo, MCI devido à AD), os níveis de fosforilação em T217 e T181 se estabilizam e, em seguida, diminuem.

[0077] Como observado acima, operações matemáticas adicio- nais podem ser realizadas com as medições de fosforilação em T181, T205 e/ou T217, incluindo, mas não se limitando à razão entre os níveis de fosforilação medidos e a razão entre os níveis de fosforilação medi- dos e a tau total. Uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosfori- lação medido(s) pode ser uma razão entre p-T181 e p-T205, p-T217 e p-T205, ou p-T181 e p-T217. Uma razão calculada a partir dos níveis de fosforilação medidos e tau total pode ser uma razão entre p-T181 e tau total, p-T205 e tau total, ou p-T217 e tau total.

[0078] Em um exemplo, um método da presente invenção compre- ende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) diagnosticar o indivíduo como tendo cerca de 10 a cerca de 25 anos, ou cerca de 10 a cerca de 20 anos desde o início de MCI devido à AD quando a fosforilação de tau em T217 e / ou T181 é cerca de 1,5σ ou superior e a fosforilação de tau em T205 é cerca de 1,5σ ou menos, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição nor- mal da fosforilação tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides ce- rebrais conforme medido por imageamento PET imagem e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em várias modalidades, a fosforilação de tau em T217 e/ou a fosforilação de tau em T181 pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2σ ou acima de 2σ. Em outras modalidades, a fosforilação de tau em T217 e/ou a fosfo- rilação de tau em T181 pode ser cerca de 1,85σ, cerca de 1,9σ, cerca de 1,95σ, cerca de 2σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ,

cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou acima de 2,5σ. Em cada uma das mo- dalidades acima, a fosforilação de tau em T205 pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,51σ, cerca de 1,55σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2,0σ ou abaixo de 2,0σ. Alternativamente, a fosforilação de tau em T205 pode ser de cerca de 2,0σ, cerca de 2,05σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou abaixo de 2,5σ. Em outro exemplo, a fosforilação de tau em T217 e/ou fosforilação de tau em T181 cerca de 2σ ou acima e a fosfo- rilação de tau em T205 pode ser cerca de 2σ ou menos. Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada para diagnosticar um indivíduo. Em ainda outras modalidades, os níveis medidos de fosforilação de tau em T205 e em T181 e/ou T217 podem ser usados em várias operações matemáticas para melhorar o poder preditivo em comparação com cada um por si. Por exemplo, a(s) razão(ões) podem ser calculadas a partir dos níveis de fosforilação medidos. Operações matemáticas diferentes de uma razão também podem ser usadas.

[0079] Em outro exemplo, um método da presente invenção com- preende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir a tau total e a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) diagnosticar o indivíduo como tendo cerca de 10 a cerca de 25 anos, ou cerca de 10 a cerca de 20 anos desde o início de MCI devido à AD quando a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total e/ou a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é de cerca de 1,5σ ou superior e a razão de fosfori- lação de tau em T205 para tau total é de cerca de 1,5σ ou inferior, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de tau total e fos- forilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em várias modalidades, a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total e/ou a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2σ ou acima de 2σ. Em outras modalidades, a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total e/ou a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total pode ser cerca de 1,85σ, cerca de 1,9σ, cerca de 1,95σ, cerca de 2σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou acima de 2,5σ. Em cada uma das modalidades acima, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,50σ, cerca de 1,55σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2,0σ ou abaixo de 2σ. Alternati- vamente, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total pode ser de cerca de 2,0σ, cerca de 2,05σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou abaixo de 2,5σ. Em outro exemplo, a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total e/ou a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total pode ser cerca de 2σ ou superior e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total pode ser cerca de 2σ ou menos. Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada para diagnosticar um indivíduo.

[0080] Em outro exemplo, um método da presente invenção com- preende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir a fosforilação de tau em (i) T181 e T205, (ii) T217 e T205, ou (iii) T181, T217 e T205; e (b) diagnosticar o indivíduo como tendo cerca de 15 anos ou menos, ou cerca de 10 anos ou menos, desde o início de

MCI devido à AD quando a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) ( ii) ou (a) (iii) é de cerca de 1,5σ ou acima, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal da fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais, conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em várias modalidades, a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2σ ou acima de 2σ. Em outras modalidades, a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) pode ser cerca de 1,85σ, cerca de 1,9σ, cerca de 1,95σ, cerca de 2σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou acima de 2,5σ. Em outro exemplo, a fosfori- lação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) pode ser cerca de 2σ ou superior. Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada para diagnosticar um indivíduo. Em ainda outras modalida- des, os níveis medidos de fosforilação de tau nos sítios específicos ci- tados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) podem ser usados em várias operações matemáticas para melhorar o poder preditivo em comparação com cada um por si. Por exemplo, a(s) razão(ões) podem ser calculadas a partir dos níveis de fosforilação medidos. Operações matemáticas diferentes de uma razão também podem ser usadas.

[0081] Em outro exemplo, um método da presente invenção com- preende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir a tau total e a fosforilação de tau em (i) T181 e T205, (ii) T217 e T205, ou (iii) T181, T217 e T205; e (b) diagnosticar o indivíduo como tendo cerca de 15 anos ou menos, ou cerca de 10 anos ou menos,

desde o início de MCI devido à AD quando a razão de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) ( ii) ou (a) (iii) para tau total é de cerca de 1,5σ ou acima, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de tau total e da fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais, conforme medido por ima- geamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em várias modalida- des, a razão de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) para tau total pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2σ ou acima de 2σ. Em outras modalidades, a razão de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) para tau total pode ser cerca de 1,85σ, cerca de 1,9σ, cerca de 1,95σ, cerca de 2σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou acima de 2,5σ. Em outro exemplo, a razão de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) para tau total pode ser cerca de 2σ ou superior. Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas moda- lidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada para diagnosticar um indivíduo.

[0082] Em outro exemplo, um método da presente invenção com- preende (a) fornecer uma primeira e uma segunda amostra de tau iso- lada obtida de um indivíduo, em que "primeiro" e "segundo" se referem à ordem em que as amostras foram coletadas e medir a fosforilação de tau em (i) T181 e T205, (ii) T217 e T205, ou (iii) T181, T217 e T205; (b) calcular a mudança na fosforilação específica do sítio em cada resíduo medido e, opcionalmente, a mudança na tau total; e (c) diagnosticar o estágio de AD de um indivíduo quando o nível de fosforilação em T181 e/ou T217 diminui ou permanece o mesmo e o nível de fosforilação em

T205 e opcionalmente tau total aumenta. A primeira e a segunda amos- tras de tau isoladas podem ser coletadas com dias, semanas ou meses de intervalo. Normalmente, a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) também será cerca de 1,5σ ou acima para ambas as amostras e, onde σ é o desvio padrão definido pela dis- tribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem pla- cas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em ainda outras modalidades, os níveis medidos de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) podem ser usados em várias operações matemáticas para melhorar o poder preditivo em comparação com cada um por si. Por exemplo, a(s) razão(ões) podem ser calculadas a partir dos níveis de fosforilação medidos. Operações matemáticas diferentes de uma ra- zão também podem ser usadas.

[0083] Em outro exemplo, um método da presente invenção com- preende (a) fornecer uma primeira e uma segunda amostra de tau iso- lada obtida de um indivíduo, em que "primeiro" e "segundo" se referem à ordem em que as amostras foram coletadas e medir a tau total e a fosforilação de tau em (i) T181 e T205, (ii) T217 e T205, ou (iii) T181, T217 e T205; (b) calcular a mudança na fosforilação específica do sítio em cada resíduo medido e a mudança na tau total; e (c) diagnosticar o estágio de AD de um indivíduo quando o nível de fosforilação em T181 e/ou T217 diminui ou permanece o mesmo, o nível de fosforilação em T205 diminui ou permanece o mesmo e a tau total aumenta. A primeira e a segunda amostras de tau isoladas podem ser coletadas com dias, semanas ou meses de intervalo. Normalmente, a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) também será cerca de 1,5σ ou acima para ambas as amostras e, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205,

T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de con- trole sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imagea- mento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em ainda outras moda- lidades, os níveis medidos de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) podem ser usados em várias opera- ções matemáticas para melhorar o poder preditivo em comparação com cada um por si. Por exemplo, a(s) razão(ões) podem ser calculadas a partir dos níveis de fosforilação medidos. Operações matemáticas dife- rentes de uma razão também podem ser usadas.

[0084] Os métodos para medir a fosforilação de tau e tau total são descritos na Seção II, e incorporados nesta seção por referência. Por exemplo, usando o protocolo detalhado para os Exemplos 5-9, a fosfo- rilação de tau em T181, T205 e T217 indicada como porcentagem da razão ptau/tau é 21,7 ± 2,3, 0,34 ± 0,13 e 1,2 ± 0,66, respectivamente, em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais medidas por imageamento PET, medidas em uma amostra de tau isolada que foi purificada a partir de CSF (ver Tabela 3, coluna de não portadores de mutação). Por conseguinte, duas vezes o desvio padrão acima da média encontrada para a população de mutação não portadora (ou seja, 2σ) para p-T181/T181, p-T205/T205 e p-T217/T217 é 43,4, 0,68 e 2,4, res- pectivamente. Um versado na técnica apreciará, no entanto, que o valor absoluto pode variar dependendo do protocolo e da fonte/especifica- ções dos padrões internos usados para quantificação absoluta.

[0085] Em uma modalidade preferida, uma amostra de tau isolada compreende tau que foi purificada do sangue ou CSF por purificação de afinidade e a fosforilação de tau é medida por espectrometria de massa. Em outra modalidade preferida, uma amostra de tau isolada compre- ende tau que foi purificada do sangue ou CSF por purificação de afini- dade usando um ligando que se liga especificamente a um epítopo den- tro do domínio intermediário de tau e, opcionalmente, com um segundo ligando que se liga especificamente a um epítopo dentro do terminal N de tau e fosforilação de tau é medida por espectrometria de massa de alta resolução. Em outra modalidade preferida, uma amostra de tau iso- lada compreende tau que foi purificada do sangue ou CSF por purifica- ção de afinidade usando um ligando que se liga especificamente a um epítopo dentro do domínio intermediário de tau e, opcionalmente, com um segundo ligando que se liga especificamente a um epítopo dentro do MTBR ou o terminal C de tau, e a fosforilação de tau é medida por espectrometria de massa de alta resolução. Em uma modalidade exem- plificativa, um protocolo de espectrometria de massa delineado nos Exemplos é usado. IV. Métodos de tratamento

[0086] Em um outro aspecto da presente invenção está um método para tratar um indivíduo em necessidade do mesmo. Os termos "tratar", "tratando" ou "tratamento", conforme usados neste documento, referem- se à prestação de cuidados médicos por um profissional treinado e li- cenciado a um indivíduo em necessidade do mesmo. O atendimento médico pode ser um teste diagnóstico, um tratamento terapêutico e/ou uma medida profilática ou preventiva. O objetivo dos tratamentos tera- pêuticos e profiláticos é prevenir ou retardar (diminuir) uma alteração fisiológica indesejada ou doença/distúrbio. Os resultados clínicos bené- ficos ou desejados de tratamentos terapêuticos ou profiláticos incluem, mas não estão limitados a, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (isto é, não piorando) da doença, atraso ou lentidão na progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão (parcial ou total), detectável ou indetectável. “Tra- tamento” também pode significar prolongar a sobrevida, em compara- ção com a sobrevida esperada se não receber o tratamento. Aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles que já têm a doença, con-

dição ou distúrbio, bem como aqueles propensos a ter a doença, condi- ção ou distúrbio ou aqueles em que a doença, condição ou distúrbio deve ser evitado. Em algumas modalidades, um indivíduo que recebe o tratamento é assintomático. Um “indivíduo assintomático”, como usado neste documento, refere-se a um indivíduo que não mostra quaisquer sinais ou sintomas de AD. Em outras modalidades, um indivíduo pode, apresentar sinais ou sintomas de AD (por exemplo, perda de memória, perder coisas, mudanças no humor ou comportamento, etc.), mas não mostrar prejuízo cognitivo ou funcional suficiente para um diagnóstico clínico de prejuízo cognitivo leve devido à doença de Alzheimer. A frase “comprometimento cognitivo leve devido à doença de Alzheimer” é de- finida na Seção IV.. Um indivíduo sintomático ou assintomático pode ter amiloidose Aβ; no entanto, o conhecimento prévio da amiloidose Aβ não é um requisito para o tratamento. Em ainda outras modalidades, um in- divíduo pode ser diagnosticado como tendo AD. Em qualquer uma das modalidades mencionadas acima, um indivíduo pode ser portador de uma das mutações genéticas conhecidas por causar a doença de Al- zheimer hereditária dominante. Em modalidades alternativas, um indiví- duo pode não ser portador de uma mutação genética conhecida por causar a doença de Alzheimer hereditária dominante.

[0087] Em uma modalidade, um método para tratar um indivíduo conforme descrito acima pode compreender (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, na amostra de tau iso- lada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos es- colhidos a partir de T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 e T231 e, opcionalmente, medir a tau total; e (b) ad- ministrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando o(s) ní- vel(is) de fosforilação medido(s) se desviam significativamente da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais con- forme medido por imageamento PET e/ou medição Aβ42/40 em CSF.

Em outra modalidade, um método para tratar um indivíduo conforme descrito acima pode compreender (a) fornecer uma primeira e uma se- gunda amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, em cada amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos de T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 e T231 e, opcionalmente, medir a tau total; (b) calcular a mudança na fosforilação específica de sítio em cada resíduo medido e, opcionalmente, a mudança na tau total; e (c) admi- nistrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando a(s) mu- dança(ões) calculada(s) significativamente se desviam da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. "Des- vio significativo da média" refere-se a valores que são pelo menos 1 desvio padrão, de preferência pelo menos 1,3 desvios padrão, mais pre- ferencialmente pelo menos 1,5 desvios padrão ou ainda mais preferen- cialmente pelo menos 2 desvios padrão, acima ou abaixo da média (ou seja, 1σ, 1,3σ, 1,5σ ou 1,5σ, respectivamente, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais, conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF). Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da mé- dia pode ser usada como critério para tratar um indivíduo.

[0088] Alternativamente ou além de usar uma medição de fosforila- ção de tau específica do sítio, opcionalmente com uma medição de tau total, em qualquer uma das modalidades acima, uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido ou uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) e tau total, pode ser usada. Uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação me- dido(s) pode ser uma razão entre p-T181 e p-T205, p-T217 e p-T205,

ou p-T181 e p-T217. Uma razão calculada a partir dos níveis de fosfori- lação medidos e tau total pode ser uma razão entre p-T181 e tau total, p-T205 e tau total, ou p-T217 e tau total. Operações matemáticas dife- rentes de uma razão também podem ser usadas. Por exemplo, os exemplos usam valores de fosforilação de tau específicos do sítio em vários modelos estatísticos (por exemplo, regressões lineares, curvas LME, curvas LOESS, etc.) em conjunto com outros biomarcadores co- nhecidos (por exemplo, estado APOE ε4, idade, sexo, resultados de tes- tes cognitivos, pontuações de testes funcionais, etc.).

[0089] Muitos agentes de imageamento e agentes terapêuticos con- templados ou usados com indivíduos em risco de desenvolver amiloi- dose Aβ ou AD, indivíduos diagnosticados como tendo amiloidose Aβ, indivíduos diagnosticados como tendo uma tauopatia, ou indivíduos di- agnosticados como tendo AD, direcionam uma alteração fisiopatológica específica. Por exemplo, as terapias de direcionamento de Aβ são ge- ralmente concebidas para diminuir a produção de Aβ, antagonizar a agregação de Aβ ou aumentar a depuração de Aβ do cérebro; as tera- pias de direcionamento de tau são geralmente concebidas para alterar os padrões de fosforilação de tau, antagonizar a agregação de tau ou aumentar a depuração de NFT; uma variedade de terapias são projeta- das para reduzir a inflamação do CNS ou a resistência à insulina do cérebro; etc. A eficácia desses vários agentes pode ser melhorada pela administração dos agentes a indivíduos que têm certos níveis de fosfo- rilação de tau em T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 e T231, conforme medido por métodos divulgados aqui.

[0090] Em uma modalidade exemplificativa, a eficácia dos agentes de imageamento e agentes terapêuticos contemplados para, ou usados com, indivíduos em risco de desenvolver amiloidose Aβ ou AD, indiví-

duos diagnosticados como tendo amiloidose Aβ, indivíduos diagnostica- dos como tendo uma tauopatia, ou indivíduos diagnosticados como tendo AD (aqui referidos coletivamente como "terapias Aβ e tau") podem ser melhorados pela administração da terapia Aβ ou tau a indivíduos que têm certos níveis de fosforilação de tau em T181, T205 e/ou T217, conforme medido pelos métodos divulgados aqui e ilustrados, por exem- plo, na FIG. 22. Por exemplo, quando a fosforilação de tau em T217 é de cerca de 1,5σ ou acima e a fosforilação de tau em T181 e T205 é de cerca de 1,5σ ou abaixo, os agentes terapêuticos preferidos podem in- cluir aqueles concebidos para evitar que um indivíduo se torne amiloide positivo (por exemplo, terapias de direcionamento de amiloide projeta- das para diminuir a produção de Aβ, antagonizar a agregação de Aβ, etc.). Como outro exemplo, quando a fosforilação de tau em T217 e/ou T181 é de cerca de 1,5σ ou acima e a fosforilação de tau em T205 é de cerca de 1,5σ ou abaixo, os agentes terapêuticos preferidos podem in- cluir aqueles concebidos para evitar que a deposição de amiloide au- mente ou reduza uma carga de placa existente de um indivíduo.

Como outro exemplo, quando a fosforilação de tau em T217, T181 e T205 é de cerca de 1,5σ ou acima, os agentes terapêuticos preferidos podem incluir aqueles concebidos para evitar o aumento da deposição de ami- loide, reduzir a carga de placa existente de um indivíduo, evitar a agre- gação de tau ou NFTs alvo.

Como outro exemplo, quando a fosforilação de tau em T217, T181 e T205 é de cerca de 1,5σ ou acima, e a fosfori- lação de tau em T217 ou T181 está se estabilizando ou diminuindo, e a tau total e/ou fosforilação de tau em T205 está aumentando, os agentes terapêuticos preferidos podem incluir aqueles projetados para evitar o aumento da deposição de amiloide, reduzir a carga de placa existente de um indivíduo, prevenir a agregação de tau ou NFTs alvo, bem como aqueles específicos para indivíduos com AD.

Os detalhes divulgados neste documento podem ser usados de forma semelhante para admi- nistrar agentes terapêuticos concebidos para outros alvos (por exemplo, inflamação do CNS, ApoE, etc.), incluindo, mas não se limitando àque- les identificados nos parágrafos seguintes.

[0091] Em um exemplo, a presente invenção fornece um método para tratar um indivíduo com um risco aumentado de conversão em MCI devido à AD, o método compreendendo (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) adminis- trar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando a fosforilação de tau em T217 e/ou T181 é de cerca de 1,5σ ou acima e a fosforilação de tau em T205 é de cerca de 1,5σ ou abaixo, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de con- trole sem placas amiloides cerebrais, conforme medido por imagea- mento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em várias modalidades, a fosforilação de tau em T217 e/ou a fosforilação de tau em T181 pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2σ ou acima de 2σ. Em outras modalidades, a fosforilação de tau em T217 e/ou a fosforilação de tau em T181 pode ser cerca de 1,85σ, cerca de 1,9σ, cerca de 1,95σ, cerca de 2σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou acima de 2,5σ. Em cada uma das modalidades acima, a fosforilação de tau em T205 pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,51σ, cerca de 1,55σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2,0σ ou abaixo de 2,0σ. Alternativamente, a fosforilação de tau em T205 pode ser de cerca de 2,0σ, cerca de 2,05σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou abaixo de 2,5σ. Em outro exemplo, a fosfori- lação de tau em T217 e/ou fosforilação de tau em T181 cerca de 2σ ou acima e a fosforilação de tau em T205 pode ser cerca de 2σ ou menos. Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada como critério para tratar um indivíduo. Em ainda outras modalidades, os níveis medidos de fosforila- ção de tau em T205 e em T181 e/ou T217 podem ser usados em várias operações matemáticas para melhorar o poder preditivo em compara- ção com cada um por si. Por exemplo, a(s) razão(ões) podem ser cal- culadas a partir dos níveis de fosforilação medidos. Operações mate- máticas diferentes de uma razão também podem ser usadas.

[0092] Em outro exemplo, a presente invenção fornece um método para tratar um indivíduo com um risco aumentado de conversão em MCI devido à AD, o método compreendendo (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir a tau total e a fosforilação de tau em ( i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) administrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando a ra- zão de fosforilação de tau em T217 para tau total e/ou a razão de fosfo- rilação de tau em T181 para tau total é de cerca de 1,5σ ou acima e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é de cerca de 1,5σ ou menos, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de tau total e fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloi- des cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em várias modalidades, a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total e/ou a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de

1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2σ ou acima de 2σ. Em outras modalida- des, a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total e/ou a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total pode ser cerca de 1,85σ, cerca de 1,9σ, cerca de 1,95σ, cerca de 2σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou acima de 2,5σ. Em cada uma das modalidades acima, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,50σ, cerca de 1,55σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2,0σ ou abaixo de 2σ. Alternativamente, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total pode ser de cerca de 2,0σ, cerca de 2,05σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou abaixo de 2,5σ. Em outro exemplo, a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total e/ou a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total pode ser cerca de 2σ ou superior e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total pode ser cerca de 2σ ou menos. Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da mé- dia pode ser usada como critério para tratar um indivíduo.

[0093] Em outro exemplo, a presente invenção fornece um método para tratar um indivíduo com um risco aumentado de conversão em MCI devido à AD, o método compreendendo (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir a fosforilação de tau em (i) T181 e T205, (ii) T217 e T205, ou (iii) T181, T217 e T205; e (b) adminis- trar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) é de cerca de 1,5σ ou acima, onde σ é o desvio padrão definido pela distri- buição normal de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais, conforme medido por imageamento PET e/ou me- dição de Aβ42/40 em CSF. Em várias modalidades, a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2σ ou acima de 2σ. Em outras modalidades, a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) pode ser cerca de 1,85σ, cerca de 1,9σ, cerca de 1,95σ, cerca de 2σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou acima de 2,5σ. Em outro exemplo, a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) pode ser cerca de 2σ ou superior. Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada como critério para tratar um indivíduo. Em ainda outras modalidades, os níveis medidos de fosforila- ção de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) podem ser usados em várias operações matemáticas para melhorar o poder preditivo em comparação com cada um por si. Por exemplo, a(s) razão(ões) podem ser calculadas a partir dos níveis de fosforilação me- didos. Operações matemáticas diferentes de uma razão também podem ser usadas.

[0094] Em outro exemplo, a presente invenção fornece um método para tratar um indivíduo com um risco aumentado de conversão em MCI devido à AD, o método compreendendo (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir a tau total e a fosforilação de tau em ( i) T181 e T205, (ii) T217 e T205, ou (iii) T181, T217 e T205; e (b) administrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando a ra- zão de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) ( ii) ou (a) (iii) para tau total é de cerca de 1,5σ ou acima, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de tau total e da fosfori- lação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais, conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em várias modalidades, a razão de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) para tau total pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2σ ou acima de 2σ. Em outras modalidades, a razão de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) para tau total pode ser cerca de 1,85σ, cerca de 1,9σ, cerca de 1,95σ, cerca de 2σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou acima de 2,5σ. Em outro exemplo, a razão de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) para tau total pode ser cerca de 2σ ou superior. Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da mé- dia pode ser usada como critério para tratar um indivíduo.

[0095] Em outro exemplo, a presente invenção fornece um método para tratar um indivíduo com sintomas de AD, o método compreendendo (a) fornecer uma primeira e uma segunda amostra de tau isolada obtida de um indivíduo, em que "primeiro" e "segundo" se referem à ordem em que as amostras foram coletadas e medir a fosforilação de tau em (i) T181 e T205, (ii) T217 e T205, ou (iii) T181, T217 e T205; (b) calcular a mudança na fosforilação específica do sítio em cada resíduo medido e, opcionalmente, a mudança na tau total; e (c) administrar uma composi- ção farmacêutica ao indivíduo quando o nível de fosforilação em T181 e/ou T217 diminui ou permanece o mesmo e o nível de fosforilação em T205 e opcionalmente tau total aumenta. A primeira e a segunda amos- tras de tau isoladas podem ser coletadas com dias, semanas ou meses de intervalo. Normalmente, a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) também será cerca de 1,5σ ou acima para ambas as amostras e, onde σ é o desvio padrão definido pela dis- tribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem pla- cas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em ainda outras modalidades, os níveis medidos de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) podem ser usados em várias operações matemáticas para melhorar o poder preditivo em comparação com cada um por si. Por exemplo, a(s) razão(ões) podem ser calculadas a partir dos níveis de fosforilação medidos. Operações matemáticas diferentes de uma ra- zão também podem ser usadas.

[0096] Em outro exemplo, a presente invenção fornece um método para tratar um indivíduo com sintomas de AD, o método compreendendo (a) fornecer uma primeira e uma segunda amostra de tau isolada obtida de um indivíduo, em que "primeiro" e "segundo" se referem à ordem em que as amostras foram coletadas e medir a fosforilação de tau e tau total em (i) T181 e T205, (ii) T217 e T205, ou (iii) T181, T217 e T205; (b) calcular a mudança na fosforilação específica do sítio em cada resíduo medido e a mudança na tau total; e (c) administrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando o nível de fosforilação em T181 e/ou T217 diminui ou permanece o mesmo, o nível de fosforilação em T205 diminui ou permanece o mesmo e a tau total aumenta. A primeira e a segunda amostras de tau isoladas podem ser coletadas com dias, se- manas ou meses de intervalo. Normalmente, a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) também será cerca de 1,5σ ou acima para ambas as amostras e, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205,

T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de con- trole sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imagea- mento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em ainda outras moda- lidades, os níveis medidos de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) podem ser usados em várias opera- ções matemáticas para melhorar o poder preditivo em comparação com cada um por si. Por exemplo, a(s) razão(ões) podem ser calculadas a partir dos níveis de fosforilação medidos. Operações matemáticas dife- rentes de uma razão também podem ser usadas.

[0097] Em cada uma das modalidades acima, uma composição far- macêutica pode compreender um agente de imageamento. Exemplos não limitativos de agentes de imageamento incluem agentes de image- amento funcional (por exemplo, fluorodeoxiglicose, etc.) e agentes de imageamento molecular (por exemplo, composto B de Pittsburgh, flor- betabeno, florbetapir, flutemetamol, anticorpos marcados com radionu- clídeo, etc.)

[0098] Alternativamente, uma composição farmacêutica pode com- preender um ingrediente farmacêutico ativo. Exemplos não limitativos de ingredientes farmacêuticos ativos incluem inibidores de colineste- rase, antagonistas de N-metil D-aspartato (NMDA), antidepressivos (por exemplo, inibidores seletivos de recaptação de serotonina, antidepres- sivos atípicos, aminocetonas, inibidores de recaptação seletivos de se- rotonina e norepinefrina, antidepressivos tricíclicos, etc.), inibidores de gama-secretase, inibidores de beta-secretase, anticorpos anti-Aβ (inclu- indo fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos), anticorpos anti-tau (incluindo fragmentos de ligação ao antí- geno, variantes ou derivados dos mesmos), células-tronco, suplemen- tos dietéticos (por exemplo, água de lítio, ácidos graxos ômega-3 com ácido lipoico, triglicerídeos de cadeia longa, genisteína, resveratrol, cur- cumina e extrato de semente de uva, etc.), antagonistas do receptor de serotonina 6, inibidores de p38alfa MAPK, fator de estimulação de colô- nia de macrófagos granulócitos recombinantes, imunoterapias passivas, vacinas ativas (por exemplo, CAD106, AF20513, etc.), inibidores da agregação da proteína tau (por exemplo, TRx0237, cloreto de metiltio- nímio, etc.), terapias para melhorar o controle do açúcar no sangue (por exemplo, insulina, exenatida, liraglutida pioglitazona, etc.), agentes anti- inflamatórios, inibidores da fosfodiesterase 9A, agonistas do receptor sigma-1, inibidores da quinase, ativadores da fosfatase, inibidores da fosfatase, bloqueadores do receptor de angiotensina, agonistas parciais do receptor endocanabinoide CB1 e/ou CB2, agonistas do receptor adrenérgico β-2, agonista do receptor nicotínico da acetilcolina, agonis- tas inversos de 5-HT2A, antagonistas do receptor alfa-2c adrenérgico, agonistas do receptor 5-HT 1A e 1D, inibidores da Glutaminil-peptídeo ciclotransferase, inibidores seletivos da produção de APP, inibidores da monoamina oxidase B, antagonistas do receptor de glutamato, agonis- tas do receptor AMPA, estimulantes do fator de crescimento nervoso, inibidores da redutase HMG-CoA, agentes neurotróficos, agonistas do receptor M1 muscarínico, moduladores do receptor GABA, agonistas PPAR-gama, moduladores de proteínas de microtúbulos, bloqueadores dos canais de cálcio, agentes anti-hipertensivos, estatinas e qualquer combinação dos mesmos.

[0099] Em outra alternativa, uma composição farmacêutica pode compreender um inibidor da quinase. Os inibidores da quinase adequa- dos podem inibir a quinase de mil e um aminoácidos (TAOK), CDK, GSK-3β, MARK, CDK5, Fyn, 5' proteína quinase ativada por monofos- fato de adenosina (AMPK), Cálcio-calmodulina quinase II, quinase-5 de- pendente de ciclina (cdk5), Caseína quinase 1 (CK1), Caseína quinase 2 (CK2), proteína quinase dependente de AMP cíclico (PKA), Quinase 1A regulada por fosforilação de tirosina de especificidade dupla

(DYRK1A), Glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3), JNK, LRRK2, qui- nase reguladora de afinidade de microtúbulo (MARK), MSK1, p35/41, p42/p44 proteína quinases ativadas por mitogênio (ERKs1/2), p38 qui- nase ativada por mitogênio (p38MAPK), p70S6 quinase, Fosforilase qui- nase, PKB/AKT, Proteína quinase C (PKC), Proteína quinase N (PKN), Quinase 1 alfa/beta semelhante a 20 derivada da próstata, 90 kDa S6 quinase ribossômica (RSK1/2) (PSK1/TAOK2), Quinase semelhante a 20 estéril derivada da próstata 2 (PSK2/TAOK1), Proteína quinase ati- vada por estresse (SAPK) 1gamma, SAPK2a, SAPK2b, SAPK3, SAPK4, SGK1, SRPK2, ou Tau-tubulina quinase 1/2 (TTBK1/2).

[0100] Em ainda outra alternativa, uma composição farmacêutica pode compreender um ativador de fosfatase. Como um exemplo não limitativo, um ativador de fosfatase pode aumentar a atividade da prote- ína fosfatase 1, 2A, 2B ou 5.

[0101] Os métodos para medir a fosforilação de tau e tau total são descritos na Seção II, e incorporados nesta seção por referência. Em uma modalidade preferida, uma amostra de tau isolada compreende tau que foi purificada do sangue ou CSF por purificação de afinidade e a fosforilação de tau é medida por espectrometria de massa. Em outra modalidade preferida, uma amostra de tau isolada compreende tau que foi purificada do sangue ou CSF por purificação de afinidade usando um ligando que se liga especificamente a um epítopo dentro do domínio intermediário de tau e, opcionalmente, com um segundo ligando que se liga especificamente a um epítopo dentro do terminal N de tau e fosfori- lação de tau é medida por espectrometria de massa de alta resolução. Em outra modalidade preferida, uma amostra de tau isolada compre- ende tau que foi purificada do sangue ou CSF por purificação de afini- dade usando um ligando que se liga especificamente a um epítopo den- tro do domínio intermediário de tau e, opcionalmente, com um segundo ligando que se liga especificamente a um epítopo dentro do MTBR ou o terminal C de tau, e a fosforilação de tau é medida por espectrometria de massa de alta resolução. Em uma modalidade exemplificativa, um protocolo de espectrometria de massa delineado nos Exemplos é usado. V. Estudos clínicos.

[0102] Outro aspecto da presente invenção é um método para ins- crever um indivíduo em um ensaio clínico, em particular um ensaio clí- nico para uma terapia Aβ ou tau, desde que todos os outros critérios para o ensaio clínico tenham sido atendidos. Em uma modalidade, um método para um método para inscrever um indivíduo em um ensaio clí- nico pode compreender (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, na amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos a partir de T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 e T231 e, opcionalmente, medir a tau total; e (b) inscrever o indivíduo em um ensaio clínico quando o(s) nível(is) de fosforilação medido(s) se des- viam significativamente da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição Aβ42/40 em CSF. Em outra modalidade, um método para um método para inscrever um indivíduo em um ensaio clínico pode com- preender (a) fornecer uma primeira e uma segunda amostra de tau iso- lada obtida de um indivíduo e medir, em cada amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos de T111, S113, T181, S199, S202, S208, T153, T175, T205, S214, T217 e T231 e, opcionalmente, medir a tau total; (b) calcular a mudança na fosforilação específica de sítio em cada resíduo medido e, opcional- mente, a mudança na tau total; e (c) inscrever o indivíduo em um ensaio clínico quando a(s) mudança(ões) calculada(s) significativamente se desviam da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de

Aβ42/40 em CSF. A frase "uma população de controle sem placas ami- loides cerebrais conforme medida por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF" é definida na Seção IV. "Desvio significativo da média" refere-se a valores que são pelo menos 1 desvio padrão, de pre- ferência pelo menos 1,3 desvios padrão, mais preferencialmente pelo menos 1,5 desvios padrão ou ainda mais preferencialmente pelo menos 2 desvios padrão, acima ou abaixo da média (ou seja, 1σ, 1,3σ, 1,5σ ou 1,5σ, respectivamente, onde σ é o desvio padrão definido pela distribui- ção normal medida em uma população de controle sem placas amiloi- des cerebrais, conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF). Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada como critério para inscrever um indivíduo.

[0103] Alternativamente ou além de usar uma medição de fosforila- ção de tau específica do sítio, opcionalmente com uma medição de tau total, em qualquer uma das modalidades acima, uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido ou uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação medido(s) e tau total, pode ser usada. Uma razão calculada a partir do(s) nível(is) de fosforilação me- dido(s) pode ser uma razão entre p-T181 e p-T205, p-T217 e p-T205, ou p-T181 e p-T217. Uma razão calculada a partir dos níveis de fosfori- lação medidos e tau total pode ser uma razão entre p-T181 e tau total, p-T205 e tau total, ou p-T217 e tau total. Operações matemáticas dife- rentes de uma razão também podem ser usadas. Por exemplo, os exemplos usam valores de fosforilação de tau específicos do sítio em vários modelos estatísticos (por exemplo, regressões lineares, curvas LME, curvas LOESS, etc.) em conjunto com outros biomarcadores co- nhecidos (por exemplo, estado APOE ε4, idade, sexo, resultados de tes- tes cognitivos, pontuações de testes funcionais, etc.).

[0104] A concepção de ensaios clínicos para terapias Aβ e tau pode ser grandemente auxiliada pelos métodos aqui divulgados. Muitos en- saios clínicos são projetados para testar a eficácia de agentes de ima- geamento ou agentes terapêuticos que direcionam uma alteração fisio- patológica específica que ocorre antes do início dos sintomas da AD. Conforme discutido acima na Seção V, a eficácia desses vários agentes pode ser melhorada pela administração dos agentes a indivíduos que têm certos níveis de fosforilação de tau específicos do sítios, conforme medido por métodos aqui divulgados e ilustrados. Da mesma forma, os ensaios clínicos envolvendo indivíduos com sintomas de AD (por exem- plo, após o início do MCI devido à AD) também se beneficiariam por serem capazes de realizar com precisão o status de AD de um inscrito, a fim de determinar se a eficácia está associada a um estágio particular de AD. Por conseguinte, medir os níveis de fosforilação de tau como aqui descrito antes de inscrever um indivíduo em um ensaio clínico, em particular em um braço de tratamento de um ensaio clínico, pode resul- tar em ensaios menores e/ou melhores resultados. Em alguns casos, os métodos descritos neste documento podem ser desenvolvidos e usados como um diagnóstico complementar para um agente terapêutico.

[0105] Em uma modalidade exemplificava, um método para um mé- todo para inscrever um indivíduo em um ensaio clínico pode compreen- der (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, na amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos a partir de T181, T205, e T217 e, opcionalmente, medir a tau total; e (b) inscrever o indivíduo em um en- saio clínico quando o(s) nível(is) de fosforilação medido(s) se desviam significativamente da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou me- dição Aβ42/40 em CSF. Em outra modalidade exemplificativa, um mé- todo para um método para inscrever um indivíduo em um ensaio clínico pode compreender (a) fornecer uma primeira e uma segunda amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir, em cada amostra de tau isolada, a fosforilação de tau em um ou mais resíduos de aminoácidos escolhidos de T181, T205, e T217 e, opcionalmente, medir a tau total; (b) calcular a mudança na fosforilação específica de sítio em cada resí- duo medido e, opcionalmente, a mudança na tau total; e (c) inscrever o indivíduo em um ensaio clínico quando a(s) mudança(ões) calculada(s) significativamente se desviam da média em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. A frase "uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medida por imagea- mento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF" é definida na Seção IV. "Desvio significativo da média" refere-se a valores que são pelo menos 1 desvio padrão, de preferência pelo menos 1,3 desvios padrão, mais preferencialmente pelo menos 1,5 desvios padrão ou ainda mais prefe- rencialmente pelo menos 2 desvios padrão, acima ou abaixo da média (ou seja, 1σ, 1,3σ, 1,5σ ou 1,5σ, respectivamente, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais, conforme medido por imagea- mento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF). Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada como critério para inscrever um indivíduo.

[0106] Em um exemplo, a presente invenção fornece um método para inscrever um indivíduo em um ensaio clínico, o método compreen- dendo (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) administrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando a fosforilação de tau em T217 e/ou T181 é de cerca de 1,5σ ou acima e a fosforilação de tau em T205 é de cerca de 1,5σ ou abaixo, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais, conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

Em várias modalidades, a fosforilação de tau em T217 e/ou a fos- forilação de tau em T181 pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2σ ou acima de 2σ.

Em outras modalidades, a fosforilação de tau em T217 e/ou a fosforilação de tau em T181 pode ser cerca de 1,85σ, cerca de 1,9σ, cerca de 1,95σ, cerca de 2σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou acima de 2,5σ.

Em cada uma das modalidades acima, a fosforilação de tau em T205 pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,51σ, cerca de 1,55σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2,0σ ou abaixo de 2,0σ.

Alternativamente, a fosforilação de tau em T205 pode ser de cerca de 2,0σ, cerca de 2,05σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou abaixo de 2,5σ.

Em outro exemplo, a fosforilação de tau em T217 e/ou fosforilação de tau em T181 cerca de 2σ ou acima e a fosforilação de tau em T205 pode ser cerca de 2σ ou menos.

Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas moda- lidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada como critério para inscrever um indivíduo.

Em ainda outras mo- dalidades, os níveis medidos de fosforilação de tau em T205 e em T181 e/ou T217 podem ser usados em várias operações matemáticas para melhorar o poder preditivo em comparação com cada um por si.

Por exemplo, a(s) razão(ões) podem ser calculadas a partir dos níveis de fosforilação medidos.

Operações matemáticas diferentes de uma razão também podem ser usadas.

[0107] Em outro exemplo, a presente invenção fornece um método para inscrever um indivíduo em um ensaio clínico, o método compreen- dendo (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir a tau total e a fosforilação de tau em ( i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) administrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total e/ou a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é de cerca de 1,5σ ou acima e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é de cerca de 1,5σ ou menos, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de tau total e fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

Em várias modalidades, a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total e/ou a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2σ ou acima de 2σ.

Em outras modalidades, a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total e/ou a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total pode ser cerca de 1,85σ, cerca de 1,9σ, cerca de 1,95σ, cerca de 2σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou acima de 2,5σ.

Em cada uma das modalida- des acima, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,50σ, cerca de 1,55σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2,0σ ou abaixo de 2σ.

Alternativamente, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total pode ser de cerca de 2,0σ, cerca de 2,05σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou abaixo de 2,5σ.

Em outro exemplo, a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total e/ou a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total pode ser cerca de 2σ ou superior e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total pode ser cerca de 2σ ou menos. Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio pa- drão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada como critério para inscrever um indivíduo.

[0108] Em outro exemplo, a presente invenção fornece um método para inscrever um indivíduo em um ensaio clínico, o método compreen- dendo (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir a fosforilação de tau em (i) T181 e T205, (ii) T217 e T205, ou (iii) T181, T217 e T205; e (b) administrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) é de cerca de 1,5σ ou acima, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais, conforme me- dido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em vá- rias modalidades, a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2σ ou acima de 2σ. Em outras modalidades, a fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) pode ser cerca de 1,85σ, cerca de 1,9σ, cerca de 1,95σ, cerca de 2σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou acima de 2,5σ. Em outro exemplo, a fosfori- lação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) pode ser cerca de 2σ ou superior. Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a extensão da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada como critério para inscrever um indivíduo. Em ainda outras modalidades, os níveis medidos de fosforilação de tau nos sítios espe- cíficos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) podem ser usados em várias operações matemáticas para melhorar o poder preditivo em compara- ção com cada um por si. Por exemplo, a(s) razão(ões) podem ser cal- culadas a partir dos níveis de fosforilação medidos. Operações mate- máticas diferentes de uma razão também podem ser usadas.

[0109] Em outro exemplo, a presente invenção fornece um método para inscrever um indivíduo em um ensaio clínico, o método compreen- dendo (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida de um indivíduo e medir a tau total e a fosforilação de tau em ( i) T181 e T205, (ii) T217 e T205, ou (iii) T181, T217 e T205; e (b) administrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando a razão de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) ( ii) ou (a) (iii) para tau total é de cerca de 1,5σ ou acima, onde σ é o desvio padrão definido pela distri- buição normal de tau total e da fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de con- trole sem placas amiloides cerebrais, conforme medido por imagea- mento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em várias modalidades, a razão de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) para tau total pode ser cerca de 1,3σ, cerca de 1,35σ, cerca de 1,4σ, cerca de 1,45σ, cerca de 1,5σ, cerca de 1,6σ, cerca de 1,7σ, cerca de 1,8σ, cerca de 1,9σ, cerca de 2σ ou acima de 2σ. Em outras modalidades, a razão de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) para tau total pode ser cerca de 1,85σ, cerca de 1,9σ, cerca de 1,95σ, cerca de 2σ, cerca de 2,1σ, cerca de 2,2σ, cerca de 2,3σ, cerca de 2,4σ, cerca de 2,5σ ou acima de 2,5σ. Em outro exemplo, a razão de fosforilação de tau nos sítios específicos ci- tados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) para tau total pode ser cerca de 2σ ou superior. Além de usar um limiar (por exemplo, pelo menos 1 desvio padrão acima ou abaixo da média), em algumas modalidades, a exten- são da mudança acima ou abaixo da média pode ser usada como crité- rio para inscrever um indivíduo.

[0110] Em outro exemplo, a presente invenção fornece um método para inscrever um indivíduo em um ensaio clínico, o método compreen- dendo (a) fornecer uma primeira e uma segunda amostra de tau isolada obtida de um indivíduo, em que "primeiro" e "segundo" se referem à or- dem em que as amostras foram coletadas e medir a fosforilação de tau em (i) T181 e T205, (ii) T217 e T205, ou (iii) T181, T217 e T205; (b) calcular a mudança na fosforilação específica do sítio em cada resíduo medido e, opcionalmente, a mudança na tau total; e (c) inscrever o indi- víduo no ensaio clínico quando o nível de fosforilação em T181 e/ou T217 diminui ou permanece o mesmo e o nível de fosforilação em T205 e opcionalmente tau total aumenta. A primeira e a segunda amostras de tau isoladas podem ser coletadas com dias, semanas ou meses de in- tervalo. Normalmente, a fosforilação de tau nos sítios específicos cita- dos em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) também será cerca de 1,5σ ou acima para ambas as amostras e, onde σ é o desvio padrão definido pela dis- tribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem pla- cas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em ainda outras modalidades, os níveis medidos de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) podem ser usados em várias operações matemáticas para melhorar o poder preditivo em comparação com cada um por si. Por exemplo, a(s) razão(ões) podem ser calculadas a partir dos níveis de fosforilação medidos. Operações matemáticas diferentes de uma ra- zão também podem ser usadas.

[0111] Em outro exemplo, a presente invenção fornece um método para inscrever um indivíduo em um ensaio clínico, o método compreen- dendo (a) fornecer uma primeira e uma segunda amostra de tau isolada obtida de um indivíduo, em que "primeiro" e "segundo" se referem à or- dem em que as amostras foram coletadas e medir a fosforilação de tau e tau total em (i) T181 e T205, (ii) T217 e T205, ou (iii) T181, T217 e T205; (b) calcular a mudança na fosforilação específica do sítio em cada resíduo medido e a mudança na tau total; e (c) inscrever o indivíduo no ensaio clínico quando o nível de fosforilação em T181 e/ou T217 diminui ou permanece o mesmo, o nível de fosforilação em T205 diminui ou permanece o mesmo e a tau total aumenta. A primeira e a segunda amostras de tau isoladas podem ser coletadas com dias, semanas ou meses de intervalo. Normalmente, a fosforilação de tau nos sítios espe- cíficos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) também será cerca de 1,5σ ou acima para ambas as amostras e, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205, ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF. Em ainda outras modalidades, os níveis medidos de fosforilação de tau nos sítios específicos citados em (a) (i), (a) (ii) ou (a) (iii) podem ser usados em várias operações ma- temáticas para melhorar o poder preditivo em comparação com cada um por si. Por exemplo, a(s) razão(ões) podem ser calculadas a partir dos níveis de fosforilação medidos. Operações matemáticas diferentes de uma razão também podem ser usadas.

[0112] Os métodos para medir a fosforilação de tau e tau total são descritos na Seção II, e incorporados nesta seção por referência. Por exemplo, usando o protocolo detalhado para os Exemplos 5-9, a fosfo- rilação de tau em T181, T205 e T217 é 21,7 ± 2,3, 0,34 ± 0,13 e 1,2 ± 0,66, respectivamente, em uma população de controle sem placas ami- loides cerebrais medidas por imageamento PET, medidas em uma amostra de tau isolada que foi purificada a partir de CSF (ver Tabela 3, coluna de não portadores de mutação). Por conseguinte, duas vezes o desvio padrão acima da média encontrada para a população de muta- ção não portadora (ou seja, 2σ) para p-T181, p-T205 e p-T217 são 43,4, 0,68 e 2,4, respectivamente. Um versado na técnica apreciará, no en- tanto, que o valor absoluto pode variar dependendo do protocolo.

[0113] Em uma modalidade preferida, uma amostra de tau isolada compreende tau que foi purificada do sangue ou CSF por purificação de afinidade e a fosforilação de tau é medida por espectrometria de massa. Em outra modalidade preferida, uma amostra de tau isolada compre- ende tau que foi purificada do sangue ou CSF por purificação de afini- dade usando um ligando que se liga especificamente a um epítopo den- tro do domínio intermediário de tau e, opcionalmente, com um segundo ligando que se liga especificamente a um epítopo dentro do terminal N de tau e fosforilação de tau é medida por espectrometria de massa de alta resolução. Em outra modalidade preferida, uma amostra de tau iso- lada compreende tau que foi purificada do sangue ou CSF por purifica- ção de afinidade usando um ligando que se liga especificamente a um epítopo dentro do domínio intermediário de tau e, opcionalmente, com um segundo ligando que se liga especificamente a um epítopo dentro do MTBR ou o terminal C de tau, e a fosforilação de tau é medida por espectrometria de massa de alta resolução. Em uma modalidade exem- plificativa, um protocolo de espectrometria de massa delineado nos Exemplos é usado.

[0114] Em cada uma das modalidades acima, um indivíduo pode ser inscrito em um braço de tratamento do ensaio clínico. O "tratamento" é definido na Seção V. Os indivíduos inscritos no braço de tratamento de um ensaio clínico podem receber uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode compreen- der um agente de imageamento. Exemplos não limitativos de agentes de imageamento incluem agentes de imageamento funcional (por exem- plo, fluorodeoxiglicose, etc.) e agentes de imageamento molecular (por exemplo, composto B de Pittsburgh, florbetabeno, florbetapir, fluteme- tamol, anticorpos marcados com radionuclídeo, etc.). Alternativamente, uma composição farmacêutica pode compreender um ingrediente far- macêutico ativo.

Exemplos não limitativos de ingredientes farmacêuti- cos ativos incluem inibidores de colinesterase, antagonistas de N-metil D-aspartato (NMDA), antidepressivos (por exemplo, inibidores seletivos de recaptação de serotonina, antidepressivos atípicos, aminocetonas, inibidores de recaptação seletivos de serotonina e norepinefrina, antide- pressivos tricíclicos, etc.), inibidores de gama-secretase, inibidores de beta-secretase, anticorpos anti-Aβ (incluindo fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos), anticorpos anti-tau (in- cluindo fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos), células-tronco, suplementos dietéticos (por exemplo, água de lítio, ácidos graxos ômega-3 com ácido lipoico, triglicerídeos de cadeia longa, genisteína, resveratrol, curcumina e extrato de semente de uva, etc.), antagonistas do receptor de serotonina 6, inibidores de p38alfa MAPK, fator de estimulação de colônia de macrófagos granulócitos re- combinantes, imunoterapias passivas, vacinas ativas (por exemplo, CAD106, AF20513, etc.), inibidores da agregação da proteína tau (por exemplo, TRx0237, cloreto de metiltionímio, etc.), terapias para melho- rar o controle do açúcar no sangue (por exemplo, insulina, exenatida, liraglutida pioglitazona, etc.), agentes anti-inflamatórios, inibidores da fosfodiesterase 9A, agonistas do receptor sigma-1, inibidores da qui- nase, ativadores da fosfatase, inibidores da fosfatase, bloqueadores do receptor de angiotensina, agonistas parciais do receptor endocanabi- noide CB1 e/ou CB2, agonistas do receptor adrenérgico β-2, agonista do receptor nicotínico da acetilcolina, agonistas inversos de 5-HT2A, an- tagonistas do receptor alfa-2c adrenérgico, agonistas do receptor 5-HT

1A e 1D, inibidores da Glutaminil-peptídeo ciclotransferase, inibidores seletivos da produção de APP, inibidores da monoamina oxidase B, an- tagonistas do receptor de glutamato, agonistas do receptor AMPA, esti- mulantes do fator de crescimento nervoso, inibidores da redutase HMG- CoA, agentes neurotróficos, agonistas do receptor M1 muscarínico, mo- duladores do receptor GABA, agonistas PPAR-gama, moduladores de proteínas de microtúbulos, bloqueadores dos canais de cálcio, agentes anti-hipertensivos, estatinas e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade exemplificativa, uma composição farmacêutica pode compreender um inibidor de quinase. Os inibidores da quinase adequa- dos podem inibir a quinase de mil e um aminoácidos (TAOK), CDK, GSK-3β, MARK, CDK5 ou Fyn. Em outra modalidade exemplificativo, uma composição farmacêutica pode compreender um ativador de fos- fatase. Como um exemplo não limitativo, um ativador de fosfatase pode aumentar a atividade da proteína fosfatase 2A.

[0115] Em cada uma das modalidades acima, um indivíduo pode ou não ser sintomático. Um “indivíduo assintomático”, como usado neste documento, refere-se a um indivíduo que não mostra quaisquer sinais ou sintomas de AD. Alternativamente, um indivíduo pode apresentar si- nais ou sintomas de AD (por exemplo, perda de memória, perder coisas, mudanças no humor ou comportamento, etc.), mas não mostrar prejuízo cognitivo ou funcional suficiente para um diagnóstico clínico de prejuízo cognitivo leve. Um indivíduo sintomático ou assintomático pode ter ami- loidose Aβ; no entanto, o conhecimento prévio da amiloidose Aβ não é um requisito para o tratamento. Em ainda outras modalidades, um indi- víduo pode ter AD. Em qualquer uma das modalidades mencionadas acima, um indivíduo pode ser portador de uma das mutações genéticas conhecidas por causar a doença de Alzheimer hereditária dominante. Em modalidades alternativas, um indivíduo pode não ser portador de uma mutação genética conhecida por causar a doença de Alzheimer hereditária dominante.

[0116] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar moda- lidades preferenciais da invenção. Deve ser apreciado pelos versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que seguem repre- sentam técnicas descobertas pelos inventores para funcionarem bem na prática da invenção. Aqueles versados na técnica devem, no entanto, à luz da presente invenção, apreciar que mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um re- sultado semelhante ou similar sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Portanto, todas as questões estabelecidas ou mostradas nas figuras anexas devem ser interpretadas como ilustrativas e não em um sentido limitativo. EXEMPLOS:

[0117] Os exemplos seguintes ilustram várias iterações da inven- ção. Exemplo 1 - Sítios de fosforilação na proteína tau no cérebro hu- mano normalnão AD

[0118] A fim de determinar os sítios de fosforilação da tau cerebral solúvel normal, os extratos de controles saudáveis foram purificados por imunocaptura usando anticorpos Tau-1 e HJ8.5 tau concentrando tau fosforilada e não fosforilada. A digestão tríptica de isoformas de tau ce- rebral gerou 27 peptídeos não modificados que eram longos e hidrofó- bicos o suficiente para serem detectados por LC-MS. (Barthélemy et al., 2016) 25 peptídeos continham serina e/ou treonina como sítios de fos- forilação potenciais. Vários peptídeos continham múltiplos sítios de fos- forilação potenciais (4-9) levando-nos a considerar diferentes peptídeos monofosforilados potencialmente coeluentes durante a separação por LC. Depois disso, o método de rastreio PRM descrito acima foi aplicado a estes peptídeos.

[0119] Os resultados da análise dos domínios de projeção na se- quência tau (103-126) revelaram múltiplos peptídeos p-tau eluindo em padrões complexos LC-MS/MS sobrepostos (FIG. 3-7). Foram identifi- cados 3 sítios de fosforilação da isoforma 0N, a isoforma mais curta da proteína tau. Embora o sistema LC não tenha a resolução para diferen- ciar os 3 peptídeos fosforilados, a identificação do fragmento e as inten- sidades correspondentes foram usadas para deconvoluir um sinal com- posto por um sítio de fosforilação principal no resíduo S113 e dois sítios de fosforilação menores nos resíduos T111 e T123 (FIG. 3). Em con- traste, quando PRM rastreia sequências de tau das isoformas 1N e 2N mais longas, foi necessária uma separação cromatográfica adicional para simplificar os padrões de eluição do peptídeo fosforilado, especial- mente quando vários sítios potenciais de monofosforilação foram predi- tos dentro da mesma sequência de peptídeo (FIG. 4-6). A separação por LC nos permitiu identificar fragmentos MS/MS semiespecíficos coe- luídos que continham resíduos diferencialmente fosforilados. No en- tanto, também foram identificados alguns sinais que podem resultar de artefatos de LC, provavelmente devido a conformações duplas do mesmo peptídeo em solução (FIG. 5). Este efeito foi importante para a sequência de peptídeo contendo os resíduos de aminoácidos 45-67 (na isoforma 0N) para os peptídeos não modificados e fosforilados (FIG. 5) e menos prevalente para as sequências 68-126 (1N) e 88-126 (2N) (FIG. 4 e 6).

[0120] A fosforilação nos resíduos S113, T111 e T123 foi confir- mada nas sequências peptídicas 68-126 (1N) e 88-126 (2N). Em todos os casos, o sinal S113 foi o mais abundante dos três com uma taxa de fosforilação de 0,2-0,5% (FIG. 4 e FIG. 6, Tabela 1). A fosforilação nos resíduos T50, T52 e S56 foi claramente identificada na sequência pep- tídica 45-67 (compartilhada pelas isoformas 1N e 2N). No mesmo pep- tídeo, os sinais LC-MS indicaram que pelo menos dois dos três resíduos

(S61, T63 e S64) foram fosforilados (FIG. 5). Nenhum sinal específico foi encontrado para identificar a fosforilação potencial no resíduo S46. A fosforilação nos resíduos S68 e T69 foi evidenciada nas sequências 68-126 (1N) e 68-87 (2N), mas nenhum fragmento específico foi detec- tado para diferenciar seus padrões LC-MS. Nas mesmas sequências de peptídeos 1N e 2N, níveis mais baixos de fosforilação foram detectados em T71. As fosforilações específicas de 2N nos resíduos T76, T101 e T102 também foram identificadas (resumidas na FIG. 8).

[0121] A indução da clivagem perdida com tripsina também foi con- siderada para o rastreio de resíduos fosforilados localizados após um sítio tríptico, conforme relatado anteriormente (sítios T175, T181, S212, T231 e S396) (Hanger et al. 1998). Esse rastreio de PRM detectou com sucesso padrões de LC-MS correspondentes a peptídeos tau fosforila- dos já descritos em tecido cerebral normal por Hanger et al (T181, S199, S202 e S404. FIG. 8). Os sinais de LC-MS correspondentes foram altos, sugerindo que os peptídeos p-tau previamente relatados em cérebros humanos normais são provavelmente os mais abundantes. A compara- ção de fosforilação S199 e S202 indicou uma abundância muito mais prevalente de fosforilação em S202 (FIG. 8). O uso de um anticorpo anti- Tau1 para extração de tau, associado a um epítopo não fosforilado na sequência de aminoácidos de 192-199, poderia explicar a baixa recupe- ração da fosforilação de S199 no extrato. Dada a abundância de fosfo- rilação de S202 e S404 no extrato, procurou-se a presença de peptídeos difosforilados das sequências 195-209 e 386-406. Foram detectados dois padrões de LC-MS com fragmentos específicos correspondentes à fosforilação dupla em S202/S199 e S202/S198 e um padrão de LC-MS correspondendo a uma fosforilação dupla em 396/404 (FIG. 8).

[0122] Rastreamentos adicionais de tau solúvel no extrato cerebral evidenciaram outros peptídeos monofosforilados menos abundantes correspondentes a resíduos fosforilados em T175, S214, T217, T231 e

S396. Sinais de fragmentos correspondentes a um peptídeo fosforilado em S184 ou S185 também foram detectados em níveis baixos quando a sequência de peptídeo monofosforilada 181-190 foi rastreada (FIG. 8). A pesquisa de monofosforilação na sequência longa 407-438 descobriu um padrão consistente com a fosforilação nos resíduos S409 e S416 e pelo menos uma fosforilação no grupo de resíduos S412/S413/T414.

[0123] No geral, Identifica-se um mínimo de 29 sítios de fosforilação únicos detectáveis na fração de tau solúvel extraída de cérebros nor- mais não AD usando o método de rastreio PRM (Tabela 1). 25 deles podem ser atribuídos inequivocamente a sinais LC-MS únicos e 4 sítios de fosforilação adicionais foram evidenciados sem atribuição aos pa- drões LC-MS exatos. Esses sítios estavam localizados em três grupos: um mínimo de 14 sítios fosforilados estavam localizados no domínio de projeção N-terminal, 10 no domínio rico em prolina no meio da sequên- cia e 6 no terminal C (FIG. 14). Tabela 1 - Comparação da taxa de fosforilação do pool de cérebro / CSF (HJ8.5 + Tau1 IP-MS). Solúvel em li- Solúvel em lisado de Sequência de sado de cére- CSF normal CSF AD Sítio fosforilado Isoforma cérebro peptídeo bro (500ul) (500ul) (1ml 10X) (1ml 500X) S46 45-67 1N/2N ? nd x x T50 45-67 1N/2N 0,5§ nd x x T52 45-67 1N/2N 2,2§ nd x x S56 45-67 1N/2N 0,01§ nd x x S61/T63/S64 45-67 1N/2N 0,5/0,2§ nd x x (2 sítios no mínimo) S68 68-126 1N 1,4/0,3§ nd x x 68-87 2N 0,3/0,05§ nd x x T69 68-126 1N 1,4/0,3§ nd x x 68-87 2N 0,3/0,05§ nd x x T71 68-126 1N 0,2§ nd x x 68-87 2N 0,02§ nd x x T76 68-87 2N 0,01§ nd x x T95 88-126 2N ? nd x x T101 88-126 2N 0,06-0,22§ nd x x T102 88-126 2N 0,06-0,22§ nd x x T111 103-126 0N 0,02§ nd 0,8§§ 8,1§§ § 68-126 1N 0,2 nd x x 88-126 2N 0,07§ nd x x S113 103-126 0N 0,2§ nd x mínima 68-126 1N 0,53§ nd x x 88-126 2N 0,59§ nd x x T123 103-126 0N 0,02§ nd x x 68-126 1N 0,02§ nd x x

88-126 2N X nd x x T153 151-155 tudo X nd x 0,8§§ T175 mc 171-180 tudo nd 0,1*§ x 0,1§ § T181 mc 175-190 tudo nd 9,5* 10,1* 13,3* S184/S185 181-190 tudo 0,1§ nd x x S199 (1) 195-209 tudo 0,29 1,3*§ 0,2*§§§ 0,2*§ S202 195-209 tudo 3,9 9,7*§ 2*§§§ 1,5* S199+S202 195-209 tudo 0,02§ nd x x S198+S202 195-209 tudo 0,01§ nd x x T205 195-209 tudo x x 2,3*§§ 4*§§ §§ S208 195-209 tudo x x 0,001 0,003§§ T212 210-221 tudo ? nd x S214 212-221 tudo 0,14 0,08§ 0,04 0,07 T217 212-221 tudo 0,43 0,5*§ 1,9*§§ 8,5*§§ § §§ T231 mc 226-234 tudo nd 0,1* 0,8* 1,4* S396 396-406 tudo 1,2§ nd x x S404 396-406 tudo 95§ 110* x x S396+S404 mc 386-406 tudo nd nd x x S409 407-438 tudo 0,3§ nd x x S411/S412/T413 § 407-438 tudo 1,2 nd x x (2 sítios no mínimo) § S416 407-438 tudo 1,0 nd x x Número de sítios únicos 29 9 12 Os valores indicam a razão fosforilada/não fosforilada em %. x: não detectado. *: medido usando os padrões internos AQUA nd: não determinado ?: não atribuído com segurança (1) provavelmente subestimado devido à menor recuperação usando a imunocaptura Tau1.` § - valor considerado normal/referência para o sítio considerado §§ - hiperfosforilação §§§ - hipofosforilação Exemplo 2 - Sítios de fosforilação na proteína tau no CSF

[0124] Em comparação com a digestão de tau no cérebro, a purifi- cação de tau no CSF usando anticorpos específicos de tau e a digestão geraram peptídeos detectáveis principalmente do domínio intermediário da sequência da proteína (resíduos 150-221). Os peptídeos foram de- tectáveis em menor extensão a partir do terminal N e quase nenhuma sequência foi detectada a partir do domínio de repetição de ligação de microtúbulo (MTBR) ou do terminal C de tau (Barthélemy et al., 2016; Sato et al., 2018). Essa diferença na recuperação do sinal pode resultar do truncamento da tau durante sua liberação dos neurônios (Sato et al., 2018). A recuperação do peptídeo deste domínio intermediário foi sufi- ciente para monitorar as isoformas fosforiladas menores corresponden- tes usando o método PRM atual. Por outro lado, um avanço tecnológico significativo no método MS será necessário para detectar peptídeos fos- forilados nos domínios MTBR e C-terminal.

[0125] O rastreio de PRM de fosfopeptídeos de tau do CSF de con- trole normal identificou vários sítios de fosforilação em comum com tau solúvel no cérebro em T181 (não mostrado), S199, S202 e T217 (FIG. 9). Um sinal baixo correspondente a pS214 também foi detectado (FIG. 9). Um padrão de fragmentação específico correspondente a pT205 foi identificado no extrato de CSF e foi separado por cromatografia dos si- nais de pS199/pS202 (FIG. 9).

[0126] Para aumentar a probabilidade de detecção de sítios fosfori- lados adicionais em tau no CSF, foram analisados os pools do CSF de pacientes com AD com demência leve a moderada. Esperou-se que os pools de CSF AD contivessem concentrações aumentadas de tau, bem como níveis aumentados de tau fosforilada. Os mesmos resíduos fosfo- rilados encontrados no CSF normal (T181, S199, S202, T217 e T231) foram detectados no CSF AD. Além disso, os sinais correspondentes a pS113 e pT175 encontrados anteriormente em tau do cérebro, mas não no CSF normal, foram detectados no CSF AD (FIG. 9, FIG. 10). Um padrão LC-MS/MS contendo fragmentos específicos e tempos de reten- ção distintos dos peptídeos fosforilados S202/S199 permitiu a identifica- ção de um novo peptídeo fosforilado em S208. Quando re-examinou-se o pS208 no CSF normal, detectou-se o sinal correspondente em baixa abundância. Um padrão LC-MS/MS correspondente a um novo peptí- deo fosforilado no resíduo T153 foi detectado próximo ao nível do pep- tídeo não fosforilado correspondente (FIG. 10). O re-exame cuidadoso dos dados do extrato do cérebro sugeriu a presença de um sinal abun- dante baixo correspondente a este local. Finalmente, foram encontrados sinais específicos correspondentes à fosforilação na sequência de ami- noácidos 103-126 da isoforma 0N em CSF AD, indicando T111 como o principal sítio de fosforilação neste peptídeo, enquanto S113 mal foi fos- forilado (FIG. 11). Ao todo, 12 sítios de fosforilação foram detectados em tau CSF, dois dos quais não foram detectáveis no lisado cerebral

(FIG. 12). Exemplo 3 - As medições de abundância de p-tau no CSF destacam as diferenças em comparação com a abundância de p-tau no cére- bro

[0127] No cérebro, S404 foi o mais altamente fosforilado dos sítios de fosforilação examinados (pS404/S404 = 110%, ou seja, 52% de S404 é fosforilado). Assim, mais da metade da tau cerebral foi fosfori- lada em S404 em comparação com outros sítios altamente fosforilados em S202 e T181 (9,7% e 9,5%, respectivamente). 1,3% de S199 foi fos- forilado, mas isso pode estar subestimado devido à incapacidade do an- ticorpo Tau1 usado para extração de se ligar ao seu epítopo fosforilado correspondente (Liu et al., 1993). A fosforilação em sítios C-terminais diferentes de S404 foi de cerca de 1%. No terminal N, T52, S68/T69, T50 e S113 também foram fosforilados com abundâncias variando de cerca de 0,5% a 2%. Outros sítios detectados pareciam ser fosforilados em níveis muito mais baixos (<0,5%).

[0128] Além da detecção única de pT205 e pS208 em tau CSF, mas não no cérebro, a abundância relativa de fosforilação de certos outros sítios de fosforilação detectados em tau cerebral foi alterada em com- paração com o controle de tau CSF (FIG. 13). Em comparação com o cérebro, a fosforilação de tau no CSF foi significativamente menor nos sítios pS199 (redução de 6 vezes, p = 0,008), pS202 (redução de 5 ve- zes, p = 0,016) e pS214 (redução de 2 vezes, p = 0,016). Por outro lado, a fosforilação de tau no CSF foi significativamente maior nos sítios pT217 (aumento de 4 vezes, p = 0,016), pT231 (aumento de 7 vezes, p = 0,016) e pT111 de 0N (aumento de 16 vezes). A abundância de PT181 foi semelhante no CSF e no cérebro (~ 10%). Quando medido no CSF AD, o pT175 permaneceu baixo (0,1-0,2% em comparação com 0,1% no cérebro).

[0129] A tau do cérebro e do CSF têm padrões de truncamento di- ferentes: as isoformas da tau do cérebro são principalmente de compri- mento total, enquanto as isoformas da tau do CSF são truncadas. Iso- formas de tau do cérebro e CSF e peptídeos correspondentes recupe- rados após IP dependem do anticorpo usado para a imunoprecipitação (Sato et al., 2018). Da mesma forma, os anticorpos usados para imuno- precipitar a tau podem impactar a recuperação da fosforilação de tau. Para avaliar este impacto na recuperação de p-tau, foram comparados os resultados de IP-MS nas taxas de fosforilação usando diferentes an- ticorpos (Tau13, HJ8.5, HJ8.7, Tau1 e Tau5), além da combinação Tau1+HJ8.5 (FIG. 14). Uma diminuição significativa da taxa de pS199/S199 foi observada quando Tau1 ou Tau1 + HJ8.5 foram usados no cérebro e CSF. Isso sugere que o truncamento do CSF entre o ter- minal N e o domínio médio pode afetar a medição da fosforilação de pS199 em comparação com o cérebro. A taxa PS199/S199 medida no cérebro e CSF com outros anticorpos parecia ser relativamente seme- lhante. Curiosamente, alguma reatividade ainda foi observada para pS199 no extrato de cérebro e em menor extensão no CSF, sugerindo ligação não específica de Tau1, embora a fosforilação de S199 esteja presente no final do epítopo Tau1 relatado (192-199).

[0130] Uma vez que a atividade da fosfatase durante o intervalo post-mortem (PMI) antes da autópsia pode diminuir a fosforilação da tau medida em extratos cerebrais, investigou-se o impacto do PMI nas taxas de fosforilação comumente encontradas no CSF e em extratos cere- brais. Foram analisadas 10 amostras de cérebros (giro frontal médio) sem patologia tau coletadas de participantes com PMI variando de 5 a 16 horas. Nenhum dos extratos cerebrais originalmente analisados tinha um PMI superior a 16 horas. Não foi encontrada associação significativa (teste de Spearman, intervalo de confiança de 95%, não mostrado) entre PMI e as taxas de fosforilação medidas nos sítios T181, S199, S202,

S214, T217, T231 e S404. Exemplo 4 - Mudança de p-tau específica de AD no CSF

[0131] O aumento da p-tau no CSF comumente relatado na AD pode ser consequência de dois efeitos potenciais: 1) o aumento global da tau, independentemente de seu estado de fosforilação, ou 2) au- mento da hiperfosforilação em sítios específicos. A normalização do si- nal ou nível de p-tau usando tau não fosforilada permite quantificar mu- danças na estequiometria de fosforilação (ou seja, hiper ou hipo-fosfori- lação em comparação com CSF normal ou tau cerebral) ocorrendo em sítios específicos independentemente da mudança global na tau total. Como foi demonstrado recentemente, a produção de tau solúvel é au- mentada na AD e se correlaciona com as placas amiloides. Portanto, controlar não apenas a quantidade, mas a taxa de fosforilação é a chave para entender. pT181, pT217, pT231, pT205, pS208 e pS214 foram hi- perfosforilados em CSF AD como era pT111 específico de 0N (FIG. 13). pT153 e pT175 não foram detectados em não AD e provavelmente au- mentaram ligeiramente em AD. Os sítios que mostraram hiperfosforila- ção significativa em comparação com não AD foram pT181 (p = 0,010), pS214 (p = 0,005) e pT217 (p = 0,003). pT181, pS214 e pT217 mostra- ram aumentos de aproximadamente 1,2 vezes, 1,6 vezes e 4 vezes na fosforilação, respectivamente. Curiosamente, nem todos os sítios moni- torados foram hiperfosforilados: pS199/S199 não foi significativamente alterado e pS202/S202 foi significativamente menor (p = 0,030) com uma diminuição de aproximadamente 1,2 vezes.

[0132] A robustez das razões de fosforilação foi avaliada incubando CSF durante 16 horas. A incubação não afetou significativamente as diferenças de razão de fosforilação de tau observadas entre não AD e CSF AD (FIG. 15). Além disso, a ausência de atividade da quinase no CSF tau foi confirmada pela não detectabilidade da fosforilação no 15N-

tau recombinante incrementado no CSF após a incubação (não mos- trado). Discussão para os Exemplos 1-4

[0133] Avanço tecnológico do PRM na medição de p-tau - Foram relatadas as análises qualitativas e quantitativas mais abrangentes de p-tau em tecido cerebral normal e CSF até o momento. Essa abordagem contrasta com os estudos anteriores de DDA sobre a fosforilação de tau, que podem não ter capturado potenciais sítios de fosforilação menores. No entanto, essa abordagem usa MS-alvo altamente sensível no modo PRM para detectar e quantificar a fosforilação menor. A identificação do sítio de fosforilação depende da interpretação manual cuidadosa dos padrões LC-MS/MS para identificar a coeluição de fragmentos de íons específicos para cada fosfopeptídeo examinado. Em estudos anteriores, a fosforilação da tau cerebral foi investigada principalmente em extratos insolúveis enriquecidos em tau hiperfosforilada de PHF e, até o mo- mento, o estudo mais detalhado relatou 9 sítios de fosforilação na pro- teína tau humana normal (Hanger et al. 2007). Essa análise de dados PRM em profundidade detectou mais de 29 resíduos fosforilados com a maioria sendo muito baixa em abundância. Na verdade, os 9 sítios rela- tados anteriormente estavam entre as modificações mais abundantes na proteína. A aplicação da análise de PRM à tau de CSF normal, pre- sente em abundância muito menor em comparação com o cérebro, le- vou à detecção de 9 sítios de fosforilação inicialmente, com 3 sítios adi- cionais detectados em CSF AD.

[0134] Além do número significativamente aumentado de sítios de fosforilação detectados, foi demonstrado como o rastreio PRM sensível nos permitiu avaliar quantitativamente a taxa de fosforilação de tau ou estequiometria, independente da concentração global de tau. Este con- ceito é frequentemente esquecido, mas crítico na avaliação de mudan-

ças na AD quando a concentração absoluta de p-tau no CSF pode au- mentar apenas devido ao aumento na concentração de isoformas de tau global, e não devido à mudança da abundância relativa de tau fosfori- lada. A medição da taxa de fosforilação deste estudo permitiu, pela pri- meira vez, a comparação do grau e distribuição das alterações da taxa de fosforilação (hiper vs hipo-fosforilação) através da proteína, em dife- rentes compartimentos (cérebro intracelular vs CSF extracelular) e em diferentes condições patológicas (AD vs não AD).

[0135] Algumas ressalvas do processo de rastreio PRM são o baixo rendimento para descoberta e o risco de espécies de p-tau ausentes ou outra modificação pós-tradução (PTM) não hipotetizada no estudo. As identificações de dados de MS podem ser usadas posteriormente em uma validação maior ou coorte clínica para projetar métodos LC-MS pro- gramados, aumentando a multiplexação e o rendimento (Gillette and Carr, 2013). Outras proteases, como AspN, podem fornecer um con- junto diferente de peptídeos tau e p-tau do que a digestão com tripsina, permitindo uma melhor cobertura de tau, ou seja, o domínio C-terminal (Hanger et al. 1998; Sato et al. 2018). A pesquisa poderia ser mais refi- nada pelo rastreio de peptídeos tau duplamente ou triplamente fosfori- lados não considerados neste estudo, embora sua abundância possa ser mínima, a menos que haja coordenação biológica de fosforilação no sítio.

[0136] Identificação de um agrupamento de sítios de fosforilação no domínio de projeção da tau - Foi encontrado um agrupamento de resí- duos fosforilados anteriormente não descritos no domínio de projeção do terminal N de tau contendo peptídeos dependentes de emenda alter- nativa. Curiosamente, este domínio não foi previamente encontrado para ser extensivamente fosforilado em PHF na fração insolúvel do cé- rebro humano (Funk et al., 2014; Hanger et al., 2007; Russell et al.,

2016; Thomas et al., 2012). Este agrupamento também não foi ampla- mente caracterizado no recente estudo abrangente realizado na prote- ína tau de camundongo no cérebro de murino (Morris et al., 2015). Es- sas discrepâncias podem ser atribuídas à dificuldade de caracterizar misturas complexas de peptídeos fosforilados, distinguíveis apenas por alguns fragmentos de MS/MS específicos e/ou deslocamento sutil do tempo de retenção em LC. Por exemplo, S46 é o único sítio fosforilado previamente relatado neste domínio em tau humana normal (Hanger et al. 1998). No entanto, não foi detectado um sinal específico para esta espécie, que pode ser confundido por algoritmos de busca com sítios fosforilados vizinhos em T50 ou T52, compartilhando um padrão de fra- gmentação próximo. A este respeito, a inspeção manual é essencial para interpretar e decifrar claramente os padrões LC-MS/MS correspon- dentes para cada sítio fosforilado. Outra possível explicação para esta discrepância poderia ser a abundância relativamente baixa do domínio N-terminal em PHF em comparação com o domínio MTBR, o domínio intermediário e o C-terminal (Mair et al., 2016).

[0137] Este domínio de projeção N-terminal foi recentemente atribu- ído como parte do componente dominante da barreira repulsiva que evita que microtúbulos vizinhos (associados a tau por meio do domínio MTBR) se aproximem (Chung et al., 2016). Esta sequência contém nu- merosos resíduos acídicos e um aumento na fosforilação pode contribuir para o aumento da acidez global, reforçando a barreira repulsiva. Jun- tamente com uma quantidade variável de extensão N-terminal induzida por emenda alternativa no éxon 2-3, a fosforilação de tau pode regular as interações tau/tau N-terminal e a distância intermolecular dos mi- crotúbulos.

[0138] Implicações biológicas de diferentes perfis de p-tau no cére- bro vs CSF - Tau é principalmente uma proteína intracelular que funci-

ona na estabilidade dos microtúbulos e era tradicionalmente conside- rada como sendo liberada apenas extracelularmente após lesão do nervo ou morte celular. No entanto, estudos recentes sugeriram que a tau é secretada em condições fisiológicas e patológicas de maneira re- gulamentada (Karch et al. 2012; Yamada et al. 2014). Ao comparar os perfis de tau cerebral solúvel e de tau no CSF em paralelo aos perfis de tau intracelular e extracelular e ao metabolismo em modelos neuronais, mostrou-se recentemente que a secreção de tau é um processo ativo que envolve diferentes taxas de renovação de isoformas de tau, inclu- indo tau truncada e p-tau (Sato et al., 2018). Compreender a associação entre essa secreção ativa e a fosforilação de tau por meio da compara- ção entre os perfis de p-tau do cérebro e do CSF fornece uma visão potencial da patogênese de AD.

[0139] Especulou-se que as isoformas p-tau enriquecidas no CSF têm menos afinidade para microtúbulos e uma maior probabilidade de serem secretadas. Inversamente, as isoformas p-tau empobrecidas no CSF poderiam ter mais propensão a permanecer dentro dos neurônios e/ou evitar a clivagem. Esses resultados demonstram que vários resí- duos fosforilados são significativamente enriquecidos no CSF em com- paração com extratos cerebrais, como T217, T231, T153 e T111. Todos são sítios dirigidos pela prolina, são substratos potenciais da proteína quinase GSK-3β e podem estar indivíduos à regulação dependente da quinase. Ao contrário do pT217, o pS214 não foi elevado no CSF em comparação com o cérebro. Este enriquecimento extracelular de pT217 sobre pS214 concordou com diferenças cinéticas que foram identifica- das previamente dentro das células para essas isoformas (Sato et al., 2018), com pT217 tendo uma taxa de renovação mais curta do que tau não fosforilada e tau-pS214. Alternativamente, a diminuição da fosfori- lação observada em alguns dos sítios tau no extrato cerebral em com- paração com o CSF também pode resultar da desfosforilação parcial que ocorre durante o PMI (Matsuo et al., 1994). Embora tal diminuição não tenha sido observada dentro da faixa de PMI de 5-16 horas, a mo- dificação das razões de fosforilação entre a morte e este intervalo inves- tigado não pode ser excluída. A avaliação da cinética de desfosforilação desses sítios tau a partir de biópsias cerebrais por espectrometria de massa ajudaria a abordar o impacto desse fenômeno nos resultados de comparação CSF/cérebro no futuro. A consideração do potencial envie- samento da fosfatase cerebral que afeta a medição da fosforilação da tau no cérebro apoiaria que o status de fosforilação de tau no CSF é mais provável de refletir o status de fosforilação de tau in vivo em neu- rônios do que os extratos cerebrais coletados post mortem. No entanto, o monitoramento da fosforilação de tau in vivo em CSF seria limitado a sítios detectados principalmente no domínio médio de tau devido ao truncamento de tau no CSF.

[0140] Por outro lado, o pS202 foi significativamente menor no CSF e o pS199 e o pS202 não foram elevados na AD, indicando que essas fosforilações podem promover o sequestro de tau dentro dos neurônios. T181 é igualmente fosforilado no CSF e no cérebro. O pT205 e o pS208 foram detectados exclusivamente em tau no CSF e não na proteína tau solúvel no cérebro. Isso é interessante considerando que a fosforilação tripla em S202, T205 e S208 é reconhecida pelo anticorpo (Malia et al., 2016) anti-AT8 comumente usado para caracterizar os estágios de Braak da agregação de tau no cérebro (Braak and Braak, 1995). De fato, o pS208 foi detectado por MS em PHF (Hanger et al. 1998). O pT205 e o pS208 estavam ausentes na tau cerebral solúvel normal nesse estudo, confirmando a improbabilidade de detectar imunorreatividade de AT8 na tau cerebral normal. Além disso, um estudo recente implica o pT205 e o pS208 como um padrão de fosforilação combinacional que, juntamente com o pS202, leva à autoagregação de tau (Despres et al., 2017). A presença exclusiva de pT205 e pS208 no CSF e taxas ainda mais ele- vadas de fosforilação em ambos os sítios em AD podem indicar um po- tencial mecanismo de eliminação de proteção para neurônios para re- mover essas espécies p-tau com tendência à patologia das células. A diminuição simultânea de pS202 em CSF AD também pode correspon- der a um sequestro aumentado de isoformas associadas quando agre- gadas a pT205 e pS208 em emaranhados AT8-positivos enriquecidos no cérebro de AD. Alternativamente, a ausência de fosforilação em pT205 e pS208 em extratos cerebrais pode resultar de sua degradação específica por fosfatases que ocorrem durante o PMI. O rápido desapa- recimento (<3 horas) da reatividade do AT8 relatado na tau, coletada da biópsia do cérebro, apoia essa ideia (Matsuo et al., 1994). Assim, essa atividade de fosfatase direcionando pT205 e pS208 de forma eficaz tam- bém pode ser vista como um mecanismo adicional de prevenção de meia-vida longa de material AT8 positivo em neurônios. O aumento de pT205 e pS208 encontrado no CSF AD indicaria então uma diminuição potencialmente patológica deste mecanismo de proteção. Finalmente, a diminuição simultânea de pS202 em CSF AD também pode correspon- der a um sequestro aumentado de isoformas associadas quando agre- gadas a pT205 e pS208 em emaranhados AT8-positivos enriquecidos no cérebro de AD.

[0141] Não se foi de fornecer detecção convincente de resíduos fos- forilados do domínio MTBR na fração solúvel do cérebro normal. Os sí- tios de fosforilação no domínio MTBR têm sido considerados para redu- zir a afinidade da tau para os microtúbulos (Biernat et al., 1993). A au- sência de tal fosforilação na tau normal poderia apoiar a anormalidade dessas modificações encontradas em PHF (Hanger et al. 2007). O trun- camento de tau no CSF restringe o exame de alterações de fosforilação in vivo uma vez que o domínio MTBR provavelmente se degradou den-

tro da célula após o truncamento de tau (Kanmert et al., 2015), e por- tanto, não foi recuperado pelo método de imuno-captura usado neste estudo.

[0142] Taxas de p-tau do CSF como biomarcadores de AD - além do número significativamente aumentado de sítios de fosforilação de- tectados, demonstrou-se como a taxa de fosforilação de tau ou estequi- ometria pode ser quantificada independentemente da concentração glo- bal de tau. Este conceito é frequentemente esquecido, mas é crítico na avaliação das mudanças de fosforilação de tau no CSF em AD quando a concentração absoluta de p-tau no CSF pode aumentar apenas devido ao aumento da concentração de tau total (ou seja, pT181), e não devido a um aumento na própria taxa de fosforilação relativa. As medições da taxa de fosforilação deste estudo permitiram, pela primeira vez, a com- paração do grau e distribuição das alterações da taxa de fosforilação (hiper vs hipofosforilação) através da proteína, em diferentes comparti- mentos (cérebro intracelular vs CSF extracelular) e em diferentes con- dições patológicas (AD vs não AD). Este método pode ser usado no futuro para observar as modificações das fosforilações cerebrais da AD em vários sítios nas regiões do cérebro e estágios de Braak, como re- centemente realizado usando imunoquímica (Neddens et al. 2018).

[0143] Neste estudo, demonstrou-se que a tau no CSF AD é geral- mente hiperfosforilada em comparação com o CSF não AD. No entanto, o grau de hiperfosforilação depende do sítio. T111, T205, S208 e T217 foram mais hiperfosforilados do que T181, que é o alvo medido mais comumente usado como um biomarcador p-tau para AD (Fagan et al. 2009). Também foi identificada a fosforilação de T153 que foi encon- trada exclusivamente em CSF AD. Curiosamente, os sítios hiperfosfori- lados no CSF AD correspondem aos sítios já significativamente aumen- tados no CSF normal em comparação com o cérebro (ou seja, T111, T205, S208 e T217 e, em menor extensão, T231). Isso indicaria que a patologia da AD exacerba os mecanismos celulares que contribuem para o enriquecimento de isoformas p-tau específicas durante a libera- ção de tau no CSF. No geral, a alta magnitude da mudança encontrada nesses sítios nos permite imaginar seu uso como biomarcadores sensí- veis para detectar AD. Esse estudo baseou-se em um número limitado de pools de CSF e estudos futuros em coortes maiores de CSF estabe- leceriam melhor as relações potenciais entre as alterações de p-tau e amiloidose cerebral e agregação de tau ao longo do curso da doença. Também pode-se perguntar se há alguma mudança específica no perfil da p-tau em outras tauopatias não AD, como PSP, CBD e FTD. Alterna- tivamente, este método pode ser usado para rastrear diferentes ativida- des de quinase in vivo e in vitro e também pode fornecer uma ferramenta promissora para avaliar novas drogas que direcionam o metabolismo anormal de tau. Métodos para os Exemplos 1-4

[0144] Extração de tau solúvel no cérebro - Estudos de cérebro e CSF envolvendo participantes foram aprovados pelo Comitê de Estudos Humanos da Washington University e pelo Centro de Pesquisa Clínica Geral. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os par- ticipantes antes da inclusão no estudo. A tau solúvel no cérebro foi ex- traída conforme descrito anteriormente (Sato et al., 2018). Resumida- mente, tecidos cerebrais humanos congelados de controles sem ami- loide e patologias tau, conforme descrito antes (Sato et al., 2018), foram obtidos do Centro de Pesquisa da Doença de Alzheimer Knight (ADRC) na Escola de Medicina da Universidade de Washington (St. Louis, MO). A tau solúvel em sarcosil foi separada dos agregados putativos de tau por ultracentrifugação, conforme relatado na literatura (Hanger et al. 1998), e agrupada. Cérebros humanos congelados (200-400 mg, regi- ões frontais) foram homogeneizados em tampão Tris-HCl (Tris-HCl 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, EGTA 10 mM, 1mMDTT, Cocktail 3 inibidor de fosfatase, inibidor de protease Roche, pH 7,4. 3,25mL/mg de tecido final) em gelo. Os homogenatos foram centrifugados a 4°C du- rante 60 minutos a 11.000xg. O sobrenadante foi solubilizado em Sarkosyl a 1% por 60 min. e centrifugado por 2 h a 100.000xg. As fra- ções solúveis em sarcosil foram reunidas e a fração de 50uL foi diluída 10 vezes com 0,5% de plasma humano antes da imunoprecipitação. Para comparação cérebro/CSF, o conjunto de lisado de cérebro foi dilu- ído de 500 a 8000 vezes antes da imunopurificação para corresponder aos níveis de tau no CSF.

[0145] Extração de tau de CSF - CSF humano foi coletado de uma coorte de 80 participantes, incluindo controles amiloide negativos e cog- nitivamente normais (CDR = 0) (n = 47, idade 60+) e pacientes com amiloide positivo e CDR > 0 com AD (n = 33, 60+ anos ou mais). Cinco e sete pools de 500uL de alíquotas de CSF foram gerados a partir dos grupos de controle e AD, respectivamente. No momento da coleta ini- cial, o CSF foi centrifugado a 1.000xg por 10 min. para remover os resí- duos celulares e imediatamente congelado a -80°C. O coquetel de inibi- dores de protease foi adicionado durante os experimentos. A tau foi imu- noprecipitada e dessalinizada conforme descrito anteriormente com al- gumas modificações (Sato et al., 2018). Resumidamente, grânulos de Sepharose ativados com CNBr (GE Healthcare 17-0430-01) foram reti- culados aos anticorpos Tau1 e HJ8.5, separadamente a uma concen- tração de 3 mg de anticorpo por g de grânulos. As amostras são enri- quecidas com peptídeos AQUA (ThermoFisher Scientific) correspon- dendo a 10 fmol fosforilada e 100 fmol de tau não fosforilada para cada sequência de interesse por mL de amostra. A concentração de tau e p- tau é calculada usando esses padrões internos. A tau solúvel foi imuno- precipitada em detergente (1% NP-40), reagente caotrópico (guanidina 5 mM) e inibidores de protease (Roche Complete Protease Inhibitor

Cocktail). Anticorpos anti-Tau1 e HJ8.5 conjugados com esferas de se- farose foram diluídos 10 e 5 vezes, respectivamente, em esferas de se- farose inativados, e 30uL de pasta de 50% das esferas de anticorpo foram girados com a solução por 90 min. em temperatura ambiente. As esferas foram lavadas três vezes em tampão de bicarbonato de trietila- mônio 25 mM (TEABC, Fluka 17902). A tau ligada foi digerida em esfe- ras com 400 ng de tripsina de grau MS (Promega, V5111) durante 16 horas a 37°C. Os digestos foram carregados em TopTip C18 (Glygen, TT2C18.96), dessalinizados e eluídos de acordo com as instruções do fabricante. Os peptídeos eluídos foram secos por centrifugação a vácuo (CentriVap Concentrator Labconco) e foram ressuspensos em 25uL de uma solução de 2% de acetonitrila e 0,1% de ácido fórmico em água grau MS.

[0146] Espectrometria de massa - Uma alíquota de 5uL da ressus- pensão do peptídeo foi injetada em LC nano-Acquity para análise de MS. O nano-Acquity LC (Waters Corporation, Milford, MA) foi equipado com HSS T3 75umx 100um, coluna de 1,8um e uma taxa de fluxo de 0,5 uL/min de um gradiente de solução A e B foi usada para separar os peptídeos. A solução A era composta por 0,1% de ácido fórmico em água grau MS e a solução B era composta por 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila. Os peptídeos foram eluídos da coluna com um gradiente de 2% a 20% da solução B em 28 minutos, em seguida, 20% a 40% da solução B por mais 13 minutos antes de aumentar para 85% da solução B em mais 3 minutos para limpar a coluna. O Orbitrap Fusion Lumos foi equipado com uma fonte de íons de eletropulverização Nanospray Flex (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). Íons de peptídeos pulveriza- dos de um emissor SilicaTip de 10um (New Objective, Woburn, Ma) na fonte de íons foram direcionados e isolados no quadrupolo. Estes foram então fragmentados por HCD e fragmentos de íons foram detectados no Orbitrap (resolução de 60.000, faixa de massa 150-1200 m/z). O mo- nitoramento de peptídeos hidrofílicos (SSRcalc &lt;<9, todos sem leu- cina) para o perfil de peptídeo foi realizado em uma coluna HSS T3 300um x 100um, 1,8 mm a uma taxa de fluxo de 4ul/min com uma elui- ção ocorrendo com uma solução B de 2% a 12% gradiente e uma pul- verização operando em um emissor SilicaTip de 30 mm.

[0147] Princípios de PRM para descoberta de peptídeos p-tau - Os peptídeos tau contendo sítios de fosforilação hipotéticos foram gerados pela digestão de proteínas de um extrato biológico enriquecido com tau, como a fração solúvel do cérebro humano. Esses peptídeos são rastre- ados por análise de MS-alvo usando um instrumento quadrupolo-orbi- trap, como o Thermo Fisher Orbitrap Lumos. Para cada peptídeo fosfo- rilado, a seleção de parâmetros de MS-alvo, como massa precursora, energia de colisão ou tempo de retenção esperado, é realizada in silico e refinada usando propriedades biofísicas medidas para os peptídeos não modificados correspondentes que são muito mais abundantes na amostra. Para detectar peptídeos fosforilados, o quadrupolo é definido para selecionar uma janela de massa incluindo a massa do precursor hipotético. Após a colisão do precursor, todos os fragmentos gerados são medidos simultaneamente no Orbitrap ao longo do tempo de eluição cromatográfica. Peptídeos potencialmente fosforilados podem ser pes- quisados na pós-análise dos dados gerados. O software Skyline (Mac- Coss Lab, University of Washington, WA) foi usado para extrair os dados LC-MS/MS. O peptídeo hipotético sendo rastreado é detectado como uma impressão digital LC-MS/MS constituída pela coeluição estrita das massas extraídas dos fragmentos MS/MS previstos (FIG. 2). A vanta- gem do método PRM sobre os métodos clássicos de DDA ou MS dire- cionado é sua capacidade de usar o instrumento MS na configuração mais sensível possível e conservar a capacidade de descoberta.

[0148] A sensibilidade máxima do instrumento Quadrupolo-Orbitrap durante o rastreio é essencial para detectar fragmentos de íons menores e facilita a identificação de peptídeo fosforilado juntamente com a loca- lização de sítios fosforilados. A sensibilidade da medição PRM depende principalmente do número de íons do alvo de interesse transferidos para o analisador Orbitrap. Esse número foi aprimorado aumentando o tempo de preenchimento usado para adquirir uma varredura MS/HRMS. O tempo de preenchimento corresponde ao tempo gasto para acumular a massa precursora alvo do feixe de íons no dispositivo de captura de íons. Os precursores acumulados são então fragmentados e os frag- mentos do produto são transferidos para o Orbitrap para serem analisa- dos. Assim, o tempo de preenchimento é definido para um máximo limi- tado pela necessidade de uma taxa de varredura MS suficiente para adquirir pontos de dados suficientes para descrever o sinal do cromato- grama (ou seja, 8-15 varreduras por pico cromatográfico). O tempo de preenchimento para o rastreio PRM em cada peptídeo fosforilado inves- tigado foi tipicamente definido como 1 segundo.

[0149] O tempo de preenchimento também é limitado pelo risco de saturação da armadilha. Isso ocorre quando muitos íons são amostra- dos na mesma varredura e transferidos para o Orbitrap, levando a me- dições de massa imprecisas devido aos efeitos da carga espacial. Para evitar tal saturação, o isolamento estreito do precursor (0,7Da) junto com a purificação da amostra apropriada (imuno purificação) enrique- cendo o alvo sobre a matriz foram escolhidos para diminuir a contribui- ção de potenciais interferências quase isobáricas.

[0150] A especificidade do experimento de descoberta do PRM de- pende do poder de resolução do sistema LC-Q Orbitrap. O poder de resolução pode ser melhorado por diferentes parâmetros analíticos, com o objetivo final de obter impressões digitais LC-MS/MS sem inter- ferência para os peptídeos direcionados. Isso limita o risco de atribuição ambígua de fragmentos devido a falsos sinais positivos. A purificação da amostra enriquecendo preferencialmente p-tau também pode melho- rar a especificidade na descoberta de peptídeos de tau fosforilados me- nores. A alta capacidade de pico cromatográfico e resolução limitam a probabilidade de coeluição. Uma janela de isolamento quadrupolo es- treita para o precursor diminui a probabilidade de interferência no es- pectro MS/MS juntamente com a limitação do risco de saturação da ar- madilha, conforme descrito acima. A alta resolução do Orbitrap e a cali- bração do analisador permitem a extração precisa de fragmentos de massa durante a limitação do processamento de dados, o risco de in- terferência de transições (Gallien et al., 2012; Peterson et al., 2012). A escolha da resolução Orbitrap (60k) é um equilíbrio entre a alta resolu- ção que requer mais tempo de aquisição e taxas de varredura razoáveis compatíveis com a aquisição cromatográfica.

[0151] Avaliação quantitativa da taxa de fosforilação específica do sítio de tau - Para avaliar quantitativamente a abundância relativa de fosforilação de sítios específicos em tau do cérebro e CSF, foi medida a extensão da fosforilação em cada sítio detectado. Foram usados três métodos para este propósito: 1) Comparação relativa entre isômeros de peptídeos fosforilados: A comparação de sinais de íons de transição é usada para identificar cada sítio fosforilado. Isso pode estimar a abun- dância relativa de cada peptídeo fosforilado compartilhando a mesma sequência. 2) Os peptídeos fosforilados são normalizados com o peptí- deo não fosforilado como referência: A transição LC-MS/MS específica para cada peptídeo fosforilado é comparada com a transição correspon- dente do peptídeo não fosforilado. Cada razão de sítio fosforilado obtida pode ser comparada através da sequência da proteína. Esta estratégia pode ser influenciada pela diferença na eficiência de fragmentação en- tre os peptídeos não fosforilados e fosforilados. Este método não pode ser aplicado quando os sítios fosforilados fazem parte de uma clivagem tríptica perdida. 3) Quantificação absoluta usando padrões internos sin- téticos marcados (por exemplo, AQUA) para cada peptídeo fosforilado e não fosforilado: Sinais de padrões fosforilados e não fosforilados são usados para definir uma razão interna. Esta estratégia leva em conside- ração a especificidade de fragmentação de cada peptídeo comparado, mas requer a síntese de peptídeos para cada espécie monitorada.

[0152] Neste estudo, exceto para aqueles que incluem clivagem perdida com tripsina, o segundo método foi utilizado para calcular as taxas de fosforilação. Também foi aplicado o terceiro método (normali- zação AQUA) em um conjunto limitado de sítios fosforilados encontra- dos no cérebro e em extratos de CSF quando os peptídeos fosforilados sintéticos estavam disponíveis (ou seja, T175, T181, S199, S202, T205, T217 e T231) e um sítio encontrado apenas no cérebro (S404) (Tabela 1). Para a medição AQUA, os extratos cerebrais foram diluídos 500 a

8.000 vezes para serem comparáveis aos níveis de tau no CSF. Esta diluição minimizou o efeito da matriz que pode resultar de razões signi- ficativamente diferentes de padrão interno AQUA para níveis de peptí- deo tau no cérebro versus CSF. O primeiro método foi usado para a interpretação inicial dos padrões complexos de LC-MS/MS da sequên- cia p-tau contendo vários resíduos fosforilados.

[0153] Estatísticas - Os dados são representados como média ± SD, a menos que especificado de outra forma. Depois de confirmar a distri- buição normal dos dados, uma ANOVA de uma via seguida por análises post hoc (teste de Tukey) foram realizadas para comparar as taxas de fosforilação de tau. A análise estatística adicional foi concluída usando GraphPad versão 8.0.1 (244) da GraphPad Software Inc. A significância estatística entre os grupos relevantes foi determinada com um teste t de Mann-Whitney bicaudal não pareado. A significância foi avaliada no ní- vel 0,01 e 0,05. Referências para os Exemplos 1-4

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[0187] A taxa de valor de captação padrão (SUVR) do PiB-PET cor- tical identifica de forma confiável placas Aß corticais significativas e é usada para classificar os indivíduos como PIB positivo (Amyloid +, SUVR  1,25) ou negativo (Amyloid -, SUVR  1,25). Para explorar a relação entre as placas amiloides e as espécies de tau solúvel, compa- rou-se o SUVR do PiB-PET cortical com a tau total do CSF e com a fosforilação da tau no CSF em vários sítios (ou seja, a razão de sítios fosforilados e não fosforilados de tau). (FIG. 16A) A fosforilação de tau em Thr217 (p-T217) teve uma área sob a curva de 97,2% (AUC) (inter- valo de confiança de 95% (CI) de 0,94, 0,99)); a fosforilação de tau em Thr181 (p-T181) teve uma AUC de 89,1% (CI 0,83, 0,94); a fosforilação de tau em Thr205 (p-T205) teve uma AUC de 74,5% (CI 0,69, 0,82); e a tau total tinha uma AUC de 72% (CI 0,65, 0,79) para classificar os por- tadores de mutação (MC) como tendo placas Aβ corticais (isto é, Ami- loide +). Estes dados indicam que nas fases iniciais de placas fibrilares positivas Aβ significativas, um aumento de fosforilação já começou em sítios específicos que ligam estes dois processos no tempo. Estes da- dos também demonstram que um aumento na razão fosforilada para não fosforilada de T217 pode servir como um marcador de diagnóstico sensível para a patologia da placa fibrilar Aβ.

[0188] Em seguida, compararam-se as razões médias de fosforila- ção padronizadas de quatro sítios de fosforilação e os níveis totais de tau por quartis PiB-PET SUVR para explorar a relação entre a carga de placa Aβ total e a fosforilação, FIG. 16B. Todos os sítios de fosforilação, exceto Ser202 (p-S202), demonstraram fosforilação aumentada com maior patologia de placa Aβ. Diferenças entre os outros três sítios tam- bém foram descobertas. p-T217 e p-T181 mostraram os maiores au- mentos após o início das placas (quartis 2-3), mas a magnitude desses aumentos diminuiu com maior carga de placa; em contraste, os aumen- tos na fosforilação em p-T205 e os níveis de tau total continuaram a crescer junto com as placas Aβ. Esses resultados sugerem que os even- tos que inicialmente levam ao aumento da fosforilação de tau na AD estão provavelmente relacionados à patologia da placa Aβ, potencial- mente por meio da regulação de quinases e fosfatases distintas que são específicas do sítio de fosforilação. Além disso, os dados sugerem que p-T217 poderia servir como um biomarcador substituto para a patologia de placa Aβ fibrilar, identificando uma assinatura potencialmente única de processamento de tau relacionado a Aβ. É importante ressaltar que entre os não portadores de mutação (NCs), os únicos participantes que mostraram um aumento na fosforilação em T217 foram aqueles que eram PiB+ (SUVR > 1,25, n = 4).

[0189] Em seguida, foi avaliado se a fosforilação de tau específica do sítio estava associada à distribuição anatômica da patologia da placa Aβ cerebral, explorando as correlações entre os sítios de fosforilação de tau específicos e as regiões corticais e subcorticais da deposição de placa amiloide medida por PiB-PET SUVR, FIG. 16C. A fosforilação em T217, T181 e T205 correlacionou-se positivamente com as placas Aβ em todo o cérebro, mas a fosforilação em S202 foi correlacionada ne- gativamente. No precuneus, uma região de deposição de placa amiloide precoce, as correlações com isoformas de tau foram comparadas com base na força da regressão bivariada controlando idade, sexo e anos estimados para o início dos sintomas (EYO) e ajustados para compara- ções múltiplas. Foi encontrada uma ordem de classificação de correla- ções de p-T217 ( =0,68, p < 10-30), p-T181 ( =0,46, p < 10-6), p-T205 ( =0,41, p < 10-5), e tau total ( =0,35, p < 0,001) com correlações po- sitivas com placas Aβ. Em contraste, p-S202 teve uma correlação in- versa ( = -0,47, p < 10-7), sugerindo que a fosforilação neste sítio é reduzida com o aumento da patologia Aβ. Essas relações estavam pre- sentes em MCs pré-sintomáticos quando há pouca evidência de neuro- degeneração, sugerindo que o aumento da tau fosforilada no CSF não é uma consequência da liberação passiva de neurônios morrendo, mas mais provavelmente um processo ativo relacionado à presença de pa- tologia de placa de Aβ22. Exemplo 6: O estágio e a progressão da doença estão associados a diferenças específicas do sítio na hiperfosforilação de tau e taxas longitudinais de mudança

[0190] A certeza do início da doença e a previsibilidade do início dos sintomas de DIAD permitem o estagiamento de indivíduos com base em 9,10,30 EYO (ou seja, a idade de um indivíduo no momento da avaliação em relação à idade de início de outros com a mutação). Em seguida, foi determinado se havia diferenças temporais no padrão de fosforilação da tau no CSF.

Isso foi feito estimando as diferenças na quantidade e taxa de mudança na fosforilação ao longo do tempo entre MCs e NCs com base em EYO.

Houve duas descobertas importantes.

Primeiro, havia evidências de que aumentos na tau total e na fosforilação em sítios es- pecíficos ocorreram em uma ordem discreta: a fosforilação de T217 ocorreu em torno de -21 EYO, e foi seguida pela fosforilação de T181 em torno de -19 EYO, então um aumento na tau total em torno de - 17 EYO e, em seguida, fosforilação de T205 em torno de -13 EYO (FIG. 17A-F). O aumento inicial na fosforilação em T217, e em menor exten- são em T181, ocorreu em um momento semelhante a quando as placas Aβ começaram a aumentar (-19 EYO). Em segundo lugar, a razão de fosforilação de T217 e T181 começou a diminuir significativamente pró- ximo ao início dos sintomas, enquanto a fosforilação em T205 perma- neceu elevada e os níveis de tau total continuaram a aumentar.

Digno de nota, a concentração de todos os peptídeos não fosforilados aumen- tou com a progressão da doença (dados não mostrados) sugerindo que a diminuição na razão de fosforilação para T217 e T181 não foi resul- tado de um aumento desproporcional em peptídeos não fosforilados es- pecificamente abrangendo esses sítios.

Para S202 não houve alteração significativa na fosforilação ao longo do curso da doença, FIG. 17E.

Es- ses resultados indicam que a fosforilação de tau ocorre de forma dife- rente para cada sítio, aumentando ou diminuindo em sítios específicos por estágio da doença.

Essas mudanças específicas do sítio sugerem uma cascata de mudanças na tau solúvel que é mais dinâmica do que se percebia anteriormente e que a tau não aumenta monotonicamente nos estados ou razões de fosforilação. O surgimento de placas amiloi- des Aβ e o início do declínio clínico, separados por duas décadas, mar- cam duas importantes demarcações de estágios durante os quais a fos- forilação da tau solúvel muda. Exemplo 7: Os marcadores de neuroimageamento da progressão da doença estão associados a diferenças específicas do sítio na hiperfosforilação de tau

[0191] Além de estimar o início dos sintomas usando o histórico fa- miliar (EYO), a progressão da doença no DIAD também pode ser esti- mada usando medidas de neuroimageamento que rastreiam vários componentes da progressão da doença, por exemplo, atrofia cerebral e declínio metabólico. Estas medidas demonstraram mudar em diferentes períodos de tempo antes do início dos sintomas, com declínio do meta- bolismo cerebral (medido por [F18] fluorodeoxiglicose [FDG]-PET) ocor- rendo até 18 anos e atrofia cerebral (determinada por MRI) ocorrendo 28,31-33 até 13 anos antes do início dos sintomas . Isso levanta a questão de saber se esses biomarcadores estão igualmente correlacionados com a fosforilação de tau em sítios específicos. Para examinar isso, fo- ram realizadas correlações transversais bivariadas entre os sítios de fosforilação e tau total com medições de imageamento de 34 regiões cerebrais corticais e 6 subcorticais, controlando por sexo, idade e EYO. Concentraram-se as análises em MCs assintomáticos, a fim de identifi- car quaisquer associações nos estágios iniciais da progressão da do- ença. O estado de fosforilação de tau em S202 não foi incluído nessas análises devido à sua ausência de mudança durante a progressão da doença.

[0192] MRI - A hiperfosforilação foi inversamente associada à es- pessura cortical em MCs assintomáticos: p-T205 foi mais fortemente as- sociado a uma diminuição na espessura cortical e subcortical em todo o cérebro, FIG. 18A, enquanto os níveis de p-T217 e tau total mostraram menos associações regionais e correlações mais fracas. A hiperfosfori- lação em p-T181 teve a correlação geral mais baixa com atrofia cortical, restrita aos lobos parietais medial e lateral e lobos medial dorsal – me- dial frontal. Isso sugere que o aumento inicial de p-T205 em -13 EYO pode estar relacionado à etiologia subjacente da atrofia cortical, que an- teriormente se mostrou começar aproximadamente em -13 EYO no pre- cuneus28.

[0193] FDG PET - Além da atrofia cortical, um declínio no metabo- lismo da glicose nos neurônios e na glia está associado à progressão da doença na AD. Portanto, testou-se se havia associações distintas entre deficiência metabólica cortical ou subcortical e fosforilação de tau. Nos MCs assintomáticos, a fosforilação em T205 foi correlacionada com o hipometabolismo de glicose em todo o córtex e regiões subcorticais, conforme medido por FDG-PET, FIG. 18B. Houve associações mínimas identificadas para os outros sítios p-tau ou nível de tau total em MCs assintomáticos.

[0194] Juntos, esses resultados indicam que os processos subja- centes que levam ao comprometimento neuronal e neurodegeneração durante a progressão da doença assintomática, conforme medido por neuroimageamento, estão mais intimamente correlacionados com p- T205. Estudos recentes identificaram um papel protetor para p-T205 nos terminais pós-sinápticos em resposta à citotoxicidade pós-sináptica in- duzida por Aß34 através da via da fyn-quinase. É possível que a associ- ação encontrada aqui, quando a função sináptica está em declínio, possa representar um processo protetor resultando em aumento da fos- forilação em T205. Com o tempo, entretanto, a hiperfosforilação pode predispor a tau à agregação. Considerando que, a fosforilação em T181 e T217 parece estar mais fortemente associada à presença de patologia de placa Aß cortical e, potencialmente, ocorre a montante da hiperfos- forilação de T205 e elevação dos níveis de tau não fosforilada solúvel.

Exemplo 8 - O declínio cognitivo está especificamente e diferenci- almente associado a diferenças específicas do sítio na hiperfosfo- rilação de tau

[0195] Estudos anteriores demonstraram que a demência AD está mais intimamente relacionada à patologia NFT neocortical do que a pa- tologia Aβ neocortical35, mas a relação entre tau solúvel e cognição per- manece incerta. Portanto, avaliou-se a mudança longitudinal na razão de fosforilação da tau solúvel e os níveis de tau total ao longo do tempo em comparação com os resultados clínicos36. Foi realizado um modelo de efeito misto com desempenho cognitivo longitudinal no composto neuropsicológico como resultado e mudança nas medidas de tau no CSF (derivadas de modelos lineares de efeitos mistos individuais), tempo e suas interações como preditor, ajustando idade, sexo, educa- ção e relações familiares. Foram testados todos os MCs (sintomáticos e assintomáticos) para esta análise e foram encontrados efeitos diferen- ciais entre o sítio de fosforilação e o declínio clínico e cognitivo. A tau não fosforilada aumentou monotonicamente com o agravamento da cognição e a fosforilação em T217 e T181 diminuiu com o agravamento da cognição, enquanto o pT205 não demonstrou nenhuma mudança em relação ao declínio cognitivo.

[0196] À medida que as razões de fosforilação de T217 e T181 di- minuíram, o declínio cognitivo acelerou (valor de t 2,35, p = 0,02 e 2,11, p = 0,04), Tabela 3 e FIG. 19. Isso sugere que a diminuição da fosfori- lação de T217 e T181, mais do que o aumento da tau solúvel, apresenta um marcador importante de declínio cognitivo.

[0197] Essas descobertas desafiam o paradigma atual de que um aumento contínuo de p-tau no CSF está associado à disfunção cogni- tiva. Neste trabalho, foram descobertos dois padrões gerais: para alguns sítios, a fosforilação diminuiu significativamente à medida que o declínio cognitivo começou, enquanto outros sítios mostraram um aumento con- tínuo ou nenhuma mudança com a progressão da doença (ver taxas de aumento vs. diminuição na FIG. 19). Além disso, as associações entre outros marcadores de progressão da doença (placas Aβ, atrofia cerebral e metabolismo) e os níveis totais de tau e fosforilação em diferentes sítios que foram identificados enfatizam ainda que os processos que le- vam à fosforilação de tau na AD são provavelmente multifatoriais e não são equivalentes. Exemplo 9 - Aumentos na tau não fosforilada estão correlaciona- dos com NFTs corticais por tau PET, mas as espécies de fosfo-tau canônicas não estão

[0198] Estudos recentes de tau-PET (18F AV-1451 ou flortaucipir) com participantes DIAD sugeriram que o aumento de NFT ocorre ape- nas após o início dos sintomas clínicos37,38. Foi testada a hipótese de que a p-tau solúvel é um marcador de patologia de NFT, enquanto a tau não fosforilada solúvel é liberada passivamente de neurônios moribun- dos14 como uma medida de neurodegeneração. Explorou-se a relação entre a mudança longitudinal das isoformas tau e p-tau no CSF que le- varam ao momento em que a tau-PET foi realizada. Em um número li- mitado de participantes (10 MCs e 4 NCs), uma única tomografia tau- PET foi realizada em até 72 horas após a obtenção da amostra de CSF. Para esses indivíduos, amostras de CSF também foram obtidas em vi- sitas anteriores (dentro de 1-3 anos), permitindo-nos avaliar a capaci- dade da mudança longitudinal nas medições de tau solúvel para predi- zer os níveis de tau-PET.

[0199] Em primeiro lugar, Confirmou-se que os níveis de NFT corti- cais em MCs apenas aumentaram perto do momento do início dos sin- tomas, FIG. 20, sugerindo que em MCs DIAD, o declínio clínico começa quando os agregados de tau começam a aumentar. Em segundo lugar, descobriu-se que o aumento longitudinal na tau não fosforilada no CSF estava associado a um valor elevado de tau-PET cortical (p = 0,03), Ta- bela 4. Houve tendências para um aumento na fosforilação para T205 sendo associado a níveis mais elevados de tau-PET e, ao contrário, que a fosforilação decrescente de T217, T181 e S202 estava associada com níveis crescentes de tau-PET, FIG. 21. Juntos, esses resultados suge- rem que o aumento da tau não fosforilada no CSF, em vez de p-tau, está mais intimamente ligado à disseminação da patologia NFT. Em contraste, uma espécie de p-tau solúvel diminui quando a tau agregada está aumentando, o que pode representar um processo de sequestro por agregados hiperfosforilados. Tabela 2. Medições demográficas, do líquido cefalorraquidiano, de neu- roimageamento e cognição para portadores e não portadores de muta- ção. Não portadores de mutação valor-p Portadores de mutação N Assintomático Sintomático (N = 141) (N = 152) (N = 77) Idade 370 34,4 ± 8,9 46,2 ± 9,2 38,5 ± 12,2 <,0001 Feminino, n (%) 370 84 (55,3) 39 (50,7) 88 (62,4) 0,15 APOE ε4, n (%) 370 48 (31,6) 23 (29,9) 51 (36,2) 0,67 EYO, MÉDIA ± SD 370 -13,4 ± 8,7 3,42 ± 3,47 -9,2 ± 12,5 <,0001 PiB PET SUVR Cortical 304 1,76 ± 0,89 2,82 ± 1,27 1,06 ± 0,17 <,0001 *PiB +, n (%) 304 81 (60,9) 48 (96,0) 2 (1,65) <,0001 CSF p-T181 (fosfo/não fosfo) 370 26,5±7,2 34,2 ± 7,7 21,7 ± 2,3 <,0001 CSF T181 total (ng/ml) 370 0,14 ± 0,09 0,30 ± 0,19 0,088 ± 0,034 <,0001 CSF p-T205 (fosfo/não fosfo) 370 0,44 ± 0,24 0,93 ± 0,36 0,34 ± 0,13 <,0001 CSF T205 total (ng/ml) 370 0,003 ± 0,003 0,011 ± 0,008 0,002 ± 0,001 <,0001 CSF p-T217 (fosfo/não fosfo) 370 3,49 ± 3,08 8,42 ± 4,05 1,25 ± 0,66 <,0001 CSF T217 total (ng/ml) 370 0,015 ± 0,018 0,054 ± 0,047 0,004 ± 0,004 <,0001 CSF p-T208 (fosfo/não fosfo) 370 0,00030 ± 0,0004 0,0010 ± 0,0006 0,00008 ± 0,00014 <,0001 CSF p-S202 (fosfo/não fosfo) 370 2,77 ± 0,80 2,52 ± 0,68 3,10 ± 0,72 <,0001 CSF S202 total (ng/ml) 370 0,016 ± 0,006 0,025 ± 0,011 0,014 ± 0,005 <,0001 Tau (ng/ml) 370 0,51 ± 0,21 0,82 ± 0,41 0,40 ± 0,14 <,0001 Precuneus (mm) 344 2,37 ± 0,15 2,10 ± 0,24 2,38 ± 0,14 <,0001 FDG PET SURV Cortical 318 1,73 ± 0,14 1,57 ± 0,18 1,71 ± 0,14 <,0001 Volume de hipocampo (mm3) 344 8863 ± 970 7290 ± 1214 8787 ± 775 <,0001 Composto Cognitivo (pontua- 356 -0,096 ± 0,640 -1,67 ± 0,85 -0,03 ± 0,59 <,0001 ção z) EYO- estimativa de anos para o início dos sintomas; PiB- composto B de Pittsburgh; p- fosforilado; S-serina; SUVR-razão do valor de capta- ção padrão; T- treonina.

Tabela 3 Mudança longitudinal na cognição global, conforme previsto pela mudança longitudinal dos sítios de tau fosforilada e níveis totais de tau em portadores de mutação.

Resultado Preditor CSF Tau p-T181 estimativa SE valor t valor p estimativa SE valor t valor p Mudança na cog- Mudança 0,16 1,91 0,09 0,93 -2,01 0,38 -5,23 <.0001 nição no tempo CSF * p-T205 p-T217 estimativa SE valor t valor p estimativa SE valor t valor p Mudança na cog- Mudança -0,06 0,5 -0,13 0,9 -2,41 0,45 -5,32 <.0001 nição no tempo CSF * Tabela 4 A mudança longitudinal da taxa de fosforilação e tau total fo- ram preditas para cada indivíduo que teve uma varredura Tau-PET rea- lizada no momento de um exame de líquido cefalorraquidiano de acom- panhamento (n = 14 (10 portadores de mutação, 4 não portadores) foi usado para prever a relação do valor da unidade padronizada de tau cortical (SUVR). A tabela indica que o único preditor de um aumento de tau-PET nesta população limitada foi o aumento dos níveis de tau solú- vel no CSF, com um aumento de 36 ng/ml associado a um aumento de 1 unidade de SUVR cortical. tau (ng/ml) p-T181 p-T205 Preditor estimativa SE valor p estima- SE valor estima- SE valor tiva p tiva p SUVR idade 0,02 0,02 0,26 0,03 0,02 0,12 0,03 0,02 0,22 Tau-PET MC em declínio 43,8 20,01 0,05 -0,68 0,63 0,3 15,3 22,87 0,52 NC em declínio 31,15 47,31 0,53 -0,45 1,88 0,82 21,38 54,76 0,7 p-T217 p-S202 Preditor estimativa SE valor p estima- SE valor tiva P SUVR idade 0,03 0,02 0,18 0,03 0,02 0,06 Tau-PET MC em declínio -2,69 3,16 0,41 -10,28 5,74 0,1 NC em declínio 11,55 13,91 0,43 -12,17 17,81 0,51 Discussão para os Exemplos 5-9

[0200] Embora a tau compreenda uma patologia característica de AD e possa ser medida em formas agregadas ou solúveis, lacunas im- portantes permanecem na compreensão de como as modificações pós- translacionais desta proteína neuronal crítica levam ao desenvolvimento de NFT2 e neurodegeneração em seres humanos. Aqui, foi demons- trado como os padrões de fosforilação de tau no CSF variam ao longo da progressão da AD. Foi adicionada à literatura clínica existente a de- monstração de que no DIAD, o processo de fosforilação e liberação de tau no sistema nervoso central é um processo dinâmico que: 1) começa uma vez que a carga da placa Aβ (medida por PiB-PET) é estabelecida (décadas antes dos sintomas), e subsequentemente se desenrola ao longo de um período de quase duas décadas, durante as quais os dife- rentes sítios de fosforilação da proteína tau são fosforilados em fases distintas em associação com diferentes marcadores de progressão da doença; e 2) diminui significativamente de uma maneira dependente do sítio perto do momento do declínio cognitivo e do aumento na tau agre- gada (conforme medido por tau-PET). Juntos, esses resultados indicam que este método de quantificação de peptídeos tau fosforilados/não fos- forilados solúveis pode rastrear o processo de AD em seus estágios pré- clínicos a sintomáticos, fornecendo uma assinatura da patologia fosfo- tau nessa doença. Além disso, eles desafiam os supostos papéis de tau/p-tau em DIAD, e possivelmente AD em geral, e recapitulam em se- res humanos as descobertas de estudos em animais que ligam a pato- logia de Aβ à hiperfosforilação de tau21,23,25,39 e liberação celular ativa em vez de uma consequência da liberação de neurônios em morte.

[0201] Embora a causalidade precise ser abordada em estudos fu- turos, os aumentos contemporâneos em p-T217, p-T181 e PiB -PET su- gerem que a fosforilação generalizada dos níveis de tau na AD está in- timamente ligada à patologia Aβ. Esta hipótese é consistente com o tra- balho recente em camundongos transgênicos AD20,21,23,34,40 e em Stable Isotope Labeling Kinetics (SILK), que demonstra que as isoformas de p- tau são liberadas de células em um processo ativo que é aumentado na presença de placas Aβ22. Esses resultados ligam a patologia de Aβ a uma mudança distinta nas concentrações de peptídeo tau solúvel e pa- drões de fosforilação, lançando luz sobre o fenômeno no qual a eleva- ção significativa de p-tau ocorre na AD, mas não em outras tauopatias neurodegenerativas.16,17 Essas descobertas também fornecem informa- ções importantes sobre alvos terapêuticos em potencial, bem como bi- omarcadores de patologia da AD precoce antes do início dos sintomas clínicos.

[0202] Um trabalho recente mostrou um aumento e disseminação de agregados tau neuríticos (filamentos helicoidais emparelhados em neurites distróficos) induzidos por isolados de NFT de cérebros de AD em camundongos transgênicos Aβ, ocorrendo bem antes dos NFTs so- máticos estabelecidos20. É possível que o aumento muito precoce em p-T217 e p-T181 possa refletir essa agregação de tau "precoce" em res- posta às placas Aβ e possa explicar a associação global de PiB PET com essas isoformas que identificamos. Além disso, isso pode explicar melhor a falta de sintomas clínicos vistos durante essa elevação inicial em p-tau, pois ocorre anos antes de uma neurodegeneração significa- tiva. Este trabalho também propõe o p-T217 como um biomarcador muito precoce com aplicação promissora como um indicador de res- posta terapêutica em terapias de direcionamento de amiloide. Isso pode ser particularmente importante em estudos de prevenção em que mar- cadores substitutos da progressão da doença são vitais para identificar terapias eficazes.

[0203] Algumas suposições comuns sobre os papéis diagnósticos de tau e p-tau solúvel são questionadas aqui. Especificamente, a estru- tura de diagnóstico atual em AD enfatiza a presença de biomarcadores que representam patologias específicas e não específicas da AD (por exemplo, Aβ, p-tau e tau)14. Dentro dessa estrutura de diagnóstico, a p- tau solúvel e a tau não fosforilada são frequentemente presumidas como sendo passivamente liberadas de neurônios em degeneração, com p- tau associada a NFTs agregados e tau não fosforilada associada à de- generação axonal. Alternativamente, esses resultados em DIAD suge- rem que a tauopatia AD poderia ser definida como uma modificação do status de fosforilação de tau solúvel (razão de fosforilação). Além disso, considerando os tempos de mudanças de status em sítios de fosforila- ção específicos (21 a 13 anos antes do início dos sintomas estimados), isso também sugere que o aumento da fosforilação, embora seja um marcador de patologia, não é necessariamente um marcador de toxici- dade relacionada ao tau ou NFTs de corpo celular. Na verdade, esses resultados indicam que para pT217 e pT181, em vez de continuar a au- mentar quando a patologia de NFT está aumentando rapidamente37, há uma diminuição dramática na fosforilação. Uma possível explicação para isso é semelhante ao que foi observado com Aβ solúvel/agre- gado41: que o aumento dramático de sequestradores de tau agregados fosforilou a tau42 no cérebro, diminuindo os níveis de CSF. No entanto, uma redução de tau por meio de mecanismos proteostáticos não pode ser excluída. Em ambos os casos, essa descoberta da correlação ne- gativa entre as taxas de fosforilação de T217 ou T181 e o declínio cog- nitivo longitudinal destaca a importância desse evento na progressão da doença. A elucidação da causa desse declínio poderia levar a uma me- lhor compreensão das ligações entre a tau solúvel e a disfunção neuro- nal e o uso de p-tau/tau no CSF no prognóstico de AD.

[0204] Dado o papel das quinases na fosforilação da tau, este grupo de enzimas é atualmente visto como um alvo potencial para a terapêu- tica da AD43. Como foi demonstrado aqui que nem todas as formas de p-tau estão associadas a marcadores de progressão da doença, e algu- mas podem de fato funcionar contra ela, certas atividades quinase/fos- fatase que resultam em alterações de p-tau podem não ser prejudiciais, pelo menos no início no processo da doença.

[0205] Em resumo, agora foi demonstrado que na AD associada a mutações autossômicas dominantes, a hiperfosforilação de tau no CSF ocorre muito cedo e exibe um padrão de alterações específicas do sítio em diferentes estágios da doença. Os mecanismos subjacentes a essas descobertas terão implicações importantes na compreensão da doença e nas terapias dirigidas por tau para a AD. Material e métodos para os exemplos 5-9

[0206] Participantes - Participantes com pelo menos 50% de risco de herdar uma mutação DIAD de famílias com mutação genética confir- mada em PSEN1, PSEN2 ou APP foram inscritos no estudo da Estudo da Rede de Alzheimer com Herança Dominante (DIAN, NIA U19 AG032438) (dian.wustl.edu; Clinictrials.gov número NCT00869817) 44. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Revisão Ins- titucional (IRB) da Washington University e em conformidade com o IRB local e os Comitês de Ética onde o estudo estava sendo realizado. A presença ou ausência de uma mutação DIAD foi determinada usando amplificação baseada em PCR do éxon apropriado seguido por sequen- ciamento de Sanger. Em cada visita de estudo, os participantes foram submetidos a avaliações clínicas abrangentes, testes cognitivos, neu- roimageamento e estudos do CSF; no entanto, em cada visita, cada par- ticipante pode não ter concluído todos os procedimentos do estudo. Os detalhes da estrutura do estudo e avaliações podem ser encontrados 10,44 em publicações anteriores . Os intervalos de acompanhamento fo- ram determinados pelo estado clínico (normal ou prejudicado) de cada participante e por seus anos estimados até o início dos sintomas (EYO) e variaram de anual a cada três anos. Os dados foram obtidos a partir de dados controlados de qualidade (avaliações anuais de qualidade para resultados irregulares e dados ausentes de 26 de janeiro de 2009 a 30 de junho de 2017) e incluíram 370 participantes (n = 150 com ava- liações longitudinais de CSF com um tempo médio entre as visitas de 2,8 anos).

[0207] Estimativa de anos até o início dos sintomas (EYO) - Na AD herdada de forma dominante, há quase 100% de penetrância, com a idade no início dos sintomas em portadores de mutação relativamente consistente para cada mutação e dentro de cada família. Isso permite a designação de anos estimados para o início dos sintomas (EYO). EYO foi definido da seguinte forma: A idade dos pais no início dos sintomas foi estabelecida para cada participante por entrevista semiestruturada. A idade dos pais no início de cada mutação foi então inserida em um banco de dados que consiste nos valores de início dos sintomas combi- nados de DIAN e de publicações anteriores de coortes DIAD. Eles foram usados para calcular uma idade média de início específica para cada mutação29. A idade de início de mutação específica foi subtraída da idade de cada participante no momento da avaliação clínica para definir o EYO do indivíduo. Quando uma idade média de início de mutação específica era desconhecida, a idade parental ou substituta de início foi usada para definir EYO29. Para participantes que eram sintomáticos no início do estudo, conforme avaliado por um CDR > 0, a idade relatada do início real dos sintomas foi subtraída da idade em cada avaliação clínica para definir EYO.

[0208] Avaliações clínicas - avaliações clínicas padronizadas, inclu- indo o uso de um parceiro de estudo, foram realizadas para cada parti- cipante. A Escala de Avaliação Clínica de Demência (CDR) foi usada para indicar o estágio de demência. Os participantes foram classificados como cognitivamente normais (CDR = 0) ou com demência muito leve (CDR = 0,5), demência leve (CDR = 1) ou demência moderada (CDR = 2)45. Os médicos avaliadores não tinham conhecimento do status gené- tico. Uma bateria neuropsicológica abrangente avaliando a função cog- nitiva geral, memória, atenção, função executiva, função visuoespacial e linguagem foi realizada em cada visita46. A partir desses testes, foi desenvolvido um composto cognitivo que detecta de forma confiável o declínio em toda a faixa de EYO e CDR47. O composto representa a média das pontuações z de testes, incluindo memória episódica, aten- ção complexa e velocidade de processamento e uma tela cognitiva geral

(Mini-Exame do Estado Mental).

[0209] Análises de Tau CSF - O CSF foi coletado por meio de pro- cedimentos padrão de punção lombar (L4/L5) usando uma agulha espi- nhal atraumática de Sprotte (22Ga) em dois tubos de polipropileno de 13ml. O CSF foi congelado rapidamente na posição vertical em gelo seco. As amostras coletadas nos Estados Unidos foram enviadas du- rante a noite em gelo seco para o laboratório do núcleo do biomarcador DIAN na Washington University, St. Louis, MO, EUA, enquanto as amostras coletadas em locais internacionais foram armazenadas a - 80°C e enviadas trimestralmente em gelo seco. Após a chegada, cada amostra foi subsequentemente descongelada, combinada em um único tubo de polipropileno e aliquotada (500μl cada) em tubos de microcen- trífuga de polipropileno (#05-538-69C, Corning Life Science, Corning, NY, EUA), após o que foram novamente congeladas por flash em gelo seco e armazenadas a −80°C.

[0210] Cada amostra de CSF descongelada foi misturada com 25 µl de uma solução contendo 15N-441 tau padrão interno (2,5 ng por amos- tra), 50 mM de Guanidina, 10% NP-40 e coquetel de inibidor de protease 10X (Roche). A tau foi extraída por captura imune usando incubação sob rotação à temperatura ambiente durante 2 horas com 20 µl de es- feras de sefarose reticuladas a anticorpos Tau1 (epítopo tau 192-199) e HJ8.5 (epítopo tau 27-35). As esferas foram centrifugadas por centrifu- gação e depois enxaguadas três vezes com 1 ml de TEABC 25 mM. As amostras foram digeridas durante a noite a 37°C com 400 ng de tripsina Gold (Promega, Madison, WI). Os peptídeos AQUA (Life Technologies, Carlsbad, CA) foram aumentados para obter uma quantidade de 5fmol por peptídeo fosforilado marcado e 50fmol por peptídeo não modificado marcado em cada amostra. A mistura de peptídeos foi carregada em pontas TopTip C18, lavada com solução de ácido fórmico 0,1% (FA) e eluída com solução de 60% ACN 0,1% FA. Os eluatos foram secos usando um Speedvac e as amostras secas foram armazenadas a -80°C antes da análise. As amostras foram ressuspensas em 25µl de 2% de ACN 0,1% de FA. Os extratos foram analisados por nanoLC-MS/HRMS usando Monitoramento de Reação Paralela usando fragmentação de HCD. Os experimentos de NanoLC-MS/MS foram realizados usando um sistema nanoAcquity UPLC (Waters, Mildford, Massachusetts) acoplado a um espectrômetro de massa Fusion Tribrid (Thermo Scientific, San Jose, Califórnia). 5 µl foram injetados para cada amostra. A separação de peptídeos foi alcançada a 60°C em 24 minutos em uma coluna Wa- ters HSS T3 (75 µm x 100 mm, 1,8 µm). As fases móveis foram (A) 0,1% de ácido fórmico em água e (B) 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila. O gradiente usado foi: 0min-0,5% B; 7,5 min-5% B; 22min-18% B; em seguida, a coluna foi enxaguada 2 minutos com 95% B. A taxa de fluxo foi fixada em 700 nl/min durante 7,5 min, em seguida, 400 nl/min para o resto da análise. Os dados foram adquiridos no modo de íon positivo a uma voltagem de pulverização de 2200 V (Nanospray Flex Ion Source, Thermo Scientific) e tubo de transferência de íons ajustado para 270°C. A voltagem de RF da lente S foi definida em 60 V. Transições MS/HRMS e foram extraídas usando o software Skyline (MacCoss lab, University of Washington). Os níveis de fosforilação de tau no CSF foram calcula- dos usando razões medidas entre as transições MS/HRMS de peptí- deos endógenos não fosforilados e peptídeos marcados com 15N do padrão interno de proteína. A razão de fosforilação em T181, S202, T205 e T217 foi medida usando a razão das transições MS/HRMS de peptídeos fosforilados e peptídeos não fosforilados correspondentes. Cada razão endógena de peptídeo fosforilado/não fosforilado foi norma- lizada usando a razão medida nas transições MS/HRMS dos padrões internos de peptídeo fosforilado/não fosforilado AQUA correspondentes.

[0211] Imageamento do cérebro - Deposição de amiloide, metabo-

lismo de glicose, tau (NFT) PET e espessura cortical/volumes subcorti- 11 18 18 cais foram avaliados usando C-PiB-PET, F-FDG-PET, F-AV-1451 (também conhecido como flortaucipir) e varreduras de MRI ponderada em T1 volumétrica, respectivamente. Procedimentos padrão foram usa- dos para garantir a consistência na coleta de dados de todos os sítios DIAN28. A varredura 11C-PiB-PET consistiu em 70 minutos de varredura dinâmica após uma injeção em bolus de ~ 13 mCi de PiB com taxas de captação padrão regional (SUVR) determinadas a partir do intervalo de 18 tempo de 40-70 minutos. A varredura F-FDG-PET começou trinta mi- nutos após uma injeção em bolus de ~ 5 mCi e durou trinta minutos. Os dados 18F-AV-1451 foram adquiridos na janela de 80-100 minutos após a injeção em bolus e foram convertidos em SUVRs. A sequência T1 MR foi uma aquisição rápida preparada por magnetização acelerada com gradiente de eco (MPRAGE) adquirida em scanners 3T (parâmetros: TR = 23000, TE = 2,95 e resolução de 1,0×1,0×1,2mm3).

[0212] Os SUVRs do PIB e FDG de 34 regiões corticais e 6 subcor- ticais de interesse (ROIs) foram obtidos usando o software FreeSurfer (surfer.nmr.mgh.harvard.edu/). Os SUVRs foram processados com ce- rebelo cinza como regiões de referência e os dados de ROI foram corri- gidos para efeitos de volume parcial usando uma função de dispersão de ponto regional (RSF)48 em estrutura de matriz de transferência geo- métrica.

[0213] Análise estatística - As características basais dos participan- tes foram resumidas como média ± SD para variáveis contínuas e n (porcentagem da coluna) para variáveis categóricas. Os valores P para comparar as diferenças entre MC assintomático, MC sintomático e NC conforme definido na linha de base são obtidos usando modelos de efei- tos mistos lineares gerais (LME) para variáveis contínuas e modelos de efeitos mistos lineares generalizados, com uma ligação logística para variáveis categóricas. Todos os modelos incorporaram um efeito familiar aleatório para dar conta das correlações nas medidas de resultado entre os participantes da mesma família. O ponto de corte para PiB PET SUVR cortical basal é escolhido de modo que a diferença na taxa longi- tudinal de mudança de PiB PET cortical entre MC e NC comece a diferir significativamente diferente de 0.

[0214] A relação transversal dos diferentes sítios de fosforilação de tau com PiB, FDG e espessura cortical/volume subcortical foi avaliada em todos os MCs assintomáticos (CDR = 0, n = 152) usando LME biva- riada em cada ROI. Os modelos incluíram efeitos fixos de EYO, educa- ção, sexo e interceptações aleatórias no nível da família. Comparado com o método de estimação de correlação simples (correlação de Pe- arson ou Spearman), o LME bivariado pode ajustar para covariáveis como EYO, bem como contabilizar a correlação dentro do agrupamento familiar49,50. Os valores de P para testar as correlações foram corrigidos usando o método Benjamini Hochberg51 para controlar a taxa de desco- berta falsa devido a testes múltiplos.

[0215] Para a taxa anual de mudança dentro de cada indivíduo ao longo do acompanhamento longitudinal, os melhores preditores lineares imparciais para cada biomarcador foram estimados usando LME, que foram então representados contra EYO basal para examinar as trajetó- rias dos biomarcadores. Modelos de efeitos mistos de spline linear ou linear, quando apropriado, foram então usados para determinar o ponto EYO basal a partir do qual o MC se tornou significativamente diferente do NC no nível basal e a taxa de mudança para cada biomarcador. Os detalhes dos modelos de efeitos mistos de spline linear podem ser en- contrados em uma publicação recente9. Os modelos de efeitos mistos de spline linear ou linear incluíram os efeitos fixos do grupo de mutação (MC ou NC), EYO basal, tempo desde a linha de base e todas as pos- síveis interações de duas ou três vias entre eles. Sexo, anos de escola- ridade e status APOE ε4 foram considerados como covariáveis, mas apenas os efeitos que foram significativos foram mantidos nos modelos. Os efeitos aleatórios incluídos nos modelos são as interceptações alea- tórias para agrupamentos familiares, interceptação aleatória individual e inclinação aleatória com matriz de covariância não estruturada para ex- plicar a correlação dentro do indivíduo devido a medições repetidas. A diferença ajustada no nível médio na linha de base e a diferença nas taxas de mudança entre MC e NC foram então testadas usando o teste t aproximado derivado dos modelos para determinar o primeiro ponto EYO onde a diferença se tornou significativa.

[0216] Para visualizar a diferença na taxa de mudança entre tau to- tal, sítio de fosforilação de tau, PiB cortical e cognição global em toda a faixa de EYO, as medidas de MC foram primeiro padronizadas usando a média e o desvio padrão do NC. A taxa de mudança de cada medida para cada MC foi então calculada usando LME, e as curvas LOESS fo- ram ajustadas para representar visualmente as trajetórias das taxas pa- dronizadas de mudança ao longo do EYO.

[0217] A utilidade da tau total e p-tau de linha de base na previsão do declínio cognitivo longitudinal foi avaliada usando LME. Os efeitos fixos nos modelos incluíram grupo de mutação, idade da linha de base, sexo, status APOE ε4, tempo e todas as possíveis interações de duas ou três vias entre eles. Os efeitos aleatórios nos modelos incluíram as interceptações aleatórias para agrupamentos familiares, interceptação aleatória individual e inclinação aleatória com matriz de covariância não estruturada.

[0218] As regressões lineares foram usadas para examinar se a taxa anual de mudança da posição de tau e fosfo-tau para MC e NC, levando a e incluindo o ponto em que a tau PET foi realizada, poderia prever tau PET SUVR, controlando o efeito da idade. Devido ao número limitado de participantes, não foi incluído um agrupamento familiar.

[0219] Todas as análises foram conduzidas usando SAS 9.4 (SAS

Institute Inc., Cary, NC). Um valor p <0,05 foi considerado como sendo estatisticamente significativo. Referências para os Exemplos 5-9

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Exemplo 10

[0271] A doença de Alzheimer (AD) é a principal causa de demência em todo o mundo. Seu diagnóstico e tratamento permanecem extrema- mente desafiadores na ausência de biomarcadores específicos e preco- ces. Desenvolvimentos recentes de biomarcadores do líquido cefalorra- quidiano (CSF) e imageamento de tomografia por emissão de pósitrons (PET) do cérebro forneceram ferramentas valiosas para detectar as pa- tologias cerebrais patognomônicas de AD de placas amiloide-Aβ e ema- ranhados de tau hiperfosforilados neurofibrilares. Atualmente, o perfil do CSF de pacientes com AD é caracterizado pela diminuição do beta-ami- loide 42 (Aβ42) e aumento da tau total e fosforilada (p-tau 181) medida com imunoensaios padrão. Este perfil permite a discriminação de pato- logias AD versus não AD e a detecção do processo de AD muitos anos antes dos sintomas ou queixas cognitivas. No entanto, as alterações na tau e p-tau do CSF não são específicas da AD. Embora o aumento de p-tau181 tenha sido interpretado como uma consequência da hiperfos- forilação devido à formação de emaranhados, o p-tau no CSF aumenta concomitantemente com a tau total. Estudos do cérebro indicam fosfo- rilação de tau em vários sítios, mas a relevância diagnóstica desses sí- tios de fosforilação adicionais no CSF não foi totalmente abordada. Os métodos baseados em espectrometria de massa (MS) são mais rele- vantes do que os imunoensaios para avaliar as alterações nos níveis de fosforilação de sítios específicos, independentemente dos níveis de tau total, uma vez que permitem a quantificação independente de peptídeos fosforilados e seus correspondentes não modificados. Consequente- mente, as correlações entre os declives de fosfopeptídeo e peptídeo não fosforilado podem ser comparadas para avaliar a taxa de fosforilação. Para quantificar as isoformas de tau fosforiladas no CSF, foi usado um método inovador de MS de alta resolução (HRMS) direcionado para peptídeos fosforilados de tau no domínio intermediário da sequência da proteína, que é o domínio mais abundante no CSF e é fosforilado em vários sítios na tau cerebral e em agregados de tau AD.

[0272] Analisou-se a fosforilação de tau em T181, S199, S202, T205 e T217 no CSF usando uma coorte compreendendo indivíduos cognitivamente normais e pacientes com comprometimento cognitivo leve estratificado por seu status amiloide com base na razão CSF Aβ42/40 e imageamento PET-PIB. Esta validação nos permitiu destacar o potencial do CSF pT217 para o diagnóstico de AD e estabelecer cor- relações entre o pT217 e a amiloidose subjacente à modificação da tau em um estágio inicial da doença

[0273] Participantes - Oitenta e seis participantes cognitivamente normais (CDR = 0) ou com comprometimento cognitivo leve foram re- crutados no estudo ADRC da Universidade de Washington em Saint Louis previamente relatado por Patterson et al. 2015 com CSF e dados de PiB-PET amiloide disponíveis. Esta coorte incluiu 29 participantes amiloide positivos e 47 amiloide negativos de acordo com os resultados do PiB-PET (considerado positivo acima de 0,18 usado como ponto de corte) e razão CSF Aβ42/Aβ40 medida por MS (considerado patológico abaixo de 0,12 usado como ponto de corte) e 10 casos com resultados conflitantes entre perfis de PET-PIB e CSF (5 com perfil de amiloidose PiB-PET (+)/CSF (-) e 5 com PiB-PET (-)/CSF (+)). Sete amostras de CSF foram extraídas em duplicata e uma em triplicata para avaliar a variabilidade.

[0274] Purificação de tau de CSF usando imunoprecipitação - 800 µl de sobrenadante de CSF obtido após imunoprecipitação de Aβ e ar- mazenamento a -80C foram usados para análise de tau. Os sobrena- dantes descongelados foram enriquecidos com 15N tau padrão interno (5 ng por amostra) e extraídos usando imunoprecipitação Tau1. Guani- dina 5 mM, NP-40 a 1% e coquetel de inibidor de protease foram adici- onados à amostra, em seguida, as amostras foram misturadas 3 horas à temperatura ambiente com 20 µl de esferas de sefarose reticuladas ao anticorpo Tau1. As esferas foram precipitadas e depois enxaguadas com 0,5 M de Guanidina e TEABC 25 mM. As amostras foram digeridas com 400 ng de tripsina. Os peptídeos AQUA (Life Technologies, Carls- bad, Califórnia) foram aumentados para atingir a quantidade individual de 10 fmol por fosfopeptídeo marcado e 100 fmol por peptídeo marcado por amostra. AQUA TPSLPpTPPTR (pT217) substituiu a versão de cli- vagem perdida usada na coorte de descoberta. Os peptídeos trípticos foram carregados nas pontas TopTip C18, lavados com solução de FA 0,1% e eluídos com solução de ACN 60% 0,1% FA. Os eluatos foram secos em speedvac. As amostras foram armazenadas a -80C. Antes da análise LC-MS, as amostras foram ressuspensas em 25 µl 2% ACN 0,1% FA. Os extratos foram analisados por nanoLC-MS/HRMS.

[0275] Peptídeos tau e quantificação de peptídeos fosforilados (Va- lidação) - A quantificação de MS de diluição isotópica estável usando 15N de peptídeos marcados foi usada para calcular os níveis absolutos de peptídeos não modificados. A taxa de fosforilação para cada sítio foi calculada por calibração de ponto único comparando a razão da área obtida nos peptídeos não fosforilados e fosforilados AQUA em contra- partida à razão da área medida para os peptídeos endógenos corres- pondentes. O nível de peptídeo fosforilado foi calculado combinando a contraparte do nível de peptídeo não modificado e a taxa de fosforilação do sítio correspondente.

[0276] Estatística - As análises estatísticas, incluindo a comparação das inclinações das linhas de regressão, foram realizadas usando o sof- tware GraphPad Prism (7.0). As significâncias estatísticas entre os va- lores obtidos nos grupos investigados foram calculadas por meio de tes- tes não paramétricos de Mann-Whitney. Os coeficientes de correlação rho rank de Spearman não paramétricos foram usados para avaliar as correlações entre duas séries de valores. A significância estatística foi definida por p<0,05.

[0277] Quantificação de peptídeos fosforilados de tau no CSF (Re- sultados) -O aumento da fosforilação de tau em T217 em AD foi detec- tado em uma coorte do Knight AD Research Center (ADRC) na Univer- sidade de Washington em Saint Louis compreendendo 86 participantes sem queixas cognitivas ou comprometimento cognitivo leve. Consis- tente com os resultados de PiB-PET e razão CSF Aβ42/Aβ40 medida por MS, os participantes foram estratificados em 29 amiloide-positivos, 47 amiloide-negativos e 10 casos com resultados conflitantes entre PET-PIB e perfil de CSF. Para melhorar a sensibilidade do ensaio, foi realizada imunopurificação com o anticorpo Tau1. Versões marcadas isotopicamente de ambos os peptídeos fosforilados e não fosforilados foram usadas para medir a razão de fosforilação do sítio. Todos os pep- tídeos fosforilados direcionados foram detectados em todas as amos- tras, com exceção de pS199 contendo o peptídeo não recuperado pelo anticorpo Tau1. Nesta coorte, foi confirmada a relevância do diagnóstico positivo do biomarcador pT217 no estágio inicial da doença. A razão pT217/T217 separou claramente os grupos amiloide positivo e negativo (FIG. 24B e FIG. 24C, AUC 0.999). Além disso, a medição da razão pT181/T181 discriminou os grupos amiloide-positivo e amiloide-nega- tivo (FIG. 24B, AUC 0,956). As razões de fosforilação de T217 e T181 também foram correlacionadas, (r = 0,524, p = 0,0002), sugerindo que a fosforilação desses sítios poderia resultar de uma via comum. No en- tanto, a sensibilidade do diagnóstico de pT181 foi menor do que a de pT217. Ambas as razões de fosforilação foram melhores discriminado- ras do que os níveis de p-tau (181) e t-tau medidos por ELISA (AUC 0,874 e 0,932, respectivamente).

[0278] Correlações entre hiperfosforilação de T217, patologia ami- loide e estado cognitivo (Resultados) - Em seguida foram determinadas as correlações entre este novo biomarcador e o processo amiloide. Os resultados da coorte ADRC sugeriram uma forte relação entre a hiper- fosforilação T217 e o estado amiloide. É importante ressaltar que a taxa de fosforilação de T217 estava significativamente correlacionada com a extensão de PiB-PET medida por Média cortical Total de FBP (FIG. 24E, r = 0,60, p = 0,001). Além disso, todos os cinco casos conflitantes com perfis de amiloidose PiB-PET (+)/CSF (-) foram hiperfosforilados em T217 (FIG. 24D, E). Em contraste, nenhuma correlação significativa foi encontrada entre a fosforilação de T217 e a razão CSF Aβ42/Aβ40. A discrepância entre PiB-PET e CSF Aβ42/Aβ40 pode ser atribuída a uma sensibilidade insuficiente do ensaio de amiloide CSF, uma vez que as razões CSF Aβ42/Aβ40 MS correspondentes estavam perto do limiar de quantificação (0,12 ± 0,02, FIG. 24E). Entre os cinco participantes com amiloidose PiB-PET (-)/CSF (+) oposta, dois exibiram T217 hiperfosfo- rilado (FIG. 24D, E). Isso sugere que esses casos destacados por sua alta hiperfosforilação de tau podem ter alterações significativas de Aβ no CSF antes da detecção de depósitos de placas amiloides. A combi- nação da razão CSF Aβ42/Aβ40 com a taxa de fosforilação T217 iden- tifica com segurança participantes amiloide-positivos sem dados de PiB- PET, mesmo com valores de razão CSF Aβ42/Aβ40 na faixa intermedi- ária ligeiramente acima do limiar (0,12 ± 20%). Entre os participantes sem queixas cognitivas (CDR-SB = 0), a fosforilação T217 foi capaz de distinguir completamente os participantes amiloide-positivos (n = 9) dos amiloides negativos (n = 26, AUC 1,00, FIG. 25), apoiando ainda mais a capacidade deste marcador de identificar com segurança os partici- pantes pré-clínicos da AD. No entanto, nenhuma correlação foi obser- vada entre os desempenhos cognitivos globais medidos com CDR-SB e razão de fosforilação T217 nesta população (FIG. 25).

[0279] Discussão - Usando métodos inovadores de HRMS direcio- nados medindo simultaneamente peptídeos de tau fosforilados de baixa abundância e suas contrapartes não modificadas no CSF, foi fornecida a primeira evidência direta de alterações nas taxas de fosforilação de tau no CSF concomitantes com alterações de amiloide e distintas do aumento da concentração de tau no CSF. Esta abordagem permite es- tudar taxas de fosforilação de tau específicas de AD avaliando hiper e hipofosforilação para indicar metabolismo anormal subjacente.

[0280] O resultado mais surpreendente do estudo atual é a hiper- fosforilação altamente específica de T217 em tau no CSF de participan- tes pré-clínicos, com AD leve e moderada investigados em duas coortes independentes e bem caracterizadas. A patologia amiloide, que prova- velmente ocorre antes da tauopatia AD, e a hiperfosforilação da tau em T217 foram fortemente associadas ao longo dos estágios da doença. Isso apoia a hipótese de que a amiloidose pode estar relacionada a al- terações na fosforilação de tau. A ausência de participantes com Aβ- amiloidose e fosforilação T217 normal neste estudo sugere que este sí- tio de fosforilação de tau poderia seguir o processo amiloide. A hiper- fosforilação de T217 poderia ser um jogador chave no processo fisiopa- tológico da AD e seu papel diferia de outros biomarcadores da tau. Nes- sas coortes, o aumento nos níveis de tau ou p-tau no CSF, conforme avaliado por ELISA, foi menos eficaz na identificação do estado de ami- loidose do que a razão pT217/T217. A especificidade desses biomarca- dores tau AD pode melhorar a previsão do risco de declínio cognitivo em indivíduos que finalmente progridem para AD clínica. Assim, a com- binação de biomarcadores de amiloidose com medição da razão pT217/T217 para detectar AD deve melhorar dramaticamente o diag- nóstico de AD pré-clínica. Embora a hiperfosforilação de T217 esteja altamente correlacionada às placas amiloides medidas com carga de PiB-PET do que aos marcadores amiloides no CSF, a modificação da tau pode não ser causada exclusivamente pela presença de placas fi- brilares. Para os dois participantes com hiperfosforilação T217 e baixo CSF Aβ 42/40 sem carga amiloide cerebral (FIG. 24E), eles poderiam ser casos com placas difusas ou formação oligomérica de Aβ apenas, não detectado por PiB-PET, mas contribuindo para reduzir os níveis de Aβ42 no CSF.

[0281] O uso generalizado de pT181 como um marcador de AD em clínicas é provavelmente devido ao seu alto nível de detectabilidade, mas não necessariamente alta especificidade. A medição de pT181 des- taca uma ligeira mudança em sua estequiometria de fosforilação em AD, em comparação com demência não AD. A taxa de fosforilação aumen- tada de T181 foi ainda mais aparente em um grupo positivo para ami- loide bem caracterizado investigado na coorte de validação. Em ambos os estudos, a razão combinando ELISA t-tau e p-tau181 não conseguiu demonstrar a alteração da razão de fosforilação que ocorre em T181, enfatizando as limitações do ELISA para monitorar com precisão essas alterações. Assim, o aumento de pT181 amplamente relatado em CSF AD resulta principalmente do aumento concomitante do nível de isofor- mas de tau, em vez de alteração significativa na estequiometria de fos- forilação de T181. A patologia Amiloide-Aβ induz hiperfosforilação em T181, mas a modificação resultante parece menos específica ou signi- ficativa em comparação com o aumento relativo observado em T217.

[0282] As modificações da estequiometria de fosforilação observa- das em S199, S202 e T205 no CSF AD provavelmente refletem mudan- ças específicas na fosforilação de tau previamente observada no cére- bro com AD. Na verdade, pS202 e pT205 são parte do epítopo dupla- mente fosforilado reconhecido pelo anticorpo AT8. AT8 liga-se aos agre- gados de tau encontrados em autópsias cerebrais com AD e a extensão dos agregados imunorreativos AT8 se correlaciona com a gravidade da tauopatia (estágios de Braak). AT8 não tem reatividade para tau normal ou tau relacionada com AD medida no CSF. Além disso, o anticorpo Tau1 que se liga a tau normal em um epítopo não fosforilado contendo

S199 não tem afinidade para agregados de tau AD. Juntos, esses acha- dos apoiam uma hiperfosforilação concomitante e abundante de S199, S202 e T205 em agregados de tau do cérebro com AD. No entanto, existe controvérsia sobre a propriedade intrínseca de tais isoformas de tau fosforiladas para promover a agregação de tau na AD. Quantidades diminuídas de fosforilação de S199 e S202 observadas em CSF AD leve e moderada são consistentes com uma acumulação das isoformas tau fosforiladas correspondentes em agregados. Além disso, a detecção de fosforilação de T205, principalmente em CSF AD moderada, sugere um papel importante desse sítio nos mecanismos patológicos subjacentes à tauopatia relacionada à amiloide. A modificação na fosforilação S202/T205 não foi detectada na segunda coorte composta por partici- pantes pré-clínicos e com AD leve (dados não mostrados), sugerindo um processo dinâmico de fosforilação de tau em sítios específicos du- rante o curso da doença.

[0283] Os presentes achados podem sugerir uma interação entre a amiloidose AD e a hiperfosforilação de tau em T217 e, em menor exten- são, em T181. Estes sítios são ambos substratos para a quinase GSK- 3 dirigida por serina/treonina prolina, e a ativação de GSK-3 por oligô- meros Aβ foi proposta como uma ligação entre o peptídeo amiloide e a fosforilação de tau. A hiperfosforilação comum e relativamente bem cor- relacionada nesses dois sítios GSK-3 em pacientes com amiloidose pode ser consistente com esse mecanismo. Outros estudos projetados para comparar as taxas de fosforilação de tau no CSF e no cérebro, incluindo os agregados de tau medidos por tau PET, provavelmente for- necerão novos insights sobre a fisiopatologia da AD e podem identificar novas abordagens terapêuticas. Essas descobertas apontam para uma ligação específica entre as placas amiloides e a tauopatia na AD e for- necem uma ligação potencial na cascata de eventos moleculares que levam à AD. Assim, dada a especificidade do pT217 no processo de AD,

ele pode representar um alvo importante para o desenvolvimento tera- pêutico futuro e uma ferramenta interessante para acompanhar os efei- tos potenciais das drogas antiamiloides na limitação deste metabolismo anormal da tau.

Claims (137)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para diagnosticar um indivíduo antes do início da doença de Alzheimer, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida do indivíduo e medir a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) diagnosticar o indivíduo como tendo um risco aumentado de conversão para comprometimento cognitivo leve devido à doença de Alzheimer quando a fosforilação de tau em T217 ou T181 é de cerca de 1,5σ ou superior e a fosforilação de tau em T205 é de cerca de 1,5σ ou inferior, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205 ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T217 é superior a 1,5σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,5σ.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando (i) a fosforilação de tau em T217 é superior a 1,75σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,75σ, (ii) a fosforilação de tau em T217 é superior a 1,8σ e a fosfori- lação de tau em T205 é inferior a 1,8σ, ou (iii) a fosforilação de tau em T217 é superior a 1,9σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,9σ.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T217 é superior a 2σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 2σ.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T181 é superior a 1,5σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,5σ.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando (i) fosforilação de tau em T181 é superior a 1,75σ e fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,75σ, (ii) fosforilação de tau em T181 é superior a 1,8σ e fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,8σ, ou (iii) fosforilação de tau em T181 é superior a 1,9σ e fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,9σ.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando fosforilação de tau em T181 é superior a 2σ e fosforilação de tau em T205 é inferior a 2σ.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T181 e T217 é superior a 1,5σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,5σ.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando (i) a fosforilação de tau em T181 e T217 é superior a 1,75σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,75σ, (ii) a fosforilação de tau em T181 e T217 é superior a 1,8σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,8σ, ou (iii) a fosforila- ção de tau em T181 e T217 é superior a 1,9σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,9σ.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T181 e T217 é superior a 2σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 2σ.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico inclui ainda uma identificação do indivíduo como cerca de 10 a cerca de 25 anos a partir do início do comprometimento cognitivo leve devido à doença de Alzhei- mer.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico inclui ainda uma identificação do indivíduo como cerca de 10 a cerca de 20 anos a partir do início do comprometi- mento cognitivo leve devido à doença de Alzheimer.

13. Método para diagnosticar um indivíduo antes do início da doença de Alzheimer, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida do indivíduo e medir a tau total e a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) diagnosticar o indivíduo como tendo um risco aumentado de conversão para comprometimento cognitivo leve devido à doença de Alzheimer quando a razão de fosforilação de tau em T217 ou T181 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 2σ, onde σ é o desvio padrão definido pela distri- buição normal da tau total e da fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205 ou T181, T205 e T217 medida em uma população de con- trole sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imagea- mento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a razão de fosfori- lação de tau em T217 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fos- forilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,5σ.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando (i) a razão de fos- forilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total T217 é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total T205 é inferior a

1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,9σ.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a razão de fosfori- lação de tau em T217 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosfo- rilação de tau em T205 para tau total é inferior a 2σ.

17. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a razão de fosfori- lação de tau em T181 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fos- forilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,5σ.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando (i) a razão de fos- forilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,9σ.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a razão de fosfori- lação de tau em T181 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosfo- rilação de tau em T205 para tau total é inferior a 2σ.

20. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a razão de fosfori- lação de tau em T181 para tau total e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total está abaixo 1,5σ.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando (i) a razão de fos- forilação de tau em T181 para tau total e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,9σ.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a razão de fosfori- lação de tau em T181 para tau total e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 2σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 2σ.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 22, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico inclui ainda uma identificação do indivíduo como cerca de 10 a cerca de 25 anos a partir do início do comprometimento cognitivo leve devido à doença de Alzhei- mer.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico inclui ainda uma identificação do indivíduo como cerca de 10 a cerca de 20 anos a partir do início do comprometi- mento cognitivo leve devido à doença de Alzheimer.

25. Método para diagnosticar um indivíduo antes do início da doença de Alzheimer, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida do indivíduo e medir a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) diagnosticar o indivíduo como tendo um risco aumentado de conversão para comprometimento cognitivo leve devido à doença de Alzheimer quando a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217 é de cerca de 1,5σ ou superior, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205 ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T217 e T205 é superior a 1,5σ.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T217 e T205 é superior a 1,75σ, é superior a 1,8σ ou é superior a 1,9σ.

28. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T217 e T205 é superior a 2σ.

29. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T181 e T205 é superior a 1,5σ.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T181 e T205 é superior a 1,75σ, é superior a 1,8σ ou é superior a 1,9σ.

31. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T181 e T205 é superior a 2σ.

32. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T181, T205 e T217 é superior a 1,5σ.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T181, T205 e T217 é superior a 1,75σ, é superior a 1,8σ ou é superior a 1,9σ.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a fosforilação de tau em T181, T205 e T217 é superior a 2σ.

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 34, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico inclui ainda uma identificação do indivíduo como cerca de 15 anos ou menos a partir do início do comprometimento cognitivo leve devido à doença de Alzhei- mer.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico inclui ainda uma identificação do indivíduo como cerca de 10 anos ou menos a partir do início do comprometimento cognitivo leve devido à doença de Alzheimer.

37. Método para diagnosticar um indivíduo antes do início da doença de Alzheimer, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida do indivíduo e medir a tau total e a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) diagnosticar o indivíduo como tendo um risco aumentado de conversão para comprometimento cognitivo leve devido à doença de Alzheimer quando a razão de fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217 para tau total é de cerca de 1,5σ ou superior, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de tau total e fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205 ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem pla- cas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a razão de fosfori- lação de tau em T217 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fos- forilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,5σ.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando (i) a razão de fos- forilação de tau em T217 para tau total é inferior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,9σ.

40. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a razão de fosfori- lação de tau em T217 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosfo- rilação de tau em T205 para tau total é superior a 2σ.

41. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a razão de fosfori- lação de tau em T181 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fos- forilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,5σ.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a razão de fosfori- lação de tau em T181 para tau total é inferior a 1,75σ e a razão de fos- forilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,9σ.

43. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a razão de fosfori- lação de tau em T181 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosfo- rilação de tau em T205 para tau total é superior a 2σ.

44. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a razão de fosfori- lação de tau em T181 para tau total é superior a 1,5σ, a razão de fosfo- rilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T217 para o tau total é superior a 1,5σ.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando (i) a razão de fos- forilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,75σ, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,8σ, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,8σ, e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,8σ, (iii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,9σ, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,9σ, e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,9σ.

46. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é diagnosticado quando a razão de fosfori- lação de tau em T181 para tau total é superior a 2σ, a razão de fosfori- lação de tau em T205 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosfo- rilação de tau em T217 para total tau é superior a 2σ.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 46, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico inclui ainda uma identificação do indivíduo como cerca de 15 anos ou menos a partir do início do comprometimento cognitivo leve devido à doença de Alzhei- mer.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico inclui ainda uma identificação do indivíduo como cerca de 10 anos ou menos a partir do início do comprometimento cognitivo leve devido à doença de Alzheimer.

49. Método para tratar um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida do indivíduo e medir a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) administrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando a fosforilação de tau em T217 ou T181 é de cerca de 1,5σ ou superior e a fosforilação de tau em T205 é de cerca de 1,5σ ou inferior, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de fosforila- ção de tau em T217 e T205, T181 e T205 ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais con- forme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

50. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T217 é superior a 1,5σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,5σ.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando (i) a fosforilação de tau em T217 é superior a 1,75σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,75σ, (ii) a fosforilação de tau em T217 é superior a 1,8σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,8σ, ou (iii) a fosforilação de tau em T217 é superior a 1,9σ e a fos- forilação de tau em T205 é inferior a 1,9σ.

52. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T217 é superior a 2σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 2σ.

53. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T181 é superior a 1,5σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,5σ.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando (i) a fosforilação de tau em T181 é superior a 1,75σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,75σ, (ii) a fosforilação de tau em T181 é superior a 1,8σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,8σ, ou (iii) a fosforilação de tau em T181 é superior a 1,9σ e a fos- forilação de tau em T205 é inferior a 1,9σ.

55. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T181 é superior a 2σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 2σ.

56. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T181 e T217 é superior a 1,5σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,5σ.

57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando (i) a fosforilação de tau em T181 e T217 é superior a 1,75σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,75σ, (ii) a fosforila- ção de tau em T181 e T217 é superior a 1,8σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,8σ, ou (iii) a fosforilação de tau em T181 e T217 é superior a 1,9σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,9σ.

58. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T181 e T217 é superior a 2σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 2σ.

59. Método para tratar um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida do indivíduo e medir a tau total e a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) administrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando a razão de fosforilação de tau em T217 ou T181 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 2σ, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de tau total e fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205 ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloi- des cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,5σ.

61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando (i) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total T217 é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total T205 é inferior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,9σ.

62. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 2σ.

63. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,5σ.

64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando (i) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,9σ.

65. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 2σ.

66. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total está abaixo 1,5σ.

67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é é administrado com uma composição far- macêutica quando (i) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,9σ.

68. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 2σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 2σ.

69. Método para tratar um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida do indivíduo e medir a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) administrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217 é de cerca de 1,5σ ou superior, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205 ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por ima- geamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T217 e T205 é superior a

1,5σ.

71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T217 e T205 é superior a 1,75σ, é superior a 1,8σ ou é superior a 1,9σ.

72. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T217 e T205 é superior a 2σ.

73. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T181 e T205 é superior a 1,5σ.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T181 e T205 é superior a 1,75σ, é superior a 1,8σ ou é superior a 1,9σ.

75. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T181 e T205 é superior a 2σ.

76. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T181, T205 e T217 é supe- rior a 1,5σ.

77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T181, T205 e T217 é supe- rior a 1,75σ, é superior a 1,8σ ou é superior a 1,9σ.

78. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a fosforilação de tau em T181, T205 e T217 é supe- rior a 2σ.

79. Método para tratar um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida do indivíduo e medir a tau total e a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) administrar uma composição farmacêutica ao indivíduo quando a razão de fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217 para tau total é de cerca de 1,5σ ou superior, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de tau total e de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205 ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloi- des cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,5σ.

81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando (i) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é inferior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,9σ.

82. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 2σ.

83. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,5σ.

84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é inferior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,9σ.

85. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 2σ.

86. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,5σ, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T217 para o tau total é superior a 1,5σ.

87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando (i) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,75σ, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,8σ, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,8σ, e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,8σ, (iii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,9σ, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,9σ, e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,9σ.

88. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é administrado com uma composição far- macêutica quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 2σ, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosforilação de tau em T217 para total tau é superior a 2σ.

89. Método para inscrever um indivíduo em um ensaio clí- nico, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida do indivíduo e medir a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) inscrever o indivíduo em um ensaio clínico quando a fos- forilação de tau em T217 ou T181 é de cerca de 1,5σ ou superior e a fosforilação de tau em T205 é de cerca de 1,5σ ou inferior, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205 ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosfo- rilação de tau em T217 é superior a 1,5σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,5σ.

91. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando (i) a fosforilação de tau em T217 é superior a 1,75σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,75σ, (ii) a fosforilação de tau em T217 é superior a 1,8σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,8σ, ou (iii) a fosfo- rilação de tau em T217 é superior a 1,9σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,9σ.

92. Método, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosfo- rilação de tau em T217 é superior a 2σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 2σ.

93. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosfo- rilação de tau em T181 é superior a 1,5σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,5σ.

94. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando (i) a fosforilação de tau em T181 é superior a 1,75σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,75σ, (ii) a fosforilação de tau em T181 é superior a 1,8σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,8σ, ou (iii) a fosfo- rilação de tau em T181 é superior a 1,9σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,9σ.

95. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosfo- rilação de tau em T181 é superior a 2σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 2σ.

96. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosfo- rilação de tau em T181 e T217 é superior a 1,5σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,5σ.

97. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando (i) a fosforilação de tau em T181 e T217 é superior a 1,75σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,75σ, (ii) a fosforilação de tau em T181 e T217 é superior a 1,8σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 1,8σ, ou (iii) a fosforilação de tau em T181 e T217 é superior a 1,9σ e a fos- forilação de tau em T205 é inferior a 1,9σ.

98. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosfo- rilação de tau em T181 e T217 é superior a 2σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 2σ.

99. Método para inscrever um indivíduo em um ensaio clí- nico, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida do indivíduo e medir a tau total e a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) inscrever o indivíduo em um ensaio clínico quando a ra- zão de fosforilação de tau em T217 ou T181 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 2σ, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de tau total e fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205 ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

100. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,5σ.

101. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando (i) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total T217 é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total T205 é inferior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,9σ.

102. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 2σ.

103. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,5σ.

104. Método, de acordo com a reivindicação 103, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando (i) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,9σ.

105. Método, de acordo com a reivindicação 103, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 2σ.

106. Método, de acordo com a reivindicação 99, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total e a razão de fosfo- rilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total está abaixo 1,5σ.

107. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando (i) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total e a razão de fos- forilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosfo- rilação de tau em T181 para tau total e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,9σ.

108. Método, de acordo com a reivindicação 106, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total e a razão de fosfo- rilação de tau em T217 para tau total é superior a 2σ e a fosforilação de tau em T205 é inferior a 2σ.

109. Método para inscrever um indivíduo em um ensaio clí- nico, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida do indivíduo e medir a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) inscrever o indivíduo em um ensaio clínico quando a fos- forilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217 é de cerca de 1,5σ ou superior, onde σ é o desvio padrão defi- nido pela distribuição normal de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205 ou T181, T205 e T217 medida em uma população de con- trole sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imagea- mento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

110. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosforilação de tau em T217 e T205 é superior a 1,5σ.

111. Método, de acordo com a reivindicação 110, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosforilação de tau em T217 e T205 é superior a 1,75σ, é superior a 1,8σ ou é superior a 1,9σ.

112. Método, de acordo com a reivindicação 110, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosforilação de tau em T217 e T205 é superior a 2σ.

113. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosforilação de tau em T181 e T205 é superior a 1,5σ.

114. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosforilação de tau em T181 e T205 é superior a 1,75σ, é superior a 1,8σ ou é superior a 1,9σ.

115. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosforilação de tau em T181 e T205 é superior a 2σ.

116. Método, de acordo com a reivindicação 109, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosforilação de tau em T181, T205 e T217 é superior a 1,5σ.

117. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosforilação de tau em T181, T205 e T217 é superior a 1,75σ, é superior a 1,8σ ou é superior a 1,9σ.

118. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a fosforilação de tau em T181, T205 e T217 é superior a 2σ.

119. Método para inscrever um indivíduo em um ensaio clí- nico, caracterizado pelo fato de que compreende (a) fornecer uma amostra de tau isolada obtida do indivíduo e medir a tau total e a fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217; e (b) inscrever o indivíduo em um ensaio clínico quando a ra- zão de fosforilação de tau em (i) T217 e T205, (ii) T181 e T205, ou (iii) T181, T205 e T217 para tau total é de cerca de 1,5σ ou superior, onde σ é o desvio padrão definido pela distribuição normal de tau total e de fosforilação de tau em T217 e T205, T181 e T205 ou T181, T205 e T217 medida em uma população de controle sem placas amiloides cerebrais conforme medido por imageamento PET e/ou medição de Aβ42/40 em CSF.

120. Método, de acordo com a reivindicação 119, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,5σ.

121. Método, de acordo com a reivindicação 120, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando (i) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é inferior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,9σ.

122. Método, de acordo com a reivindicação 120, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 2σ.

123. Método, de acordo com a reivindicação 119, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,5σ.

124. Método, de acordo com a reivindicação 123, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é inferior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é inferior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,8σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,8σ, ou (iii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,9σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,9σ.

125. Método, de acordo com a reivindicação 123, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 2σ.

126. Método, de acordo com a reivindicação 119, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,5σ, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,5σ e a razão de fosforilação de tau em T217 para o tau total é superior a 1,5σ.

127. Método, de acordo com a reivindicação 126, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando (i) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,75σ,

a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,75σ e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,75σ, (ii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é supe- rior a 1,8σ, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é su- perior a 1,8σ, e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,8σ, (iii) a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 1,9σ, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 1,9σ, e a razão de fosforilação de tau em T217 para tau total é superior a 1,9σ.

128. Método, de acordo com a reivindicação 126, caracteri- zado pelo fato de que o indivíduo é inscrito no ensaio clínico quando a razão de fosforilação de tau em T181 para tau total é superior a 2σ, a razão de fosforilação de tau em T205 para tau total é superior a 2σ e a razão de fosforilação de tau em T217 para total tau é superior a 2σ.

129. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 89 a 128, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está inscrito no braço de tratamento do ensaio clínico.

130. Método, de acordo com a reivindicação 129, caracteri- zado pelo fato de que o braço de tratamento do ensaio clínico compre- ende administrar uma composição farmacêutica ao indivíduo.

131. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 49 a 89 ou reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende uma terapia Aβ ou tau.

132. Método, de acordo com a reivindicação 131, caracteri- zado pelo fato de que a terapia de Aβ ou tau é uma terapia de direcio- namento de beta amiloide, uma quinase, um inibidor de quinase ou uma fosfatase.

133. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 132, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma muta- ção genética conhecida por causar a doença de Alzheimer hereditária dominante.

134. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 132, caracterizado pelo fato de que o indivíduo não tem uma mutação genética conhecida por causar a doença de Alzheimer heredi- tária dominante.

135. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 134, caracterizado pelo fato de que a amostra de tau isolada compreende tau que foi purificada do sangue ou CSF por purificação por afinidade.

136. Método, de acordo com a reivindicação 135, caracteri- zado pelo fato de que a amostra de tau isolada compreende tau que foi purificada do sangue ou CSF por purificação de afinidade usando um ligando que se liga especificamente a um epítopo dentro do domínio intermediário de tau e, opcionalmente, com um segundo ligando que se liga especificamente a um epítopo dentro do terminal N de tau.

137. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 135, caracterizado pelo fato de que a fosforilação de tau é me- dida por espectrometria de massa.