JP2024507328A - アルツハイマー病のステージおよび進行に伴うｃｓｆタウ種を検出する方法、およびその使用 - Google Patents

アルツハイマー病のステージおよび進行に伴うｃｓｆタウ種を検出する方法、およびその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、アルツハイマー病による認知症に至るまでの期間を決定すること、認知症発症からの時間を決定すること、アルツハイマー病をステージ分類すること、処置決定を導くこと、および、ある特定の治療介入の臨床効果を評価することを含む、様々なＣＳＦタウ種を定量および分析するための方法、ならびにタウオパチーの病理学的特徴および／または臨床症状を測定するためのその使用を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それらの出願のそれぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２０２１年１月２１日に出願された米国仮出願第６３／１４０，２３０号、２０２１年２月１８日に出願された米国仮出願第６３／１５１，０５１号、２０２１年４月２日に出願された米国仮出願第６３／１７０，１８５号、２０２１年４月２８日に出願された米国仮出願第６３／１８０，９１５号、２０２１年５月１２日に出願された米国仮出願第６３／１８７，６９７号、および２０２１年６月２１日に出願された米国仮出願第６３／２１３，００６号の優先権を主張するものである。
政府支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈより授与されたＡＧ０４６３６３およびＡＧ０３２４３８の下で政府の資金提供を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年１月２０日に生成されたＡＳＣＩＩコピーは、「７１５６１６＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられ、サイズは８，９３６バイトである。
本開示は、様々なＣＳＦタウ種を定量および分析するための方法、ならびに原発性タウオパチー（例えば、ＭＡＰＴ、ＰＳＰ、ＣＢＤ）および二次性タウオパチー（例えば、ＡβアミロイドーシスによるＡＤ）を含むタウオパチーの病理学的特徴および／または臨床症状を測定するためのその使用を包含する。
微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴまたはタウ）は、ニューロンの形態学および生理学に必須の役割を果たす。タウは、６つの異なる全長タンパク質のアイソフォームを有し、アセチル化、グリコシル化およびリン酸化を含む多数の潜在的翻訳後修飾を受ける。
脳内の不溶性凝集体としてのタウタンパク質の蓄積は、アルツハイマー病およびタウオパチーと呼ばれる他の神経変性疾患の特質の１つである。大脳皮質における細胞内タングルは、アルツハイマー病（ＡＤ）の決定的な病理学的特徴であり、細胞外アミロイドβ（Ａβ）プラークの出現から長期間たった後に臨床症状が発症することと相関しており、細胞外アミロイドβ（Ａβ）プラークは、症状発症の最長２０年前から発現し始める。タウ病変は脳領域全体に伝播し、特定の病理学的タウ種がプリオン様手段で細胞から細胞へ伝播することによって広がるようであるが、これらの種（すなわち、単量体、オリゴマー、およびフィブリル種）の性質および広がりのプロセスは不明である。
ＡＤにおいて、可溶性ｐ－タウおよび非リン酸化タウが、脳脊髄液中で２倍増加する。これらの変化は、タウおよびＮＦＴをＣＳＦに受動的に放出するニューロン死（神経変性）の影響を反映していると提唱されている。しかし、重大なＮＦＴ病変および神経変性を伴う他のタウオパチー（例えば、進行性核上性麻痺、前頭側頭葉変性タウ）では、ＣＳＦの可溶性ｐ－タウおよび総タウのレベルは増加しない。これらの観察は、ＡβがＡＤ特有のタウオパチーにつながるプロセスを引き起こす場合があることを示唆しており、この考えは細胞モデルおよび動物モデルによって裏付けられている。この概念は、ヒトにおけるアミロイドプラークの存在下での可溶性タウの活発な産生の増加によってさらに裏付けられている。
いくつかの質量分析（ＭＳ）研究では、ＡＤ脳においてタウの微小管結合領域（ＭＴＢＲ）が凝集体に富んでいることが示唆されている。さらに、一連の極低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ＥＭ）研究により、タウ凝集体のコア構造がＭＴＢＲドメインのサブセグメントからなり、特定の立体配座がタウオパチーに依存することが実証された。しかし、これらの研究では死後の脳組織が使用されており、ＣＳＦなどの生物学的試料中の対応する細胞外ＭＴＢＲ含有タウ種の病態生理学についてはほとんど知られていない。
タウは、ＡＤ病変の特質を構成し、凝集形態または可溶性形態で測定され得るが、この重要な神経細胞タンパク質の翻訳後修飾およびアイソフォームが、ヒトにおけるＮＦＴおよび神経変性の発症にどのようにつながるかについての我々の理解には、大きなギャップが残っている。例えば、ＡＤの前臨床ステージおよび臨床ステージにおいてタウにどのような病態生理学的変化が起こるかは不明である。そのため、タウを使用して、ＡＤに関連する症状の発症前に対象をステージ分類して、処置決定を導くことができる場合、それがどの程度であるかは不明である。
一態様では、本開示は、（ａｉ）対象から得られた血液試料またはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、および適宜ＭＴＢＲ－タウ２１２、残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率 ＭＴＢＲ－タウ２４３、ＭＴＢＲ－タウ３Ｒ、もしくはそれらの組合せを測定すること、または（ａｉｉ）対象から得られた血液試料もしくはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、残基Ｔ２１７におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること、ならびに（ｂ）（ａｉ）もしくは（ａｉｉ）の測定値を使用して、認知症発症までの時間を計算することであって、認知症発症までの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価までの年数である、計算することによって対象における認知症発症までの時間を測定する方法を包含する。
別の態様では、本開示は、アルツハイマー病の認知症状または挙動症状を伴わない対象において認知症発症までの時間を測定する方法を包含し、この方法は、一般に、（ａ）対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理してタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得し、次いで、枯渇試料を処理してタウ種の第２の集団を取得することであって、タウ種の第１の集団にはＮ末端タウおよび／またはｍｉｄドメインタウが濃縮されており、濃縮されたタウ種の第２の集団にはＭＴＢＲ－タウが濃縮されている、取得すること；（ｂｉ）タウ種の第１の集団における残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、ならびに適宜、タウ種の第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること、または
（ｂｉｉ）タウ種の第１の集団における残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の第１の集団における残基Ｔ２１７におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、ならびにタウ種の第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること；ならびに
（ｃ）（ｂｉ）もしくは（ｂｉｉ）の測定値を使用して認知症発症までの時間を計算することであって、認知症発症までの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価までの年数である、計算すること
を含む。
一部の実施形態では、対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理して、濃縮されたタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得することは、血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合する第１のエピトープ結合剤およびタウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させることであって、第１および第２のエピトープ結合剤を順次にまたは同時に使用する、接触させることを含み；タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、ＨＪ８．５、もしくはＨＪ８．５と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよく、タウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、タウ１、またはタウ１と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよい。
一部の実施形態では、枯渇試料を処理して、濃縮されたタウ種の第２の集団を取得することは、ＭＴＢＲ－タウ種を濃縮するための化学抽出工程を実行することであって、化学抽出工程は、酸を混合して枯渇試料のタンパク質を沈殿させることであって、酸は過塩素酸であってもよく、沈殿したタンパク質の除去後の上清中にＭＴＢＲ－タウ種が存在している、沈殿させることを含んでもよい、実行すること；あるいは、枯渇試料を、タウのＭＴＢＲ内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させることであって、エピトープ結合剤は、Vandermeeren et al., J Alzheimers Dis, 2018, 65:265-281に記載の７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、もしくはＰＴ７６、またはRoberts et al., Acta Neuropathol Commun, 2020, 8: 13に記載の７Ｇ６、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６の抗原結合フラグメント、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６と同じエピトープに特異的に結合する他のエピトープ結合剤であってもよい、接触させることを含む。
一部の実施形態では、対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理して、濃縮されたタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得することは、血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合する第１のエピトープ結合剤およびタウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させることであって、第１および第２のエピトープ結合剤を順次にもしくは同時に使用する、接触させることを含み、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、ＨＪ８．５、もしくはＨＪ８．５と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよく、タウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、タウ１、もしくはタウ１と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよく；ならびに枯渇試料を処理して、濃縮されたタウ種の第２の集団を取得することは、ＭＴＢＲ－タウ種を濃縮するための化学抽出工程を、実行することであって、化学抽出工程は、酸を混合して枯渇試料のタンパク質を沈殿させることであって、酸は過塩素酸であってもよく、沈殿したタンパク質の除去後の上清中にＭＴＢＲ－タウ種が存在している、沈殿させることを含んでもよい、実行すること；あるいは、枯渇試料を、タウのＭＴＢＲ内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させることであって、エピトープ結合剤は、Vandermeeren et al., J Alzheimers Dis, 2018, 65:265-281に記載の７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、もしくはＰＴ７６、またはRoberts et al., Acta Neuropathol Commun, 2020, 8: 13に記載の７Ｇ６、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６の抗原結合フラグメント、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６と同じエピトープに特異的に結合する他のエピトープ結合剤であってもよい、接触させることを含む。
上記の態様のそれぞれにおいて、対象は、ＣＤＲがゼロであり得る。
一部の実施形態では、認知症発症までの計算された時間の測定値を使用して、対象の疾患の進行をステージ分類すること、対象の脳の病変をステージ分類すること、または対象のための治療剤もしくは診断剤を選択することができる。
さらに別の態様では、本開示は、治療剤または診断薬を対象に投与することによって、アルツハイマー病の認知症状または挙動症状を伴わない対象を処置するための方法であって、治療剤は、Ａβ産生を低減させるか、Ａβ凝集を防止するかもしくはそれに拮抗するか、または脳のＡβクリアランスを増大させ、治療剤は、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、受動免疫療法（限定されるものではないが、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、もしくは抗ＡｐｏＥ抗体を含む）、または能動免疫療法であってもよく、あるいは治療剤は、タウの凝集を防止するかまたはそれに拮抗し、神経原線維変化クリアランスを増大させ、タウのリン酸化パターンを変化させ、治療剤は、タウタンパク質凝集阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、受動免疫療法（限定されるものではないが、抗タウ抗体を含む）、または能動免疫療法であってもよい、方法を提供する。
別の態様では、本開示は、（ａｉ）対象から得られた血液試料またはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、および適宜ＭＴＢＲ－タウ２１２、残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率 ＭＴＢＲ－タウ２４３、ＭＴＢＲ－タウ３Ｒ、もしくはそれらの組合せを測定すること、または（ａｉｉ）対象から得られた血液試料もしくはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、タウの残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率を測定すること、およびＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること、ならびに（ｂ）（ａｉ）もしくは（ａｉｉ）の測定値を使用して、認知症発症からの時間を計算することであって、認知症発症からの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価からの年数である、計算することによって、アルツハイマー病の認知症状または行動症状を有する対象において認知症発症からの時間を測定するための方法を提供する。
さらに別の態様では、本開示は、（ａ）対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理してタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得し、次いで、枯渇試料を処理してタウ種の第２の集団を取得することであって、タウ種の第１の集団にはＮ末端タウおよび／またはｍｉｄドメインタウが濃縮されており、濃縮されたタウ種の第２の集団にはＭＴＢＲ－タウが濃縮されている、取得すること；（ｂｉ）タウ種の第１の集団における残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、ならびに適宜、タウ種の第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること、または（ｂｉｉ）タウ種の第１の集団における残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の第１の集団における残基Ｔ２１７におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、ならびにタウ種の第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること；ならびに（ｃ）（ｂｉ）もしくは（ｂｉｉ）の測定値を使用して認知症発症からの時間を計算することであって、認知症発症からの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価からの年数である、計算することによって、アルツハイマー病の認知症状または行動症状を有する対象において認知症発症からの時間を測定するための方法を提供する。
一部の実施形態では、対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理して、濃縮されたタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得することは、血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合する第１のエピトープ結合剤およびタウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させることであって、第１および第２のエピトープ結合剤を順次にまたは同時に使用する、接触させることを含み；タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、ＨＪ８．５、もしくはＨＪ８．５と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよく、タウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、タウ１、またはタウ１と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよい。
一部の実施形態では、枯渇試料を処理して、濃縮されたタウ種の第２の集団を取得することは、
ＭＴＢＲ－タウ種を濃縮するための化学抽出工程を実行することであって、
化学抽出工程は、酸を混合して枯渇試料のタンパク質を沈殿させることであって、酸は過塩素酸であってもよく、沈殿したタンパク質の除去後の上清中にＭＴＢＲ－タウ種が存在している、沈殿させることを含んでもよい、実行すること；あるいは、
枯渇試料を、タウのＭＴＢＲ内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させることであって、
エピトープ結合剤は、Vandermeeren et al., J Alzheimers Dis, 2018, 65:265-281に記載の７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、もしくはＰＴ７６、またはRoberts et al., Acta Neuropathol Commun, 2020, 8: 13に記載の７Ｇ６、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６の抗原結合フラグメント、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６と同じエピトープに特異的に結合する他のエピトープ結合剤であってもよい、接触させること
を含む。
対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理して、濃縮されたタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得することが、
血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または
血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または
血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合する第１のエピトープ結合剤およびタウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させることであって、第１および第２のエピトープ結合剤を順次にもしくは同時に使用する、接触させること
を含み
タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、ＨＪ８．５、もしくはＨＪ８．５と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよく、タウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、タウ１、もしくはタウ１と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよく；ならびに枯渇試料を処理して、濃縮されたタウ種の第２の集団を取得することは、ＭＴＢＲ－タウ種を濃縮するための化学抽出工程を、実行することであって、化学抽出工程は、酸を混合して枯渇試料のタンパク質を沈殿させることであって、酸は過塩素酸であってもよく、沈殿したタンパク質の除去後の上清中にＭＴＢＲ－タウ種が存在している、沈殿させることを含んでもよい、実行すること；あるいは、枯渇試料を、タウのＭＴＢＲ内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させることであって、エピトープ結合剤は、Vandermeeren et al., J Alzheimers Dis, 2018, 65:265-281に記載の７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、もしくはＰＴ７６、またはRoberts et al., Acta Neuropathol Commun, 2020, 8: 13に記載の７Ｇ６、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６の抗原結合フラグメント、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６と同じエピトープに特異的に結合する他のエピトープ結合剤であってもよい、接触させることを含む、請求項１８に記載の方法。
一部の実施形態では、認知症発症までの計算された時間の測定値を使用して、対象の疾患の進行をステージ分類すること、対象の脳の病変をステージ分類すること、または対象のための治療剤もしくは診断剤を選択することができる。
したがって、本開示は、アルツハイマー病の認知症状または挙動症状を伴わない対象を処置するための方法であって、対象に治療剤または診断剤を投与することを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、対象における認知の変化を測定するための方法であって、（ａ）対象から得た血液試料またはＣＳＦ試料中のＴ１１１、Ｔ１５３、Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、および対象から得た血液試料またはＣＳＦ試料中のＭＴＢＲ－タウ２７５、ＭＴＢＲ－タウ２９９、およびＭＴＢＲ－３Ｒのうちの少なくとも１つを測定すること、および適宜、対象から得た血液試料またはＣＳＦ試料中の総タウを測定すること；ならびに（ｂ）（ａ）の測定値を使用して認知における変化を計算することであって、この認知における変化は、国際ショッピングリスト試験（ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｈｏｐｐｉｎｇ Ｌｉｓｔ Ｔｅｓｔ）による遅延想起スコア、ウェクスラー記憶検査法（Ｗｅｃｈｓｌｅｒ Ｍｅｍｏｒｙ Ｓｃａｌｅ－Ｒｅｖｉｓｅｄ）による論理記憶遅延再生スコア、ウェクスラー成人知能検査法（ Ｗｅｃｈｓｌｅｒ Ａｄｕｌｔ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｓｃａｌｅ－Ｒｅｖｉｓｅｄ）による数字記号コード化試験（Ｄｉｇｉｔ Ｓｙｍｂｏｌ Ｃｏｄｉｎｇ ｔｅｓｔ）総スコア、およびＭＭＳＥ総スコア、からなる認知複合スコアによって測定される認知における変化と同等である、計算することを含む方法を提供する。
一部の実施形態では、認知における変化の測定を使用して、治療剤の有効性を評価する。
本開示の他の態様および反復を、以下により十分に説明する。
出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された写真を含有する。カラー写真を有するこの特許出願公開のコピーは、要求および必要な料金の支払いに応じて事務局が提供することとなる。
図１は、最長のヒトタウアイソフォーム（２Ｎ４Ｒ）の概略図である。Ｎ末端（Ｎ末端）、ｍｉｄドメイン、ＭＴＢＲおよびＣ末端（Ｃ末端）が、このアイソフォームについて同定され、他のタウアイソフォーム（例えば２Ｎ３Ｒ、１ＮＲ４、１Ｎ３Ｒ、０Ｎ４Ｒおよび０Ｎ３Ｒ）については予測可能な形で変動するであろう。
図２Ａは、本開示のいくつかの方法を示す概略図である。１つの方法は、青色ボックス内で詳しく説明されている方法（右－タウ化学抽出法）である。別の方法は、赤色ボックス（左－ Ｎ末端タウおよびｍｉｄドメインタウのＩＰ）ならびに青色ボックス（右－ タウ化学抽出法）の組合せである。図２Ｂは、本開示のいくつかの方法を示す概略図である。１つの方法は、青色ボックス内で詳しく説明されている方法（右－タウ化学抽出法）である。別の方法は、赤色ボックス（左－ Ｎ末端タウおよびｍｉｄドメインタウのＩＰ）ならびに青色ボックス（右－ タウ化学抽出法）の組合せである。 同上。
図３は、本開示の方法を示す概略図である。
図４は、本開示の方法を示す概略図である。
図５は、タウ病変が、アルツハイマー病において、別個のフェーズを通して発展することを示す例証である。決定的なアルツハイマー病突然変異を有する参加者群において、４種の異なる可溶性タウ種および不溶性タウを測定し、発明者らは、３５年間（ｘ－軸）にわたってタウ関連変化が展開し（ｙ－軸）、疾患のステージおよび他の測定可能なバイオマーカーに基づいて異なることを示す。２１７位（紫色）および１８１位（青色）において、原繊維性アミロイド病変のリン酸化の発生でスタートし、増加し始める。神経細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ）機能不全（代謝変化に基づく）の増加と共に、可溶性タウ（橙色）と一緒に２０５位（緑色）でのリン酸化が増加し始める。最後に、神経変性（脳萎縮および認知低下に基づく）の発症と共に、タウＰＥＴタングル（赤色）が発生し始める一方、２１７および１８１のリン酸化が減少し始める。まとめると、これは、疾患の間の、可溶性および凝集タウの動的かつ多岐のパターン、ならびにアミロイド病変との密接な関係を強調する。
図６Ａおよび図６Ｂは、ＣＳＦのＭＴＢＲ－タウ２９９、ＭＴＢＲ－タウ３０６、およびＭＴＢＲ－タウ３５４が、アルツハイマー病の連続体全体において別個の特徴を呈し、タングル状態を反映していることを示す。図６Ａは、Ｅ２８１４結合の領域を示す４Ｒおよび３Ｒタウの図である。図６Ｂは、症状発症までの推定年数と関連したＭＴＢＲ－タウ２９９、ＭＴＢＲ－タウ３０６、およびＭＴＢＲ－タウ－３５４の濃度を示す。赤色の点：有症状突然変異保持者（ＭＣ）；オレンジ色の点：無症状突然変異保持者：青色の点：非保持者（ＮＣ）；赤色の曲線” ＭＣについてのＬＯＥＳＳ曲線；青色の曲線：ＮＣについてのＬＯＥＳＳ曲線。
アルツハイマー病の臨床ステージにわたる脳タウ凝集体からのＣＳＦへのＭＴＢＲ－タウ種の分泌を示す図である。ＡＤの前臨床ステージでは、脳のタウ凝集体は未熟であるため、３つのＭＴＢＲ－タウ種（ＭＴＢＲ－タウ－２４３、ＭＴＢＲ－タウ－２９９、およびＭＴＢＲ－タウ－３５４）が等しい濃度でＣＳＦ中に分泌される。しかし、疾患進行と共にタウ凝集体が成熟し、ＭＴＢＲ－タウ－３５４（Ｒ４ドメイン）の堅いコアを形成するにつれて、ＣＳＦ中のＭＴＢＲ－タウ－３５４種が安定化する。ＭＴＢＲ－タウ－２９９（Ｒ２～Ｒ３ドメイン）種は、後期症状ステージで堅いコア構造に結合するが、ＭＴＢＲ－タウ－２４３種（Ｒ１ドメインの上流）は露出したままであり、これによりプロテアーゼ消化およびＣＳＦへの放出が可能になる。最終的に、ＣＳＦ中のこれら３つの種の不均衡は、脳タウ凝集体形成の反映として観察される。
図８Ａ、図８Ｂ、および図８Ｃは、アミロイドＰＥＴ状態を分類する際のｐタウ種のＲＯＣおよびＡＵＣを示す。図８Ａは、突然変異保持者のｐＴ１１１、ｐＴ１５３、ｐＳ２０８、およびｐＴ２３１を示す。図８Ｂは、突然変異保持者および非保持者両方のｐＴ１１１、ｐＴ１５３、ｐＳ２０８、およびｐＴ２３１を示す。図８Ｃは、群の曲線下面積および９５％信頼区間を示す。
図９Ａ、図９Ｂ、および図９Ｃは、アミロイドＰＥＴ状態を分類する際のＭＴＢＲ－タウ種のＲＯＣおよびＡＵＣを示す。図９Ａは、突然変異保持者のＭＴＢＲ－タウ２１２、ＭＴＢＲ－タウ２４３、ＭＴＢＲ－タウ２６０、およびＭＴＢＲ－タウ２７５を示す。図９Ｂは、突然変異保持者および非保持者両方のＭＴＢＲ－タウ２１２、ＭＴＢＲ－タウ２４３、ＭＴＢＲ－タウ２６０、およびＭＴＢＲ－タウ２７５を示す。図９Ｃは、群の曲線下面積および９５％信頼区間を示す。
図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃは、アミロイドＰＥＴ状態を分類する際のＭＴＢＲ－タウ種のＲＯＣおよびＡＵＣを示す。図１０Ａは、突然変異保持者のＭＴＢＲ－タウ２８２、ＭＴＢＲ－タウ２９９、ＭＴＢＲ－タウ３０６、およびＭＴＢＲ－タウ３５４を示す。図１０Ｂは、突然変異保持者および非保持者両方のＭＴＢＲ－タウ２８２、ＭＴＢＲ－タウ２９９、ＭＴＢＲ－タウ３０６、およびＭＴＢＲ－タウ３５４を示す。図１０Ｃは、群の曲線下面積および９５％信頼区間を示す。
図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃは、アミロイドＰＥＴ状態を分類する際のＭＴＢＲ－タウ種のＲＯＣおよびＡＵＣを示す。図１１Ａは、突然変異保持者のＭＴＢＲ－タウ３８６、ＭＴＢＲ－タウ３９６、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比、およびＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ２８２比を示す。図１１Ｂは、突然変異保持者および非保持者両方のＭＴＢＲ－タウ３８６、ＭＴＢＲ－タウ３９６、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比、およびＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ２８２比を示す。図１１Ｃは、群の曲線下面積および９５％信頼区間を示す。
図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、および図１２Ｆは、突然変異保持者におけるｐＴ１１１、ｐＴ１５３、およびｐＳ２０８のボックスプロットを示す。図１２Ａは、リン酸化比ｐＴ１１１／Ｔ１１１の元の値がＰｉＢ 四分位ごとに増加することを示す（Ｑ１についてはｎ＝４７、Ｑ２については４６、Ｑ３については４６、およびＱ４については４７）。図１２Ｂは、リン酸化比ｐＴ１５３／Ｔ１５３の元の値がＰｉＢ 四分位ごとに増加することを示す（Ｑ１についてはｎ＝４７、Ｑ２については４６、Ｑ３については４６、およびＱ４については４７）。図１２Ｃは、リン酸化比ｐＳ２０８／Ｓ２０８の元の値がＰｉＢ 四分位ごとに増加することを示す（Ｑ１についてはｎ＝４７、Ｑ２については４６、Ｑ３については４６、およびＱ４については４７）。図１２Ｄは、リン酸化比ｐＴ１１１／Ｔ１１１の標準値がＰｉＢ 四分位ごとに増加することを示す（Ｑ１についてはｎ＝４７、Ｑ２については４６、Ｑ３については４６、およびＱ４については４７）。図１２Ｅは、リン酸化比ｐＴ１５３／Ｔ１５３の標準値がＰｉＢ 四分位ごとに増加することを示す（Ｑ１についてはｎ＝４７、Ｑ２については４６、Ｑ３については４６、およびＱ４については４７）。図１２Ｆは、リン酸化比ｐＳ２０８／Ｓ２０８の標準値がＰｉＢ 四分位ごとに増加することを示す（Ｑ１についてはｎ＝４７、Ｑ２については４６、Ｑ３については４６、およびＱ４については４７）。Ｐ値はＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定からのものである。 同上。
図１３Ａ、図１３Ｂ、図１３Ｃ、図１３Ｄ、図１３Ｅ、図１３Ｆ、図１３Ｇ、図１３Ｈ、図１３Ｉ、図１３Ｊ、図１３Ｋ、図１３Ｌ、図１３Ｍ、図１３Ｎ、図１３Ｏ、図１３Ｐ、図１３Ｑ、図１３Ｒおよび図１３Ｓは、症状発症までの推定年数と関連した様々なタウ種の濃度を示す。図１３Ａは、ｐＴ１１１／Ｔ１１１を示す；図１３Ｂは、ｐＴ１５３／Ｔ１５３を示す；図１３Ｃは、ｐＳ２０８／Ｓ２０８を示す；図１３Ｄは、ｐＴ２３１／Ｔ２３１を示す；図１３ＥはｐＴ１５３を示す；図１３ＦはｐＳ２０８を示す；図１３ＧはｐＴ２３１を示す；図１３Ｈは、ｐＴ２３１／Ｔ２３１を示す；図１３Ｉは、ＭＴＢＲ－タウ２１２を示す；図１３Ｊは、ＭＴＢＲ－タウ２４３を示す；図１３Ｋは、ＭＴＢＲ－タウ２６０を示す；図１３Ｌは、ＭＴＢＲ－タウ２７５を示す；図１３Ｍは、ＭＴＢＲ－タウ２８２を示す；図１３Ｎは、ＭＴＢＲ－タウ２９９を示す；図１３Ｏは、ＭＴＢＲ－タウ３Ｒを示す；図１３Ｐは、ＭＴＢＲ－タウ３５４を示す；図１３Ｑは、ＭＴＢＲ－タウ３８６を示す；図１３Ｒは、ＭＴＢＲ－タウ３９６を示す；図１３Ｓは、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ２８２を示す；図１３Ｔは、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、図１４Ｅ、図１４Ｆ、図１４Ｇ、図１４Ｈ、図１４Ｉ、図１４Ｊ、図１４Ｋ、図１４Ｌ 図１４Ｍ、図１４Ｎ、図１４Ｏ、および図１４Ｐは、ＤＩＡＮ ＥＹＯによるｐタウおよびＭＴＢＲの年次変化を示す（年次変化は線形混合効果モデルから推定した）。断面積データのＥＹＯカットオフ：ｐＴ１１１／Ｔ１１１では－１９、ｐＴ１５３／Ｔ１５３では－２２、ｐＳ２０８／Ｓ２０８では－２２；変化率のＥＹＯカットオフ：ｐＴ１１１／Ｔ１１１およびｐＴ１５３／Ｔ１５３では－２５、ｐＳ２０８／Ｓ２０８ではカットオフなし。すべての長期的な分析は、対数変換されたｐＴ１１１／Ｔ１１１およびｐＳ２０８／Ｓ２０８、および平方根変換されたｐＴ１５３／Ｔ１５３に基づいていた。図１４Ａは、ｐＴ１１１／Ｔ１１１を示す；図１４Ｂは、ｐＴ１５３／Ｔ１５３を示す；図１４Ｃは、ｐＳ２０８／Ｓ２０８を示す；図１４Ｄは、ｐＴ２３１／Ｔ２３１を示す；図１４Ｅは、ＭＴＢＲ－タウ２１２を示す；図１４Ｆは、ＭＴＢＲ－タウ２４３を示す；図１４Ｇは、ＭＴＢＲ－タウ２６０を示す；図１４Ｈは、ＭＴＢＲ－タウ２７５を示す；図１４Ｉは、ＭＴＢＲ－タウ２８２を示す；図１４Ｊは、ＭＴＢＲ－タウ２９９を示す；図１４Ｋは、ＭＴＢＲ－タウ３Ｒを示す；図１４Ｌは、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ２８２を示す；図１４Ｍは、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４を示す；図１４Ｎは、ＭＴＢＲ－タウ３５４を示す；図１４Ｏは、ＭＴＢＲ－タウ３８６を示す；図１３Ｐは、ＭＴＢＲ－タウ３９６を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１５は、認知複合のベースラインバイオマーカーと長期的変化率との間の関連性を示す。 図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃ、図１６Ｄ、図１６Ｅ、図１６Ｆ、図１６Ｇ、図１６Ｈ、図１６Ｉ、図１６Ｊ、図１６Ｋ、図１６Ｌ、図１６Ｍ、図１６Ｎ、図１６Ｏ、および図１６Ｐは、様々なタウ種と全体的な認知との間の年次変化における関連性を示す。図１６Ａは、ｐＴ１１１／Ｔ１１１を示す；図１６Ｂは、ｐＴ１５３／Ｔ１５３を示す；図１６Ｃは、ｐＳ２０８／Ｓ２０８を示す；図１６Ｄは、ｐＴ２３１／Ｔ２３１を示す；図１６Ｅは、ＭＴＢＲ－タウ２１２を示す；図１６Ｆは、ＭＴＢＲ－タウ２４３を示す；図１６Ｇは、ＭＴＢＲ－タウ２６０を示す；図１６Ｈは、ＭＴＢＲ－タウ２７５を示す；図１６Ｉは、ＭＴＢＲ－タウ２８２を示す；図１６Ｊは、ＭＴＢＲ－タウ２９９を示す；図１６Ｋは、ＭＴＢＲ－タウ３Ｒを示す；図１６Ｌは、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ２８２を示す；図１６Ｍは、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４を示す；図１６Ｎは、ＭＴＢＲ－タウ３５４を示す；図１６Ｏは、ＭＴＢＲ－タウ３８６を示す；図１６Ｐは、ＭＴＢＲ－タウ３９６を示す。ｐＴ１５３／Ｔ１５３およびＭＴＢＲ３Ｒは、他のタウ種よりも年次変化において高い相関関係を有する。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図７Ａおよび図１７Ｂは、ベースラインおよび年次変化における突然変異保持者（無症状および有症状）のタウリン酸化の様々な部位におけるリン酸化占有率の相関を示す。図１７Ａは、ｐＴ１１１／Ｔ１１１、ｐＴ１５３／Ｔ１５３およびｐＳ２０８／２０８とｐＴ２１７／２１７との相関を示す。図１７Ｂは、ｐＴ１１１／Ｔ１１１、ｐＴ１５３／Ｔ１５３およびｐＳ２０８／２０８とｐＴ２０５／２０５との相関を示す。 同上。
図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ、図１８Ｄ、図１８Ｅ、図１８Ｆ、図１８Ｇ、図１８Ｈ、図１８Ｉ、図１８Ｊ、および図１８Ｋは、突然変異保持者（有症状および無症状）および非保持者のベースラインおよび年間変化率における相関のヒートマップを示す。図１８Ａは、ＭＣのベースラインにおける相関のヒートマップを示す。すべてのＭＴＢＲ種および総タウが一緒にクラスター化されている（いくつかの小さなクラスター）。ＭＴＢＲデータセットからの比率は、ＭＴＢＲのタウ種ではなく、他のタウ種でクラスター化される。ｐＳ２０２／Ｓ２０２は他のタウ種、すなわちＴＰＰＳＳ（総タウの領域を指定）とは関連しない。図１８Ｂは、すべてのＭＣを使用したベースラインにおける相関のヒートマップを示す。図１８Ｃは、無症状ＭＣを使用したベースラインにおける相関のヒートマップを示す。図１８Ｄは、有症状ＭＣを使用したベースラインにおける相関のヒートマップを示す。図１８Ｅは、非保持者を使用したベースラインにおける相関のヒートマップを示す。図１８Ｆは、突然変異保有者に関する２つのマーカーの年間変化率間の相関を色で表すヒートマップを示す。図１８Ｇは、無症状突然変異保有者に関する２つのマーカーの年間変化率間の相関を色で表すヒートマップを示す。図１８Ｈは、有症状突然変異保有者に関する２つのマーカーの年間変化率間の相関を色で表すヒートマップを示す。図１８Ｉは、突然変異保有者に関する２つのマーカーの年間変化率間の相関の絶対値を色で表すヒートマップを示す。図１８Ｊは、無症状突然変異保有者に関する２つのマーカーの年間変化率間の相関の絶対値を色で表すヒートマップを示す。図１８Ｋは、有症状突然変異保有者に関する２つのマーカーの年間変化率間の相関の絶対値を色で表すヒートマップを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図１９Ａ、図１９Ｂ、および図１９Ｃは、すべての突然変異保持者、無症状突然変異保持者、および有症状突然変異保持者におけるＤＩＡＮ ＥＹＯの予測を示す。半部分Ｒ２乗は、ＶＡＲ１がモデルに含まれている場合、モデルのＲ２乗がｘによって加えられることを示す。半偏相関の２乗は、Ｒ２乗の増分値の尺度となるため、変数重要度を示す。従属変数の合計変動も独立変数間の相関関係に起因する部分を構成するため、半部分Ｒ２乗は合計でＲ２乗にはならない。図１９Ａは、すべての突然変異保持者におけるｐＴ２０５／Ｔ２０５、ＭＴＢＲ－タウ２１２、およびＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４についてのＤＩＡＮ ＥＹＯの予測を示す。図１９Ｂは、無症状突然変異保持者におけるｐＴ２０５／Ｔ２０５、ｐＴ２１７／Ｔ２１７およびＭＴＢＲ－タウ２１２のＤＩＡＮ ＥＹＯの予測を示す。図１９Ｃは、有症状突然変異保持者におけるｐＴ２０５／Ｔ２０５のＤＩＡＮ ＥＹＯの予測を示す。
図２０Ａおよび図２０Ｂは、５ＥＹＯ間隔ごとのタウ種異常率を示す。ＮＣの各バイオマーカーの９５パーセンタイルを、ＭＣの各バイオマーカーを正常および異常として定義するための閾値として使用した。図２０Ａは、５ＥＹＯ間隔ごとのタウ種異常率を示す。図２０Ｂは、５ＥＹＯ間隔ごとのタウ種異常率を示す折れ線グラフである。
図２１Ａは、年間変化率（平均対標準偏差比－ＭＳＲ）の効果量の比較を示す。図２１Ｂは、年間変化率（平均対標準偏差比－ＭＳＲ）の効果量の比較を示す。ａＭＣおよびベースラインＥＹＯ≧－２５。 同上。
図２２Ａおよび図２２Ｂは、ＭＴＢＲ－タウ２９９およびＭＴＢＲ－タウ３５４の変化がＡＤ発症時（ＣＤＲ＝１）に影響されることを示す。図２２Ａは、ＭＴＢＲ－タウ２９９を示す。図２２Ｂは、ＭＴＢＲ－タウ５３４を示す。
図２３は、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比によってＡＤステージ分類の区別力が高まることを示す。
図２４Ａおよび図２４Ｂは、ＡＤ連続体全体における認知スコアを予測するためのＣＳＦＭＴＢＲ－２９９／３５４比の性能を示す。図２４Ａは、ＭＴＢＲ－２９９／３５４およびＣＤＲ－ＳＢを示す。図２４Ｂは、ＭＴＢＲ－２９９／３５４およびＭＭＳＥを示す。
図２５は、ＭＴＢＲ－タウ対認知スコアの要約表を示す。
図２６Ａは、ＭＴＢＲ－タウ２９９／３５４比とｐＴ２１７％占有率との間の相関を示す。図２６Ｂは、ｐＴ２１７％が、「初期ステージのタウ病変」を要約するＥ２８１４関連ＭＴＢＲ－タウ２９９／３５４とよく相関していることを示している→ｐＴ２１７％は、Ｅ２８１４臨床試験の代理の有効性マーカーとして使用することができる。
図２７Ａは、図２７Ｂおよび図２７Ｃで定量され議論されたタウ由来のトリプチペプチド（灰色の棒）の概略図である。図２７Ｂおよび図２７Ｃは、ＭＴＢＲタウ－２４３、２９９および３５４を含む脳ＭＴＢＲタウ種が、対照脳抽出物と比較して凝集したアルツハイマー病脳不溶性抽出物に富んでいることを示すグラフであり、ＭＴＢＲタウが、アルツハイマー病脳において特異的に沈着していることが確認される。グラフは、（図１８Ｂ）対照およびアルツハイマー病の脳（ｎ＝２、発見コホートにおける６～８の脳領域試料／群）からのタウペプチドの濃縮プロファイルを示し、（図１８Ｃ）対照（アミロイド陰性、ｎ＝８）、非常に軽度～中等度アルツハイマー病（ＡＤ）（アミロイド陽性、ＣＤＲ＝０．５～２、ｎ＝５）、重度ＡＤ脳（アミロイド陽性、ＣＤＲ＝３、ｎ＝７）（検証コホートでは合計ｎ＝２０）を示す。内部正規化のために、タウペプチドの相対存在量をｍｉｄドメイン（残基１８１～１９０）ペプチドと比較して定量した。微小管結合領域（ＭＴＢＲ）ドメインの上流領域（残基２４３～２５４、ＭＴＢＲタウ－２４３）およびリピート領域２（Ｒ２）～Ｒ３およびＲ４（それぞれ、残基２９９～３１７、ＭＴＢＲタウ－２９９および３５４～３６９、ＭＴＢＲタウ－３５４）を含有する種には、対照と比較してアルツハイマー病脳の不溶性画分が高度に濃縮されており、ＣＤＲによって測定される疾患進行の臨床ステージによって特に濃縮されていた。ＭＴＢＲタウ－２９９およびＭＴＢＲタウ－３５４はフィラメントコアの内側に位置しているが、ＭＴＢＲタウ－２４３はアルツハイマー病凝集体のコアの外側に位置している（Fitzpatrick et al., 2017）。注目すべきは、アルツハイマー病の脳では残基１９５～２０９が減少していたが、これは高度なリン酸化が原因である可能性がある。データは、中央値、四分位区間、最小値、最大値、および外れ値の個々の点を記述するＴｕｋｅｙ法を使用した箱ひげ図として表す。統計検定における有意性：＊＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。 同上。
図２８Ａは、実施例３で定量され、図１９Ｂおよび図１９Ｃでさらに議論されるタウ由来のトリプシンペプチド（灰色の棒）、ならびに抗体ＨＪ８．５およびタウ１の一般結合部位の概略図である。図２８Ｂは、対照ヒトＣＳＦにおけるタウプロファイルを示すグラフである。アミロイド陰性およびＣＤＲ＝０患者（ｎ＝３０）の断面コホートからの対照ヒトＣＳＦ中のタウペプチドを、Ｎ末端～ｍｉｄドメインのタウに焦点を合わせたタウ１／ＨＪ８．５免疫沈降によって定量した。微小管結合領域（ＭＴＢＲ）およびＣ末端領域を含有する種を定量するために、免疫沈降後のＣＳＦ試料を化学的に抽出し、順次に分析した。タウ１／ＨＪ８．５免疫沈降法（青丸）を使用すると、残基２２２以降、ペプチド回収率が劇的に低下し；したがって、この方法では、Ｎ末端～ｍｉｄドメインのタウ（残基６～２３～２４３～２５４）ペプチドのみを定量した（Sato et al., 2018）。対照的に、免疫沈降後のＣＳＦの化学抽出法（赤色の正方形）では、０．４～７ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＭＴＢＲ～Ｃ末端領域を含むタウの全領域の定量が可能であった。データは平均値として表す。 同上。
図２９Ａ、図２９Ｂ、および図２９Ｃは、ＣＳＦ ＭＴＢＲ－タウ－２４３、２９９、および３５４種が、アルツハイマー病連続体全体において別個の特徴を呈し、タングル状態を反映していることを示す。図２９ＡはＭＴＢＲ－タウ－２４３濃度、図２９ＢはＭＴＢＲ－タウ－２９９濃度、および図２９ＣはＭＴＢＲ－タウ－３５４濃度。アミロイド陰性ＣＤＲ＝０（ｎ＝３０）、アミロイド陽性ＣＤＲ＝０（ｎ＝１８）、アミロイド陽性ＣＤＲ＝０．５（ｎ＝２８）、アミロイド陽性ＣＤＲ≧１（ｎ＝１２）、およびアミロイド陰性ＣＤＲ≧０．５（ｎ＝１２）。ＭＴＢＲ－タウ－２４３は、すべての臨床ステージを通じてＡＤ進行と共に継続的な増加を示した。ＭＴＢＲ－タウ－２９９および３５４濃度は、非常に軽度のＡＤステージ（アミロイド陽性およびＣＤＲ＝０．５）まで同様に増加したが、その後、ＣＤＲ≧１で飽和する（ＭＴＢＲ－タウ－２９９）か、または低下する（ＭＴＢＲ－タウ－３５４）。＊＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。ＮＳ＝有意ではない。 同上。 同上。
図３０Ａ、図３０Ｂ、図３０Ｃ、図３０Ｃ、および図３０Ｄは、ＣＳＦ ＭＴＢＲ－タウ－２４３が、ｐ－タウ２１７を含むすべてのタウ種においてタウＰＥＴ測定値と最も高度に相関していることを示し、ＣＳＦ ＭＴＢＲ－タウ－２４３がタウ病変を再現するための最も有望なバイオマーカーであることを示唆している。タウＰＥＴ（ＡＶ－１４５１）ＳＵＶＲと図３０Ａ ＭＴＢＲ－タウ－２４３、図３０Ｂ ＭＴＢＲ－タウ－２９９、図３０Ｃ ｐ－タウ２１７濃度との間の相関、および図３０Ｄは、ＣＳＦ中のｐ－タウ２１７リン酸化占有率（タウＰＥＴコホートからの対照ｎ＝１５およびアルツハイマー病（ＡＤ）ｎ＝２０）。白丸：対照、黒正方形：ＡＤ。ＭＴＢＲ－タウ－２４３はタウＰＥＴ ＳＵＶＲと最も有意な相関を示した（Ｓｐｅａｒｍａｎ ｒ＝０．７５８８、ｐ＜０．０００１）。一方、ＭＴＢＲ－タウ－２９９、ｐ－タウ２１７濃度およびｐ－タウ２１７リン酸化占有率は中等度の相関を示し（それぞれＳｐｅａｒｍａｎ ｒ＝０．４５８４、０．５４７８、および０．５５５５）、飽和は高タウＰＥＴ測定試料で観察された。 同上。
図３１は、「タウ１／ＨＪ８．１－ＩＰ後の」化学抽出によるＭＴＢＲ－タウ２４３対ＭＴＢＲ－タウ２１２を示し、ここで、ＭＴＢＲ－タウ２１２については、ＣＸはステージに沿った増加をもたらすが、Ｅ２８１４－ＩＰはそうではない。
図３２は、「タウ１／ＨＪ８．１－ＩＰ後の」化学抽出によるＭＴＢＲ－タウ２４３対ＭＴＢＲ－タウ２１２を示し、ここで、ＭＴＢＲ－タウ２１２については、ＣＸはステージに沿った増加をもたらすが、Ｅ２８１４－ＩＰはそうではない。
中枢神経系中の神経原線維変化中へのタウタンパク質凝集は、アルツハイマー病（ＡＤ）を含むある特定の神経変性障害の病因となる。タウ不安定化の機構はなお完全に理解されていないが、タウタンパク質はタウ凝集体中で高リン酸化されることが判明した。さらに、ＡＤ脳ではタウの微小管結合領域（ＭＴＢＲ）の凝集体が豊富であることが示唆されている。しかし、ＡＤの進行全体にわたる、対応する細胞外ｐタウおよびＭＴＢＲ含有タウ種の病態生理学についてはほとんど知られていない。血液およびＣＳＦ中には複数のタウペプチドが存在するが、これらのポリペプチドの存在量が非常に少ないため、これらの生物学的試料中のタウ種の検出および定量は妨げられてきた。
出願人らは、タウを定量化する特定の方法（例えば、特定のアミノ酸残基におけるリン酸化および／またはＭＴＢＲタウ）を使用して、前臨床の無症状ステージから有症状ステージにわたるＡＤの過程を追跡することができることを発見した。タウアイソフォーム、翻訳後修飾、存在量および溶解度の変動が非常に大きいことを考慮すると、アルツハイマー病に関連する症状の発症前に、対照をステージ分類し、処置決定を導くためにタウ種を使用することは困難であった。しかし、出願人は、ＡＤによる認知症の発症からある特定の病態生理学的変化の発症までの年数を特定するのに特に有用なタウ種の特定の組合せを定量する方法を特定した。
本明細書に開示される方法は、生物学的試料を様々なタウ種の定量に好適な試料に変換する処理工程の独特の組合せを利用する。例えば、本開示の一部の方法では、処理工程は、複数のタウタンパク質を濃縮しながらある特定のタンパク質を枯渇させる。本開示の他の方法では、処理工程は、複数のＭＴＢＲタウタンパク質を濃縮しながらある特定のタンパク質を枯渇させる。本明細書に開示されるある特定の方法は、ｍｉｄドメイン非依存性ＭＴＢＲタウ種を定量するのに特に好適である。また、タウオパチーの臨床徴候および症状を測定し、タウオパチーを診断し、タウオパチーを直接処置するための、ｍｉｄドメイン非依存性ＭＴＢＲタウ種およびある特定のアミノ酸残基におけるタウリン酸化の使用も本明細書に記載される。本発明のこれらおよび他の態様ならびに反復を、以下により十分に説明する。
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解されるように、ある特定の用語を最初に定義する。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の実施形態が関係する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において記載されているものと類似するか、それを修正するか、またはそれと等価な多数の方法および材料を、本発明の実施形態の実践において不必要な実験を伴うことなく使用することができ、好ましい材料および方法は本明細書において記載されている。本発明の実施形態を説明し特許請求するにあたって、下記に記載する定義に従って以下の用語を使用する。
「約」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば典型的な測定技術および器具を通して発生することのある、限定されるものではないが質量、容量、時間、距離および量を含む任意の定量可能な変数に関する数量の変動を指す。さらに、実際に使用される固体および液体の操作手順を考慮すると、組成物を作製するかまたは方法を実行するため等に使用される成分の製造、供給源または純度の差異を通して起こる可能性のある、一定数の不慮の誤差および変動が存在する。「約」という用語は、最大±５％であり得るが、±４％、３％、２％、１％等でもあり得る、これらの変動も包含する。「約」という用語による修飾の有無を問わず、特許請求の範囲は量についての等価物を含む。
本明細書において使用される場合、抗体は、当該技術分野において理解されるような完全な抗体、すなわち２つの重鎖および２つの軽鎖からなるものを指すか、または抗原結合領域を有し、限定されるものではないが、フラグメント、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体、Ｆｖおよび一本鎖抗体Ｆｖを含む、任意の抗体様の分子を指す。抗体という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体も指す。様々な抗体ベースのコンストラクトおよびフラグメントを調製および使用するための技術は、当該技術分野において公知である。抗体を調製および特徴付けるための手段も、当該技術分野において公知である（例えばAntibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
本明細書において使用される場合、「アプタマー」という用語は、生化学的活性、分子の認識または結合特性に関して有用な生物学的活性を有するポリヌクレオチド、一般的にはＲＮＡまたはＤＮＡを指す。通常、アプタマーは分子活性を有し、例えば特定のエピトープ（領域）における標的分子へ結合する。アプタマーはポリペプチドと結合する点で特異的であり、インビトロ進化法（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により、合成および／または同定できることが一般的に認められている。アプタマーを調製および特徴付ける手段は、インビトロ進化法を含め、当該技術分野において公知である。例えば、その全体を参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，９３９，３１３を参照されたい。
「Ａβ」という用語は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれるより大きなタンパク質のカルボキシ末端中の領域に由来するペプチドを指す。ＡＰＰをコードする遺伝子は、第２１染色体に位置する。毒性を有し得る異なる多数の形態のＡβが存在し、Ａβペプチドは典型的に３７～４３アミノ酸配列長であるが、これらは全体のサイズを変化させる短縮化および修飾を有し得る。これらは、可溶性および不溶性の区画中、モノマー、オリゴマーおよび凝集体形態で、細胞内または細胞外で見出すことができ、他のタンパク質または分子と複合体形成し得る。Ａβの有害効果または毒性効果は、上記の形態のいずれかまたはすべて、ならびに具体的に記載されていないその他の点に起因し得る。例えば、２つのそのようなＡβアイソフォームにはＡβ４０およびＡβ４２が挙げられ、Ａβ４２アイソフォームは特に原線維形成的または不溶性であり、疾患状態に関連する。「Ａβ」という用語は、典型的に、個別のＡβ種間の区別なしに、複数のＡβ種を指す。特定のＡβ種は、ペプチドのサイズにより、例えばＡβ４２、Ａβ４０、Ａβ３８等と同定される。
本明細書において使用される場合、「Ａβ４２／Ａβ４０値」という用語は、対象から得られた試料中のＡβ４２の量の、同じ試料中のＡβ４０の量と比較した比を意味する。
「Ａβアミロイドーシス」は、脳内の臨床的に異常なＡβ沈着として定義される。Ａβアミロイドーシスを有すると決定される対象は、本明細書において「アミロイド陽性」と称され、一方でＡβアミロイドーシスを有しないと決定される対象は、本明細書において「アミロイド陰性」と称される。Ａβアミロイドーシスの承認済みの指標が当該技術分野において存在する。本開示の時点では、Ａβアミロイドーシスは、典型的に、アミロイド画像化（例えばＰｉＢ ＰＥＴ、ｆｌｕｏｒｂｅｔａｐｉｒもしくは当該技術分野において公知の他の画像化方法）により直接測定されるか、または脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ４２の低減もしくはＣＳＦ Ａβ４２／４０比の低減により、間接的に測定される。平均皮質結合能（ｍｅａｎ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）スコア＞０．１８を有する［１１Ｃ］ＰＩＢ－ＰＥＴ画像は、Ａβアミロイドーシスの指標であり、免疫沈降および質量分析（ＩＰ／ＭＳ）による約１ｎｇ／ｍｌの脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ４２濃度も同様である。あるいは、ＰＩＢ－ＰＥＴによって決定されるアミロイド陽性の予測精度を最大化するＣＳＦ Ａβ４２／４０のカットオフ比を使用することもできる。これらのような、または当該技術分野において公知のおよび／または実施例で使用される他の値は、Ａβアミロイドーシスを臨床的に確認するために、単独でまたは組合せで使用することができる。例えば、各々がその全体を参照により本明細書に組み込まれる、Klunk W E et al. Ann Neurol 55(3) 2004, Fagan A M et al. Ann Neurol, 2006, 59(3), Patterson et. al, Annals of Neurology, 2015, 78(3): 439-453、またはJohnson et al., J. Nuc. Med., 2013, 54(7): 1011-1013を参照されたい。Ａβアミロイドーシスを有する対象は、症候性であることもあればそうでないこともあり、症候性の対象は、Ａβアミロイドーシスに関連する疾患についての臨床基準を満たすこともあれば満たさないこともある。Ａβアミロイドーシスに関連する症状の非限定的な例には、認知機能障害、挙動変化、言語機能異常、情動調節不全、発作、認知症および神経系構造または機能の障害を挙げることができる。Ａβアミロイドーシスに関連する疾患には、限定されるものではないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）、レビー小体型認知症および封入体筋炎が挙げられる。Ａβアミロイドーシスを有する対象は、Ａβアミロイドーシスに関連する疾患を発症する増大したリスクを有する。
「Ａβアミロイドーシスの臨床徴候」は、当該技術分野において公知のＡβ沈着の尺度を指す。Ａβアミロイドーシスの臨床徴候には、限定されるものではないが、アミロイド画像化（例えばＰｉＢ ＰＥＴ、ｆｌｕｏｒｂｅｔａｐｉｒまたは当該技術分野において公知の他の画像化方法）により、または脳脊髄液（ＣＳＦ）Ａβ４２もしくはＡβ４２／４０比の低減により同定される、Ａβ沈着を挙げることができる。例えば、各々がその全体を参照により本明細書に組み込まれる、Klunk WE et al. Ann Neurol 55(3) 2004、およびFagan AM et al. Ann Neurol 59(3) 2006を参照されたい。各々がその全体を参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第１４／３６６，８３１号、第１４／５２３，１４８号および第１４／７４７，４５３号に記載されているように、Ａβアミロイドーシスの臨床徴候には、Ａβの代謝の測定、特に、単独での、または他のＡβ突然変異体（例えばＡβ３７、Ａβ３８、Ａβ３９、Ａβ４０および／または総Ａβ）の代謝の測定と比較した、Ａβ４２代謝の測定も挙げることができる。さらなる方法は、各々がその全体を参照により本明細書に組み込まれる、Albert et al. Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 170-179; McKhann et al., Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 263-269;およびSperling et al. Alzheimer's & Dementia 2007 Vol. 7, pp. 280-292に記載されている。重要なことに、Ａβアミロイドーシスの臨床徴候を有する対象は、Ａβ沈着に関連する症状を有することもあれば有しないこともある。また、Ａβアミロイドーシスの臨床徴候を有する対象には、Ａβアミロイドーシスに関連する疾患を発症する増大したリスクがある。
「アミロイド画像化の候補」は、臨床医によりアミロイド画像化が臨床的に保証される個体として特定された対象を指す。非限定的な例として、アミロイド画像化の候補は、１つもしくは複数のＡβアミロイドーシスの臨床徴候、１つもしくは複数のＡβプラークに関連する症状、１つもしくは複数のＣＡＡに関連する症状、またはそれらの組合せを有する対象であり得る。臨床医は、彼らの臨床的ケアを指示するために、そのような対象についてのアミロイド画像化を推奨してもよい。別の非限定的な例として、アミロイド画像化の候補は、Ａβアミロイドーシスに関連する疾患についての臨床試験における潜在的な参加者（対照対象または試験対象のいずれか）であり得る。
「Ａβプラークに関連する症状」または「ＣＡＡに関連する症状」は、それぞれ、アミロイド線維と呼ばれる規則的に配列された線維の凝集体から構成されるアミロイドプラークまたはＣＡＡの形成により引き起こされるかまたはそれに関連する、任意の症状を指す。代表的なＡβプラークに関連する症状には、限定されるものではないが、ニューロン変性、認知機能障害、記憶障害、挙動変化、情動調節不全、発作、神経系構造または機能の障害、およびアルツハイマー病またはＣＡＡの発症または悪化の増大したリスクを挙げることができる。ニューロン変性には、ニューロンの構造の変化（分子の変化、例えば毒性タンパク質の細胞内蓄積、タンパク質凝集等、およびマクロレベルの変化、例えば軸索または樹状突起の形状または長さの変化、ミエリン鞘組成の変化、ミエリン鞘の喪失等を含む）、ニューロンの機能の変化、ニューロンの機能の喪失、ニューロン死、またはそれらの任意の組合せを挙げることができる。認知機能障害には、限定されるものではないが、記憶、注意、集中、言語、論理的思考、創造性、実行機能、計画および系統化の困難さを挙げることができる。挙動変化には、限定されるものではないが、身体的または言語的な攻撃、衝動性、抑制の低下、無感動、自発性の低下、人格の変化、アルコール、タバコまたは薬物の乱用、および他の依存症関連の行動を挙げることができる。情動調節不全には、限定されるものではないが、うつ病、不安、躁病、興奮性および情動失禁を挙げることができる。発作には、限定されるものではないが、全身性強直性間代性発作、複雑部分発作、および非てんかん性の心因性発作を挙げることができる。神経系構造または機能の障害には、限定されるものではないが、水頭症、パーキンソニズム、睡眠障害、精神病、姿勢および共調運動の障害を挙げることができる。これには、運動障害、例えば単不全麻痺、片側不全麻痺、四肢不全麻痺、運動失調、バリスムスおよび振戦を挙げることができる。これには、嗅覚、触覚、味覚、視覚、聴覚を含む感覚喪失または機能障害も挙げることができる。さらに、これには、自律神経系障害、例えば腸および膀胱の機能障害、性機能障害、血圧および体温の調節不全を挙げることができる。最後に、これには、視床下部および下垂体の機能障害に起因するホルモン障害、例えば成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、プロラクチンおよび無数の他のホルモンおよび調節因子の欠乏および調節不全を挙げることができる。
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。哺乳動物には、限定されるものではないが、ヒト、霊長類、家畜、げっ歯類および愛玩動物が挙げられる。対象は、医学的ケアもしくは処置の待機中であってもよく、医学的ケアもしくは処置を受けていてもよく、または医学的ケアもしくは処置を受けたことがあってもよい。
本明細書において使用される場合、「対照集団」、「正常集団」、もしくは「健康な」対象からの試料という用語は、タウオパチーもしくはＡβアミロイドーシスを有さないと臨床的に決定された対象もしくは対象の群、または定性的もしくは定量的試験結果に基づく、Ａβアミロイドーシス（アルツハイマー病を含むがこれに限定されない）に関連する臨床疾患を指す。「正常な」対象は、通常、評価される個体とほぼ同じ年齢であり、限定されるものではないが、同じ年齢の対象および５～１０年の範囲内の対象を含む。
本明細書において使用される場合、「血液試料」という用語は、血液、好ましくは末梢（または循環）血に由来する生物学的試料を指す。血液試料は全血、血漿または血清であることができるが、血漿が典型的に好ましい。
「アイソフォーム」という用語は、本明細書において使用される場合、タンパク質をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシング、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質のタンパク分解処理、遺伝的変異および体細胞組換えに起因して生じる、同じタンパク質変異体のいくつかの異なる形態のいずれかを指す。「アイソフォーム」および「変異体」という用語は、互換的に使用される。
「タウ」という用語は、遺伝子ＭＡＰＴ（またはそのホモログ）によってコードされる複数のアイソフォーム、ならびにインビボでＣ末端が切断される種、インビボでＮ末端が切断される種、インビボで翻訳後修飾される種、またはそれらの任意の組合せを指す。本明細書において使用される場合、「タウ」、「タウタンパク質」、および「タウ種」という用語は、互換的に使用され得る。限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類、魚類、ウシ、カエル、ヤギおよびニワトリを含む多数の動物では、タウは遺伝子ＭＡＰＴによりコードされる。遺伝子がＭＡＰＴとして同定されていない動物では、ホモログが当該技術分野において周知の方法で同定され得る。
ヒトでは、ＭＡＰＴのエクソン２、３および１０の選択的スプライシングにより生成される、タウの６つのアイソフォームが存在する。これらのアイソフォームは、３５２～４４１アミノ酸長の範囲にわたる。エクソン２および３は、Ｎ末端に各々２９個のアミノ酸インサートをコードし（Ｎと呼ばれる）、全長ヒトタウアイソフォームは、両方のインサート（２Ｎ）、１つのインサート（１Ｎ）を有するか、またはインサートを有しない（０Ｎ）ことがある。すべての全長ヒトタウアイソフォームは、微小管結合ドメイン（Ｒと呼ばれる）の３つの繰り返しも有する。Ｃ末端のエクソン１０を含むことで、エクソン１０によりコードされる第４の微小管結合ドメインを含むこととなる。したがって、全長ヒトタウアイソフォームは、微小管結合ドメインの４つの繰り返し（エクソン１０を含む：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４）、または微小管結合ドメインの３つの繰り返し（エクソン１０を除く：Ｒ１、Ｒ３およびＲ４）から構成され得る。ヒトタウは、翻訳後修飾されることもあればされないこともある。例えば、タウがリン酸化、ユビキチン化、グリコシル化および糖化されることがあることは、当該技術分野において公知である。ヒトタウはまた、インビボでＣ末端、Ｎ末端、またはＣ末端およびＮ末端でタンパク質分解的に処理しても、しなくてもよい。したがって、「ヒトタウ」という用語は、２Ｎ３Ｒ、２Ｎ４Ｒ、１Ｎ３Ｒ、１Ｎ４Ｒ、０Ｎ３Ｒ、および０Ｎ４Ｒアイソフォーム、ならびにインビボでＣ末端が切断される種、インビボでＮ末端が切断される種、インビボで翻訳後修飾される種、またはそれらの任意の組合せを包含する。タウをコードする遺伝子の選択的スプライシングは他の動物において同様に発生する。
本明細書において使用される場合、「タウ－４４１」という用語は、長さが４４１アミノ酸である最長のヒトタウアイソフォーム（２Ｎ４Ｒ）を指す。タウ－４４１のアミノ酸配列は、配列番号１として提供される。このアイソフォームのＮ末端（Ｎ末端）、ｍｉｄドメイン、ＭＴＢＲ、およびＣ末端（Ｃ末端）が、図１に同定されている。これらの領域は、他のタウアイソフォーム（例えば、２Ｎ３Ｒ、１ＮＲ４、１Ｎ３Ｒ、０Ｎ４Ｒ、および０Ｎ３Ｒ）では予測可能な方法で変化する。したがって、アミノ酸の位置がタウ－４４１と比較して同定されると、当業者は、他のアイソフォームの対応するアミノ酸の位置を決定することができるであろう。特に指示がない限り、本開示で使用されるアミノ酸残基の付番は、タウ－４４１に基づく（例えば、Ｔ２１７はタウ－４４１の２１７位のスレオニン残基である）。
本明細書において使用される場合、「Ｎ末端タウ」という用語は、タウのＮ末端の２つ以上のアミノ酸（例えば、タウ－４４１のアミノ酸１～１０３など）を含むタウタンパク質、または複数のタウタンパク質を指す。
本明細書において使用される場合、「ｍｉｄドメインタウ」という用語は、タウのｍｉｄドメインの２つ以上のアミノ酸（例えば、タウ－４４１のアミノ酸１０４～２４３など）を含むタウタンパク質、または複数のタウタンパク質を指す。
本明細書において使用される場合、「ＭＴＢＲタウ」という用語は、タウの微小管結合領域（ＭＴＢＲ）の２つ以上のアミノ酸（例えば、タウ－４４１のアミノ酸２４４～３６８など）を含むタウタンパク質、または複数のタウタンパク質を指す。
本明細書において使用される場合、「Ｃ末端タウ」という用語は、タウのＣ末端の２つ以上のアミノ酸（例えば、タウ－４４１のアミノ酸３６９～４４１など）を含むタウタンパク質、または複数のタウタンパク質を指す。
「タウのタンパク質分解ペプチド」とは、インビトロタンパク質分解切断によって産生されるタウタンパク質のペプチドフラグメントを指す。「タウのタトリプシンペプチド」とは、トリプシンによるインビトロ切断によって産生されるタウタンパク質のペプチドフラグメントを指す。タウのトリプシンペプチドは、本明細書では最初の４つのアミノ酸によって称され得る。例えば、「ＬＱＴＡ」（配列番号３の最初の４つのアミノ酸）は、トリプシンペプチドＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫ（配列番号３）を指す。最初の４つのアミノ酸によって同定される他のトリプシンペプチドの非限定的な例には、ＩＧＳＴ（配列番号２）、ＶＱＩＩ（配列番号４）、ＬＤＬＳ（配列番号５）、ＨＶＰＧ（配列番号６）、ＩＧＳＬ（配列番号７）、ＶＱＩＶ（配列番号９）、およびＴＰＰＳ（配列番号１０）が挙げられる。
脳内のタウ沈着に関連する疾患は、本明細書では「タウオパチー」と称される。「タウ沈着」という用語は、限定されるものではないが、神経原線維変化、神経網糸状体、およびジストロフィー性神経突起におけるタウ凝集体を含む、あらゆる形態の病変タウ沈着を含む。当該技術分野において公知のタウオパチーには、限定されるものではないが、進行性核上性麻痺、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症、第１７番染色体に関連する前頭側頭型認知症およびパーキンソニズム、リティコ－ボディグ病、グアムのパーキンソン病認知症、神経原線維変化型老年期認知症、神経節腫および神経細胞腫、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、鉛脳症、結節性硬化症、ハラフォルデン－シュパッツ病、リポフスチン症、ピック病、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、嗜銀顆粒症（ａｒｇｙｒｏｐｈｉｌｉｃ ｇｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＡＧＤ）、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）が挙げられる。
タウオパチーは、病理学的タウ沈着物中に見出されるタウアイソフォームの優勢によって分類される。３つのＭＴＢＲを有するタウで優勢に構成されるタウ沈着を伴うタウオパチーは、「３Ｒタウオパチー」と称される。ピック病は、３Ｒタウオパチーの非限定的な例である。明確にするために、一部の３Ｒタウオパチーの病理学的タウ沈着は、３Ｒおよび４Ｒタウアイソフォームの混合であり得、３Ｒアイソフォームが優勢である場合がある。アルツハイマー病患者の脳内の細胞内神経原線維変化（すなわち、タウ沈着）には、一般にほぼ同量の３Ｒおよび４Ｒアイソフォームが含まれていると考えられている。４つのＭＴＢＲを有するタウで優勢に構成されるタウ沈着を伴うタウオパチーは、「４Ｒタウオパチー」と称される。ＰＳＰ、ＣＢＤ、およびＡＧＤは、ＦＴＬＤの一部の形態と同様に、４Ｒタウオパチーの非限定的な例である。特に、一部のＶ３３４ＭおよびＲ４０６Ｗ突然変異保持者など、遺伝的に確認されたＦＴＬＤ症例を有する一部の対象の脳内の病理学的タウ沈着は、３Ｒおよび４Ｒアイソフォームの混合を示す。
タウオパチーの臨床徴候は、限定されるものではないが神経原線維変化を含む、脳内のタウの凝集体であり得る。脳内のタウ凝集体を検出および定量するための方法は、当該技術分野において公知である（例えばタウ特異的リガンド、例えばＴＨＫ５３１７、ＴＨＫ５３５１、ＡＶ１４５１、ＰＢＢ３、ＭＫ－６２４０、ＲＯ－９４８、ＰＩ－２６２０、ＧＴＰ１、ＰＭ－ＰＢＢ３およびＪＮＪ６４３４９３１１、ＪＮＪ－０６７）等を使用するタウＰＥＴ）。
「処置する」、「処置すること」または「処置」という用語は、本明細書において使用される場合、訓練を受け免許を受けた専門家による、それを必要とする対象への医学的ケアの提供を指す。医学的ケアは、診断試験、治療処置、および／または予防もしくは防止手段であってもよい。治療および予防的処置の目的は、所望されない生理学的変化または疾患／障害を防止するかまたは緩慢化する（和らげる）ことである。治療または予防的処置の有益なまたは所望の臨床結果には、限定されるものではないが、検出可能かまたは検出不可能かにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の減弱、安定化した（すなわち、悪化しない）病態、疾患進行の遅延または緩慢化、病態の改善または軽減、および寛解（部分または完全のいずれか）が挙げられる。「処置」は、処置を受けない場合に予測される生存期間と比較して生存期間を延長することも意味することができる。処置を必要とする者には、疾患、状態もしくは障害を既に有する者、ならびに疾患、状態もしくは障害を有する傾向にある者、または疾患、状態もしくは障害を防止する予定の者が挙げられる。したがって、処置を必要とする対象は、疾患の症状または臨床徴候を有している場合もあれば、有していない場合もある。
「タウ治療」という句は、集合的に、タウオパチーを発症するリスクのある対象、またはタウオパチーを有すると臨床的に診断された対象のために企図される、または彼らと共に使用する、任意の造影剤、治療処置、および／または予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置を指す。造影剤の非限定的な例には、機能的造影剤（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、フルオロデオキシグルコース等）および分子造影剤（例えばＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈ化合物Ｂ、フロルベタベン、フロルベタピル、フルテメタモル、放射性標識タウ特異的リガンド、放射性核種標識抗体等）が挙げられる。治療剤の非限定的な例には、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ－メチルＤ－アスパルテート（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、抗うつ剤（例えば選択的セロトニン再取り込み阻害剤、非定型抗うつ剤、アミノケトン、選択的セロトニンおよびノルエピネフリン再取り込み阻害剤、三環系抗うつ剤等）、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、抗Ａβ抗体（抗原結合フラグメント、その変異体または誘導体を含む）、抗タウ抗体（抗原結合フラグメント、その変異体または誘導体を含む）、幹細胞、栄養補助食品（例えばリチウム水、リポ酸を有するオメガ３脂肪酸、長鎖トリグリセリド、ゲニステイン、レスベラトロール、クルクミンおよびグレープシード抽出物等）、セロトニン受容体６のアンタゴニスト、ｐ３８アルファＭＡＰＫ阻害剤、組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、受動免疫療法、活性ワクチン（例えばＣＡＤ１０６、ＡＦ２０５１３等）、タウタンパク質凝集阻害剤（例えばＴＲｘ０２３７、塩化メチルチオニミウム等）、血糖管理を改善するための治療（例えばインスリン、エキセナチド、リラグルチドピオグリタゾン等）、抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ９Ａ阻害剤、シグマ１受容体アゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、ホスファターゼ阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬、ＣＢ１および／またはＣＢ２エンドカンナビノイド受容体部分アゴニスト、β－２アドレナリン受容体アゴニスト、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト、５－ＨＴ２Ａ逆アゴニスト、アルファ－２ｃアドレナリン受容体アンタゴニスト、５－ＨＴ１Ａおよび１Ｄ受容体アゴニスト、グルタミニル－ペプチドシクロトランスフェラーゼ阻害剤、ＡＰＰ産生の選択的阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト、神経成長因子興奮剤、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、神経栄養剤（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｇｅｎｔ）、ムスカリン性Ｍ１受容体アゴニスト、ＧＡＢＡ受容体調節因子、ＰＰＡＲ－ガンマアゴニスト、微小管タンパク質調節因子、カルシウムチャネル遮断薬、抗高血圧薬、スタチン、ならびにそれらの任意の組合せが挙げられる。
「平均から有意に逸脱する」は、少なくとも１標準偏差、好ましくは少なくとも１．３標準偏差、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差、平均を上回るかまたは下回る値を指す（すなわち、正常な対象または正常な集団からのタウ種の平均レベル）。
「Ａβおよびタウ治療」という句は、集合的に、ＡβアミロイドーシスもしくはＡＤを発症するリスクのある対象、Ａβアミロイドーシスを有すると診断された対象、タウオパチーを有すると診断された対象、またはＡＤを有すると診断された対象に対して企図される、または彼らと共に使用する、任意の造影剤または治療剤を指す。
ＩＩ．タウの測定方法
本開示は、質量分析により生物学的試料中のタウを測定する方法を提供する。一般的に言えば、生物学的試料中のタウを測定するための本開示の方法は、生物学的試料を用意すること、１つまたは複数のタンパク質を枯渇させて、その後タウを精製することによって生物学的試料を処理することと、精製タウをプロテアーゼで切断して、その後、適宜、得られた切断産物を固相抽出により脱塩して、タウのタンパク質分解ペプチドを含む試料を取得することと、タウのタンパク質分解ペプチドを含む試料を用いて液体クロマトグラフィー－質量分析を実行して、少なくとも１つのタウのタンパク質分解ペプチドの濃度（相対的または絶対的）を検出および測定することとを含む。したがって、実際には、開示された方法では、タウの少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドを使用して、生物学的試料中に存在するタウの量を検出および測定する。
一例では、本開示の方法は、（ａ）血液試料またはＣＳＦ試料から選択される生物学的試料を用意すること；（ｂ）タンパク質沈殿によって沈殿したタンパク質を分離して、生物学的試料からタンパク質を除去して、上清を得ること；（ｃ）固相抽出により上清からタウを精製すること；（ｄ）精製タウをプロテアーゼで切断し、その後、適宜、得られた切断産物を固相抽出により脱塩して、タウのタンパク質分解ペプチドを含む試料を取得すること；および（ｅ）タウのタンパク質分解ペプチドを含む試料を用いて液体クロマトグラフィー－質量分析を実行して、少なくとも１つのタウのタンパク質分解ペプチドの濃度を検出および測定することを含む。
別の例では、本開示の方法は、（ａ）親和性枯渇による生物学的試料中のＮ末端タウ、ｍｉｄドメインタウ、またはＮ末端タウおよびｍｉｄドメインタウを低減させることであって、生物学的試料は、血液試料またはＣＳＦ試料である、低減させること；（ｂ）親和性枯渇後に残り、Ｎ末端非依存性タウおよび／またはｍｉｄドメイン非依存性タウと称することができるタウを、（ｉ）タンパク質沈殿および沈殿タンパク質の分離によって生物学的試料から追加のタンパク質を除去して上清を取得し、次いで固相抽出によって上清からタウを精製すること、または（ｉｉ）ＭＴＢＲタウをアフィニティ精製し、それにより（ｉ）もしくは（ｉｉ）濃縮タウを生成することを含む方法によって濃縮すること；（ｃ）濃縮タウをプロテアーゼで切断し、その後、適宜、得られた切断産物を固相抽出により脱塩して、タウのタンパク質分解ペプチドを含む試料を取得すること；および（ｄ）タウのタンパク質分解ペプチドを含む試料を用いて液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を実行して、少なくとも１つのタウのタンパク質分解ペプチドの濃度を検出および測定することを含む。
別の例では、本開示の方法は、（ａ）親和性枯渇による生物学的試料中のＮ末端タウ、ｍｉｄドメインタウ、またはＮ末端タウおよびｍｉｄドメインタウを低減させることであって、生物学的試料は、血液試料またはＣＳＦ試料である、低減させること；（ｂ）タンパク質沈殿によって沈殿したタンパク質を分離して親和性枯渇試料から追加のタンパク質を除去して、上清を得ること；（ｃ）固相抽出により上清からタウを精製すること；（ｄ）精製タウをプロテアーゼで切断し、その後、適宜、得られた切断産物を固相抽出により脱塩して、タウのタンパク質分解ペプチドを含む試料を取得すること；および（ｅ）タウのタンパク質分解ペプチドを含む試料を用いて液体クロマトグラフィー－質量分析を実行して、少なくとも１つのタウのタンパク質分解ペプチドの濃度を検出および測定することを含む。
別の例では、本開示の方法は、（ａ）親和性枯渇による生物学的試料中のＮ末端タウ、ｍｉｄドメインタウ、またはＮ末端タウおよびｍｉｄドメインタウを低減させることであって、生物学的試料は、血液試料またはＣＳＦ試料である、低減させること；（ｂ）親和性枯渇試料からＭＴＢＲタウをアフィニティ精製すること；（ｃ）精製されたＭＴＢＲタウをプロテアーゼで切断し、その後、適宜、得られた切断産物を固相抽出により脱塩して、ＭＴＢＲタウのタンパク質分解ペプチドを含む試料を取得すること；および（ｄ）ＭＴＢＲタウのタンパク質分解ペプチドを含む試料を用いて液体クロマトグラフィー－質量分析を実行して、少なくとも１つのＭＴＢＲタウのタンパク質分解ペプチドの濃度を検出および測定することを含む。
別の例では、本開示の方法は、（ａ）生物学的試料からＭＴＢＲタウをアフィニティ精製することであって、生物学的試料は、血液試料またはＣＳＦ試料である、アフィニティ精製すること；（ｂ）精製されたＭＴＢＲタウをプロテアーゼで切断し、その後、適宜、得られた切断産物を固相抽出により脱塩して、ＭＴＢＲタウのタンパク質分解ペプチドを含む試料を取得すること；および（ｃ）ＭＴＢＲタウのタンパク質分解ペプチドを含む試料を用いて液体クロマトグラフィー－質量分析を実行して、少なくとも１つのＭＴＢＲタウのタンパク質分解ペプチドの濃度を検出および測定することを含む。
本開示は、上記の方法のそれぞれにおいて、１つまたは複数の残基におけるタウのリン酸化占有率を測定することをさらに企図する。リン酸化占有率は、リン酸化の化学量論とも称され、もう１残基でのタウのリン酸化を定量することによって測定する。説明のために残基Ｔ２１７を使用すると、リン酸化占有率は、典型的にはｐＴ２１７／Ｔ２１７で表され、ここで、分子「ｐＴ２１７」はリン酸化残基Ｔ２１７の量（相対的または絶対的）であり、分母「Ｔ２１７」は、残基Ｔ２１７の量（相対的または絶対的）である。タウの２つ以上の残基におけるリン酸化を測定する場合、この方法は、値の間の比または別の数学的関係を計算することをさらに含み得る。一部の実施形態では、本明細書の方法は、Ｔ１１１、Ｓ１１３、Ｔ１８１、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、およびＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基におけるタウリン酸化を測定することを含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、Ｔ１１１、Ｔ１８１、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｔ２０５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、およびＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基におけるタウリン酸化を測定することを含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、Ｔ１１１、Ｔ１５３、Ｔ１８１、Ｔ２０５、Ｓ２０８、Ｔ２１７、およびＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基におけるタウリン酸化を測定することを含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、Ｔ１１１、Ｔ１５３、Ｔ１８１、Ｔ２０５、Ｔ２１７、およびＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基におけるタウリン酸化を測定することを含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、Ｔ１１１、Ｔ１５３、Ｔ１８１、Ｔ２１７、およびＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基におけるタウリン酸化を測定することを含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、Ｔ１１１、Ｔ１５３、Ｔ１８１、Ｔ２０５、Ｓ２０８、およびＴ２１７から選択される１つまたは複数の残基におけるタウリン酸化を測定することを含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、Ｔ１８１、Ｔ２０５、およびＴ２１７から選択される１つまたは複数の残基におけるタウリン酸化を測定することを含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、Ｔ２０５でのタウリン酸化を測定することを含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、Ｔ２０５、および適宜Ｔ１１１、Ｔ１８１、Ｓ２０８、Ｔ１５３、Ｔ１７５、Ｓ２１４、Ｔ２１７、およびＴ２３１から選択される１つまたは複数の追加の残基におけるタウリン酸化を測定することを含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、Ｔ２０５、および適宜Ｔ１１１、Ｔ１５３、Ｔ１８１、Ｓ２０８、およびＴ２１７から選択される１つまたは複数の追加の残基におけるタウリン酸化を測定することを含む。一部の実施形態では、本明細書の方法は、Ｔ２０５、および適宜Ｔ１８１、およびＴ２１７から選択される１つまたは複数の追加の残基におけるタウリン酸化を測定することを含む。
一般に言えば、１つまたは複数の残基におけるタウのリン酸化占有率は、タウを含む任意の試料を使用して測定することができる。しかし、アミノ酸残基は、どの試料を使用するべきかに影響を与える場合がある。例えば、Ｔ１１１でのタウリン酸化の測定が所望される場合、抗体タウ１またはＣ末端をＴ１１１に結合する他のアフィニティ精製試薬を使用して、血液またはＣＳＦ試料からｍｉｄドメインタウを親和性枯渇させ、ｐＴ１１１／Ｔ１１１の測定にはアフィニティ精製試薬に結合したタウを使用するべきである。ある特定の実施形態では、リン酸化占有率の測定には、ｍｉｄドメインタウが濃縮された（またはＮ末端およびｍｉｄドメインタウが濃縮された）試料を使用することができる。
本開示は、タウの部位特異的リン酸化を定量的に評価するための任意の１つの特定の方法に限定されない。好適な方法は、単一のアミノ酸のリン酸化状態のみが異なるタウアイソフォームを区別し、異なるアミノ酸でリン酸化されたｐ－タウアイソフォームを区別し、総タウの全体的変化から独立して特定の部位で起こるリン酸化の変化を定量するべきである。総タウの全体的な変化とは独立して特異的部位で発生するリン酸化化学量論の変化は、以下の３つのアプローチのいずれかで定量することができる：１）同じ配列を共有する各リン酸化ペプチドの相対的存在量を推定するために使用することのできる、リン酸化ペプチド異性体間の相対的比較、２）参照としてのタウタンパク質からの任意のペプチドを用いた、リン酸化ペプチドの標準化、および３）標識した合成内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌａｂｅｌｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を使用した、各リン酸化および非リン酸化ペプチドについての絶対量定量、ここで各リン酸化ペプチドについての絶対量定量値は、タウタンパク質からの任意のペプチドについて得られた任意の絶対量定量値を用いて標準化される。すべての３つの手法は、各部位についての相対的なリン酸化の変化の比較のために、内部標準化を使用する。当該技術分野において公知の他の方法も使用してもよい。絶対的定量に内部合成標識標準を使用する場合、可溶性タウを濃縮するために試料を処理する前に、標識標準を試料にスパイクすることが好ましい。
例示的な実施形態では、タウの部位特異的リン酸化は、高分解能質量分析により測定される。好適な種類の質量分析が当該技術分野において公知である。これらには、限定されるものではないが、四重極型、飛行時間型、イオントラップおよびＯｒｂｉｔｒａｐ、ならびに異なる種類の質量分析計を１つの構成に組み合わせたハイブリッド型質量分析計（例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析計）が挙げられる。タウは典型的に、ＭＳ分析の前にタンパク分解により消化される。好適なプロテアーゼには、限定されるものではないが、トリプシン、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－ＣおよびＡｒｇ－Ｎが挙げられる。アフィニティ精製／枯渇を使用してタウ試料を生成する場合、固定化リガンドからタウを溶出した後、またはタウが固定化リガンドに結合している間に消化が発生する場合がある。アフィニティ精製／枯渇については、第ＩＩ（ｃ）節で詳細に説明する。１つまたは複数の浄化ステップに続き、消化されたタウペプチドは、高分解能質量分析計と適合する液体クロマトグラフィーシステムにより分離されてもよい。クロマトグラフィーシステムは、所望のＬＣ－ＭＳパターンを生成するために、慣習的な実験により最適化されてもよい。多様なＬＣ－ＭＳ技術を、部位特異的タウリン酸化を定量的に分析するために使用してもよい。非限定的な例には、選択反応モニタリング、並列反応モニタリング、選択イオンモニタリングおよびデータ非依存型解析法（ｄａｔａ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）が挙げられる。上記で述べたように、部位特異的タウリン酸化のすべての定量分析は、総タウの全体的変化を考慮するべきである。例示的な実施形態では、実施例において概説される質量分析プロトコールが使用される。
本開示は、上記の方法のそれぞれにおいて、総タウを測定することをさらに企図する。タウは、可溶性および不溶性の区画中、モノマーおよび凝集体形態で、規則的なまたは不規則な構造で、細胞内または細胞外で見出され、他のタンパク質または分子と複合体形成し得る。したがって、生物学的試料の供給源（例えば脳組織、ＣＳＦ、血液等）および生物学的試料の任意の下流処理は、所与の試料中のタウアイソフォームの全体量に影響を与えることとなる。総タウ測定は、質量分析により行うことができる。あるいは、総タウは、イムノアッセイまたはタウ濃度を定量する他の方法により測定することができる。ある特定の実施形態では、総タウは、ＴＰＳＬ（配列番号１８の最初の４つのアミノ酸）トリプシンペプチド（すなわち、ＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲ（配列番号１８））またはＴＰＰＳ（配列番号１０の最初の４つのアミノ酸）トリプシンペプチド（すなわち、ＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫ（配列番号１０））を定量することによる質量分析によって測定することができる。ある特定の実施形態では、総タウの測定には、ｍｉｄドメインタウが濃縮された（またはＮ末端およびｍｉｄドメインタウが濃縮された）試料を使用することができる。
なおさらなる実施形態では、本開示は、上記方法のそれぞれにおいて、生物学的試料中の１つもしくは複数のタンパク質の存在／非存在を決定すること、および／または生物学的試料中の１つもしくは複数の追加のタンパク質の濃度を測定することを企図する。一部の実施形態では、１つまたは複数のタンパク質は、タウの精製前に生物学的試料から枯渇させたタンパク質であり得る。例えば、ある特定の実施形態では、Ｎ末端タウ種および／またはｍｉｄドメインタウ種は、本明細書に開示される方法によって定量されるタウ種（例えば、ＭＴＢＲタウ、Ｃ末端タウ）とは別々に同定および／または定量することができる。代わりに、または加えて、Ａβ、ＡｐｏＥ、またはその他の目的のタンパク質は、生物学的試料の一部を並行して処理することによって、本明細書に開示される方法で利用する前に、生物学的試料から目的のタンパク質を枯渇させることによって、または本明細書に開示される試料処理工程中に生物学的試料から目的のタンパク質を枯渇させることによって、同定および／または定量することができる。
生物学的試料、好適な内部標準、および１つまたは複数のタンパク質を枯渇させる工程、タウを精製する工程、プロテアーゼによる精製タウを切断する工程、および質量分析の工程を以下でより詳細に説明する。
（ａ）生物学的試料
好適な生物学的試料には、対象から得られた血液試料または脳脊髄液（ＣＳＦ）試料が含まれる。一部の実施形態では、対象はヒトである。ヒト対象は、医療もしくは処置を待っている場合があるか、または医療もしくは処置を受けている場合があるか、または医療もしくは処置を受けたことがある場合がある。様々な実施形態では、ヒト対象は、健康な対象、神経変性疾患を発症するリスクのある対象、神経変性疾患の徴候および／または症状を有する対象、または神経変性疾患と診断された対象であり得る。さらなる実施形態では、神経変性疾患はタウオパチーであり得る。特定の例では、タウオパチーは、アルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、または前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）であり得る。他の実施形態では、対象は実験動物である。さらなる実施形態では、対象は、ヒトタウおよび適宜１つまたは複数の追加のヒトタンパク質（例えば、ヒトＡβ、ヒトＡｐｏＥなど）を発現するように遺伝子操作された実験動物である。
ＣＳＦは、留置ＣＳＦカテーテルの有無を問わない、腰椎穿刺によって得てもよい。対象から同時に収集された複数の血液またはＣＳＦ試料は、プールされてもよい。血液は、静脈内カテーテルの有無を問わない静脈穿刺によるか、またはフィンガースティック（またはその等価物）により収集してもよい。収集したら、血液試料またはＣＳＦ試料を、当該技術分野において公知の方法（例えば、全細胞および細胞残屑を除去するための遠心分離；分析試験の前に標本を安定化および保存するように設計された添加剤の使用等）に従って処理してもよい。血液試料またはＣＳＦ試料は、即時に使用されてもよく、または冷凍し無期限に保管されてもよい。本明細書に開示される方法で使用する前に、生物学的試料は、必要または所望であれば、プロテアーゼ阻害剤、同位体標識内部標準、界面活性剤およびカオトロピック剤を含むように、および／または他の分析物（例えば、タンパク質、ペプチド、代謝物など）を枯渇させるために修飾されていてもよい。
使用される試料のサイズは、試料の種類、試料が得られた対象の健康状態、および分析されるべき分析物（タウに加えて）に応じて変動することができ、または変動することになる。ＣＳＦ試料の体積は、約０．０１ｍＬ～約５ｍＬ、または約０．０５ｍＬ～約５ｍＬであってもよい。特定の例において、試料のサイズは、約０．０５ｍＬ～約１ｍＬのＣＳＦであってもよい。血漿試料の量は、約０．０１ｍＬ～約２０ｍＬであってもよい。
（ｂ）同位体標識タウ内部標準物質
同位体標識タウは、試料処理全体の変動を考慮し、適宜絶対濃度を計算するための内部標準として使用することができる。一般に、同位体標識タウ内部標準を、重要な試料処理の前に添加するが、必要であれば複数回添加することができる。例えば、図２～４に示される方法を参照されたい。
複数の同位体標識タウ内部標準が本明細書に記載されている。すべて、少なくとも１つのアミノ酸残基に重同位体標識が組み込まれている。１つまたは複数の完全長アイソフォームを使用してもよい。あるいは、または加えて、当該技術分野で公知のように、翻訳後修飾を有するタウアイソフォームおよび／またはタウのペプチドフラグメントも使用することができる。一般的に言えば、組み込まれる標識アミノ酸残基は、その化学的特性に影響を与えることなくペプチドの質量を増加させる必要があり、同位体標識の存在によって生じる質量シフトは、質量分析法で内部標準（ＩＳ）と内因性タウ分析物のシグナルを区別できるようにする程度に十分でなければならない。本明細書に示すように、好適な重同位体標識としには、限定されるものではないが、２Ｈ、１３Ｃ、および１５Ｎが挙げられる。典型的には、約１～１０ｎｇの内部標準で通常十分である。
（ｃ）１つまたは複数のタンパク質を枯渇させること
本開示の方法は、１つまたは複数のタンパク質を試料から枯渇させる工程を含む。「枯渇する」という用語は、量または数が減少することを意味する。したがって、タンパク質の枯渇試料は、元の試料中の量よりも測定可能なほど少ない任意の量のタンパク質を有する場合があり、これにはタンパク質の量が存在しない場合も含まれる。
タンパク質は、１つまたは複数のタンパク質を特異的に標的とする方法、例えば、親和性枯渇、固相抽出、または当該技術分野で公知の他の方法によって、試料から枯渇させることができる。タンパク質または複数のタンパク質の標的枯渇は、そのタンパク質の下流分析が所望される状況（例えば、同定、定量、翻訳後修飾の分析など）で使用してもよい。例えば、Ａβペプチドは、好適なエピトープ結合剤によるＡβの親和性枯渇後に、当該技術分野で公知の方法によって同定および定量することができる。別の非限定的な例として、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）の状態は、ＡｐｏＥの親和性枯渇およびＡｐｏＥアイソフォームの同定に続いて、当技術分野で公知の方法によって決定することができる。標的枯渇を使用して、その後の分析のために他のタンパク質、例えば、限定されるものではないが、アポリポプロテインＪ、シヌクレイン、可溶性アミロイド前駆体タンパク質、α－２マクログロブリン、Ｓ１００Ｂ、ミエリン塩基性タンパク質、インターロイキン、ＴＮＦ、ＴＲＥＭ－２、ＴＤＰ－４３、ＹＫＬ－４０、ＶＩＬＩＰ－１、ＮＦＬ、プリオンタンパク質、ｐＮＦＨ、およびＤＪ－１を単離することもできる。ある特定のタウタンパク質の標的枯渇は、他のタウタンパク質を濃縮するため、および／または質量分析を混乱させる（ｃｏｆｏｕｎｄ）タンパク質を除去するためにも本明細書で使用される。例えば、本開示のある特定の実施形態では、Ｎ末端タウタンパク質および／またはｍｉｄドメインタウタンパク質は、質量分析による分析のためのさらなる試料処理の前に試料から枯渇させる。枯渇タウタンパク質の下流分析を、行ってもよく、または行わなくてもよいが、両方の選択肢が本開示の方法によって企図される。
一部の実施形態では、標的枯渇は、親和性枯渇によって発生し得る。親和性枯渇とは、分子に対するその特異的結合特性を利用して、試料から目的のタンパク質を枯渇させる方法を指す。典型的には、分子は、固体支持体、例えばビーズ、樹脂、組織培養プレートなどに接着したリガンドである（固定化リガンドと称される）。リガンドの固体支持体への固定化は、リガンドとタンパク質の相互作用が発生した後に行ってもよい。好適なリガンドには、抗体、アプタマー、および他のエピトープ結合剤が挙げられる。この分子は、目的のタンパク質を選択的に吸収するポリマーまたは他の材料であってもよい。非限定的な例として、脂肪オキソエチル化アルコールで置換されたポリヒドロキシメチレン（例えば、ＰＨＭ－Ｌ ＬＩＰＯＳＯＲＢ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、血清からリポタンパク質（ＡｐｏＥを含む）を選択的に吸収することができる。２つ以上の親和性枯渇剤を組み合わせて、複数のタンパク質を順次にまたは同時に枯渇させることができる。
一部の実施形態では、本開示の方法は、タウ－４４１の、両端を含むアミノ酸１～２４３内、（または０Ｎまたは１Ｎアイソフォームについては同様に定義された領域内）のエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのエピトープ結合剤を使用して、試料から１つまたは複数のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。様々な実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のエピトープ結合剤を使用することができる。２つ以上のエピトープ結合剤を使用する場合、それらは順次にまたは同時に使用することができる。
一部の実施形態では、本開示の方法は、タウのＮ末端内のエピトープ（例えば、両端を含む、タウ－４４１のアミノ酸１～１０３）に特異的に結合するエピトープ結合剤、およびタウのｍｉｄドメイン内のエピトープ（例えば、両端を含む、タウ－４４１のアミノ酸１０４～２４３）に特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、試料から１つまたは複数のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、順次にまたは同時に使用することができる。
一部の実施形態では、本開示の方法は、両端を含む、タウ－４４１のアミノ酸１～３５内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、および両端を含む、タウ－４４１のアミノ酸１０４～２４３内（または０Ｎまたは１Ｎアイソフォームについては同様に定義された領域内）のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、試料から１つまたは複数のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、順次にまたは同時に使用することができる。
一部の実施形態では、本開示の方法は、両端を含む、タウ－４４１のアミノ酸１～１０３内（または０Ｎまたは１Ｎアイソフォームについては同様に定義された領域内）のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；両端を含む、タウ－４４１のアミノ酸１０４～２４３内（または０Ｎまたは１Ｎアイソフォームについては同様に定義された領域内）のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；およびアミロイドベータのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、試料から１つまたは複数のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、順次にまたは同時に使用することができる。
一部の実施形態では、本開示の方法は、両端を含む、タウ－４４１のアミノ酸１～３５内（または０Ｎまたは１Ｎアイソフォームについては同様に定義された領域内）のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；両端を含む、タウ－４４１のアミノ酸１０４～２４３内（または０Ｎまたは１Ｎアイソフォームについては同様に定義された領域内）のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；およびアミロイドベータのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、試料から１つまたは複数のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、順次にまたは同時に使用することができる。
一部の実施形態では、本開示の方法は、両端を含む、タウ－４４１のアミノ酸１～１０３内（または０Ｎまたは１Ｎアイソフォームについては同様に定義された領域内）のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；およびアミロイドベータのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、試料から１つまたは複数のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、順次にまたは同時に使用することができる。
一部の実施形態では、本開示の方法は、両端を含む、タウ－４４１のアミノ酸１～３５内（または０Ｎまたは１Ｎアイソフォームについては同様に定義された領域内）のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；およびアミロイドベータのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、試料から１つまたは複数のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、順次にまたは同時に使用することができる。
一部の実施形態では、本開示の方法は、両端を含む、タウ－４４１のアミノ酸１０４～２４３内（または０Ｎまたは１Ｎアイソフォームについては同様に定義された領域内）のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤；およびアミロイドベータのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用して、試料から１つまたは複数のタンパク質を親和性枯渇させることを含む。エピトープ結合剤は、順次にまたは同時に使用することができる。
上記の実施形態のそれぞれにおいて、エピトープ結合剤は、抗体またはアプタマーを含み得る。一部の実施形態では、アミロイドベータに特異的に結合するエピトープ結合剤は、ＨＪ５．１であるか、またはＨＪ５．１と同じエピトープに結合する、および／またはＨＪ５．１を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。一部の実施形態では、両端を含む、タウ－４４１のアミノ酸１～１０３内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、ＨＪ８．５であるか、または、ＨＪ８．５と同じエピトープに結合する、および／またはＨＪ８．５を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。一部の実施形態では、両端を含む、タウ－４４１のアミノ酸１０４～２２１内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、タウ１であるか、または、タウ１と同じエピトープに結合する、および／またはタウ１を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。抗体が特異的に結合するエピトープを同定する方法、および２つの抗体間の競合阻害を評価するアッセイは、当該技術分野で公知である。
あるいは、より一般的な方法、例えば限外濾過、または酸、有機溶媒もしくは塩を用いたタンパク質沈殿によって、試料からタンパク質を枯渇させることができる。一般に、これらの方法は、高存在量および高分子量のタンパク質を確実に減少させるために使用され、その結果、低分子量および／または低存在量のタンパク質およびペプチド（例えば、タウ、Ａβなど）が濃縮される。
一部の実施形態では、タンパク質は、沈殿によって試料から枯渇させることができる。簡潔には、沈殿は、試料に沈殿剤を添加して完全に混合すること、試料を沈殿剤と共にインキュベートしてタンパク質を沈殿させること、および沈殿したタンパク質を遠心分離または濾過により分離することを含む。得られた上清はその後、下流用途で使用することができる。必要な試薬の量は、当該技術分野で公知の方法によって実験的に決定することができる。好適な沈殿剤には、過塩素酸、トリクロロ酢酸、アセトニトリル、メタノールなどが挙げられる。例示的な実施形態では、タンパク質は酸沈殿によって試料から枯渇させる。さらなる実施形態では、タンパク質は、過塩素酸を使用する酸沈殿によって試料から枯渇させる。
非限定的な例として、過塩素酸を使用する酸沈殿によって、試料からタンパク質を枯渇させることができる。本明細書で使用される場合、「過塩素酸」は、特に指示がない限り、７０％過塩素酸を指す。一部の実施形態では、過塩素酸は、約１％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、約１％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、約１％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、約３％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、約３％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、約３％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、３．５％ｖ／ｖ～約１５％ｖ／ｖ、３．５％ｖ／ｖ～約１０％ｖ／ｖ、または３．５％ｖ／ｖ～約５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。他の実施形態では、過塩素酸は、約３．５％ｖ／ｖの最終濃度で添加される。過塩素酸の添加に続けて、試料は十分に混合され（例えばボルテックスミキサーにより）、沈殿を促進するために、低温で典型的に約１０分またはそれよりも長く保持される。例えば、試料は、約１０分～約６０分、約２０分～約６０分、または約３０分～約６０分保持されてもよい。他の例では、試料は、約１５分～約４５分、または約３０分～約４５分保持されてもよい。他の例では、試料は、約１５分～約３０分、または約２０分～約４０分保持されてもよい。他の例では、試料は、約３０分保持される。試料は次に、沈殿したタンパク質をペレットにするために低温で遠心分離にかけられ、可溶性タウを含む上清（すなわち、酸可溶性画分）は、新たな容器に移される。上記の文脈において使用される場合、「低温」は１０℃以下の温度を指す。例えば、低温は約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃または約１０℃であってもよい。一部の実施形態では、より狭い温度範囲、例えば約３℃～約５℃、またさらには約４℃が好ましいものであり得る。ある特定の実施形態では、低温は、試料を氷上に置くことにより達成されてもよい。
上記アプローチの一方または両方からの２つ以上の方法を組み合わせて、複数のタンパク質を順次にまたは同時に枯渇させることができる。例えば、１つまたは複数のタンパク質を選択的に枯渇させ（標的枯渇）、続いて高存在量／分子量のタンパク質を枯渇させることができる。あるいは、高存在量／分子量のタンパク質を最初に枯渇させ、続いて１つまたは複数のタンパク質の標的枯渇を行うことができる。さらに別の代替法では、高存在量／分子量のタンパク質を最初に枯渇させ、続いて１つまたは複数のタンパク質の第１のラウンドの標的枯渇を行い、その後、第１のラウンド標的とは異なる１つまたは複数の異なるタンパク質の第２ラウンドの標的枯渇を行ってもよい。他の反復は、当業者には容易に明らかであろう。
（ｄ）タウを精製すること
本明細書に開示される方法の別の工程は、タウ、特にＭＴＢＲタウを精製することを含む。一部の例では、ＭＴＢＲタウは、Ｎ末端非依存性および／またはｍｉｄドメイン非依存性ＭＴＢＲタウである。精製タウは、部分的に精製されていても完全に精製されていてもよい。
一部の実施形態では、本開示の方法は、固相抽出によってタウを精製することを含む。固相抽出によるタウの精製は、タウを吸着する吸着剤を含む固相とタウを含む試料を接触させること、１つまたは複数の洗浄工程、および吸着剤からのタウの溶出を含む。好適な吸着剤には、逆相吸着剤が含まれる。好適な逆相吸着剤は、当該技術分野で公知であり、限定されるものではないが、アルキル結合シリカ、アリール結合シリカ、スチレン／ジビニルベンゼン材料、Ｎ－ビニルピロリドン／ジビニルベンゼン材料が挙げられる。例示的な実施形態では、逆相材料は、Ｎ－ビニルピロリドンおよびジビニルベンゼンを含むポリマー、またはスチレンおよびジビニルベンゼンを含むポリマーである。例示的な実施形態では、吸着剤は、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ（Ｗａｔｅｒｓ）である。タウを含む上清と接触させる前に、吸着剤は典型的に、製造者の使用説明書に従って、または当技術分野において公知のように、予め調整される（例えば、水混和性有機溶媒、および次に移動相を含む緩衝液を用いる）。加えて、一部の逆相材料は他のものよりも強くイオン化された分析物を保持するため、上清を酸性化してもよい。移動相中の、および溶出のための揮発性成分の使用は、試料の乾燥を促進するため、好ましい。例示的な実施形態では、洗浄工程は、約０．０５％ｖ／ｖトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）～約１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む液体相、またはその等価物を含む液相の使用を含み得る。一部の例では、洗浄は、約０．０５％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ ＴＦＡまたは約０．０５％ｖ／ｖ～約０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む液体相を用いてもよい。一部の例では、洗浄は、約０．１％ｖ／ｖ～約１．０％ｖ／ｖ ＴＦＡまたは約０．１％ｖ／ｖ～約０．５％ｖ／ｖ ＴＦＡを含む液体相を用いてもよい。結合したタウは、次に約２０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖアセトニトリル（ＡＣＮ）を含む液体相、またはその等価物を用いて溶出される。一部の例では、タウは約２０％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ ＡＣＮまたは約２０％ｖ／ｖ～約３０％ｖ／ｖ ＡＣＮを含む液体相を用いて溶出されてもよい。一部の例では、タウは約３０％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖ ＡＣＮまたは約３０％ｖ／ｖ～約４０％ｖ／ｖ ＡＣＮを含む液体相を用いて溶出されてもよい。溶出液は、当該技術分野において公知の方法（例えば真空乾燥（例えばｓｐｅｅｄ－ｖａｃ）、凍結乾燥、窒素気流下での蒸発等）により乾燥されてもよい。
一部の実施形態では、本開示の方法は、アフィニティ精製によってＭＴＢＲタウを精製する工程を含む。アフィニティ精製とは、分子に対するその特異的結合特性を利用して、目的のタンパク質を濃縮する方法を指す。典型的には、分子は、固体支持体、例えばビーズ、樹脂、組織培養プレートなどに接着したリガンドである（固定化リガンドと称される）。リガンドの固体支持体への固定化は、リガンドとタンパク質の相互作用が発生した後に行ってもよい。好適なリガンドには、抗体、アプタマー、および他のエピトープ結合剤が挙げられる。アフィニティ精製によるＭＴＢＲタウの精製は、タウを含む試料を好適な固定化リガンドと接触させること、１つまたは複数の洗浄工程、および固定化リガンドからのＭＴＢＲタウの溶出を含む。
一部の実施形態では、本開示の方法は、タウ－４４１の、両端を含むアミノ酸２３５～３６８内、またはタウ－４４１の、両端を含むアミノ酸２４４～３６８内（または他の完全長アイソフォームの同様に定義された領域内）のエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのエピトープ結合剤を使用するアフィニティ精製によって、ＭＴＢＲタウを精製する工程を含む。様々な実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のエピトープ結合剤を使用することができる。２つ以上のエピトープ結合剤を使用する場合、それらは順次にまたは同時に使用することができる。好適なエピトープ結合剤の非限定的な例には、Vandermeeren et al., J Alzheimers Dis, 2018, 65:265-281に記載の７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、およびＰＴ７６、ならびにRoberts et al., Acta Neuropathol Commun, 2020, 8: 13に記載の抗体Ｅ２８１４および７Ｇ６、ならびにそれらの抗体と同じエピトープに特異的に結合する他のエピトープ結合剤が挙げられる。さらなる実施形態では、本開示の方法は、ＭＴＢＲタウのＲ１内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、ＭＴＢＲタウのＲ２内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、ＭＴＢＲタウのＲ３内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、ＭＴＢＲタウのＲ４内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、３Ｒタウに特有のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、４Ｒタウに特有のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、ＭＴＢＲタウのＲ１およびＲ２にまたがるエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、ＭＴＢＲタウのＲ２およびＲ３にまたがるエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、ＭＴＢＲタウのＲ３およびＲ４にまたがるエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤、またはそれらの任意の組合せを使用するアフィニティ精製によってＭＴＢＲタウを精製することを含む。特定の例において、本開示の方法は、タウ－４４１のアミノ酸３１６～３５５（または他の完全長アイソフォームの同じ領域）を含むエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤を使用するアフィニティ精製によって、ＭＴＢＲタウを精製することを含む。様々な実施形態では、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のエピトープ結合剤を使用することができる。２つ以上のエピトープ結合剤を使用する場合、それらは順次にまたは同時に使用することができる。
上記の実施形態のそれぞれにおいて、エピトープ結合剤は、抗体またはアプタマーを含み得る。一部の実施形態では、ＭＴＢＲタウのＲ３およびＲ４内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、７７Ｇ７であるか、または７７Ｇ７と同じエピトープに結合する、および／または７７Ｇ７を競合的に阻害するエピトープ結合剤である（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。一部の実施形態では、３Ｒタウに特有のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、ＲＤ３であるか（de Silva et al., Neuropathology and Applied Neurobiology, 2003, 29: 288-302）、またはＲＤ３と同じエピトープに結合する、および／またはＲＤ３を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。一部の実施形態では、４Ｒタウに特有のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、ＲＤ４であるか（de Silva et al., Neuropathology and Applied Neurobiology, 2003, 29: 288-302）、またはＲＤ４と同じエピトープに結合する、および／またはＲＤ４を競合的に阻害するエピトープ結合剤である。
（ｅ）精製タウをプロテアーゼで切断すること
本明細書に開示される方法の別の工程は、精製タウをプロテアーゼで切断することを含む。プロテアーゼによる精製タウの切断は、タウを消化するのに好適な条件下で、精製タウを含む試料をプロテアーゼと接触させることを含む。アフィニティ精製を使用する場合、固定化リガンドからタウを溶出した後、またはタウが結合している間に消化が発生する場合がある。好適なプロテアーゼには、限定されるものではないが、トリプシン、Ｌｙｓ－Ｎ、Ｌｙｓ－ＣおよびＡｒｇ－Ｎが挙げられる。好ましい実施形態では、プロテアーゼはトリプシンである。得られた切断産物は、タウのタンパク質分解ペプチドを含む組成物である。プロテアーゼがトリプシンである場合、得られる切断生成物はタウのトリプシンペプチドを含む。タンパク質分解的切断に続いて、得られた切断生成物を、典型的には固相抽出によって脱塩する。
（ｆ）ＬＣ－ＭＳ
本明細書に開示される方法の別の工程は、タウのタンパク質分解ペプチドを含む試料を用いて液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を実行して、少なくとも１つのタウのタンパク質分解ペプチドの濃度を検出および測定することを含む。したがって、実際には、開示された方法では、タウの１つまたは複数のタンパク質分解ペプチドを使用して、生物学的試料中に存在するタウタンパク質の量を検出および測定する。
トリプシンがプロテアーゼである実施形態では、ＭＴＢＲタウの存在を示すタウのタンパク質分解ペプチドには、限定されるものではないが、表Ａに列挙されるペプチドが含まれる。消化に代替酵素を使用する場合、得られるタンパク質分解ペプチドはわずかに異なる場合があるが、当業者は容易に決定することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、同じ種類の２つの生物学的試料間のトリプシンペプチドの量の変動は、それらの生物学的試料を構成するＭＴＢＲタウ種の違いを反映すると考えられている。本明細書に開示されるように、ＭＴＢＲタウのある特定のタンパク質分解ペプチドの量、ならびにＭＴＢＲタウのある特定のタンパク質分解ペプチドの比率によって、処置決定の指針となる臨床的に意味のある情報が提供されることがある。したがって、ＭＴＢＲタウのトリプシンペプチドの検出および定量が可能になる方法は、多くの神経変性疾患の診断および処置に有用である。
タウのタンパク質分解ペプチドは、高分解能質量分析計と適合する液体クロマトグラフィーシステムによって分離することができる。好適なＬＣ－ＭＳシステムは、ＩＤ＜１．０ｍｍカラムを備え、流速約１００μｌ／分未満を使用することができる。好ましい実施形態では、ナノフローＬＣ－ＭＳシステムを使用する（例えば、ＩＤ約５０～１００μｍのカラムおよび流速＜１μＬ／分、好ましくは約１００～８００ｎＬ／分、より好ましくは約２００～６００ｎＬ／分）。例示的な実施形態では、ＬＣ－ＭＳシステムはＩＤ０．０５ｍＭカラムを備え、流量約４００ｎＬ／分を使用することができる。
当該技術分野で公知のように、タンデム質量分析を使用して分解能を向上させることができ、または技術を改善して、単一の質量分析器でタンデム質量分析の分解能を達成することができる。好適な種類の質量分析計は、当該技術分野において公知である。これらには、限定されるものではないが、四重極型、飛行時間型、イオントラップおよびＯｒｂｉｔｒａｐ、ならびに異なる種類の質量分析計を１つの構成に組み合わせたハイブリッド型質量分析計（例えば、それぞれＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析計、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）質量分析計、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）質量分析計、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計）が挙げられる。例示的な実施形態では、ＬＣ－ＭＳシステムは、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析計、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）質量分析計、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）質量分析計、または四重極型での同様のもしくは改良された集束性およびイオン透過性を有する質量分析計から選択される質量分析計を備えることができる。好適な質量分析プロトコールは、分析前に収集されるイオンの数（例えば、ｏｒｂｉｔｒａｐを使用したＡＧＣ設定）および／または注入時間を最適化することによって開発することができる。例示的な実施形態では、実施例において概説される質量分析プロトコールが使用される。
ＩＩＩ．対象をステージ分類すること
一態様では、本開示は、アルツハイマー病の認知症状または挙動症状を伴わない対象において認知症発症までの時間を測定する方法であって、（ａｉ）対象から得られた血液試料またはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、および適宜ＭＴＢＲ－タウ２１２、残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率 ＭＴＢＲ－タウ２４３、および／またはＭＴＢＲ－タウ３Ｒを測定すること、または（ａｉｉ）対象から得られた血液試料もしくはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、残基Ｔ２１７におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること、ならびに（ｂ）（ａｉ）もしくは（ａｉｉ）の測定値を使用して、認知症発症までの時間を計算することであって、認知症発症までの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価（ＣＤＲ）までの年数である、計算することを含む方法を提供する。例示的な実施形態では、アルツハイマー病の認知症状または挙動症状を伴わない対象は、ＣＤＲがゼロである。
別の態様では、本開示は、アルツハイマー病の認知症状または挙動症状を伴わない対象において認知症発症までの時間を測定する方法であって、（ａ）対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理してタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得し、次いで、枯渇試料を処理してタウ種の第２の集団を取得することであって、タウ種の第１の集団にはＮ末端タウおよび／またはｍｉｄドメインタウが濃縮されており、濃縮されたタウ種の第２の集団にはＭＴＢＲ－タウが濃縮されている、取得すること；（ｂｉ）タウ種の第１の集団における残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、および適宜、タウ種の第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること、または（ｂｉｉ）タウ種の第１の集団における残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の第１の集団における残基Ｔ２１７におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること；ならびに（ｃ）（ｂｉ）もしくは（ｂｉｉ）の測定値を使用して認知症発症までの時間を計算することであって、認知症発症までの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価までの年数である、計算することを含む方法を提供する。例示的な実施形態では、アルツハイマー病の認知症状または挙動症状を有する対象は、ＣＤＲがゼロより大きい、０．５以上、または１以上である。非限定的な例として、アルツハイマー病の認知症状または挙動症状を有する対象は、ＣＤＲが０．５、１、１．５、または２であり得る。
別の態様では、本開示は、アルツハイマー病の認知症状または行動症状を有する対象において認知症発症からの時間を測定するための方法であって、（ａｉ）対象から得られた血液試料またはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、および適宜ＭＴＢＲ－タウ２１２、残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率 ＭＴＢＲ－タウ２４３、および／またはＭＴＢＲ－タウ３Ｒを測定すること、または（ａｉｉ）対象から得られた血液試料もしくはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、残基Ｔ２１７におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること、ならびに（ｂ）（ａｉ）もしくは（ａｉｉ）の測定値を使用して、認知症発症からの時間を計算することであって、認知症発症からの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価からの年数である、計算することを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、アルツハイマー病の認知症状または行動症状を有する対象において認知症発症からの時間を測定するための方法であって、（ａ）対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理してタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得し、次いで、枯渇試料を処理してタウ種の第２の集団を取得することであって、タウ種の第１の集団にはＮ末端タウおよび／またはｍｉｄドメインタウが濃縮されており、濃縮されたタウ種の第２の集団にはＭＴＢＲ－タウが濃縮されている、取得すること；（ｂｉ）タウ種の第１の集団における残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、および適宜、タウ種の第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること、または（ｂｉｉ）タウ種の第１の集団における残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の第１の集団におけるタウの残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること；ならびに（ｃ）（ｂｉ）もしくは（ｂｉｉ）の測定値を使用して認知症発症からの時間を計算することであって、認知症発症からの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価からの年数である、計算することを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、アルツハイマー病の認知症状または行動症状を有する対象において認知症発症からの時間を測定するための方法であって、（ａｉ）残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、ＭＴＢＲ－タウ（例えば、ＭＴＢＲ－タウ２９９）の変化率を測定すること、および適宜、対象から得た血液試料またはＣＳＦ試料中のＭＴＢＲ－タウ２１２を測定することと、（ｂ）（ａｉ）もしくは（ａｉｉ）の測定値を使用して、認知症発症からの時間を計算することであって、認知症発症からの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価からの年数である、計算することを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、対象における認知の変化を測定するための方法であって、（ａ）対象から得た血液試料またはＣＳＦ試料中のＴ１１１、Ｔ１５３、Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、および対象から得た血液試料またはＣＳＦ試料中のＭＴＢＲ－タウ２７５、ＭＴＢＲ－タウ２９９、およびＭＴＢＲ－タウ３Ｒ（ＭＴＢＲ－タウ３０６）のうちの少なくとも１つを測定することと、適宜、対象から得た血液試料またはＣＳＦ試料中の総タウを測定すること；ならびに（ｂ）（ａ）の測定値を使用して認知における変化を計算することを含む方法を提供する。
上記の実施形態のいくつかでは、認知症発症までの時間を計算することは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定されたタウ種レベルの平均からの有意な逸脱量を決定することを含む。「平均から有意に逸脱する」は、少なくとも１標準偏差、好ましくは少なくとも１．３標準偏差、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差、平均を上回るかまたは下回る値（すなわち、それぞれ１σ、１．３σ、１．５σまたは１．５σであり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団において測定された正規分布により定義される標準偏差である）を指す。閾値（例えば、平均を少なくとも１標準偏差を上回るもしくは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るもしくは下回る変化の程度、または経時的な変化率を使用して対象の認知症発症まで時間を計算することができる。
生物学的試料は、無症状であってもまたは無症状でなくてもよい対象から得ることができる。「無症候性の対象」は、ＡＤのいかなる徴候も症状も示さない対象を指す。しかし、対象は、ＡＤの徴候または症状（例えば記憶喪失、物を置き忘れること、気分または挙動の変化等）を呈し得るが、軽度認知障害または認知症の臨床診断についての十分な認知障害も機能障害も示さない。さらなる一実施形態では、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異のうちの１つを有し得る。代わりの一実施形態では、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異を有し得ない。特定の家族的な関連を有しないアルツハイマー病は、散発性アルツハイマー病と称される。
本開示の別の態様は、対象のアルツハイマー病のステージを診断するための方法を包含する。様々な実施形態では、「ＡＤのステージ」は、ＡＤに起因する認知症の発症から経過した時間の量（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２カ月等）として定義されてもよい。ＡＤの臨床診断についての基準は存在するが、臨床現場では、所与の対象についての症状発症の時期が不明であるか、または認知症もしくはＡＤのいずれかの診断が疑わしいことが多い。そのため、対象のＡＤのステージを客観的に診断する試験が、当該技術分野において必要とされている。
部位特異的タウリン酸化、ＭＴＢＲ－タウ種の測定、および適宜総タウの測定を使用する代わりに、またはそれに加えて、上記の実施形態のいずれかにおいて、測定されたリン酸化レベルおよび／またはＭＴＢＲ－タウレベルから計算された比、あるいは測定されたリン酸化レベルおよび／またはＭＴＢＲ－タウレベルと総タウから計算された比を使用することができる。両方の手法を、実施例において詳述する。比以外の数学演算も使用してもよい。例えば、実施例では、様々な統計学的モデル（例えば線形回帰、ＬＭＥ曲線、ＬＯＥＳＳ曲線など）における部位特異的タウリン酸化値および／またはＭＴＢＲタウ値を、他の公知のバイオマーカー（例えばＡＰＯＥε４状態、年齢、性別、認知試験スコア、機能試験スコア等）と併せて使用する。測定の選択および数学演算の選択は、方法の特異性を最大化するために最適化されてもよい。例えば、診断の精度は、ＲＯＣ曲線下面積により評価されてもよく、一部の実施形態では、０．７以上のＲＯＣ ＡＵＣ値（例えば０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５等）が閾値として設定される。
ヒトにおける脳のアミロイドプラークは、慣習的に、アミロイド陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）により測定される。例えば、皮質Ａβプラークの１１Ｃ－Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ化合物Ｂ（ＰｉＢ）ＰＥＴ画像化は、Ａβプラーク病態を検出するために一般的に使用される。皮質ＰｉＢ－ＰＥＴの標準取込値比（ｓｔａｎｄａｒｄ ｕｐｔａｋｅ ｖａｌｕｅ ｒａｔｉｏ）（ＳＵＶＲ）は、有意な皮質Ａβプラークを確実に同定し、対象を ＰＩＢ陽性（ＳＵＶＲ≧１．２５）または陰性（ＳＵＶＲ＜１．２５）と分類するために使用される。したがって、上記の実施形態では、ＰＥＴ画像化により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団は、皮質ＰｉＢ－ＰＥＴ ＳＵＶＲ＜１．２５を有する対象の集団を指すことがある。ＰｉＢ結合の他の値（例えば平均皮質結合能）または皮質領域以外の目的の領域の分析も、対象をＰＩＢ陽性または陰性と分類するために使用されてもよい。他のＰＥＴ造影剤も使用されてもよい。
ＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団は、Patterson et al, Annals of Neurology, 2015に記載されるように、質量分析により測定される場合、＜０．１２のＡβ４２／４０測定を有する対象の集団を指すことがある。
図５および６は、ＡＤによる認知症発症までの年数との関係における、単離タウ試料におけるタウリン酸化およびＭＴＢＲ－タウレベルの動的パターンを示す。図２０は、５ＥＹＯ間隔ごとの様々なタウ種異常率を示す。平均から大きく逸脱するＴ２１７のリン酸化レベルは、ＡＤによる認知症の発症の約２１年前に初めて発生する。Ｒ２におけるＭＴＢＲ－タウ２９９の変化は発症の約２２年前に発生し、ｐ－タウ２１７占有率の変化が最初に検出されたのに近い。Ｒ４におけるＭＴＢＲ－タウ３５４の増加は、潜在的に脳タングルへの沈着が原因で、臨床ステージ後期には飽和する。特に、タウの病態生理を再現するＭＴＢＲ－タウ２９９／３５４の比は、ｐＴ２１７占有率（すなわち、ＡＤによる認知症発症の約２１年前から）と高度に相関している。ＭＴＢＲ－タウ３Ｒの変化率は、ＡＤによる認知症発症の約２０年前から増加し始め、ＡＤ進行と高い相関がある。ＭＴＢＲ－タウ２４３の変化率は、ＡＤによる認知症発症の約１５年前から増加し始める。ＴＢＲ－タウ２１２レベルの変化は、ＡＤ進行と高度に相関している。平均から大きく逸脱するＴ２０５のリン酸化レベルは、ＡＤによる認知症の発症の約１３年前に初めて発生する。
一例において、本開示の方法は、対象から得られた生物学的試料を用意すること、ならびに（ａｉ）対象から得られた血液試料またはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、および適宜ＭＴＢＲ－タウ２１２、残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率 ＭＴＢＲ－タウ２４３、および／またはＭＴＢＲ－タウ３Ｒを測定すること、または（ａｉｉ）対象から得られた血液試料もしくはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、タウの残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率を測定すること、およびＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること；（ｂ）（ａｉ）もしくは（ａｉｉ）の測定値を使用して認知症発症までの時間を計算することであって、認知症発症までの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価までの年数である、計算すること；ならびに（ｃ）Ｔ２１７におけるタウリン酸化および／またはＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比が平均より約１．５σ以上であり、Ｔ２０５でのタウのリン酸化が平均より約１．５σ未満高い場合、対象を、ＡＤによる認知症の発症から約１０年～約２５年、または約１０年～約２０年であると決定することを含み、ここで、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５におけるタウリン酸化、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比およびＭＴＢＲ－タウ２１２の正規分布により定義される標準偏差である。様々な実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化および／またはＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比は、対照集団の平均を約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２σまたは２σ超ほど上回ってもよい。他の実施形態では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化および／またはＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比は、対照集団の平均を約１．８５σ、約１．９σ、約１．９５σ、約２σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σまたは２．５σ超ほど上回ってもよい。上記の実施形態のそれぞれにおいて、Ｔ２０５におけるタウのリン酸化は、平均であるか対照集団の平均を約１．３σ、約１．３５σ、約１．４σ、約１．４５σ、約１．５σ、約１．５１σ、約１．５５σ、約１．６σ、約１．７σ、約１．８σ、約１．９σ、約２．０σ未満ほど上回ってもよい。あるいは、Ｔ２０５におけるタウのリン酸化は、対照集団の平均を約２．０σ、約２．０５σ、約２．１σ、約２．２σ、約２．３σ、約２．４σ、約２．５σ、または２．５σ未満ほど上回っていてもよい。さらなる例では、Ｔ２１７におけるタウリン酸化および／またはＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比は、対照集団の平均を約２σ以上上回っていてもよく、Ｔ２０５におけるタウリン酸化は、対照集団の平均を約２σまたはそれ以下未満ほど上回っていてもよい。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る絶対値の変化の程度、または経時的な変化率を使用して対象を分類するために使用してもよい。なおさらなる実施形態では、Ｔ２０５および／またはＴ２１７におけるタウリン酸化の測定レベル、ならびにＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比値および／またはＭＴＢＲ－タウ２１２値は、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。
別の例では、本開示の方法は、（ａ）対象から得られた第１および第２の生物学的試料を用意することであって、「第１の」および「第２の」は、試料が収集された順序を指すこと、ならびに上記のようにタウ種を測定すること；（ｂ）測定された各残基における部位特異的リン酸化の変化、およびＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比値および適宜ＭＴＢＲ－タウ２１２値の変化を計算することと；（ｃ）リン酸化レベルＴ２１７および／またはＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比が低減するかまたは同じままであり、Ｔ２０５におけるリン酸化レベルが増大する場合、対象のＡＤのステージを診断することとを含む。第１のおよび第２の単離されたタウ試料は、数日、数週または数カ月の間隔で収集されてもよい。典型的に、（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）または（ａ）（ｉｉｉ）に列挙される特異的部位におけるタウリン酸化も、両方の試料について約１．５σ以上となり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で測定された、Ｔ２１７およびＴ２０５、Ｔ１８１およびＴ２０５またはＴ１８１、Ｔ２０５およびＴ２１７におけるタウリン酸化の正規分布により定義される標準偏差である。なおさらなる実施形態では、特異的部位におけるタウリン酸化の測定レベルおよび（ａ）（ｉ）、（ａ）（ｉｉ）に記載のＭＴＢＲ－タウ種の値は、各々それ自身と比較して予測力を改善するために、様々な数学演算において使用されてもよい。例えば、比は、測定されたリン酸化レベルから算出されてもよい。比以外の数学演算も使用してもよい。
タウリン酸化およびＭＴＢＲ－タウを測定する方法は第ＩＩ節に記載されており、参照によりこの節に組み込まれる。しかし、当業者は、絶対値が、絶対量定量に使用されるプロトコールおよび内部標準の供給源／規格に依存して変動し得ることを諒解するであろう。
上記の一部の実施形態では、対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理して、濃縮されたタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得することは、血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合する第１のエピトープ結合剤およびタウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させることを含んでもよい。第１および第２のエピトープ結合剤は、順次にまたは組み合わせて使用することができる。一部の例では、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、ＨＪ８．５、またはＨＪ８．５と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤である。一部の例では、タウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、タウ１、またはタウ１と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤である。
上記の他の実施形態では、枯渇試料を処理して、濃縮されたタウ種の第２の集団を取得することは、ＭＴＢＲ－タウ種を濃縮するための化学抽出工程を、実行することを含んでもよい。ある特定の実施形態では、化学抽出工程は、酸を混合して枯渇試料のタンパク質を沈殿させることであって、酸は過塩素酸であってもよく、沈殿したタンパク質の除去後の上清中にＭＴＢＲ－タウ種が存在している、沈殿させることを含んでもよい。あるいは、枯渇試料を処理して、濃縮されたタウ種の第２の集団を取得することは、枯渇試料を、タウのＭＴＢＲ内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させることを含んでもよい。ある特定の実施形態では、エピトープ結合剤は、Vandermeeren et al., J Alzheimers Dis, 2018, 65:265-281に記載の７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、もしくはＰＴ７６、またはRoberts et al., Acta Neuropathol Commun, 2020, 8: 13に記載のＥ２８１４もしくは７Ｇ６、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６、Ｅ２８１４もしくは７Ｇ６の抗原結合フラグメント、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６、Ｅ２８１４もしくは７Ｇ６と同じエピトープに特異的に結合する他のエピトープ結合剤であってもよい、接触させることを含む。
上記のさらに他の実施形態では、対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理して、濃縮されたタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得することは、血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または血液試料もしくはＣＳＦ試料を、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合する第１のエピトープ結合剤およびタウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させることを含んでもよく；ならびに枯渇試料を処理して、濃縮されたタウ種の第２の集団を取得することは、ＭＴＢＲ－タウ種を濃縮するための化学抽出工程を、実行すること、または枯渇試料を、タウのＭＴＢＲ内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させることを含む。第１および第２のエピトープ結合剤は、順次にまたは組み合わせて使用することができる。ある特定の例では、タウのＮ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、ＨＪ８．５、またはＨＪ８．５と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であり；タウのｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、タウ１、またはタウ１と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤である。化学抽出工程は、酸を混合して枯渇試料のタンパク質を沈殿させることであって、酸は過塩素酸であってもよく、沈殿したタンパク質の除去後の上清中にＭＴＢＲ－タウ種が存在している、沈殿させることを含んでもよい。タウのＭＴＢＲ内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤は、Vandermeeren et al., J Alzheimers Dis, 2018, 65:265-281に記載の７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、もしくはＰＴ７６、またはRoberts et al., Acta Neuropathol Commun, 2020, 8: 13に記載のＥ２８１４もしくは７Ｇ６、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６、Ｅ２８１４もしくは７Ｇ６の抗原結合フラグメント、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６、Ｅ２８１４もしくは７Ｇ６と同じエピトープに特異的に結合する他のエピトープ結合剤であってもよい。
ＩＶ．処置方法
本開示はまた、対象の疾患進行をステージ分類するための；対象の脳の病変をステージ分類するための；対象のための診断剤を選択するための；ならびに対象の疾患ステージおよび根底にある疾患病変に合わせた、対象のための治療剤もしくは治療剤のクラスを選択するための；本明細書に記載される認知症発症までの時間の測定値の使用を包含する。したがって、本開示の別の態様は、対象を処置するための方法であって、対象の認知症発症までの時間の測定を考慮して対象のために選択された治療剤または診断剤を対象に投与することを含む方法である。
「処置する」、「処置すること」または「処置」という用語は、本明細書において使用される場合、訓練を受け免許を受けた専門家による、それを必要とする対象への医学的ケアの提供を指す。医療は、診断検査、治療的処置、および／または予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）措置であり得る。治療および予防的処置の目的は、所望されない生理学的変化または疾患／障害を防止するかまたは緩慢化する（和らげる）ことである。治療または予防的処置の有益なまたは所望の臨床結果には、限定されるものではないが、検出可能かまたは検出不可能かにかかわらず、症状の緩和、疾患の程度の減弱、安定化した（すなわち、悪化しない）病態、疾患進行の遅延または緩慢化、病態の改善または軽減、および寛解（部分または完全のいずれか）が挙げられる。「処置」は、処置を受けない場合に予測される生存期間と比較して生存期間を延長することも意味することができる。処置を必要とする者には、疾患、状態もしくは障害を既に有する者、ならびに疾患、状態もしくは障害を有する傾向にある者、または疾患、状態もしくは障害を防止する予定の者が挙げられる。一部の実施形態では、処置を受けている対象は無症候性である。「無症候性の対象」は、本明細書において使用される場合、ＡＤのいかなる徴候も症状も示さない対象を指す。別の実施形態では、対象は、ＡＤの徴候または症状（例えば記憶喪失、物を置き忘れること、気分または挙動の変化等）を呈し得るが、アルツハイマー病に起因する認知症の臨床診断についての十分な認知障害も機能障害も示さない。症候性または無症候性の対象はＡβアミロイドーシスを有し得るが、Ａβアミロイドーシスの事前知識は、処置のための必要条件ではない。なおさらなる実施形態では、対象はＡＤを有すると診断されてもよい。上述の実施形態のいずれかでは、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異のうちの１つを有し得る。代わりの一実施形態では、対象は、優性遺伝性アルツハイマー病を引き起こすことが公知の遺伝子突然変異を有し得ない。
一実施形態では、上記のように対象を処置するための方法は、対象から得られた生物学的試料を用意すること、ならびに（ａｉ）対象から得られた血液試料またはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、および適宜ＭＴＢＲ－タウ２１２、残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率 ＭＴＢＲ－タウ２４３、および／またはＭＴＢＲ－タウ３Ｒを測定すること、または（ａｉｉ）残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、残基Ｔ２１７におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること；ならびに（ｂ）ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に、測定レベルが、脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で平均値から著しく逸脱している場合に、医薬組成物を対象に投与することを含んでもよい。
別の実施形態では、上記のように対象を処置するための方法は、（ａ）対象から得られた第１および第２の生物学的試料を用意し、各試料において測定すること、（ａｉ）対象から得られた血液試料またはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、および適宜ＭＴＢＲ－タウ２１２、残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率 ＭＴＢＲ－タウ２４３、および／またはＭＴＢＲ－タウ３Ｒを測定すること、または（ａｉｉ）残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、タウの残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率を測定すること、およびＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること；（ｂ）（ａｉ）もしくは（ａｉｉ）の測定値もしくは測定値の変化を使用して認知症発症までの時間を計算することであって、認知症発症までの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価までの年数である、計算すること；ならびに（Ｃ）ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に、計算された測定値または変化が、脳のアミロイドプラークを有しない対照集団中で平均値から著しく逸脱している場合に、医薬組成物を対象に投与することを含んでもよい。「平均から有意に逸脱する」は、少なくとも１標準偏差、好ましくは少なくとも１．３標準偏差、より好ましくは少なくとも１．５標準偏差、またはさらにより好ましくは少なくとも２標準偏差、平均を上回るかまたは下回る値（すなわち、それぞれ１σ、１．３σ、１．５σまたは１．５σであり、σは、ＰＥＴ画像化および／またはＣＳＦ中のＡβ４２／４０測定により測定される場合に脳のアミロイドプラークを有しない対照集団において測定された正規分布により定義される標準偏差である）を指す。閾値（例えば、少なくとも１標準偏差、平均を上回るかまたは下回る）を使用することに加えて、一部の実施形態では、平均を上回るかまたは下回る変化の程度を、対象を処置するための基準として使用してもよい。
部位特異的タウリン酸化の測定を使用する代わりに、またはそれに加えて、上記の実施形態のいずれかにおいて、ＭＴＢＲ－タウ種の測定レベルから計算される比を使用することができる。比以外の数学演算も使用してもよい。例えば、実施例では、様々な統計学的モデル（例えば線形回帰、ＬＭＥ曲線、ＬＯＥＳＳ曲線等）における部位特異的タウリン酸化値を、他の公知のバイオマーカー（例えばＡＰＯＥε４状態、年齢、性別、認知試験スコア、機能試験スコア等）と併せて使用する。
ＡβアミロイドーシスもしくはＡＤを発症するリスクのある対象、Ａβアミロイドーシスを有すると診断された対象、タウオパチーを有すると診断された対象、またはＡＤを有すると診断された対象に対して企図される、または彼らと共に使用される多数の造影剤および治療剤は、特定の病態生理の変化を標的とする。例えば、Ａβ標的療法は、一般的に、Ａβ産生を低減するか、Ａβ凝集に拮抗するか、または脳のＡβクリアランスを増大させるように設計され、タウ標的療法は、一般的にタウリン酸化パターンを変化させるか、タウ凝集に拮抗するか、またはＮＦＴクリアランスを増大させるように設計され、様々な療法は、ＣＮＳ炎症または脳のインスリン耐性を減少するように設計される、等である。これらの様々な薬剤の有効性は、本明細書に開示される方法によってステージ分類された対象に薬剤を投与することによって改善することができる。
例示的な実施形態では、ＡβアミロイドーシスまたはＡＤを発症するリスクのある対象、Ａβアミロイドーシスを有すると診断された対象、タウオパチーを有すると診断された対象、またはＡＤを有すると診断された対象（集合的に、本明細書において「Ａβおよびタウ療法」と称する）に対して企図される、または共に使用される造影剤および治療剤の有効性は、Ｔ２０５および／またはＴ２１７におけるある特定のタウリン酸化レベル、および／またはＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を有する対象に、Ａβもしくはタウ療法を投与すること、ならびに適宜、本明細書に開示され、図および実施例に示される方法によって測定されるＭＴＢＲ－タウ２１２および／またはＭＴＢＲ－タウ３Ｒおよび／またはＭＴＢＲ－２４３を測定することによって改善することができる。
例えば、認知症発症までの時間の測定値が約２０年、約２５年、または約３０年以上である実施形態では、好適な治療法は、病理学的アミロイド沈着（すなわち、対象の年齢から予想されるよりも大きいアミロイド沈着）を防止する一次予防療法であってもよい。非限定的な例には、Ａβ産生を低減させるか、Ａβ凝集を防止するもしくはそれに拮抗させるか、または脳のＡβクリアランスを増大させる治療剤、例として、限定されるものではないが、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、受動免疫療法（限定されるものではないが、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、もしくは抗ＡｐｏＥ抗体を含む）、能動免疫療法が挙げられる。
認知症発症までの時間の測定値が約２５年～約１５年、または約２０年～約１５年である実施形態では、好適な治療法は、さらなる病理学的アミロイドベータ沈着を防止するか、または対象の既存のアミロイドベータプラーク負荷を減少させる二次予防療法であってもよい。非限定的な例には、Ａβ産生を低減させるか、Ａβ凝集を防止するもしくはそれに拮抗させるか、または脳のＡβクリアランスを増大させる治療剤、例として、限定されるものではないが、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、および受動免疫療法（限定されるものではないが、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、もしくは抗ＡｐｏＥ抗体を含む）が挙げられる。
認知症発症までの時間の測定値が約１５年以下である実施形態では、好適な治療法は、さらなる病理学的アミロイドベータ沈着を防止するか、または対象の既存のアミロイドベータプラーク負荷を減少させる治療法に加えて、タウ凝集を防止するかもしくはタウ凝集に拮抗する、または神経原線維変化を標的とする二次予防療法であってもよい。非限定的な例には、タウ凝集を防止するもしくはそれに拮抗させるか、または神経原線維変化を標的とする治療剤が含まれ、タウタンパク質凝集阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、受動免疫療法（抗タウ抗体を含むがこれらに限定されない）が挙げられる。
抗Ａβ抗体の非限定的な例には、ソラネズマブ（ＬＹ２０６２４３０；Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、アデュカヌマブ（ＢＩ－ＩＢ０３７；Ｂｉｏｇｅｎ）、クレネズマブ（ＭＡＢＴ１０２Ａ、ＲＧ７４１２、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈおよびＲｏｃｈｅ）、ガンテネルマブ（ＲＯ４９０９８３２、ＲＧ１４５０２；Ｒｏｃｈｅ）、バピネウズマブ（ｂａｐｉｎｅｚｕｍａｂ）（ＪａｎｓｓｅｎおよびＰｆｉｚｅｒ）、ＢＡＮ２４０１（Ｅｉｓａｉ）、ＬＹ３００２８１３（Ｌｉｌｌｙ）、ＲＯ７１２６２０９（Ｒｏｃｈｅ）、ＡＡＢ－００３、およびＧＫ９３３７７６が挙げられる。
抗タウ抗体の非限定的な例には、セモリネマブ（ＡＣ ＩｍｍｕｎｅおよびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＡＢＢＶ－８Ｅ１２（Ａｂｂｖｉｅ）、ＢＩＩＢ０９２（Ｂｉｏｇｅｎ）、ＢＩＩＢ０７６（Ｂｉｏｇｅｎ）、ＬＹ３３０３５６０（Ｌｉｌｌｙ）、ＲＯ７１０５７０５（Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＪＮＪ－６３７３３６５７（Ｊａｎｓｓｅｎ）、Ｌｕ ＡＦ８７９０８（Ｌｕｎｄｂｅｃｋ）が挙げられる。
抗ＡｐｏＥ抗体の非限定的な例には、ＨＪ６．３、ＨＡＥ－４（ＷＵＳＴＬ、Ｄｅｎａｌｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。
治療剤の非限定的な例には、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ－メチルＤ－アスパルテート（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、抗うつ剤（例えば選択的セロトニン再取り込み阻害剤、非定型抗うつ剤、アミノケトン、選択的セロトニンおよびノルエピネフリン再取り込み阻害剤、三環系抗うつ剤等）、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、抗Ａβ抗体（抗原結合フラグメント、その変異体または誘導体を含む）、抗タウ抗体（抗原結合フラグメント、その変異体または誘導体を含む）、抗ＴＲＥＭ２抗体（その抗原結合フラグメント、変異体または誘導体を含む）、ＴＲＥＭ２アゴニスト、幹細胞、栄養補助食品（例えばリチウム水、リポ酸を有するオメガ３脂肪酸、長鎖トリグリセリド、ゲニステイン、レスベラトロール、クルクミンおよびグレープシード抽出物等）、セロトニン受容体６のアンタゴニスト、ｐ３８アルファＭＡＰＫ阻害剤、組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、受動免疫療法、活性ワクチン（例えばＣＡＤ１０６、ＡＦ２０５１３等）、タウタンパク質凝集阻害剤（例えばＴＲｘ０２３７、塩化メチルチオニミウム等）、血糖管理を改善するための治療（例えばインスリン、エキセナチド、リラグルチドピオグリタゾン等）、抗炎症剤、ホスホジエステラーゼ９Ａ阻害剤、シグマ１受容体アゴニスト、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、ホスファターゼ阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断薬、ＣＢ１および／またはＣＢ２エンドカンナビノイド受容体部分アゴニスト、β－２アドレナリン受容体アゴニスト、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト、５－ＨＴ２Ａ逆アゴニスト、アルファ－２ｃアドレナリン受容体アンタゴニスト、５－ＨＴ１Ａおよび１Ｄ受容体アゴニスト、グルタミニル－ペプチドシクロトランスフェラーゼ阻害剤、ＡＰＰ産生の選択的阻害剤、モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、ＡＭＰＡ受容体アゴニスト、神経成長因子興奮剤、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、神経栄養剤（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ａｇｅｎｔ）、ムスカリン性Ｍ１受容体アゴニスト、ＧＡＢＡ受容体調節因子、ＰＰＡＲ－ガンマアゴニスト、微小管タンパク質調節因子、カルシウムチャネル遮断薬、抗高血圧薬、スタチン、ならびにそれらの任意の組合せが挙げられる。例示的な実施形態では、医薬組成物は、キナーゼ阻害剤を含んでもよい。好適なキナーゼ阻害剤は、ｔｈｏｕｓａｎｄ－ａｎｄ－ｏｎｅアミノ酸キナーゼ（ＴＡＯＫ）、ＣＤＫ、ＧＳＫ－３β、ＭＡＲＫ、ＣＤＫ５またはＦｙｎを阻害し得る。別の例示的な実施形態では、医薬組成物は、ホスファターゼ活性化剤を含んでもよい。非限定的な例として、ホスファターゼ活性化剤は、プロテインホスファターゼ２Ａの活性を増大させ得る。一部の実施形態では、処置は、限定されるものではないが、タウリン酸化パターンを変化させるか、タウ凝集に拮抗するか、または病理学的タウアイソフォームおよび／または凝集体のクリアランスを増大させる活性医薬成分を含む、タウ標的療法を含む医薬組成物である。一部の実施形態では、処置は、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、抗ＴＲＥＭ２抗体、ＴＲＥＭ２アゴニスト、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、ワクチン、またはタウタンパク質凝集阻害剤である。
治療剤のクラスの非限定的な例および特定の例もまた、以下の表に提示される。
例えば、Ｔ２１７におけるタウリン酸化およびＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比値が、対照集団の平均を約１．５σ以上上回っており、Ｔ２０５におけるタウリン酸化は、平均に近いか対照集団の平均を約１．５σ以上未満ほど上回っている場合、好ましい治療剤には、対象がアミロイド陽性になるのを防止するように設計されたもの（例えば、Ａβ産生を減少させる、Ａβ凝集に拮抗させるなどのように設計されたアミロイド標的療法）を挙げることができる。別の例として、Ｔ２１７におけるタウリン酸化およびＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比値が、対照集団の平均を約１．５σ以上上回っており、Ｔ２０５におけるタウリン酸化は、対照集団の平均を約１．５σ以上ほど上回っている場合、好ましい治療剤には、アミロイド沈着によって対象の既存のプラーク負荷が増加または減少するのを防止するように設計されたものを挙げることができる。別の例として、Ｔ２１７におけるタウリン酸化およびＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比値、およびＴ２０５が、対照集団の平均を約１．５σ以上上回っている場合、好ましい治療剤には、アミロイド沈着によって対象の既存のプラーク負荷が増加、減少するのを防止するように、タウの凝集を防止するように、またはＮＦＴを標的にするように設計されたものを挙げることができる。別の例として、Ｔ２１７におけるタウリン酸化およびＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比値、およびＴ２０５が、対照集団の平均を約１．５σ以上上回っており、Ｔ２１７でのタウリン酸化およびＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比の値がプラトーとなるかまたは低下しており、Ｔ２０５での総タウおよび／またはタウリン酸化が増大している場合、好ましい治療剤には、アミロイド沈着によって対象の既存のプラーク負荷が増加、減少するのを防止するように、タウの凝集を防止するように、またはＮＦＴを標的にするように設計されたもの、ならびにＡＤ患者に特異的なものを挙げることができる。本明細書に開示される詳細は、限定されるものではないが、前述の段落で特定されたものを含む、他の標的（例えば、ＣＮＳ炎症、ＡｐｏＥなど）用に設計された治療剤を投与するために、同様に使用することができる。
以下の実施例は、本発明の様々な反復を例証する。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するように本発明者らによって発見された技術を表すことが、当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態における変更を行うことができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似した結果をなお得られることを理解するべきである。したがって、添付の図面において記載されるかまたは示されるすべての事柄は、例示的なものとして解釈されることとなり、意味を限定するものではない。
［実施例１］
いくつかの試料処理法－ Sato et al., 2018に記載のＮ末端タウおよびｍｉｄドメインタウの免疫沈降法（ＩＰ）；化学抽出法（ＣＸ）；およびＩＰ法とＣＸ法を組み合わせてＭＴＢＲタウを濃縮するプロセス（ＰｏｓｔＩＰ－ＣＸ）が開発された。ＣＸおよびＰｏｓｔＩＰ－ＣＸ法は、ＭＴＢＲタウを検出および定量するために特別に開発された。これらの方法の概要を図２に示す。
簡潔には、ＣＳＦ（約４７５μＬ）を、内部標準として１５Ｎタウ－４４１（２Ｎ４Ｒ）均一標識を含有する溶液（１００ｐｇ／μＬのおよそ１０μＬ溶液、または２００ｐｇ／μＬのおよそ５μＬ溶液）と混合した。Ｎ末端タウおよび中間ドメインタウ種をタウ１およびＨＪ８．５抗体で免疫沈降し、その後、以前に記載されているように（Sato et al., 2018）処理してトリプシン消化させた。
ＣＸ法については、ＣＳＦ（約４７５μＬ）を、内部標準として１５Ｎタウ－４４１（２Ｎ４Ｒ）均一標識を含有する溶液（１００ｐｇ／μＬのおよそ１０μＬ溶液、または２００ｐｇ／μＬのおよそ５μＬ溶液）と混合した。次に、タウを化学的に抽出した。２５μＬの過塩素酸を使用して、非常に豊富なＣＳＦタンパク質を沈殿させた。混合し、氷上で１５分間インキュベートした後、混合物を４℃、２０，０００ｇで１５分間遠心分離し、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ ９６－ウェルμＥｌｕｔｉｏｎプレート（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、以下の工程に従って上清をさらに精製した。プレートを３００μＬのメタノールで１回洗浄し、５００μＬの０．１％ＦＡ水溶液で１回平衡化した。上清を、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ ９６－ウェルμＥｌｕｔｉｏｎプレートに加え、固相に吸着させた。次に、固相を、５００μＬの０．１％ＦＡ水溶液で１回洗浄した。溶出緩衝液（１００μＬ；水中３５％アセトニトリルおよび０．１％ＦＡ）を添加し、溶出液をＳｐｅｅｄ－ｖａｃによって乾燥させた。乾燥試料を、５０ｍＭ ＴＥＡＢＣ中の５０μＬのトリプシン溶液（１０ｎｇ／μＬ）によって溶解し、３７℃で２０時間インキュベートした。
ＰｏｓｔＩＰ－ＣＸ法については、免疫沈降後のＣＳＦ（すなわち、上記のＩＰ法の後に残る上清）を、ＣＸ法に記載したように処理した。
トリプシン消化後、すべての試料をＣ１８ ＴｏｐＴｉｐでの固相抽出によって精製した。この精製プロセスでは、差分定量のために、残基３５４～３６９（ＭＴＢＲタウ－３５４）および３５４～３６８（タウ３６８）のＡＱＵＡ内部標準ペプチド５ｆｍｏｌずつをスパイクした。試料を溶出する前に、水中の３％過酸化水素および３％ＦＡをビーズに添加し、続いて４℃で終夜インキュベートして、メチオニンを含有するペプチドを酸化させた。溶出液を凍結乾燥させ、ＰＲＭモードで動作するＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ ＴｒｉｂｒｉｄまたはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｔｒｉｂｒｉｄ Ｅｃｌｉｐｓｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結したｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムでＭＳ分析を行う前に、２７．５μＬの水中２％アセトニトリルおよび０．１％ＦＡに再懸濁した。
ＣＸ法およびＰｏｓｔＩＰ－ＣＸ法によって、質量分析法によって検出可能および定量可能なＭＴＢＲタウを含む試料を生成した。ＭＴＢＲタウの定量可能なシグナルは、ＩＰ法では得られなかった。実証されていないが、同様の感度を有するＭＴＢＲタウを検出および定量するための代替方法もまた使用することができると考えられている。
［実施例２］
ＭＳによるＣＳＦタウ分析：ＣＳＦ（４５５μＬ）を、内部標準として１５Ｎタウ－４４１（２Ｎ４Ｒ）均一標識（１００ｐｇ／μＬ）を含有する１０μＬの溶液と混合した。主にＮ末端～ｍｉｄドメイン領域で構成されるタウ種を、タウ１およびＨＪ８．５抗体により免疫沈降した。免疫沈降したタウ種を、以前に記載されているように（Sato et al., 2018）処理し、消化させた。続いて、２０μＬの１５Ｎ－タウ内部標準（１００ｐｇ／μＬ）を免疫沈降後のＣＳＦにスパイクした。次に、以前に報告されたように（Barthelemy et al., 2016b）、いくつかの変更を加えてタウを化学的に抽出した。２５μＬの過塩素酸を使用して、非常に豊富なＣＳＦタンパク質を沈殿させた。混合し、氷上で１５分間インキュベートした後、混合物を４℃、２０，０００ｇで１５分間遠心分離し、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ ９６－ウェルμＥｌｕｔｉｏｎプレート（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、以下の工程に従って上清をさらに精製した。プレートを３００μＬのメタノールで１回洗浄し、５００μＬの０．１％ＦＡ水溶液で１回平衡化した。上清を、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ ９６－ウェルμＥｌｕｔｉｏｎプレートに加え、固相に吸着させた。次に、固相を、５００μＬの０．１％ＦＡ水溶液で１回洗浄した。溶出緩衝液（１００μＬ；水中３５％アセトニトリルおよび０．１％ＦＡ）を添加し、溶出液をＳｐｅｅｄ－ｖａｃによって乾燥させた。乾燥試料を、５０ｍＭ ＴＥＡＢＣ中の５０μＬのトリプシン溶液（１０ｎｇ／μＬ）によって溶解し、３７℃で２０時間インキュベートした。
免疫沈降試料と化学抽出試料の両方をインキュベートした後、各トリプシン消化物をＣ１８ ＴｏｐＴｉｐでの固相抽出によって精製した。この精製プロセスでは、差分定量のために、残基３５４～３６９（ＭＴＢＲタウ－３５４）および３５４～３６８（タウ３６８）のＡＱＵＡ内部標準ペプチド５ｆｍｏｌずつをスパイクした。試料を溶出する前に、水中の３％過酸化水素および３％ＦＡをビーズに添加し、続いて４℃で終夜インキュベートして、メチオニンを含有するペプチドを酸化させた。溶出液を凍結乾燥させ、ＰＲＭモードで動作するＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ ＴｒｉｂｒｉｄまたはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｔｒｉｂｒｉｄ Ｅｃｌｉｐｓｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結したｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムでＭＳ分析を行う前に、２７．５μＬの水中２％アセトニトリルおよび０．１％ＦＡに再懸濁した。１９個のＣＳＦタウペプチドを定量した（表１）。ＣＳＦタウ分析の概略手順を、図２Ａに記載する。
統計分析：特に指定がない限り、バイオマーカー値の差異を一元配置ＡＮＯＶＡで評価した。両側ｐ＜０．０５は統計的に有意と考えられ、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ偽発見率（ＦＤＲ）法（BenjaminiおよびHochberg, 1995）を使用して、ＦＤＲを５％に設定して、多重比較のために補正した。Ｓｐｅａｒｍａｎ相関を使用して、タウバイオマーカーと認知試験測定値およびタウＰＥＴ ＳＵＶＲの間の関連性を評価した。
［実施例３］
「ＰｏｓｔＩＰ－ＩＰ」と称される追加の試料処理方法を開発して、実施例１および２に記載のＰｏｓｔＩＰ－ＣＸ方法と比較した。ＰｏｓｔＩＰ－ＩＰ法の例示的なワークフローを、図３および図４に提供する。
実施例２に記載のＬＯＡＤ１００コホートから得られたＣＳＦ試料を、ＰｏｓｔＩＰ－ＣＸ法（実施例１）またはＰｏｓｔＩＰ－ＩＰ法（本実施例）によって処理し、次いで、実施例２に一般に記載したようにＬＣ－ＭＳによって分析した。
［実施例４］
血漿および脳脊髄液（ＣＳＦ）から増加している可溶性タウ種を同定および定量するための方法の進歩により、アルツハイマー病（ＡＤ）におけるタウ関連病変の役割をよりよく理解する機会が提供される。優性遺伝性および散発性アルツハイマー病に関する最近の研究では、タウタンパク質の特定の位置における過剰リン酸化、Ｎ末端フラグメントおよび微小管結合領域（ＭＴＢＲ）が、アルツハイマー病カスケードの様々な態様に関連していることが実証されている。しかし、様々な可溶性タウ種によって提供される潜在的な特有の情報を評価する必要がある。優性遺伝アルツハイマーネットワーク（Ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ＡＤ Ｎｅｔｗｏｒｋ）（ＤＩＡＮ）研究は、複数の可溶性タウ種と疾患進行ならびにアミロイドおよび神経変性の複数のバイオマーカーとの関連を調査する機会を提供する。
この実施例では、１２種を超えるＣＳＦリン酸化タウ（ｐ－タウ）および短縮化ＭＴＢＲ種を、ＤＩＡＮに登録された２２７名の突然変異保持者（ＭＣ）（１５２名の無症状ＭＣ、７７名の有症状ＭＣ）および１４１名の非保有者から定量した。症状発症までの推定年数（ＥＹＯ）を予測するためのｐ－タウとＭＴＢＲ種の最適な組合せを、段階的選択による線形回帰を使用して評価した。相関ヒートマップおよび階層的クラスタリングを使用して、タウ／ｐ－タウ種および他のバイオマーカー間のベースラインレベルおよび長期的変化率の関連パターンを調査した。
ＤＩＡＮは、ＡＰＰ、ＰＳＥＮ１、またはＰＳＥＮ２遺伝子におけるＡＤの原因となる既知の突然変異を有する親の生物学的な成人した子供である個人（突然変異保持者および非保持者、無症状および有症状）の国際的多施設レジストリーであり、ＤＩＡＮでは、個人を、標準的な機器を使用して、参加時におよびその後長期的に均一な手段で評価する。標準的な手段には以下のものが含まれる：（１）統一データセット（ＵＤＳ）の臨床および認知バッテリー、ならびに追加の神経心理学的測定および性格測定；（２）アルツハイマー病ニューロイメージングイニシアチブ（ＡＤＮＩ）構造的画像化（磁気共鳴画像法、すなわちＭＲＩ、機能的画像化（１８フルオロデオキシグルコース陽電子放出断層撮影法、すなわちＦＤＧ ＰＥＴ）、およびアミロイド画像法（ピッツバーグコンパウンドＢ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ－Ｂ）、すなわちＰＩＢ）ＰＥＴプロトコール）；（３）ＡＤＮＩプロトコールに従って、ＤＮＡ分析およびＡＤの推定バイオマーカーのアッセイのための体液（血液、ＣＳＦ）の収集、ならびに（４）検死される個人の脳組織の均一な組織病理学的検査。ＤＩＡＮでは、有症状個人とは、臨床認知症評価がゼロより大きい（ＣＤＲ＞０）個人である。臨床認知症評価は、認知症の症状の重症度を定量するために使用される周知の尺度である。ＤＩＡＮにおける症状リスクは、ＥＹＯによって定義される。ここでのＥＹＯは、認知症と診断された親の年齢から参加者の現在の年齢を差し引いたものと定義される。ベースラインで有症状であった参加者については、ＣＤＲ＞０で評価し、報告された実際の症状発症時の年齢を各臨床評価時の年齢から差し引いてＥＹＯを定義した。
リン酸化タウの検出および定量化：試料処理
ヒトＣＳＦを、アミロイド陰性および認知に関して正常な（ＣＤＲ＝０）対照（ｎ＝４７、年齢６０＋）ならびにアミロイド陽性およびＣＤＲ＞０ ＡＤ患者（ｎ＝３３、年齢６０＋）を含む参加者８０名のコホートからプールした。対照およびＡＤ群から、それぞれ５００μＬ ＣＳＦアリコートの５つおよび７つのプールを生成した。最初の収集時に、ＣＳＦを１，０００×ｇで１０分間スピンダウンして、細胞デブリを除去し、－８０℃にて直ちに冷凍した。プロテアーゼ阻害剤カクテルを実験中に添加した。タウを、一部変更を加えて、以前に説明されているように（Sato et al., 2018）、免疫沈降させ、脱塩した。簡潔には、ＣＮＢｒ－活性化セファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ １７－０４３０－０１）を、ビーズグラム当たり３ｍｇ抗体の濃度で、抗体タウ１およびＨＪ８．５に別々に架橋した。試料に、試料１マイクロリットル当たり目的の各配列について１０ｆｍｏｌのリン酸化タウおよび１００ｆｍｏｌの非リン酸化タウの量になるように、ＡＱＵＡペプチド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をスパイクした。タウおよびｐ－タウ濃度は、これらの内部標準を使用して計算する。可溶性タウは、洗剤（１％ＮＰ－４０）、カオトロピック試薬（５ｍＭグアニジン）およびプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ）中で免疫沈降させた。セファロースビーズにコンジュゲートした抗タウ１およびＨＪ８．５抗体は、不活化したセファロースビーズ中でそれぞれ１０倍および５倍希釈し、３０μＬの抗体ビーズの５０％スラリーを、溶液と共に室温にて９０分間回転させた。ビーズを２５ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝剤（ＴＥＡＢＣ、Ｆｌｕｋａ １７９０２）中で３回洗浄した。結合したタウを、４００ｎｇ ＭＳグレードトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ５１１１）を用いて、３７℃にて１６時間ビーズ上で消化した。消化物をＴｏｐＴｉｐ Ｃ１８（Ｇｌｙｇｅｎ、ＴＴ２Ｃ１８．９６）上にロードし、脱塩し、製造者の使用説明書に従って溶出させた。溶出させたペプチドを真空遠心分離（ＣｅｎｔｒｉＶａｐ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｌａｂｃｏｎｃｏ）により乾燥させ、２％アセトニトリルおよびＭＳグレード水中０．１％ギ酸の２５μＬの溶液中で再懸濁した。
ヒトの血液を、上記と実質的に同じ手段で処理するが、より大量の血液（例えば、約５００μＬ～約１０ｍＬ）を使用してもよい。
追加の詳細は、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１９／０３０７２５号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
ＭＴＢＲ－タウの検出および定量：試料処理
ＭＴＢＲタウ種の検出および定量のために、ＣＳＦを図４に示すように処理した。タウ１およびＨＪ８．５による免疫沈降は、上で一般に説明したとおりであった。Ｅ２８１４は、抗タウ抗体（Ｅｉｓａｉ）である。例えば、Roberts et al., Acta Neuropathol Commun, 2020, 8(1): 13を参照されたい。ＴｏｐＴｉｐ Ｃ１８を使用したトリプシン消化および脱塩を、上で一般に説明したとおりに実行した。ヒトの血液を、実質的に同じ手段で処理するが、より大量の血液（例えば、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ）を使用してもよい。
リン酸化タウおよびＭＴＢＲタウの検出および定量：質量分析
ペプチド再懸濁液の５μＬアリコートを、ＭＳ分析のためにｎａｎｏ－Ａｃｑｕｉｔｙ ＬＣに注入した。ｎａｎｏ－Ａｃｑｕｉｔｙ ＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）に、ＨＳＳ Ｔ３ ７５μｍ×１００μｍ、１．８μｍカラムを取り付け、流速０．５μＬ／分の溶液ＡおよびＢのグラジエントを使用して、ペプチドを分離した。溶液Ａを、ＭＳグレード水中０．１％ギ酸で構成し、溶液Ｂを、アセトニトリル中０．１％ギ酸で構成した。ペプチドは、２％から２０％の溶液Ｂで２８分、次いで２０％から４０％の溶液Ｂでさらに１３分、その後８５％の溶液Ｂまでさらに３分上昇させるグラジエントでカラムから溶出させて、カラムを清掃した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓは、Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘエレクトロスプレーイオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を備えていた。１０μｍ ＳｉｌｉｃａＴｉｐエミッター（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ、Ｗｏｂｕｒｎ、Ｍａ）からイオン源中へとスプレーされたペプチドイオンは、四重極子を標的化し、四重極子において単離された。これらをＨＣＤによりフラグメント化し、Ｏｒｂｉｔｒａｐでイオンフラグメントを検出した（分解能３０，０００または６０，０００、質量範囲１５０～１２００ｍ／ｚ）。ペプチドプロファイリングのための親水性ペプチド（ＳＳＲｃａｌｃ＜９、すべてロイシンなし）のモニタリングを、ＨＳＳ Ｔ３ ３００μｍ×１００μｍ、１．８ｍｍカラム、４μｌ／分の流速で行い、２％から１２％の溶液Ｂのグラジエントで溶出を発生させ、スプレーを３０ｍｍ ＳｉｌｉｃａＴｉｐエミッター上で作動させた。
一部のＭＳ遷移のリストを以下に示す。ペプチドは左の列に列挙する。命名法「Ｋ．ＩＡＴＰＲ．Ｇ」は、トリプシンペプチドがＩＡＴＰＲ（配列番号１６）であることを示す。「Ｋ．ＩＡＴＰＲ．Ｇ」における「．」は、切断部位をマークするためにソフトウェアプログラムによって使用される。
結果
ＥＹＯを予測する場合、タウバイオマーカーの最良の組合せは、すべての突然変異保持者（ＭＣ）についてのＴ２０５におけるリン酸化占有率（ｐＴ２０５／Ｔ２０５）、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比、およびＭＴＢＲ－タウ２１２であった（ｒ２＝０．６）。ｐＴ２０５／Ｔ２０５、ｐＴ２１７／Ｔ２１７、およびＭＴＢＲ－タウ２１２は無症状ＭＣに対して最良の組合せであり（ｒ２＝０．４７）、ｐＴ２０５／Ｔ２０５単独は有症状ＭＣに対して最も予測的であった（ｒ２＝０．１２）。ベースラインリン酸化占有率（ｐＴ２１７／Ｔ２１７、ｐＴ１８１／Ｔ１８１、ｐＴ１５３／Ｔ１５３、ｐＴ１１１／Ｔ１１１、ｐＴ２０５／Ｔ２０５、ｐＳ２０８／Ｓ２０８）および２つのＭＴＢＲ比（ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ２８２））は、アミロイド病変（ＰｉＢ ＰＥＴ、ＣＳＦ Ａβ４２／Ａβ４０比）と共にクラスター化されているが、一方、ＭＴＢＲ－タウは総タウおよび神経損傷／神経炎症バイオマーカー（ＹＫＬ４０、ＮＧＲＮ、ＶＩＬＩＰ１、ＳＮＡＰ２５）とより関連していた。ｐＴ１５３／Ｔ１５３の年次変化は、ＰｉＢ ＰＥＴ（－０．４３）およびＣＳＦ Ａβ４２／Ａβ４０（０．６７）の年次変化と最も高い相関を有し；一方、ｐＴ２１７／Ｔ２１７、ｐＴ１８１／Ｔ１８１、総タウ、ｐＴ１５３／Ｔ１５３、ＭＴＢＲ－３Ｒ、ｐＴ１１１／Ｔ１１１、ｐＴ２３１／Ｔ２３１、ＭＴＢＲ－タウ２７５、およびＭＴＢＲ－タウ２９９の年次変化は、認知複合の年次変化と高い相関があった（ｒ＞０．５）。
この研究は、ＡＤ進行に伴って起こる可溶性タウ関連変化の多様性をさらに強調している。重要なことに、この研究は、疾患進行および特定の非タウバイオマーカーの変化を追跡するタウ関連の病理学的変化の進行には明確な段階があることを示唆している。これらの知見は、ＡＤにおけるタウの役割および治療試験の結果を理解するのに役立つ可能性がある。これらの知見は、ＡＤの診断、予後、および処置にも活用される。非限定的な例として、これらの知見は、対象が追加の診断試験を受けるべきかどうか、および／または適切な試験（例えば、アミロイドベースのＰＥＴ、タウベースのＰＥＴなど）を選択するべきかどうかを決定するために使用することができる。別の非限定的な例として、これらの知見は、対象の疾患ステージおよび根底にある疾患病変（タウバイオマーカーによって測定される）に合わせた、対象のための治療剤もしくは治療剤のクラスを選択するために使用することができる。
［実施例５］
背景：脳タウ凝集は、アルツハイマー病（ＡＤ）の病理学的特質であり、タウ微小管結合領域（ＭＴＢＲ）は、ＡＤタウタングルのコアである。近年、Ｒ１におけるタウ残基２４３～２５４（ＭＴＢＲ－タウ２４３）、Ｒ２における２９９～３１７（ＭＴＢＲ－タウ２９９）、およびＲ４における３５４～３６９（ＭＴＢＲ－タウ３５４）が、散発性ＡＤ脳タングルに特異的に富んでいると同定された。ＣＳＦ中の対応する可溶性ＭＴＢＲ種は、タウ－ＰＥＴによって測定される臨床進行およびタウ病変と高い相関を伴って増加した。細胞外ＭＴＢＲ－タウは近年ヒトＡＤで発見されたため、ＭＴＢＲ－タウはこの領域を標的とする抗体の優先標的となっている。この研究では、これらのＭＴＢＲ－タウの変化がいつ発生したか、およびＤＩＡＮの臨床的変化、認知的変化およびバイオマーカーの変化との関係を決定しようとした。
方法：ＣＳＦ中の１２を超えるタウ種を定量するための高精度方法を開発した。ＭＴＢＲ－タウをプロファイリングするために、Ｒ２およびＲ４に対して二重エピトープである抗ＭＴＢＲ、抗体Ｅ２８１４および潜在的なタウ薬剤を使用して免疫沈降を実行した。ＤＩＡＮ観察コホートに登録された２２７名の突然変異保持者（ＭＣ）（無症状１５２名、有症状７７名）および非保持者１４１名からのＣＳＦを分析した。
結果：ＣＳＦＭＴＢＲ－タウは、ＭＣにおいて特異的に増加し、異なる時点で変化した。Ｒ２におけるＭＴＢＲ－タウ２９９の変化は、推定症状発症年（ＥＹＯ）－２２で発生し、ｐ－タウ２１７占有率の変化が最初に検出された（ＥＹＯ－２１）のに近かった。Ｒ４におけるＭＴＢＲ－タウ３５４の増加は、潜在的に脳タングルへの沈着が原因で、臨床ステージ後期には飽和した。特に、タウの病態生理を再現するＭＴＢＲ－タウ２９９／３５４の比は、特に無症状ＭＣにおいて、初期アミロイドマーカーであるｐ－タウ２１７占有率と高度に相関しており（ｒ＝０．８２）、これは、タウ－ＰＥＴ陰性集団における抗ＭＴＢＲ療法を評価するためのバイオマーカーとしてのＭＴＢＲ－タウおよびｐ－タウ２１７を示している。
結論：発明者らは、症状発症の何年も前から変化があり、症状ステージまで継続するタウタングルの可溶性尺度であるＭＴＢＲ種を同定し、Ｅ２８１４などの抗ＭＴＢＲ－タウ抗体を用いて早期介入を実施し得ることを示唆した。最後に、発明者らは、これらの結果を利用して、無症状および有症状保持者の独立したコホートにおける可溶性ＭＴＢＲ－タウを標的とする、ＤＩＡＮ試験ユニット（ＤＩＡＮ－ＴＵ）Ｅ２８１４薬物におけるタウ次世代プラットフォームを設計した。散発性ＡＤおよびＤＩＡＤでは、ＣＳＦの「Ｅ２８１４関連」ＭＴＢＲが、ＡＤにおいて特異的に増加した。ＡＤ連続体全体におけるＥ２８１４関連ＭＴＢＲ－タウプロファイルは、ｓＡＤとＤＩＡＤの間で類似しているように見える。ｓＡＤおよびＤＩＡＤの初期ステージ（前臨床ステージ）（－２０ＥＹＯ）での増加。Ｅ２８１４関連ＭＴＢＲのレベルは、ＡＤ発症後に低下する（ＣＤＲ＞１、ＥＹＯ＞０）。ＭＴＢＲ－２６０（後期Ｒ１）、２７０（初期Ｒ２）、２８２（中期Ｒ２）、および２９９（Ｒ２～Ｒ３）では、Ｅ２８１４関連ＭＴＢＲ－タウレベルはＣＸレベルとよく相関している。ＭＴＢＲ－２４３（Ｒ１上流）および３５４（Ｒ４）では、Ｅ２８１４関連ＭＴＢＲタウレベルとＣＸレベルの相関は低く、これは潜在的にＭＴＢＲ切断および脳内のタウ凝集への動員が原因である。Ｅ２８１４－ＩＰ研究により、ＣＳＦＭＴＢＲ－タウには複数の切断部位、例えば２５４（Ｒ１上流）～２６０（初期Ｒ１）および３５４（Ｒ４）～３８６（Ｃ末端）が存在することが明らかになった。長期的評価により、ＭＴＢＲ－タウ２９９および３５４がＡＤ発症前に増加するが、一方、ＡＤ発症後に減少する特異的軌跡が明らかになった（→脳タウ凝集体の反映）。ＭＴＢＲ－２９９／３５４の比を考慮する場合、ＣＳＦ中の「Ｅ２８１４関連ＭＴＢＲ－タウ」はＡＤにおける認知尺度を予測することができる。ＣＳＦ中の「Ｅ２８１４関連ＭＴＢＲ－タウ」は、ＭＴＢＲ－２９９／３５４の比を考慮する場合、「初期ステージＡＤ」のみにおけるタウ病変（タウ－ＰＥＴ）を再現する。

Claims (39)

  1. アルツハイマー病の認知症状または挙動症状を伴わない対象において認知症発症までの時間を測定する方法であって、
    （ａｉ）前記対象から得られた血液試料またはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、および適宜ＭＴＢＲ－タウ２１２、残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率 ＭＴＢＲ－タウ２４３、ＭＴＢＲ－タウ３Ｒ、もしくはそれらの組合せを測定すること、または
    （ａｉｉ）前記対象から得られた血液試料もしくはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、残基Ｔ２１７におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること；ならびに
    （ｂ）（ａｉ）もしくは（ａｉｉ）の前記測定値を使用して、認知症発症までの時間を計算することであって、認知症発症までの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価までの年数である、計算すること
    を含む方法。
  2. アルツハイマー病の認知症状または挙動症状を伴わない対象において認知症発症までの時間を測定する方法であって、
    （ａ）前記対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理してタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得し、次いで、枯渇試料を処理してタウ種の第２の集団を取得することであって、
    タウ種の前記第１の集団にはＮ末端タウおよび／またはｍｉｄドメインタウが濃縮されており、
    濃縮されたタウ種の前記第２の集団にはＭＴＢＲ－タウが濃縮されている、取得すること；
    （ｂｉ）タウ種の前記第１の集団における残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の前記第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、および適宜、タウ種の前記第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること、または
    （ｂｉｉ）タウ種の前記第１の集団における残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の第１の集団における残基Ｔ２１７におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の前記第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること；ならびに
    （ｃ）（ｂｉ）もしくは（ｂｉｉ）の前記測定値を使用して認知症発症までの時間を計算することであって、認知症発症までの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価までの年数である、計算すること
    を含む方法。
  3. 前記対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理して、濃縮されたタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得することが、
    前記血液試料もしくは前記ＣＳＦ試料を、タウの前記Ｎ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または
    前記血液試料もしくは前記ＣＳＦ試料を、タウの前記ｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または
    前記血液試料もしくは前記ＣＳＦ試料を、タウの前記Ｎ末端内のエピトープに特異的に結合する第１のエピトープ結合剤およびタウの前記ｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させることであって、前記第１および第２のエピトープ結合剤を順次にまたは同時に使用する、接触させること
    を含み；
    タウの前記Ｎ末端内のエピトープに特異的に結合する前記エピトープ結合剤は、ＨＪ８．５、またはＨＪ８．５と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよく、タウの前記ｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する前記エピトープ結合剤は、タウ１、またはタウ１と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよい、請求項２に記載の方法。
  4. 前記枯渇試料を処理して、濃縮されたタウ種の第２の集団を取得することは、
    ＭＴＢＲ－タウ種を濃縮するための化学抽出工程を実行することであって、
    前記化学抽出工程は、酸を混合して前記枯渇試料のタンパク質を沈殿させることであって、前記酸は過塩素酸であってもよく、前記沈殿したタンパク質の除去後の上清中に前記ＭＴＢＲ－タウ種が存在している、沈殿させることを含んでもよい、実行すること；あるいは、
    前記枯渇試料を、タウの前記ＭＴＢＲ内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させることであって、
    前記エピトープ結合剤は、Vandermeeren et al., J Alzheimers Dis, 2018, 65:265-281に記載の７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、もしくはＰＴ７６、またはRoberts et al., Acta Neuropathol Commun, 2020, 8: 13に記載の７Ｇ６、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６の抗原結合フラグメント、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６と同じエピトープに特異的に結合する他のエピトープ結合剤であってもよい、接触させること
    を含む、請求項２に記載の方法。
  5. 前記対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理して、濃縮されたタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得することが、
    前記血液試料もしくは前記ＣＳＦ試料を、タウの前記Ｎ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または
    前記血液試料もしくは前記ＣＳＦ試料を、タウの前記ｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または
    前記血液試料もしくは前記ＣＳＦ試料を、タウの前記Ｎ末端内のエピトープに特異的に結合する第１のエピトープ結合剤およびタウの前記ｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させることであって、前記第１および第２のエピトープ結合剤を順次にもしくは同時に使用する、接触させること
    を含み
    タウの前記Ｎ末端内のエピトープに特異的に結合する前記エピトープ結合剤は、ＨＪ８．５、もしくはＨＪ８．５と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよく、タウの前記ｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する前記エピトープ結合剤は、タウ１、もしくはタウ１と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよく；ならびに
    前記枯渇試料を処理して、濃縮されたタウ種の第２の集団を取得することは、
    ＭＴＢＲ－タウ種を濃縮するための化学抽出工程を実行することであって、
    前記化学抽出工程は、酸を混合して枯渇試料のタンパク質を沈殿させることであって、前記酸は過塩素酸であってもよく、沈殿したタンパク質の除去後の上清中に前記ＭＴＢＲ－タウ種が存在している、沈殿させることを含んでもよい、実行すること；あるいは、
    前記枯渇試料を、タウの前記ＭＴＢＲ内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させることであって、
    前記エピトープ結合剤は、Vandermeeren et al., J Alzheimers Dis, 2018, 65:265-281に記載の７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、もしくはＰＴ７６、またはRoberts et al., Acta Neuropathol Commun, 2020, 8: 13に記載の７Ｇ６、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６の抗原結合フラグメント、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６と同じエピトープに特異的に結合する他のエピトープ結合剤であってもよい、接触させること
    を含む、請求項２に記載の方法。
  6. 前記対象は、ＣＤＲがゼロである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 対象の疾患進行をステージ分類するための、請求項１から６のいずれか一項に記載の認知症発症までの時間の測定値の使用。
  8. 対象の脳病変をステージ分類するための、請求項１から６のいずれか一項に記載の認知症発症までの時間の測定値の使用。
  9. 対象に対する治療剤または診断剤を選択するための、請求項１から６のいずれか一項に記載の認知症発症までの時間の測定値の使用。
  10. アルツハイマー病の認知症状または挙動症状を伴わない対象を処置するための方法であって、前記対象に請求項９に記載の治療剤または診断剤を投与することを含む方法。
  11. 前記診断剤がタウＰＥＴトレーサーであり、前記タウＰＥＴトレーサーが、フロルタウシピル（Ｌｉｌｌｙ）、ＭＫ－６２４０（Ｃｅｒｖｅａｕ）、ＰＩ－２６２０（Ｌｉｆｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ）、ＲＯ－９４８（Ｒｏｃｈｅ）、ＧＰＴ１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＪＮＪ－０６７（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＪＮＪ－６４３４９３１１（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＡＰＮ－１６０７、ＳＮＦＴ－１（Ｔｏｋｏｈｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ＰＭ－ＰＢＢ３、ＡＶ１４５１、ＴＨＫ５３５１、およびＴＨＫ５３１７、からなる群から選択されていてもよい、請求項９に記載の使用または請求項１０に記載の方法。
  12. 前記診断剤がＡβＰＥＴトレーサーであり、前記ＡβＰＥＴトレーサーが、ＦＤＤＮＰ、ＡＶ－４５、ＧＥ０６７、ＢＡＹ９４－９１７２、ＰＩ、ＧＤＦ、ＮａＦ、ｐ５＋１４、フロルベタピル、フロルベタベン、およびフルテメタモール、からなる群から選択される、請求項９に記載の使用または請求項１０に記載の方法。
  13. 前記治療剤が、Ａβ産生を低減させるか、Ａβ凝集を防止するかもしくはそれに拮抗させるか、または脳のＡβクリアランスを増大させ、前記治療剤が、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、受動免疫療法（限定されるものではないが、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、もしくは抗ＡｐｏＥ抗体を含む）、または能動免疫療法であってもよい、請求項９に記載の使用または請求項１０に記載の方法。
  14. 前記治療剤が、タウの凝集を防止するかまたはそれに拮抗し、神経原線維変化クリアランスを増大させ、タウのリン酸化パターンを変化させ、前記治療剤が、タウタンパク質凝集阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、受動免疫療法（限定されるものではないが、抗タウ抗体を含む）、または能動免疫療法であってもよい、請求項９に記載の使用または請求項１０に記載の方法。
  15. 前記治療剤が、ガンマセクレターゼ阻害剤またはベータセクレターゼ阻害剤である、請求項９に記載の使用または請求項１０に記載の方法。
  16. 前記治療剤が、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、または抗ＡｐｏＥ抗体である、請求項９に記載の使用または請求項１０に記載の方法。
  17. アルツハイマー病の認知症状または行動症状を有する対象において認知症発症からの時間を測定するための方法であって、
    （ａｉ）前記対象から得られた血液試料またはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、ＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、および適宜ＭＴＢＲ－タウ２１２、残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率 ＭＴＢＲ－タウ２４３、ＭＴＢＲ－タウ３Ｒ、もしくはそれらの組合せを測定すること、または
    （ａｉｉ）前記対象から得られた血液試料もしくはＣＳＦ試料中の残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、タウの残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率を測定すること、およびＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること；ならびに
    （ｂ）（ａｉ）もしくは（ａｉｉ）の前記測定値を使用して、認知症発症からの時間を計算することであって、認知症発症からの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価からの年数である、計算すること
    を含む方法。
  18. アルツハイマー病の認知症状または行動症状を有する対象において認知症発症からの時間を測定するための方法であって、
    （ａ）前記対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理してタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得し、次いで、前記枯渇試料を処理してタウ種の第２の集団を取得することであって、
    タウ種の前記第１の集団にはＮ末端タウおよび／またはｍｉｄドメインタウが濃縮されており、
    濃縮されたタウ種の前記第２の集団にはＭＴＢＲ－タウが濃縮されている、取得すること；
    （ｂｉ）タウ種の前記第１の集団における残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の前記第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２９９／ＭＴＢＲ－タウ３５４比を測定すること、および適宜、タウ種の前記第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること、または
    （ｂｉｉ）タウ種の前記第１の集団における残基Ｔ２０５におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の第１の集団におけるタウの残基Ｔ２１７におけるリン酸化占有率を測定すること、およびタウ種の前記第２の集団におけるＭＴＢＲ－タウ２１２を測定すること；ならびに
    （ｃ）（ｂｉ）もしくは（ｂｉｉ）の測定値を使用して認知症発症からの時間を計算することであって、認知症発症からの時間は、ゼロより大きい臨床認知症評価からの年数である、計算すること
    を含む方法。
  19. 前記対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理して、濃縮されたタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得することが、
    前記血液試料もしくは前記ＣＳＦ試料を、タウの前記Ｎ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または
    前記血液試料もしくは前記ＣＳＦ試料を、タウの前記ｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または
    前記血液試料もしくは前記ＣＳＦ試料を、タウの前記Ｎ末端内のエピトープに特異的に結合する第１のエピトープ結合剤およびタウの前記ｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させることであって、前記第１および第２のエピトープ結合剤を順次にまたは同時に使用する、接触させること
    を含み；
    タウの前記Ｎ末端内のエピトープに特異的に結合する前記エピトープ結合剤は、ＨＪ８．５、またはＨＪ８．５と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよく、タウの前記ｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する前記エピトープ結合剤は、タウ１、またはタウ１と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよい、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記枯渇試料を処理して、濃縮されたタウ種の第２の集団を取得することは、
    ＭＴＢＲ－タウ種を濃縮するための化学抽出工程を実行することであって、
    前記化学抽出工程は、酸を混合して前記枯渇試料のタンパク質を沈殿させることであって、前記酸は過塩素酸であってもよく、前記沈殿したタンパク質の除去後の上清中に前記ＭＴＢＲ－タウ種が存在している、沈殿させることを含んでもよい、実行すること；あるいは、
    前記枯渇試料を、タウの前記ＭＴＢＲ内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させることであって、
    前記エピトープ結合剤は、Vandermeeren et al., J Alzheimers Dis, 2018, 65:265-281に記載の７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、もしくはＰＴ７６、またはRoberts et al., Acta Neuropathol Commun, 2020, 8: 13に記載の７Ｇ６、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６の抗原結合フラグメント、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６と同じエピトープに特異的に結合する他のエピトープ結合剤であってもよい、接触させること
    を含む、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記対象からの血液試料またはＣＳＦ試料を処理して、濃縮されたタウ種の第１の集団および枯渇試料を取得することが、
    前記血液試料もしくは前記ＣＳＦ試料を、タウの前記Ｎ末端内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または
    前記血液試料もしくは前記ＣＳＦ試料を、タウの前記ｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させること、または
    前記血液試料もしくは前記ＣＳＦ試料を、タウの前記Ｎ末端内のエピトープに特異的に結合する第１のエピトープ結合剤およびタウの前記ｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する第２のエピトープ結合剤と接触させることであって、前記第１および第２のエピトープ結合剤を順次にもしくは同時に使用する接触させること
    を含み、
    タウの前記Ｎ末端内のエピトープに特異的に結合する前記エピトープ結合剤は、ＨＪ８．５、もしくはＨＪ８．５と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよく、タウの前記ｍｉｄドメイン内のエピトープに特異的に結合する前記エピトープ結合剤は、タウ１、もしくはタウ１と同じエピトープに特異的に結合する別のエピトープ結合剤であってもよく、ならびに
    前記枯渇試料を処理して、濃縮されたタウ種の第２の集団を取得することは、
    ＭＴＢＲ－タウ種を濃縮するための化学抽出工程を実行することであって、
    前記化学抽出工程は、酸を混合して枯渇試料のタンパク質を沈殿させることであって、前記酸は過塩素酸であってもよく、前記沈殿したタンパク質の除去後の上清中にＭＴＢＲ－タウ種が存在している、沈殿させることを含んでもよい、実行すること；あるいは、
    前記枯渇試料を、タウの前記ＭＴＢＲ内の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するエピトープ結合剤と接触させることであって、
    前記エピトープ結合剤は、Vandermeeren et al., J Alzheimers Dis, 2018, 65:265-281に記載の７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、もしくはＰＴ７６、またはRoberts et al., Acta Neuropathol Commun, 2020, 8: 13に記載の７Ｇ６、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６の抗原結合フラグメント、または７７Ｇ７、ＲＤ３、ＲＤ４、ＵＣＢ１０１７、ＰＴ７６もしくは７Ｇ６と同じエピトープに特異的に結合する他のエピトープ結合剤であってもよい、接触させること
    を含む、請求項１８に記載の方法。
  22. 前記対象は、ＣＤＲが０．５以上、ＣＤＲが１以上、またはＣＤＲが２以上である、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 対象の疾患進行をステージ分類するための、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の認知症発症までの時間の測定値の使用。
  24. 対象の脳病変をステージ分類するための、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の認知症発症までの時間の測定値の使用。
  25. 対象に対する治療剤または診断剤を選択するための、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の認知症発症までの時間の測定値の使用。
  26. アルツハイマー病の認知症状または挙動症状を伴わない対象を処置するための方法であって、前記対象に請求項２５に記載の治療剤または診断剤を投与することを含む方法。
  27. 前記診断剤がタウＰＥＴトレーサーであり、前記タウＰＥＴトレーサーが、フロルタウシピル（Ｌｉｌｌｙ）、ＭＫ－６２４０（Ｃｅｒｖｅａｕ）、ＰＩ－２６２０（Ｌｉｆｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ）、ＲＯ－９４８（Ｒｏｃｈｅ）、ＧＰＴ１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＪＮＪ－０６７（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＪＮＪ－６４３４９３１１（Ｊａｎｓｓｅｎ）、ＡＰＮ－１６０７、ＳＮＦＴ－１（Ｔｏｋｏｈｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ＰＭ－ＰＢＢ３、ＡＶ１４５１、ＴＨＫ５３５１、およびＴＨＫ５３１７、からなる群から選択されていてもよい、請求項２５に記載の使用または請求項２６に記載の方法。
  28. 前記診断剤がＡβＰＥＴトレーサーであり、前記ＡβＰＥＴトレーサーが、からなる群から選択される、請求項２５に記載の使用または請求項２６に記載の方法。
  29. 前記治療剤が、Ａβ産生を低減させるか、Ａβ凝集を防止するかもしくはそれに拮抗させるか、または脳のＡβクリアランスを増大させ、前記治療剤が、ガンマ－セクレターゼ阻害剤、ベータ－セクレターゼ阻害剤、受動免疫療法（限定されるものではないが、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、もしくは抗ＡｐｏＥ抗体を含む）、または能動免疫療法であってもよい、請求項２５に記載の使用または請求項２６に記載の方法。
  30. 前記治療剤が、タウの凝集を防止するかまたはそれに拮抗し、神経原線維変化クリアランスを増大させ、タウのリン酸化パターンを変化させ、前記治療剤が、タウタンパク質凝集阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ活性化剤、受動免疫療法（限定されるものではないが、抗タウ抗体を含む）、または能動免疫療法であってもよい、請求項２５に記載の使用または請求項２６に記載の方法。
  31. 前記治療剤が、ガンマセクレターゼ阻害剤またはベータ－セクレターゼ阻害剤である、請求項２５に記載の使用または請求項２６に記載の方法。
  32. 前記治療剤が、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、または抗ＡｐｏＥ抗体である、請求項２５に記載の使用または請求項２６に記載の方法。
  33. 前記治療剤が、抗Ａβ抗体、抗タウ抗体、または抗ＡｐｏＥ抗体である、請求項２５に記載の使用または請求項２６に記載の方法。
  34. 前記治療剤が、コリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、または抗炎症剤である、請求項２５に記載の使用または請求項２６に記載の方法。
  35. 対象における認知の変化を測定するための方法であって、
    （ａ）対象から得た血液試料またはＣＳＦ試料中のＴ１１１、Ｔ１５３、Ｔ１８１、Ｔ２１７およびＴ２３１から選択される１つまたは複数の残基におけるタウのリン酸化占有率を測定すること、および
    前記対象から得た血液試料またはＣＳＦ試料中のＭＴＢＲ－タウ２７５、ＭＴＢＲ－タウ２９９、およびＭＴＢＲ－３Ｒのうちの少なくとも１つを測定すること、および
    適宜、前記対象から得た血液試料またはＣＳＦ試料中の総タウを測定すること；ならびに
    （ｂ）（ａ）の測定値を使用して認知における変化を計算すること
    を含む方法。
  36. 前記認知における変化が、国際ショッピングリスト試験（ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｈｏｐｐｉｎｇ Ｌｉｓｔ Ｔｅｓｔ）による遅延想起スコア、ウェクスラー記憶検査法（Ｗｅｃｈｓｌｅｒ Ｍｅｍｏｒｙ Ｓｃａｌｅ－Ｒｅｖｉｓｅｄ）による論理記憶遅延再生スコア、ウェクスラー成人知能検査法（Ｗｅｃｈｓｌｅｒ Ａｄｕｌｔ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ Ｓｃａｌｅ－Ｒｅｖｉｓｅｄ）による数字記号コード化試験（Ｄｉｇｉｔ Ｓｙｍｂｏｌ Ｃｏｄｉｎｇ ｔｅｓｔ）総スコア、およびＭＭＳＥ総スコア、からなる認知複合スコアによって測定される認知における変化と同等である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記対象はＣＤＲがゼロである、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
  38. 前記対象はＣＤＲが０．５以上である、請求項３５または請求項３５に記載の方法。
  39. 治療剤の有効性を評価するための、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の認知における変化の測定値の使用。
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