JP7439962B2 - 分析方法 - Google Patents
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Description
本発明は、分析方法に関する。
アルツハイマー病の発症において、アミロイド前駆タンパク質(APP;Amyloid precursor protein)の切断によって生じるアミロイドβ(Aβ)などのAβ関連ペプチドが深く関わっている。そして、免疫沈降法および質量分析法を組み合わせて血液内の複数のAβ関連ペプチドを検出し、検出した特定のAβ関連ペプチド比が、脳内アミロイド蓄積の血液バイオマーカーとして有望であることが報告されている(非特許文献1、非特許文献2)。
血液試料中のAβ関連ペプチドを測定する方法として、例えば、抗体固定化担体と試料中のペプチドとを結合させる工程と、これらの結合体を洗浄する工程と、有機溶媒含有酸性水溶液を用いて抗体固定化担体からペプチドを解離させる工程と、解離したペプチドを質量分析により検出する工程とを備える方法が開示されている(特許文献1、特許文献2)。特許文献1および特許文献2の測定方法では、試料中にペプチドが微量にしか存在しない場合であっても検出することができる。
Kaneko N, Nakamura A, Washimi Y, Kato T, Sakurai T, Arahata Y, Bundo M, Takeda A, Niida S, Ito K, Toba K, Tanaka K, Yanagisawa K. : Novel plasma biomarker surrogating cerebral amyloid deposition. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2014;90(9):353-364.
Nakamura A, Kaneko N, Villemagne VL, Kato T, Doecke J, Dore V, Fowler C, Li QX, Martins R, Rowe C, Tomita T, Matsuzaki K, Ishii K, Ishii K, Arahata Y, Iwamoto S, Ito K, Tanaka K, Masters CL, Yanagisawa K. : High performance plasma amyloid-β biomarkers for Alzheimer's disease. Nature. 2018;554(7691):249-254.
ところで、免疫沈降法によって夾雑物質を取り除いて分析対象物質のみを溶出させた溶出液を、質量分析法で測定する際に、溶出液中の分析対象物質の濃度(濃縮度)が高いほど、すなわち、溶出液の使用量が少ないほど、質量分析法で検出される分析対象物質のシグナル強度が強くなるため、高感度な分析が可能となる。その一方、質量分析法に供されるサンプル数、すなわち、質量分析結果(マススペクトル)の数は、複数であることが、分析精度の観点から望ましい。
そのため、分析対象物質を高濃度となるように少量の溶出液で溶出し、その少量の溶出液を複数のサンプル数に分けて質量分析用の測定プレートに配置することが試みられる。しかしながら、このような測定を、日時・場所などの環境を変更して複数回実施したところ、溶出液の量が不足し、所望数のサンプル結果(マススペクトル)よりも少なくなる場合が生じてデータ数が減り、精度が低下する不具合が生じる。その一方、上記不具合を回避すべく、溶出液の量を多くしてマージンを作りすぎてしまうと、高濃度で溶出できず、高感度での分析ができない不具合が生じる。
本発明は、質量分析法を用いて分析する際に、分析対象物質を高感度かつ高精度で検出することを目的とする。
本発明の第1の態様の分析方法は、湿度を測定する湿度測定工程と、分析対象物質を含有する試料を担体に接触させて、前記担体に前記分析対象物質を結合させる結合工程と、前記分析対象物質が結合した前記担体に、揮発性有機溶媒を含有する溶出液を接触させて、前記溶出液に前記分析対象物質を溶出させる溶出工程と、前記分析対象物質が溶出した前記溶出液を質量分析用の測定プレートに配置する配置工程と、前記分析対象物質を質量分析法にて検出する検出工程とを備える。前記溶出工程において、前記湿度に応じて、前記溶出液の使用量を決定する。
本発明の第1の態様によれば、分析対象物質を高感度かつ高精度で検出することができる。
1.第1の態様
本発明の第1の態様の分析方法として、分析対象物質としてポリペプチド、試料として生体試料、質量分析法としてMALDI(Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization;マトリックス支援レーザー脱離イオン化法)を採用した際の分析方法を説明する。
本発明の第1の態様の分析方法として、分析対象物質としてポリペプチド、試料として生体試料、質量分析法としてMALDI(Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization;マトリックス支援レーザー脱離イオン化法)を採用した際の分析方法を説明する。
第1の態様の分析方法は、湿度測定工程と、第1結合工程(本発明の「結合工程」の一例)と、第1洗浄工程と、第1溶出工程と、中性化工程と、第2結合工程と、第2洗浄工程と、第2溶出工程(本発明の「溶出工程」の一例)と、配置工程と、検出工程とを備える。
第1の態様の分析測定対象である「ポリペプチド」には、「ペプチド」、「タンパク質」も含まれる。ポリペプチドには、種々のものが含まれ、具体的には、Aβ関連ペプチドが挙げられる。Aβ関連ペプチドは、アミロイド前駆タンパク質(APP;Amyloid precursor protein)が切断されることにより生じるAβ、および、Aβの配列を一部でも含むペプチドである。具体的には、実施例において示されており、また、WO2015/178398にも開示されている。
(湿度測定工程)
湿度測定工程では、湿度を測定する。具体的には、後述する第2溶出工程および配置工程が実施される分析空間(室内)の湿度を測定する。一般的にこれらは同一空間で実施されるが、異なっている場合は、各空間の湿度を測定し、第2溶出工程開始直後から、溶出液が測定プレートに配置されるまでの時間で按分した平均湿度とすればよい。
湿度測定工程では、湿度を測定する。具体的には、後述する第2溶出工程および配置工程が実施される分析空間(室内)の湿度を測定する。一般的にこれらは同一空間で実施されるが、異なっている場合は、各空間の湿度を測定し、第2溶出工程開始直後から、溶出液が測定プレートに配置されるまでの時間で按分した平均湿度とすればよい。
(第1結合工程)
第1結合工程では、生体試料を第1担体(本発明の「担体」の一例)に接触させる。例えば、生体試料を第1担体と混合する。これにより、第1担体にポリペプチドが結合して、第1結合体が得られる。
第1結合工程では、生体試料を第1担体(本発明の「担体」の一例)に接触させる。例えば、生体試料を第1担体と混合する。これにより、第1担体にポリペプチドが結合して、第1結合体が得られる。
生体試料としては、例えば、血液、脳脊髄液、尿、体分泌液、唾液、痰などの体液;例えば、糞便などが挙げられる。血液試料には、全血、血漿、血清などが含まれる。血液試料は、個体から採取された全血に、遠心分離、冷凍保存などの処理がなされたものであってよい。
生体試料は、通常、結合溶液と混合した状態で、第1担体に接触させる。
結合溶液としては、通常の免疫沈降法で用いられる結合溶液を用いることができる。好ましくは、結合溶液は、界面活性剤を含有する中性緩衝液が挙げられる。界面活性剤を含有することにより、非特異的吸着を抑制することができる。
界面活性剤としては、タンパク質変性の抑制、除去容易性などの観点から、好ましくは、中性界面活性剤が挙げられる。中性界面活性剤としては、例えば、n-デシル-β-D-マルトシド(DM:n-Decyl-β-D-maltoside)、n-ドデシル-β-D-マルトシド(DDM:n-Dodecyl-β-D-maltoside)、n-ノニル-β-D-チオマルトシド(NTM:n-Nonyl-β-D-thiomaltoside)などの、マルトースを親水性部分に有する界面活性剤;α-D-グルコピラノシルα-D-グルコピラノシド モノオクタノエート(トレハロースC8)、α-D-グルコピラノシルα-D-グルコピラノシド モノドデカノエート(トレハロースC12)、α-D-グルコピラノシルα-D-グルコピラノシド モノミリステート(トレハロースC14)などの、トレハロースを親水性部分に有する界面活性剤;n-オクチル-β-D-チオグルコシド、n-オクチル-β-D-グルコシド、n-へプチル-β-D-チオグルコシドなどの、グルコースを親水性部分に有する界面活性剤などが挙げられる。これらは、1種単独で用いることができ、または、2種以上を併用することができる。
緩衝液としては、例えば、Tris緩衝液、リン酸緩衝液、HEPES緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液などが挙げられる。緩衝液のpHは、例えば、6.5以上、8.5以下である。
結合溶液中の界面活性剤濃度は、例えば、0.001%(w/v)以上、好ましくは、0.05%(w/v)以上であり、また、例えば、10%(w/v)以下、好ましくは、2%(w/v)以下である。
第1担体は、ポリペプチドが結合可能なものであればよく、例えば、抗体固定化担体が挙げられる。
第1担体に固定化されている抗体は、ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を有していればよく、例えば、ポリペプチドを認識可能な抗原結合部位を有する免疫グロブリンまたはその断片が挙げられる。
免疫グロブリンとしては、例えば、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA、IgY、IgD、IgEなどが挙げられる。免疫グロブリンは、分析対象物質に応じて適宜決定され、公知のものを採用すればよい。免疫グロブリン断片としては、例えば、F(ab’)2、F(ab’)、F(ab)、Fd、Fv、L鎖、H鎖などが挙げられる。分析対象物質がAβ関連ペプチドとする場合、Aβ関連ペプチドを認識可能な抗原結合部位を有する免疫グロブリンまたはその断片(抗Aβ関連ペプチド抗体)は、例えば、6E10、4G8、1E11、11A50-B10、12F4、9C4、82E1、12B2、1A10およびこれらの断片などである。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよい。
第1担体の材質としては、例えば、アガロース、セファロース、デキストラン、シリカゲル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、(メタ)アクリル酸系ポリマー、フッ素樹脂、金属錯体樹脂、ガラス、金属、磁性体などが挙げられる。後述する第1溶出工程や第2溶出工程において、磁力によって容易に担体のみを抽出でき、かつ、担体取り出し時に溶出液の減少を抑制できる観点から、好ましくは、磁性体が挙げられる。
第1担体の形状としては、球状(ビーズ形状を含む)、板状、針状、不定形などのいずれの形状であってもよく、また、マイクロデバイス内の流路壁などであってもよい。
第1結合工程の前に、必要に応じて、IgG、IgMなどの抗体を除去する前処理などを実施してもよい。
(第1洗浄工程)
第1洗浄工程では、第1結合工程の後において、洗浄液を用いて第1結合体を洗浄する。
第1洗浄工程では、第1結合工程の後において、洗浄液を用いて第1結合体を洗浄する。
洗浄方法は、公知の方法を採用すればよく、好ましくは、複数回洗浄を実施する。例えば、界面活性剤を含有する中性緩衝液を用いて洗浄し、続いて、界面活性活性剤を含有しない中性緩衝液を用いて洗浄する。
界面活性剤を含有する中性緩衝液としては、結合溶液で例示した界面活性剤および中性緩衝液と同様のものを使用することができる。これにより、例えば、疎水性の高い不要成分(血中タンパク質、脂質、糖脂質など)を効果的に除去することができる。
界面活性剤を含有しない中性緩衝液も、結合溶液で例示した中性緩衝液と同様のものを使用することができる。これにより、界面活性剤が第1結合体に残存することによる泡立ちを抑制することができる。
洗浄方法としては、一般的な方法を採用すればよく、例えば、洗浄液内で担体を攪拌する方法、洗浄ノズルから洗浄液を噴射する方法などが挙げられる。
これら中性緩衝液による洗浄後に、必要に応じて、水による洗浄をさらに実施してもよい。
(第1溶出工程)
第1溶出工程では、第1洗浄工程の後において、第1結合体を第1溶出液に接触させる。これにより、第1結合体からポリペプチドが解離して、第1溶出液にポリペプチドが溶出する。
第1溶出工程では、第1洗浄工程の後において、第1結合体を第1溶出液に接触させる。これにより、第1結合体からポリペプチドが解離して、第1溶出液にポリペプチドが溶出する。
第1溶出液は、ポリペプチドを溶出するための液体であって、例えば、グリシン緩衝液、塩酸などの酸性水溶液を用いる。第1溶出液のpHは、例えば、1.0以上、3.5以下である。
第1溶出液は、好ましくは、界面活性剤を含有する。これにより、第1結合体からポリペプチドをより確実に解離させることができる。また、溶出されたポリペプチドが、試験管、マイクロプレートなどの容器に付着することを抑制する。したがって、ポリペプチドの回収率を確実に向上させることができる。
界面活性剤としては、結合溶液で例示した界面活性剤と同様のものが挙げられる。第1溶出液中の界面活性剤濃度は、例えば、0.001%(w/v)以上、好ましくは、0.05%(w/v)以上であり、また、例えば、10%(w/v)以下、好ましくは、2%(w/v)以下である。
(中性化工程)
中性化工程では、第1溶出工程の後において、ポリペプチドが溶出した第1溶出液を中性化する。これにより、ポリペプチドを含有する精製溶液が得られる。
中性化工程では、第1溶出工程の後において、ポリペプチドが溶出した第1溶出液を中性化する。これにより、ポリペプチドを含有する精製溶液が得られる。
中性化方法としては、例えば、第1溶出液を中性緩衝液と混合する。好ましくは、第1溶出液を、界面活性剤を含有する中性緩衝液と混合する。
中性緩衝液および界面活性剤としては、結合溶液で例示した中性緩衝液および界面活性剤と同様のものが挙げられる。
精製溶液のpHは、例えば、pH6.0以上、好ましくは、6.5以上であり、また、例えば、8.5以下、好ましくは、8.0以下である。これにより、第2結合工程において、結合効率を向上させることができる。
(第2結合工程)
第2結合工程では、中性化工程の後において、精製溶液を第2担体に接触させる。これにより、第2担体にポリペプチドが結合して、第2結合体が得られる。
第2結合工程では、中性化工程の後において、精製溶液を第2担体に接触させる。これにより、第2担体にポリペプチドが結合して、第2結合体が得られる。
第2担体としては、好ましくは、抗体固定化担体であり、具体的には、第1担体で例示した抗体固定化担体と同様のものが挙げられる。
(第2洗浄工程)
第2洗浄工程では、第2結合工程の後において、洗浄液を用いて第2結合体を洗浄する。洗浄方法は、公知の方法を採用すればよく、具体的には、第1洗浄工程で例示した洗浄方法と同様の方法を実施すればよい。
第2洗浄工程では、第2結合工程の後において、洗浄液を用いて第2結合体を洗浄する。洗浄方法は、公知の方法を採用すればよく、具体的には、第1洗浄工程で例示した洗浄方法と同様の方法を実施すればよい。
(第2溶出工程)
第2溶出工程では、第2洗浄工程の後において、第2結合体を第2溶出液に接触させる。これにより、第2結合体からポリペプチドが解離して、第2溶出液にポリペプチドが溶出する。
第2溶出工程では、第2洗浄工程の後において、第2結合体を第2溶出液に接触させる。これにより、第2結合体からポリペプチドが解離して、第2溶出液にポリペプチドが溶出する。
第2溶出液は、ポリペプチドを溶出するための液体であって、例えば、グリシン緩衝液、塩酸などの酸性水溶液を用いる。第2溶出液のpHは、例えば、1.0以上、3.5以下である。
第2溶出液は、揮発性有機溶媒を含有する。これにより、第2結合体からポリペプチドを効率よく解離させ、第2溶出液に溶出させることができ、ポリペプチドの回収率を向上させることができる。
このような揮発性有機溶媒としては、水と任意の割合で混和する有機溶媒が挙げられ、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、トルエン、イソプロパノール、ヘキサン、ブタノール、シクロヘキサン、エチレングリコール、ベンゼン、クロロホルム、アセトアルデヒド、トリエチルアミン、フェノール、ナフタレン、ホルムアルデヒド、テトラヒドロフラン、酢酸エチルなどが挙げられ、好ましくは、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどが挙げられる。これらは、1種単独で用いることができ、または、2種以上併用してもよい。
第2溶出液中の揮発性有機溶媒濃度は、例えば、10%(v/v)以上、好ましくは、30%(v/v)以上、より好ましくは、55%(v/v)以上であり、また、例えば、90%(v/v)以下、好ましくは、85%(v/v)以下、より好ましくは、80%(v/v)以下である。濃度が上記範囲内にすることにより、第2担体からポリペプチドの解離が効率よく起き、また、質量分析時の感度(S/N比)を向上させることができる。
第2溶出液は、好ましくは、メチオチンなどのアミノ酸を含有する。これにより、質量分析用の測定プレートに配置し、分析が開始するまでの間において、ポリペプチドの酸化を低減させることができ、分析精度を向上させることができる。第2溶出液中のアミノ酸濃度は、例えば、0.01mM以上、好ましくは、0.05mM以上であり、また、例えば、5mM以下、好ましくは、1mM以下である。
本工程では、第2結合体と接触させる第2溶出液の使用量は、湿度に応じて決定する。すなわち、湿度が低い場合の溶出液の使用量は、湿度が高い場合の溶出液の使用量よりも多くするように、決定する。
具体的には、まず、第1環境(第1湿度)下での第2溶出液の使用量(第1使用量)を決定する。すなわち、第1環境下で湿度(第1湿度)を測定する。そして、第1湿度において、所望サンプル数(所望ウェル数)かつ所望量のサンプルをMALDIプレートに配置できるように、第2溶出液を過不足なく決定する。この際、第2溶出液の量は、ポリペプチド濃度を高くするために、なるべく少なくする。必要に応じて、試験管やチューブに残存するデッド量や揮発性有機溶媒の揮発分量も加える。一例として、各ウェルに配置される第2溶出液サンプルを1μL、サンプル数(ウェル数)を4つに設定した場合、合計4μLとなるが、これに、デッド量(例えば、2μL)や揮発量(例えば、2μL)も追加する。
次いで、第2環境(第2湿度)下で湿度を測定し、その湿度に応じて、第1湿度での第1使用量を基準にして、第2溶出液の使用量(第2使用量)を決定する。すなわち、第2環境下で湿度(第2湿度)を測定する。そして、第2湿度が第1湿度よりも低い場合は、第2使用量は、第1使用量よりも多くなるように決定し、一方、第2湿度が第1湿度よりも高い場合は、第2使用量は、第1使用量よりも少なくなるように決定する。
第2使用量の決定の算出方法は、有機溶媒種や湿度、配置時間に応じて適宜決定されるが、例えば、第1湿度と第2湿度との差が20%以上(好ましくは、30%以上)である場合は、第1使用量と第2使用量との比を例えば1.1以上(例えば1.5以下)とすればよい。一例としては、第1湿度が50%以上で、第1使用量が8μLで、第2湿度が30%以下であった場合、第2使用量は、約9μLとすればよい。
なお、第1環境および第2環境での温度条件は限定的でなく、同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、略同一温度、具体的には、第1環境と第2環境との温度差が10度以下である。
第2溶出工程における使用量の決定は、この分析工程において、第2溶出工程開始後から配置工程完了までに、所望時間、例えば、3分以上、好ましくは、5分以上、また、例えば、60分以下、好ましくは、30分以下の時間を要する場合に特に有効である。また、第2溶出液中の揮発性有機溶媒濃度が、高濃度である場合、例えば、10%(v/v)以上、好ましくは、55%(v/v)%以上である場合にも有効である。
なお、本発明の第1の態様は、以下の知見に基づいてなされたものであるが、本発明の範囲は、以下の知見に限定されない。ポリペプチドが溶出した第2溶出液は、後述するMALDIで測定され、ポリペプチドが検出される。この際、MALDIに供される溶出液の量が少ないほど、すなわち、ポリペプチドの濃度が濃いほど、検出結果が高感度で得られるため、溶出液の量が少ないことが好ましい。また、検出精度を高めるため、MALDIで分析されるサンプル数(使用されるウェル数)は、複数以上あることが好ましい。したがって、第2溶出液の使用量が、分析の感度および精度を左右する一因となる。
そして、低量の第2溶出液に高濃度でポリペプチドを溶出させて、複数のウェル数(所望のサンプル数)に配置して、MALDI測定を複数回実施したところ、例えば、異なる日時にまたがって複数回測定したところ、所望のサンプル数よりも少ないサンプル数の結果が得られ、精度が下がる場合が生じる。本発明者らは、この現象を鋭意検討したところ、測定環境に着目し、測定環境が低湿度である場合、分析対象物質を第2溶出液に溶出させ始めた後MALDI装置用の測定プレートに配置しようとするまでの間に、第2溶出液の揮発性有機溶媒が揮発して、第2溶出液の液量が不足してしまい、MALDIプレートに第2溶出液を配置できなくなる知見を見出した。
そして、湿度を測定し、その測定湿度に応じて第2溶出液の使用量を決定することによって、ポリペプチドを高濃度で溶出液に溶出させるとともにMADLIプレートに配置される第2溶出液の液量(ひいては、サンプル数)の不足を防止することに達成した。その結果、高濃度かつ所望数のサンプルを用いてMALDI分析することができ、高感度および高精度の分析を可能とした。
(配置工程)
配置工程では、第2溶出工程の後において、第2溶出液を測定プレートに配置する。具体的には、ポリペプチドが溶出された第2溶出液を、MALDI装置用のMALDIプレートの各ウェルに分配する。
配置工程では、第2溶出工程の後において、第2溶出液を測定プレートに配置する。具体的には、ポリペプチドが溶出された第2溶出液を、MALDI装置用のMALDIプレートの各ウェルに分配する。
第2溶出液をMALDIプレートに分配するウェル数(測定サンプル数)は、好ましくは、複数以上であり、具体的には、2ウェル以上、好ましくは、4ウェル以上であり、また、例えば、50ウェル以下、好ましくは、20ウェル以下、より好ましくは、10ウェル以下である。ウェル数が複数であることにより、測定サンプル数(測定されるマススペクトル数)が増加し、検出精度を向上させることができる。
各ウェルに配置される第2溶出液の量は、それぞれ、例えば、0.2μL以上、好ましくは、0.5μL以上であり、また、例えば、4μL以下、好ましくは、2μL以下である。ウェル単位当たりの量が上記下限以上であることにより、分析対象物質を確実に検出することができる。また、ウェル単位当たりの量が上記上限以下であることにより、測定に供される分析対象物質のサンプル数を多くすることができる。
この作業は、自動分注装置を使用してもよく、また、ピペットなどを用いて手作業で実施してもよい。
なお、第2溶出液の配置に先立って、予め、MALDIプレートに、マトリックスを配置していてもよい。また、逆に、第2溶出液をMALDIプレートに配置した後に、その第2溶液の上にマトリックスを配置してもよい。マトリックスについては、分析工程にて後述する。
(分析工程)
分析工程では、配置工程の後において、第2溶出液に含有されるポリペプチドをMALDIによって検出する。
分析工程では、配置工程の後において、第2溶出液に含有されるポリペプチドをMALDIによって検出する。
MALDIでの検出には、例えば、MALDI-TOF(マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間)型質量分析装置、MALDI-IT(マトリックス支援レーザー脱離イオン化-イオントラップ)型質量分析装置、MALDI-IT-TOF(マトリックス支援レーザー脱離イオン化-イオントラップ-飛行時間)型質量分析装置、MALDI-FTICR(マトリックス支援レーザー脱離イオン化-フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴)型質量分析装置などを用いて常法に従って操作すればよい。
マトリックスは、例えば、マトリックス含有溶液をMALDIプレートに滴下し、乾燥させることにより、配置する。
マトリックスとしては、例えば、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA;α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)、2,5-ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、3-アミノキノリンなどが挙げられる。これらは、1種単独で用いることができ、または、2種以上を併用することができる。
マトリックスが含有させる溶媒としては、例えば、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸、メタノール、エタノール、水などが挙げられる。これらは、1種単独で用いることができ、または、2種以上を併用することができる。
マトリックス含有溶媒中のマトリックス濃度は、例えば、0.1mg/mL以上、好ましくは0.5mg/mL以上であり、また、例えば、50mg/mL以下、好ましくは、10mg/mL以下である。
好ましくは、マトリックスとともに、マトリックス添加剤を併用する。マトリックス添加剤としては、例えば、ホスホン酸基含有化合物、アンモニウム塩などが挙げられ、好ましくは、洗浄液の残存によるバックグランドへの悪影響を抑制できる観点から、ホスホン酸基含有化合物が挙げられる。ホスホン酸基含有化合物としては、例えば、ホスホン酸、メチルホスホン酸、フェニルホスホン酸、1-ナフチルメチルホスホン酸、メチレンジホスホン酸(MDPNA;Methylenediphosphonic acid)、エチレンジホスホン酸、エタン-1-ヒドロキシ-1,1-ジホスホン酸、ニトリロトリホスホン酸、エチレンジアミノテトラホスホン酸などが挙げられる。
マトリックス含有溶媒中のマトリックス添加剤濃度は、例えば、0.01%(w/v)以上、好ましくは、0.1%(w/v)以上であり、また、例えば、10%(w/v)以下、好ましくは、1%(w/v)以下である。
2.そのほかの態様
(1)第1の態様の分析方法では、2回の免疫沈降法(アフィニティ精製)を実施しているが、例えば、1回の免疫沈降法でもよい。この場合、分析方法は、湿度測定工程と、第1結合工程(結合工程)と、第1洗浄工程(洗浄工程)と、第2溶出工程(溶出工程)と、配置工程と、検出工程とを備える。生体試料中のポリペプチドの存在量がより一層微量な場合でも、ポリペプチドを分析することができる観点から、第1の態様が好ましい。
(1)第1の態様の分析方法では、2回の免疫沈降法(アフィニティ精製)を実施しているが、例えば、1回の免疫沈降法でもよい。この場合、分析方法は、湿度測定工程と、第1結合工程(結合工程)と、第1洗浄工程(洗浄工程)と、第2溶出工程(溶出工程)と、配置工程と、検出工程とを備える。生体試料中のポリペプチドの存在量がより一層微量な場合でも、ポリペプチドを分析することができる観点から、第1の態様が好ましい。
(2)第1の態様の分析方法では、まず、湿度測定工程を実施しているが、湿度測定工程は、第2溶出工程の前であれば限定されず、例えば、第1結合工程、第1洗浄工程または第1中性化工程の後で実施してもよい。
(3)第1の態様の分析方法では、抗体として、抗体固定化担体を用いて免疫沈降法を実施しているが、免疫沈降法に限定されず、例えば、固相抽出法を実施することもできる。この場合、固相抽出法は、好ましくは、逆相の保持モードを採用する。担体は、官能基を表面に有する担体であり、官能基としては、例えば、オクチル基(C8)、オクタデシル基(C18)、ベンゼン環などが挙げられる。
(4)第1の態様の分析方法では、試料として生体試料を用い、分析対象物質をポリペプチドに設定しているが、これらに限定されない。試料は、例えば、生物試料(細胞培養上清、細胞溶解液、微生物培養上清、微生物溶解液など)、飲食料、汚染水、土壌などであってもよい。また、上記試料に含有されるポリペプチドをプロテアーゼ(トリプシン、Lys-C、Lys-N、Glu-C、Thermolysin、AspN、キモトリプシンなど)によって消化して生成される消化ペプチドを、試料としても用いてもよい。分析対象物質は、例えば、ポリペプチド以外の生体成分、医薬品成分、食品成分、残留農薬成分などとしてもよい。
(5)第1の態様の分析方法では、質量分析のイオン化法としてMALDIを採用しているが、例えば、MALDI以外のイオン化法、具体的には、LDI(Laser desorption ionization;レーザー脱離イオン化法)、SELDI(surface enhanced laser desorption ionization;表面増強レーザー脱離イオン化法)、PALDI(ナノ粒子支援レーザー脱離イオン化法)などを採用してもよい。
3.態様
上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
(第1項)一態様に係る分析方法は、湿度を測定する湿度測定工程と、分析対象物質を含有する試料を、担体に接触させて、前記分析対象物質を前記担体に結合させる結合工程と、前記分析対象物質が結合した前記担体を、揮発性有機溶媒を含有する溶出液に接触させて、前記分析対象物質を前記溶出液に溶出させる溶出工程と、前記分析対象物質が溶出した前記溶出液を、質量分析用の測定プレートに配置する配置工程と、前記分析対象物質を質量分析法にて検出する検出工程とを備え、前記溶出工程において、前記湿度に応じて、前記溶出液の使用量を決定してもよい。
第1項の分析方法によれば、異なる環境下でも、分析対象物質を質量分析法にて、高感度および高精度で分析することができる。
(第2項)第1項に記載の分析方法において、前記溶出工程において、前記湿度が低い場合の溶出液の使用量は、前記湿度が高い場合の溶出液の使用量よりも多くするように、決定してもよい。
第2項の分析方法によれば、湿度が低い環境下でも、分析対象物質を質量分析法にて、高感度および高精度で分析することができる。
(第3項)第1項または第2項に記載の分析方法において、前記配置工程では、前記溶出液を前記測定プレートの複数のウェルに配置してもよい。
第3項の分析方法によれば、1つのサンプルから複数の質量分析結果が得られるため、高精度で分析することができる。
(第4項)第1~3項のいずれか一項に記載の分析方法において、前記揮発性有機溶媒が、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、トルエン、イソプロパノール、ヘキサン、ブタノール、シクロヘキサン、エチレングリコール、ベンゼン、クロロホルム、アセトアルデヒド、トリエチルアミン、フェノール、ナフタレン、ホルムアルデヒド、テトラヒドロフラン、および、酢酸エチルからなる群から選択される少なくとも1種を含有してもよい。
第4項の分析方法によれば、測定対象物質を溶出液に効率よく溶出することができ、質量分析に供する測定対象物質の回収率を向上させることができる。その結果、質量分析の感度を向上させることができる。
(第5項)第1~4項のいずれか一項に記載の分析方法において、前記溶出液中の前記揮発性有機溶媒の濃度が、10%(v/v)以上であってもよい。
第5項の分析方法によれば、測定対象物質をより一層効率よく溶出液に溶出することができ、質量分析に供する測定対象物質の回収率をより確実に向上させることができる。その結果、質量分析の感度をより確実に向上させることができる。
(第6項)第1~5項のいずれか一項に記載の分析方法において、前記質量分析法が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法であってもよい。
第6項の分析方法によれば、ポリペプチドなどの生体高分子の分析を容易にすることができる。
(第7項)第1~6項のいずれかに記載の分析方法において、前記分析対象物質が、ポリペプチドであり、前記担体が、抗体固定化担体であってもよい。
第7項の分析方法によれば、Aβ関連ペプチドなどのポリペプチドを検出することができる。
(第8項)第7項に記載の分析方法において、前記抗体固定化担体に固定されている抗体が、抗Aβ関連ペプチド抗体であり、前記分析対象物質が、Aβ関連ペプチドであってもよい。
第8項の分析方法によれば、アルツハイマー型認知症の発症などを検査することができる。
次に実施例および比較例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらによって限定されない。
(抗体ビーズの用意)
アミロイドβタンパク質(Aβ)の3-8残基をエピトープとする抗Aβ抗体(IgG)のクローン6E10(Covance社)を用意した。抗Aβ抗体(IgG)100μgに対して磁性ビーズ(Dynabeads M-270 Epoxy)約3.3×108個を、固定化緩衝液(1.3M硫酸アンモニウムを含有する0.1Mリン酸緩衝液;pH7.4)中で37℃、16~24時間反応させた。これにより、抗体固定化担体としての抗体ビーズを作製した。
アミロイドβタンパク質(Aβ)の3-8残基をエピトープとする抗Aβ抗体(IgG)のクローン6E10(Covance社)を用意した。抗Aβ抗体(IgG)100μgに対して磁性ビーズ(Dynabeads M-270 Epoxy)約3.3×108個を、固定化緩衝液(1.3M硫酸アンモニウムを含有する0.1Mリン酸緩衝液;pH7.4)中で37℃、16~24時間反応させた。これにより、抗体固定化担体としての抗体ビーズを作製した。
<実施例1>
1.第1環境下での測定
(湿度測定工程)
室内の湿度を測定したところ、58.0%であった。なお、温度は、23.1℃であった。
1.第1環境下での測定
(湿度測定工程)
室内の湿度を測定したところ、58.0%であった。なお、温度は、23.1℃であった。
(第1結合工程、第1洗浄工程、第1溶出工程)
分析対象物質をAβ関連ペプチドとし、ヒト血漿を用意した。ヒト血漿250μLを、安定同位体標識されたAβ1-38(SIL-Aβ1-38)11pMを含む中性緩衝液(0.2%(w/v)DDM、0.2%(w/v)NTM、800mM GlcNAc、100mM Tris-HCl、300mM NaCl;pH7.4)250μLと混合し、氷上で5~60分静置させた。そのヒト血漿を抗体ビーズと混合し、4℃で1時間振盪させた。なお、SIL-Aβ1-38は、マススペクトルのシグナル強度を標準化するための内部標準とした。その後、抗体ビーズを、洗浄緩衝液(0.1%(w/v)DDM、0.1%(w/v)NTM、50mM Tris-HCl、150mM NaCl;pH7.4)100μLで1回洗浄し、50mM酢酸アンモニウム緩衝液50μLで1回洗浄した。その後、抗体ビーズを、第1溶出液(0.1%(w/v)DDMを含む50mMグリシン緩衝液;pH2.8)に接触させて、Aβ関連ペプチドを第1溶出液に溶出させた。
分析対象物質をAβ関連ペプチドとし、ヒト血漿を用意した。ヒト血漿250μLを、安定同位体標識されたAβ1-38(SIL-Aβ1-38)11pMを含む中性緩衝液(0.2%(w/v)DDM、0.2%(w/v)NTM、800mM GlcNAc、100mM Tris-HCl、300mM NaCl;pH7.4)250μLと混合し、氷上で5~60分静置させた。そのヒト血漿を抗体ビーズと混合し、4℃で1時間振盪させた。なお、SIL-Aβ1-38は、マススペクトルのシグナル強度を標準化するための内部標準とした。その後、抗体ビーズを、洗浄緩衝液(0.1%(w/v)DDM、0.1%(w/v)NTM、50mM Tris-HCl、150mM NaCl;pH7.4)100μLで1回洗浄し、50mM酢酸アンモニウム緩衝液50μLで1回洗浄した。その後、抗体ビーズを、第1溶出液(0.1%(w/v)DDMを含む50mMグリシン緩衝液;pH2.8)に接触させて、Aβ関連ペプチドを第1溶出液に溶出させた。
(中性化工程)
Aβ関連ペプチドを含有する第1溶出液を、中性緩衝液(0.2%(w/v)DDM、800mM GlcNAc、300mM Tris-HCl、300mM NaCl;pH7.4)と混合させて、精製溶液を得た。
Aβ関連ペプチドを含有する第1溶出液を、中性緩衝液(0.2%(w/v)DDM、800mM GlcNAc、300mM Tris-HCl、300mM NaCl;pH7.4)と混合させて、精製溶液を得た。
(第2結合工程、第2洗浄工程、第2溶出工程)
精製溶液を抗体ビーズと混合し、4℃で1時間振盪させた。その後、抗体ビーズを、洗浄緩衝液(0.1%(w/v)DDM、50mM Tris-HCl、150mM NaCl;pH7.4)50μLで2回洗浄し、50mM酢酸アンモニウム緩衝液50μLで1回洗浄し、水30μLで1回洗浄した。その後、抗体ビーズを、8μLの第2溶出液(5mM HClと0.1mMメチオニンを含む70%(v/v)アセトニトリル水溶液;pH2.3)に接触させて、Aβ関連ペプチドを第2溶出液に溶出させた。
精製溶液を抗体ビーズと混合し、4℃で1時間振盪させた。その後、抗体ビーズを、洗浄緩衝液(0.1%(w/v)DDM、50mM Tris-HCl、150mM NaCl;pH7.4)50μLで2回洗浄し、50mM酢酸アンモニウム緩衝液50μLで1回洗浄し、水30μLで1回洗浄した。その後、抗体ビーズを、8μLの第2溶出液(5mM HClと0.1mMメチオニンを含む70%(v/v)アセトニトリル水溶液;pH2.3)に接触させて、Aβ関連ペプチドを第2溶出液に溶出させた。
(配置工程)
質量分析装置として、MALDI-TOF MS装置(島津製作所製、AXIMA Performance)を用いた。Linear TOF用のマトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)を用い、マトリックス添加剤としてメチレンジホスホン酸(MDPNA)を用い、溶媒としてアセトニトリルを用いて、0.5mg/mL CHCA/0.2%(w/v)MDPNAマトリックス溶液を調製した。MALDIプレート(μFocus MALDI plate 900μm(Hudson Surface Technology,Inc.,Fort Lee,NJ))の4wellに、マトリックス溶液を0.5μLずつ滴下し、乾固させた。これらの4wellに、Aβ関連ペプチドを含有する第2溶出液を滴下して、配置させた。なお、第2溶出工程開始後から配置工程完了までの所要時間は、5分15秒であった。
質量分析装置として、MALDI-TOF MS装置(島津製作所製、AXIMA Performance)を用いた。Linear TOF用のマトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)を用い、マトリックス添加剤としてメチレンジホスホン酸(MDPNA)を用い、溶媒としてアセトニトリルを用いて、0.5mg/mL CHCA/0.2%(w/v)MDPNAマトリックス溶液を調製した。MALDIプレート(μFocus MALDI plate 900μm(Hudson Surface Technology,Inc.,Fort Lee,NJ))の4wellに、マトリックス溶液を0.5μLずつ滴下し、乾固させた。これらの4wellに、Aβ関連ペプチドを含有する第2溶出液を滴下して、配置させた。なお、第2溶出工程開始後から配置工程完了までの所要時間は、5分15秒であった。
(検出工程)
MALDI-TOF MSを作動させて、Aβ関連ペプチドを検出した。設定条件として、マススペクトルデータはAXIMA Performance(Shimadzu/KRATOS,Manchester,UK)を用いて、ポジティブイオンモードのLinear TOFで取得した。1wellに対して400スポット、16000ショットずつ積算した。Linear TOFのm/z値はピークのアベレージマスで表示した。m/z値は外部標準としてhuman angiotensin IIおよびhuman ACTH fragment 18-39、bovine insulin oxidized beta-chain、bovine insulinを用いてキャリブレーションした。
MALDI-TOF MSを作動させて、Aβ関連ペプチドを検出した。設定条件として、マススペクトルデータはAXIMA Performance(Shimadzu/KRATOS,Manchester,UK)を用いて、ポジティブイオンモードのLinear TOFで取得した。1wellに対して400スポット、16000ショットずつ積算した。Linear TOFのm/z値はピークのアベレージマスで表示した。m/z値は外部標準としてhuman angiotensin IIおよびhuman ACTH fragment 18-39、bovine insulin oxidized beta-chain、bovine insulinを用いてキャリブレーションした。
2.第2環境下での測定
(湿度測定工程)
日時を変更して、室内の湿度を測定したところ、21.2%であった。なお、温度は、21.2℃であった。
(湿度測定工程)
日時を変更して、室内の湿度を測定したところ、21.2%であった。なお、温度は、21.2℃であった。
(第1結合工程~検出工程)
第2溶出液の使用量を9μLに変更した以外は、第1環境と同様に実施した。
第2溶出液の使用量を9μLに変更した以外は、第1環境と同様に実施した。
<結果>
図1に、第1環境(湿度58.0%)におけるマススペクトルを示す。図2に、第2環境(湿度21.2%)におけるマススペクトルを示す。図1および図2において、縦軸はシグナル強度、横軸は質量電荷比(m/z)である。表1に、分析対象物質となるAβ関連ペプチドのアミノ酸配列を示す。図1および図2から、高湿度条件および低湿度条件のいずれの環境でもAβ関連ペプチドが溶出していることが高感度で確認できた。また、所望サンプル数(Well 1~4)のマススペクトルが得られており、高精度の検出が可能であることが確認できた。
図1に、第1環境(湿度58.0%)におけるマススペクトルを示す。図2に、第2環境(湿度21.2%)におけるマススペクトルを示す。図1および図2において、縦軸はシグナル強度、横軸は質量電荷比(m/z)である。表1に、分析対象物質となるAβ関連ペプチドのアミノ酸配列を示す。図1および図2から、高湿度条件および低湿度条件のいずれの環境でもAβ関連ペプチドが溶出していることが高感度で確認できた。また、所望サンプル数(Well 1~4)のマススペクトルが得られており、高精度の検出が可能であることが確認できた。
<参考例>
第2環境において、第2溶出液の使用量を第1環境と同様の8μLのままにした以外は、同様に実施した。そうすると、MALDIプレートに第2溶出液が3wellにしか配置されず、所望サンプル数の分析ができなかった。
第2環境において、第2溶出液の使用量を第1環境と同様の8μLのままにした以外は、同様に実施した。そうすると、MALDIプレートに第2溶出液が3wellにしか配置されず、所望サンプル数の分析ができなかった。
Claims (8)
- 湿度を測定する湿度測定工程と、
分析対象物質を含有する試料を、担体に接触させて、前記分析対象物質を前記担体に結合させる結合工程と、
前記分析対象物質が結合した前記担体を、揮発性有機溶媒を含有する溶出液に接触させて、前記分析対象物質を前記溶出液に溶出させる溶出工程と、
前記分析対象物質が溶出した前記溶出液を、質量分析用の測定プレートに配置する配置工程と、
前記分析対象物質を質量分析法にて検出する検出工程と
を備え、
前記溶出工程において、前記湿度に応じて、前記溶出液の使用量を決定する、分析方法。 - 前記溶出工程において、前記湿度が低い場合の溶出液の使用量は、前記湿度が高い場合の溶出液の使用量よりも多くするように、決定する、請求項1に記載の分析方法。
- 前記配置工程では、前記溶出液を前記測定プレートの複数のウェルに配置する、請求項1に記載の分析方法。
- 前記揮発性有機溶媒が、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、トルエン、イソプロパノール、ヘキサン、ブタノール、シクロヘキサン、エチレングリコール、ベンゼン、クロロホルム、アセトアルデヒド、トリエチルアミン、フェノール、ナフタレン、ホルムアルデヒド、テトラヒドロフラン、および、酢酸エチルからなる群から選択される少なくとも1種を含有する、請求項1に記載の分析方法。
- 前記溶出液中の前記揮発性有機溶媒の濃度が、10%(v/v)以上である、請求項1に記載の分析方法。
- 前記質量分析法が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法である、請求項1に記載の分析方法。
- 前記分析対象物質が、ポリペプチドであり、
前記担体が、抗体固定化担体である、請求項1に記載の分析方法。 - 前記抗体固定化担体に固定されている抗体が、抗Aβ関連ペプチド抗体であり、
前記分析対象物質が、Aβ関連ペプチドである、請求項7に記載の分析方法。
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Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
徳原 賢他,常温吸着捕集/加熱脱着/キャピラリーガスクロマトグラフィー/質量分析法による悪臭規制アルデヒド類と有機,BUNSEKI KAGAKU,1997年,Vol.46/No.5,PP.367-374 |
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