PT2359142E - Importina 9 como biomarcador para a esquizofrenia - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "IMPORTINA 9 COMO BIOMARCADOR PARA A ESQUIZOFRENIA"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a um método de diagnóstico ou monitorização de esquizofrenia ou uma predisposição para esta.

Antecedentes da Invenção A esquizofrenia é uma doença neuropsiquiátrica multifacetada com um inicio e etiologia conduzidos por uma complexa interacção de factores genéticos, de desenvolvimento, nutricionais e ambientais. Afecta, pelo menos, 1% da população mundial e custa centenas de mil milhões de dólares na prestação de cuidados de saúde e perda de salários. 0 diagnóstico actual de esquizofrenia e outros distúrbios psicóticos é subjectivo devido ao vasto espectro de sintomas, sua sobreposição com outros distúrbios e a falta de ensaios empíricos específicos para a doença. Um maior conhecimento das vias moleculares afectadas será um passo importante para a melhoria dos testes de diagnóstico, desenvolvendo novos tratamentos pré-sintomáticos e avaliando a eficácia das intervenções preventivas. 0 documento WO 2008/090319 descreve um método de diagnóstico ou monitorização de um distúrbio psicótico ou predisposição para 1 este, compreendendo a medida, numa amostra retirada de um indivíduo, do nível de um biomarcador seleccionados de precursor de clusterina, inibidor de inter a-tripsina, IgM, apoliproteína A2 e glicoproteína a2 H5. 0 documento WO 2008/107700 descreve a utilização de um biomarcador peptídico que é uma α-defensina ou um seu fragmento, como um biomarcador para a esquizofrenia ou para um importante distúrbio depressivo, ou predisposição para este.

Sumário da Invenção

Utilizando uma plataforma global de proteómica com base numa tecnologia nanoLC-MS/MS unidimensional e bidimensional foram identificados biomarcadores de proteína de doença para a esquizofrenia. Foram conduzidos dois estudos de investigação, utilizando amostras de soro retiradas do primeiro início, de doentes de esquizofrenia naive para fármacos e controlos saudáveis.

De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção é a utilização in vitro de Importina 9 como um biomarcador para a esquizofrenia ou predisposição para esta. Em uma forma de realização, a invenção adicionalmente compreende a utilização de um ou mais péptidos adicionais seleccionados de, NALP8, Proteína S dependente da vitamina K, Alfa-l-antiquimiotripsina, Lumicano, Helicase, relacionados com Haptoglobina, membro 1B da família C do tipo ANKRD26, proteína 2B contendo o domínio AAA da família ATPase, proteína C9orf93 não caracterizada, globulina que se liga a Tiroxina, membro AI da família contendo o domínio EF-mão, sintase do semi-aldeído alfa aminoadípico, mitocondrial, fosfodiesterase gama 1 de 1-fosfatidilinositol, carboxipeptidase 2 2 citossólica, Alfa-l-antiquimiotripsina, Proteína FLJ36157 não caracterizada, Atractina, Rootletina, componente 7 do Complemento, Afamina, proteína tipo Quinesina, Polimerase 1 de Poli[ADP-ribose (PARP1], região C da cadeia gama 1 de Ig, Paraoxonase/arilesterase 1, Cadeia pesada H2 do Inibidor da inter-alfa-tripsina, Cadeia pesada H4 do Inibidor da Inter-alfa-tripsina, Apoliproteína C-III, Proteína da Zona da Gravidez, cofactor 2 da Heparina, Subcomponente do complemento Clr, como um biomarcador para a esquizofrenia ou predisposição para esta.

Em uma forma de realização, a invenção compreende adicionalmente a utilização de um ou mais péptidos adicionais seleccionados de ligase LRSAM1 da proteína ubiquitina E3, IgMu, Factor 13 de coagulação, Apoliproteína Cl, Apoliproteína D, serina/treonina proteína Cinase, membro 6 da subfamília B da cassete de ligação de ATP mitocondrial, ligase da proteína ubiquitina E3, Haptoglobina, proteína 2 contendo o domínio AAA da família de ATPase, Cadeia beta da espectrina do eritrócito, Proteína da matriz oligomérica da cartilagem, Proteína C de ligação a manose, Integrina beta-3, Proteína 2 associada a microtúbulos, Catepsina L2, Factor B do Complemento, Componente 5 do complemento, Vitronectina; proteína S, Clusterina (ApoJ), Proteína 2 de ligação a Hialuronano e ADN topoisomerase 2-alfa, como um biomarcador para a esquizofrenia ou predisposição para esta.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção é um método de diagnóstico ou monitorização de esquizofrenia ou predisposição para esta, compreendendo detectar e/ou quantificar, numa amostra de um indivíduo de teste, um ou mais dos biomarcadores peptídicos listados acima. 3

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção é um método de monitorização de eficácia de uma terapia num indivíduo que tem, é suspeito de ter ou está prediposto a esquizofrenia, compreendendo a detecção e/ou quantificação, numa amostra do referido indivíduo, um ou mais dos biomarcadores peptídicos listados acima.

Um outro aspecto da invenção proporciona ligandos, tais como compostos que ocorrem naturalmente ou sintetizados quimicamente, capazes de se ligarem especificamente ao biomarcador peptídico. Um ligando de acordo com a invenção pode compreender um péptido, um anticorpo ou um seu fragmento, ou um aptâmero ou oligonucleótido, capaz de se ligar especificamente ao biomarcador peptídico. 0 anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento capaz de se ligar especificamente ao biomarcador peptídico. Um ligando de acordo com a invenção pode ser marcado com um marcador detectável, tal como um marcador luminescente, fluorescente ou radioactivo; alternativamente ou adicionalmente, um ligando de acordo com a invenção pode ser marcado com um marcador de afinidade, e. g., um marcador de biotina, avidina, estreptavidina ou His (e. g., hexa-His).

Um biossensor de acordo com a invenção pode compreender o biomarcador peptídico ou um seu mimo de forma/estrutural capaz de se ligar especificamente a um anticorpo contra o biomarcador peptídico. É também proporcionada uma matriz compreendendo um ligando ou mimo como aqui descrito. É também proporcionado pela invenção a utilização de um ou mais ligandos como aqui descritos, que pode ser dos que ocorrem naturalmente ou quimicamente sintetizados, e é adequadamente um 4 péptido, anticorpo ou seu fragmento, aptâmero ou oligonucleótido, ou a utilização de um biossensor da invenção, ou uma matriz da invenção, ou um kit da invenção para detectar e/ou quantificar o péptido. Nestas utilizações, a detecção e/ou quantificação pode ser efectuada numa amostra biológica tal como do grupo consistindo em CSF, sangue total, soro do sangue, plasma, urina, saliva ou outro fluido corporal, hálito, e. g., como hálito condensado, ou um seu extracto ou purificação ou uma sua diluição. São proporcionados kits de diagnóstico ou monitorização para realizar os métodos da invenção. Estes kits compreenderão adequadamente um ligando de acordo com a invenção, para detecção e/ou quantificação do biomarcador peptídico, e/ou um biossensor e/ou uma matriz como aqui descritos, opcionalmente em conjunto com instruções para a utilização do kit.

Um outro aspecto da invenção é a utilização de um kit para monitorização ou diagnóstico de esquizofrenia, em que o referido kit compreende um biossensor que detecta e/ou quantifica o biomarcador como aqui descrito, em que o referido biossensor compreende um ligando capaz de se ligar especificamente ao biomarcador como aqui descrito.

Os biomarcadores para esquizofrenia ou outros distúrbios psicóticos são alvos essenciais para a descoberta de novas moléculas alvo e fármacos que retardam ou interrompem a progressão do distúrbio. Como o nivel de biomarcador peptídico é indicativo de distúrbio e de resposta a fármaco, o biomarcador é útil para a identificação de novos compostos terapêuticos em ensaios in vitro e/ou in vivo. Os biomarcadores da invenção 5 podem ser empregues em métodos para rastreio de compostos que modulam a actividade do péptido.

Deste modo, num outro aspecto da invenção, é proporcionada a utilização de um ligando, como descrito, que pode ser um péptido, anticorpo ou seu fragmento ou aptâmero ou oligonucleótido de acordo com a invenção; ou a utilização de um biossensor de acordo com a invenção, ou uma matriz de acordo com a invenção; ou um kit de acordo com a invenção, para identificar uma substância capaz de promover e/ou suprimir a produção do biomarcador. É também proporcionado um método para identificar uma substância capaz de promover ou suprimir a produção do péptido num indivíduo, compreendendo a administração de uma substância de teste a um indivíduo animal e detectar e/ou quantificar o nível do biomarcador peptídico presente numa amostra de teste do indivíduo.

Descrição da Invenção 0 termo '"biomarcador" significa um indicador distintivo biológico ou biologicamente derivado de um processo, evento ou estado. Os biomarcadores peptídicos podem ser utilizados em métodos de diagnóstico, e. g., rastreio clínico, e de avaliação de prognóstico e na monitorização dos resultados de terapia, identificação de doentes com maior probabilidade de responder a um particular tratamento terapêutico, pesquisa e desenvolvimento de fármacos. Os biomarcadores e suas utilizações são valiosos para a identificação de novos tratamentos farmacológicos e para descoberta de novos alvos para tratamento com o fármaco. Os 6 biomarcadores peptídicos aqui descritos podem também estar na forma "precursora".

Aqui as referências a "outro distúrbio psicótico" referem-se a qualquer distúrbio psicótico apropriado de acordo com o DSM-IV Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4a edição, American Psychiatric Assoe, Washington, D.C., 2000. Em uma forma de realização particular, o outro distúrbio psicótico é um distúrbio psicótico relacionado com a esquizofrenia. Exemplos de distúrbios psicóticos relacionados com a esquizofrenia incluem distúrbio psicótico breve, distúrbio delirante, distúrbio psicótico devido a um estado clínico geral, distúrbio esquizoefector, distúrbio esquizofreniforme e distúrbio psicótico induzido por substância.

Como utilizado aqui, o termo "biossensor" significa qualquer coisa capaz de detectar a presença do biomarcador. São aqui descritos exemplos de biossensores.

Os biossensores de acordo com a invenção podem compreender um ligando ou ligandos, como aqui descrito, capazes de se ligarem especificamente ao biomarcador peptídico. Estes biossensores são úteis para detectar e/ou quantificar um péptido da invenção. São aqui descritos kits de diagnóstico para o diagnóstico e monitorização de esquizofrenia. De um modo preferido, estes contêm um biossensor capaz de detectar e/ou quantificar um biomarcador peptídico. 7

Os métodos de monitorização da invenção podem ser utilizados para monitorizar o inicio, progressão, estabilização, melhoria e/ou remissão.

Nos métodos de diagnóstico ou monitorização de acordo com a invenção, a detecção e/ou quantificação do biomarcador peptídico numa amostra biológica de um indivíduo de teste pode ser efectuada em duas ou mais ocasiões. Podem ser feitas comparações entre o nível de biomarcador em amostras retiradas em duas ou mais ocasiões. Pode ser realizada avaliação de qualquer alteração no nível do biomarcador peptídico em amostras retiradas em duas ou mais ocasiões. A modulação do nível de biomarcador peptídico é útil como um indicador do estado da esquizofrenia ou predisposição para esta. Um aumento no nível do biomarcador, ao longo do tempo, é indicador de inicio ou progressão, i. e., agravamento deste distúrbio, enquanto uma diminuição no nível do biomarcador peptídico indica a melhoria ou remissão do distúrbio ou vice-versa.

Um método de diagnóstico ou monitorização de acordo com a invenção, pode compreender a quantificação do biomarcador peptídico numa amostra biológica de teste de um indivíduo de teste e comparação do nível do péptido presente na referida amostra de teste com um ou mais controlos. 0 controlo utilizado num método da invenção pode ser um ou mais controlo seleccionados do grupo consistindo em: o nível do péptido biomarcador encontrado numa amostra de controlo normal de um indivíduo normal, um nível de normal péptido biomarcador; um intervalo normal de péptido biomarcador, o nível numa amostra de um indivíduo com esquizofrenia ou outro distúrbio psicótico, ou uma predisposição diagnosticada para este; nível de péptido biomarcador para a esquizofrenia ou outro distúrbio psicótico, ou gama de péptido biomarcador para esquizofrenia ou outro distúrbio psicótico.

Um método de diagnóstico de esquizofrenia preferido ou predisposição para este, compreende: (a) quantificação da quantidade do biomarcador peptídico numa amostra biológica de teste; e (b) comparação da quantidade do referido péptido na referida amostra de teste com a quantidade presente numa amostra biológica normal de controlo de um indivíduo normal.

Um nível mais elevado do biomarcador peptídico na amostra de teste relativamente ao nível no controlo normal é indicador da presença de esquizofrenia ou predisposição para esta; um nível equivalente ou inferior do péptido na amostra de teste relativamente ao controlo normal é indicador de ausência de esquizofrenia e/ou ausência de uma predisposição para esta. 0 termo "diagnóstico" como aqui utilizado inclui identificação, confirmação e/ou caracterização de esquizofrenia ou predisposição para esta. Por predisposição entende-se um indivíduo que não apresenta normalmente o distúrbio, mas é provável ser afectado pelo distúrbio com o tempo. Os métodos de monitorização e diagnóstico de acordo com a invenção são úteis para confirmar a existência de um distúrbio ou predisposição para este; para monitorizar o desenvolvimento do distúrbio pela avaliação do início e progressão, ou para avaliar a melhoria ou regressão do distúrbio. Os métodos de monitorização e 9 diagnóstico são também úteis em métodos para a avaliação do rastreio clinico, prognóstico, escolha da terapia, avaliação do beneficio terapêutico, i. e., para pesquisa de fármacos e desenvolvimento de fármacos.

Os métodos de diagnóstico e monitorização eficientes proporcionam "soluções para o doente" muito potentes com o potencial para melhoria do prognóstico, estabelecendo o diagnóstico correcto, permitindo a identificação rápida do tratamento mais apropriado (diminuindo, assim, a exposição desnecessária a efeitos secundários prejudiciais do fármaco), reduzindo as taxas de "diminuição de tempo" e relapso. É também proporcionado um método de monitorização da eficácia de uma terapia para a esquizofrenia num indivíduo que tem este distúrbio, é suspeito de ter este distúrbio ou está predisposto a este, compreendendo detectar e/ou quantificar o péptido presente numa amostra biológica do referido indivíduo. Nos métodos de monitorização, as amostras de teste podem ser retiradas em duas ou mais ocasiões. 0 método pode ainda compreender a comparação do nível do(s) biomarcador(es) presente (s) na amostra de teste com um ou mais controlos e/ou com uma ou mais amostras de teste retiradas antes do mesmo indivíduo de teste, e. g., antes do início da terapia e/ou do mesmo indivíduo de teste num estádio precoce da terapia. 0 método pode compreender a detecção de uma alteração no nível do(s) biomarcador(es) nas amostras de teste retiradas em diferentes ocasiões. A invenção proporciona um método para a monitorização da eficácia da terapia para a esquizofrenia num indivíduo, compreendendo: 10 (a) quantificação da quantidade do biomarcador peptídico; e (b) a comparação da quantidade do referido péptido na referida amostra de teste com a quantidade presente em um ou mais controlos e/ou uma ou mais amostras de teste anteriores retiradas num tempo anterior do mesmo indivíduo de teste.

Um decréscimo no nível do biomarcador peptídico na amostra de teste relativamente ao nível numa amostra de teste anterior retirada antes do mesmo indivíduo de teste é indicador de um efeito benéfico, e. g., estabilização ou melhoria, da referida terapia no distúrbio, suspeito de distúrbio ou predisposição para.

Os métodos para monitorização da eficácia de uma terapia podem ser utilizados para monitorizar a eficácia terapêutica de terapias existentes e novas terapias em indivíduos humanos e em animais não humanos (e. g., em modelos animais). Estes métodos de monitorização podem ser incorporados em pesquisas para novas substâncias de fármaco e combinações de substâncias.

Adequadamente, o tempo que passou entre o retirar das amostras de um indivíduo que sofreu o diagnóstico ou monitorização deverá ser 3 dias, 5 dias, uma semana, duas semanas, um mês, 2 meses, 3 meses, 6 ou 12 meses. As amostras podem ser retiradas antes e/ou durante e/ou após uma terapia anti-depressiva. As amostras podem ser retiradas em intervalos ao longo do tempo remanescente, ou uma sua parte, de um indivíduo. 11 0 termo "detecção" como aqui utilizado significa confirmar a presença do biomarcador peptídico presente na amostra. A quantificação da quantidade do biomarcador presente numa amostra pode incluir a determinação da concentração do biomarcador peptídico presente na amostra. A detecção e/ou quantificação pode ser efectuada directamente na amostra ou indirectamente num seu extracto, ou numa sua diluição.

Em aspectos alternativos da invenção, a presença do biomarcador peptídico é avaliada por detecção e/ou quantificação do anticorpo ou seus fragmentos capazes de se ligar especificamente ao biomarcador que são produzidos pelo corpo do indivíduo em resposta ao péptido e deste modo estão presentes numa amostra biológica de um indivíduo possuindo esquizofrenia ou uma predisposição para esta. A detecção e/ou quantificação pode ser efectuada por qualquer método adequado para identificar a presença e/ou a quantidade de uma proteína específica numa amostra biológica de um doente ou uma purificação ou extracto de uma amostra biológica ou uma sua diluição. Em métodos da invenção, a quantificação pode ser efectuada por uma medida da concentração do biomarcador peptídico na amostra ou amostras. As amostras biológicas que podem ser testadas num método da invenção incluem fluido cérebroespinal (CSF), sangue total, soro de sangue, plasma, urina, saliva ou outro fluido corporal (fezes, fluido lacrimal, fluido sinovial, expectoração), hálito, e. g., como hálito condensado ou um seu extracto ou purificação, ou uma sua diluição. As amostras biológicas também incluem homogenatos de tecido, secções de tecido e espécimes de biópsia de um indivíduo vivo, ou retiradas pós-morte. As amostras podem ser preparadas, 12 por exemplo, quando apropriado diluídas ou concentradas, e armazenadas da forma habitual. A detecção e/ou quantificação dos biomarcadores peptídicos pode ser efectuada por detecção do biomarcador peptídico ou de um seu fragmento, e. g.r um fragmento com truncagem C-terminal ou com truncagem N-terminal. Os fragmentos são adequadamente superiores a 4 aminoácidos de comprimento, de um modo preferido, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos de comprimento. O biomarcador pode ser directamente detectado, e. g., por SELDI ou MALDI-TOF. Alternativamente, o biomarcador pode ser detectado directa ou indirectamente via interacção com um ligando ou ligandos, tais como um anticorpo ou um seu fragmento de ligação ao biomarcador ou outro péptido, ou ligando, e. g., aptâmero ou oligonucleótido, capaz de se ligarem especificamente o biomarcador. O ligando pode possuir um marcador detectável, tais como um marcador luminescente, fluorescente ou radioactivo, e/ou um marcador de afinidade.

Por exemplo, a detecção e/ou quantificação pode ser efectuada por um ou mais métodos seleccionados do grupo consistindo em: SELDI (-TOF), MALDI (-T0F), uma análise com base em gel 1-D, uma análise com base em gel 2-D, Espectr. massa (MS) , LC de fase reversa (RP), permeação de tamanho (filtração em gel), troca iónica, afinidade, HPLC, UPLC e outras LC ou técnicas com base em LC MS. As técnicas LC MS apropriadas incluem ICAT® (Applied Biosystems, CA, EUA), ou iTRAQ® (Applied Biosystems, CA, EUA). A cromatografia líquida (e. g.r cromatografia líquida de pressão elevada (HPLC) ou cromatografia líquida de baixa pressão (LPLC)), cromatografia de camada fina, 13 espectroscopia RMN (ressonância magnética nuclear) pode também ser utilizada.

Os métodos de diagnóstico ou monitorização de acordo com a invenção podem compreender a análise de uma amostra do fluido cérebroespinal (CSF) por SELDI TOF ou MALDI TOF para detectar a presença ou nível do biomarcador peptídico. Estes métodos são também adequados para rastreio clínico, prognóstico, monitorização dos resultados de terapia, identificar doentes com maior probabilidade de responder a um tratamento terapêutico particular, para pesquisa de fármacos e desenvolvimento, e identificação de novos alvos para tratamento com fármaco. A detecção e/ou quantificação dos biomarcadores peptídicos pode ser efectuada utilizando um método imunológico, envolvendo um anticorpo ou um seu fragmento capaz de se ligar especificamente ao biomarcador peptídico. Os métodos imunológicos adequados incluem imunoensaios em sanduíche, tais como ELISA sanduíche, em que a detecção dos biomarcadores peptídicos é efectuada utilizando dois anticorpos que reconhecem diferentes epitopos num biomarcador peptídico; radioimunoensaios (RIA), ensaios imunoabsorventes ligados a enzimas (ELISA) directos, indirectos ou competitivos, imunoensaios enzimáticos (EIA), imunoensaios de Fluorescências (FIA), transferência de western, imunoprecipitação e qualquer imunoensaio à base de partículas (e. g., utilizando ouro, prata ou partículas de látex, partículas magnéticas, ou Q-manchas). Os métodos imunológicos podem ser realizados, por exemplo, em placa de microtitulação ou formato de tira.

Os métodos imunológicos de acordo com a invenção podem ser baseados, por exemplo, em qualquer dos métodos que se seguem. 14 A imunoprecipitação é o método imunoensaio mais simples; isto mede a quantidade de precipitado, que se forma após o anticorpo reaqente ter sido incubado com a amostra e ter reagido com o antigénio alvo ai presente para formar um agregado insolúvel. As reacções de imunoprecipitação podem ser qualitativas ou quantitativas.

Em imunoensaios de partícula, vários anticorpos são ligados à partícula, e a partícula é capaz de se ligar a muitas moléculas de antigénio simultaneamente. Isto acelera fortemente a velocidade da reacção visível. Isto permite a detecção rápida e sensível do biomarcador.

Em imunonefelometria, a interacção de um anticorpo e antigénio alvo nos resultados do biomarcador na formação de complexos imunitários que são muito pequenos para precipitar. No entanto, estes complexos dispersarão a luz incidente e isto pode ser medido utilizando um nefelómetro. A concentração de antigénio, i. e., o biomarcador, pode ser determinado em minutos de reacção.

Os métodos de radioimunoensaio (RIA) empregam os isótopos radioactivos, tal como I , para marcar o antigénio ou o anticorpo. 0 isótopo utilizado emite raios gama, que são normalmente medidos após remoção do radiomarcado não ligado (livre) . As principais vantagens de RIA, em comparação com outros imunoensaios, são a elevada sensibilidade, detecção fácil do sinal e ensaios rápidos bem estabelecidos. As principais desvantagens são os riscos de saúde e segurança colocados pela utilização de radiação e o tempo e despesa associados com a manutenção de segurança de radiação licenciada e programa de 15 eliminação de resíduos. Por esta razão, a RIA foi amplamente substituída na prática de rotina de laboratório clínico por imunoensaios enzimáticos.

Os imunoensaios de enzima (EIA) foram desenvolvidos como uma alternativa a radioimunoensaios (RIA). Estes métodos utilizam uma enzima para marcar o anticorpo ou o antigénio alvo. A sensibilidade de EIA aproxima-se da de RIA, sem o perigo colocado por isótopos radioactivos. Um dos métodos EIA mais vastamente utilizados para a detecção é o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). Os métodos ELISA podem utilizar dois anticorpos, um que é específico para o antigénio alvo e o outro que é acoplado a uma enzima, adição do substrato para os resultados da enzima na produção de um sinal quimioluminescente ou fluorescente. 0 imunoensaio fluorescente (FIA) refere-se a imunoensaios que utilizam uma marca fluorescente ou uma marca de enzima que actua no substrato para formar um produto fluorescente. As medições fluorescentes são inerentemente mais sensíveis do que as medições colorimétricas (espectrofotométricas). Deste modo, os métodos FIA têm uma maior sensibilidade analítica do que os métodos EIA, que empregam a medição da absorvência (sensibilidade óptica).

Os imunoensaios quimioluminescentes utilizam uma marca quimioluminescente, que produz luz quando excitados por energia química; as emissões são medidas utilizando um detector de luz.

Os métodos imunológicos de acordo com a invenção podem deste modo ser realizados utilizando métodos bem conhecidos. Qualquer procedimento directo (e. g., utilizando um chip sensor) ou 16 indirecto pode ser utilizado na detecção de biomarcadores peptidicos da invenção.

Os sistemas Biotina-Avidina ou Biotina-Estreptavidina são sistemas de marcação genéricos que podem ser adaptados para utilização em métodos imunológicos da invenção. Um parceiro de ligação (hapteno, antigénio, ligando, aptâmero, anticorpo, enzima etc.) é marcado com biotina e o outro parceiro (superfície, e. g., poço, esfera, sensor, etc.) é marcado com avidina ou estreptavidina. Isto é tecnologia convencional para imunoensaios, ensaios com sondas de genes e (bio)sensores, mas é uma via indirecta de imobilização em vez de uma via directa. Por exemplo, um ligando biotinilado (e. g., anticorpo ou aptâmero) específico para um biomarcador peptídico da invenção pode ser imobilizado numa superfície de avidina ou estreptavidina, o ligando imobilizado pode então ser exposto a uma amostra contendo ou suspeita de conter o biomarcador peptídico de modo a detectar e/ou quantificar um biomarcador peptídico da invenção. A detecção e/ou quantificação do antigénio imobilizado podem então ser efectuadas através de um método imunológico como aqui descrito. 0 termo "anticorpo" como aqui utilizado inclui, mas não é limitado a: anticorpos policlonais, monoclonais, bi-específicos, humanizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab e fragmentos F(ab')2> fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) e fragmentos de ligação a epitopo de qualquer dos acima. 0 termo "anticorpo" como aqui utilizado também se refere a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente activas de moléculas de imunoglobulina, i. e., moléculas que contêm um sítio de ligação ao antigénio que se liga especificamente a um 17 antigénio. As moléculas de imunoglobulina da invenção podem ser de qualquer classe (e. g., IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. A identificação de biomarcadores chave específicos para uma doença é central para a integração dos procedimentos de diagnóstico e regimes terapêuticos. Utilizando ferramentas de diagnóstico apropriadas com biomarcadores preditivos, tais como os biossensores, podem ser desenvolvidos, consequentemente, em métodos e utilizações da invenção, uma detecção e quantificação podem ser efectuadas utilizando um biossensor, sistema microanalítico, sistema de micro engenharia, sistema de microseparação, sistema de imunocromatografia ou outros dispositivos analíticos adequados. 0 biossensor pode incorporar um método imunológico para a detecção dos biomarcador(es), eléctrico, térmico, magnético, óptico (e. g., holograma) ou tecnologias acústicas. Utilizando estes biossensores, é possível detectar o biomarcador(es) alvo nas concentrações antecipadas encontradas em amostras biológicas.

Deste modo, de acordo com um outro aspecto da invenção é proporcionado um dispositivo para o diagnóstico ou monitorização de esquizofrenia que compreende um biossensor, sistema microanalítico, de microengenharia, de microseparação e/ou imunocromatografia configurado para detectar e/ou quantificar qualquer dos biomarcadores aqui definidos. 0(s) biomarcador(es) da invenção podem ser detectados utilizando um biossensor incorporando tecnologias com base em hologramas "smart", ou sistemas acústicos de elevada frequência, estes sistemas são particularmente adaptáveis a "código de barras" ou configurações em matriz. 18

Em sensores de holograma smart (Smart Holograms Ltd, Cambridge, RU) , uma imagem holográfica é armazenada num fino filme polimérico que é sensibilizado para reagir especificamente com o biomarcador. Na exposição, o biomarcador reage com o polímero levando a uma alteração na imagem apresentada pelo holograma. A leitura do resultado do teste pode ser uma alteração no brilho óptico, imagem, cor e/ou posição da imagem. Para aplicações qualitativas e semi-quantitativas, um holograma sensor pode ser lido à vista, removendo este modo a necessidade de equipamento de detecção. Um simples sensor de cor pode ser utilizado para leitura do sinal quando são necessárias medições quantitativas. A opacidade ou cor da amostra não interfere com o funcionamento do sensor. 0 formato do sensor permite a multiplexação para a detecção simultânea de várias substâncias. Os sensores reversíveis e irreversíveis podem ser concebidos para preencher diferentes exigências, e monitorização contínua de um particular biomarcador de interesse é realizável.

De forma adequada, os biossensores para a detecção de um ou mais biomarcadores da invenção combinam o reconhecimento biomolecular com meios apropriados para converter a detecção da presença, ou quantificação, do biomarcador na amostra num sinal. Os biossensores podem ser adaptados para teste de diagnóstico em "sítio alternado", e. g., na enfermaria, departamento de doentes externos, cirurgia, domicílio, campo e local de trabalho.

Os biossensores para detectar um ou mais biomarcadores da invenção incluem sensores acústicos, de ressonância de plasmão, holográficos e de microengenharia. Podem ser empregues elementos de reconhecimento impressos, tecnologia de transístor em filme fino, dispositivos de ressonância acústica magnéticos e outros 19 novos sistemas acústico-eléctricos podem ser empregues em biossensores para a detecção de um ou mais biomarcadores da invenção.

Os métodos que envolvem a detecção e/ou quantificação de um ou mais biomarcadores peptidicos da invenção podem ser efectuados em instrumentação de bancada, ou podem ser incorporados em plataformas descartáveis, de diagnóstico ou monitorização, que podem ser utilizadas em ambiente de não laboratório, e. g., no consultório do médico ou na cama do doente. Os biossensores adequados para realizar os métodos da invenção incluem cartões "de crédito" com leitores ópticos ou acústicos. Os biossensores podem ser configurados para permitir que os dados recolhidos sejam electronicamente transmitidos ao médico para interpretação e podem, deste modo, formar a base para a e-neuromedicina.

Qualquer animal adequado pode ser utilizado como um indivíduo animal não humano, por exemplo, um primata não humano, cavalo, vaca, porco, cabra, ovelha, cão, gato, peixe, roedor, e. g., cobaio, rato ou murganho; insecto (e. g., Drosophila), anfíbio (e. g.f Xenopus) ou C. elegans. A substância de teste pode ser uma substância farmacêutica ou química conhecida, tal como, mas não se limitando a, uma substância terapêutica para distúrbio antidepressivo; ou a substância de teste pode ser uma nova entidade química, sintética ou natural, ou uma combinação de duas ou mais das referidas substâncias acima. É proporcionado um método para identificar uma substância capaz de promover ou suprimir a produção do biomarcador 20 peptídico num indivíduo, compreendendo a exposição de um célula de teste a uma substância de teste e monitorização do nível do biomarcador peptídico na referida célula de teste ou segregada pela referida célula de teste. A célula de teste pode ser procariótica, no entanto é preferido que uma célula eucariótica seja empregue em métodos de teste à base de células. Adequadamente, a célula eucariótica é uma célula de levedura, célula de insecto, célula de Drosophila, célula de anfíbio (e. g., de Xenopus), célula de C. elegans ou é uma célula de origem humana, primata não humana, equina, bovina, porcina, caprina, ovina, canina, felina, piscícula, murina ou de roedor.

Em métodos para identificar substâncias de potencial utilização terapêutica, animais não humanos ou células podem ser utilizados que são capazes de expressar o péptido.

Os métodos de rastreio também incluem um método de identificação de um ligando capaz de ligação ao biomarcador peptídico de acordo com a invenção, compreendendo a incubação da substância de teste na presença do biomarcador peptídico em condições apropriadas para a ligação, e detectar e/ou quantificar a ligação do péptido à referida substância de teste.

As tecnologias de rastreio de elevado processamento com base no biomarcador, as utilizações e métodos da invenção, e. g., configuradas num formato de matriz, são adequadas para monitorizar as assinaturas do biomarcador para a identificação de compostos terapêuticos potencialmente úteis, e. g., ligandos, tais como compostos naturais, compostos químicos sintéticos (e. g., de bibliotecas combinatórias), péptidos, anticorpos 21 monoclonais ou policlonais ou seus fragmentos, que podem ser capazes de ligação ao biomarcador.

Os métodos da invenção podem ser efectuados num formato de matriz, e. g., num chip, ou como uma matriz multipoço. Os métodos podem ser adaptados em plataformas para testes únicos, ou testes múltiplos idênticos ou múltiplos não idênticos, e podem ser efectuados num formato de elevado processamento. Os métodos da invenção podem compreender a realização de um ou mais testes adicionais, diferentes para confirmar ou excluir o diagnóstico, e/ou para ainda caracterizar um estado. A invenção proporciona ainda uma substância, e. g., um ligando, identificado ou identificável por um método de identificação ou rastreio ou utilização da invenção. Estas substâncias podem ser capazes de inibir, directa ou indirectamente, a actividade do biomarcador peptídico, ou de suprimir a produção do biomarcador peptídico. O termo "substâncias" inclui substâncias que não se ligam directamente ao biomarcador peptídico e modulam directamente uma função, mas em vez disso modulam indirectamente uma função do biomarcador peptídico. Os ligandos estão também incluídos no termo substâncias; os ligandos da invenção (e. g., um composto químico natural ou sintético, péptido, aptâmero, oligonucleótido, anticorpo ou fragmento de anticorpo) são capazes de ligação, de um modo preferido, ligação específica ao péptido. A invenção proporciona ainda uma substância de acordo com a invenção para utilização no tratamento de esquizofrenia ou predisposição para esta. 22 É também proporcionada a utilização acordo com a invenção no tratamento uma substância de esquizofrenia ou de de predisposição para esta. É também proporcionada a utilização de uma substância de acordo com a invenção como um medicamento. É ainda proporcionada a utilização de uma substância de acordo com a invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de esquizofrenia ou predisposição para esta. É proporcionado um kit para diagnóstico ou monitorização de esquizofrenia ou predisposição para esta. Adequadamente, um kit de acordo com a invenção pode conter um ou mais componentes seleccionados do grupo: um ligando especifico para o biomarcador peptidico ou um mimo de forma/estrutural do biomarcador peptidico, um ou mais controlos, um ou mais reagentes e um ou mais consumíveis; opcionalmente em conjunto com instruções para utilização do kit. A identificação de biomarcadores para esquizofrenia ou outros distúrbios psicóticos permitem a integração de procedimentos de diagnóstico e regimes terapêuticos. Normalmente, existem significativos atrasos na determinação do tratamento eficaz e até agora não foi possível realizar a avaliação rápida de resposta a fármaco. Tradicionalmente, muitas terapias antidepressivas necessitaram de ensaios de tratamento que duravam semanas a meses para uma determinada abordagem terapêutica. A detecção de um biomarcador peptidico da invenção pode ser utilizada para rastrear indivíduos antes da sua participação em ensaios clínicos. Os biomarcadores proporcionam os meios para indicar resposta terapêutica, falência na 23 resposta, perfil de efeito colateral não favorável, grau de compromisso com a medicação e implementação de níveis de fármacos no soro adequados. Os biomarcadores podem ser utilizados para proporcionar o aviso de resposta adversa ao fármaco. Os biomarcadores são úteis no desenvolvimento de terapias personalizadas do cérebro, uma vez que a avaliação da resposta pode ser utilizada para afinar a dosagem, minimizar o número de medicações prescritas, redução do atraso em alcançar terapia eficaz e evitar reacções adversas ao fármaco. Deste modo através da monitorização de um biomarcador da invenção, o cuidado ao doente pode ser adaptada de forma precisa para responder às necessidades determinadas pelo distúrbio e o perfil farmacogenómico do doente, o biomarcador pode deste modo ser utilizado para titular a dose óptima, prever uma resposta terapêutica positiva e identificar os doentes em risco elevado de efeitos secundários.

Os testes à base de biomarcador proporcionam uma avaliação de primeira linha de 'novos' doentes, e proporciona medições objectivas para um diagnóstico preciso e rápido, num período de tempo e com precisão, não alcançável utilizando as normais medições subjectivas.

Além disso, os testes de diagnóstico por biomarcador são úteis para identificar membros da família ou doentes em risco de desenvolver esquizofrenia ou outros distúrbios psicóticos. Isto permite o início de terapia apropriada ou medidas de prevenção, e. g.r gerindo os factores de risco. Estas abordagens são reconhecidas por melhorar o resultado e podem prevenir o início do distúrbio. 24

Os métodos de monitorização por biomarcador, os biossensores e kits são também vitais como ferramentas de monitorização do doente, para permitir que o médico determine se o relapso é devido ao agravamento do distúrbio, fraco compromisso do doente ou abuso de substância. Se o tratamento farmacológico for avaliado como sendo inadequado, depois a terapia pode ser restabelecida ou aumentada; uma alteração na terapia pode ser ministrada se for apropriado. Como os biomarcadores são sensíveis ao estado do distúrbio, estes proporcionam uma indicação do impacto da terapia do fármaco ou do abuso de substância.

Em formas de realização particulares de qualquer dos aspectos da invenção previamente mencionados, a invenção pode adicionalmente compreender a utilização de um ou mais péptidos seleccionados de Factor 13 de coagulação, Apoliproteína Cl, Apoliproteina D, serina/treonina proteína Cinase, Membro 6 da subfamília B da cassete de ligação de ATP mitocondrial, ligase da proteína ubiquitina E3, Haptoglobina, proteína 2 contendo o domínio AAA da família de ATPase, Cadeia beta da espectrina do eritrócito, Proteína da matriz oligomérica da cartilagem,

Proteína C de ligação a manose, Integrina beta-3, Proteína 2 associada a microtúbulos, Catepsina L2, Factor B do complemento, Componente 5 do complemento, Vitronectina; proteína S,

Clusterina (ApoJ), proteína 2 de ligação a hialuronano, topoisomerase 2-alfa de ADN. 0 estudo que se segue ilustra a invenção 25

Estudo

Utilizando o perfil proteómico global, um intervalo de biomarcadores circulantes que se diferenciam do primeiro inicio, foram identificados doentes com esquizofrenia nafves para o fármaco de controlos saudáveis. 0 objectivo do estudo foi estabelecer a utilidade destes marcadores para 1) o diagnóstico precoce de esquizofrenia, 2) a previsão das respostas a fármacos com um foco nos efeitos metabólicos secundários, 3) a selecção de tratamentos de fármaco apropriados no primeiro inicio e 4) focando a medicina translacional na validação de modelos pré-clínicos para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos. Em particular, estes biomarcadores foram testados para selecção de doentes e para monitorização da sua resposta a novos tratamentos terapêuticos.

Materiais e Métodos 0 primeiro conjunto de 67 amostras de soro investigadas compreendeu 22 amostras retiradas de doentes com Esquizofrenia em primeiro início naives para o fármaco, 33 amostras retiradas de voluntários saudáveis e 12 amostras de controlo de qualidade. Estas foram preparadas de forma aleatória e de forma cega. 0 segundo conjunto de 46 amostras de soro compreendeu 20 amostras retiradas de doentes com Esquizofrenia em primeiro início naives para o fármaco, 18 amostras retiradas de voluntários saudáveis e 8 amostras de controlo de qualidade. Estas foram preparadas de forma aleatória e de forma cega. 26 A cada amostra foram removidas as 20 proteínas mais abundantes utilizando cromatografia de imunoafinidade (ProteoPrep20, Sigma, St. Louis MO), aplicando um total de 560 pg de proteína de cada amostra na coluna de remoção. A troca de tampão foi efectuada com 50 mM de bicarbonato de amónio utilizando colunas de centrifugação (Millipore, Bedford MA) com um peso molecular de exclusão de 5 kDa. As proteínas foram reduzidas utilizando 5 mM de ditiotreitol (Sigma, St. Louis MO) a 60 °C durante 30 min, e alquiladas com 10 mM de iodoacetamida (Sigma, St. Louis MO) no escuro à temperatura ambiente durante 30 min. As proteínas foram digeridas utilizando Tripsina (Promega, Madison, WI) , a uma proporção de 1:50 (p/p Tripsina/Proteína) durante 16 horas a 37 °C. As digestões foram interrompidas por adição de 2,3 pL de 8,8 M de HC1 a cada amostra. As amostras foram armazenadas a -80 °C.

Cada amostra foi injectada e analisada 3 vezes seguida pela injecção de um branco (para assegurar que não se arrastam péptidos de uma amostra para a outra neste processo sequencial). Para cada amostra, foram aplicados 8 pL utilizando "split-less nano Ultra Performance Liquid Chromatography" (10 kpsi nanoAcquity, Waters, Milford MA) . Os tampões utilizados foram A: H2O+0,l% de ácido fórmico; B: Acetonitrilo+0, 1% de ácido fórmico. A dessalinização das amostras foi efectuada em linha com de tampão A a 100% durante 3 minutes, utilizando uma coluna de captura em linha C18 de Fase Reversa (180 pm i.d., 20 mm de comprimento e 5 pm de tamanho de partícula) (Waters, Milford MA). As amostras foram separadas utilizando uma nanoColuna C18 (75 pm i.d., 200 mm de comprimento, 1,7 pm de tamanho de partícula) (Waters, Milford MA), a 300 mL/min. 27 A nanoUPLC foi acoplada em linha através de um emissor nanoESI de 7 cm de comprimento e 10 pm de ponta (New Objective, Woburn, MA) a um Espectrómetro de Massa Quadrupolo - Tempo de Vôo (Qtof Premier, Waters, Milford MA) . Os dados foram adquiridos em modo MSE (Expressão). Neste modo, o quadrupolo é estabelecido para transferir todos os iões enquanto a célula de colisão muda de baixa para elevada energia de colisão intermitentemente através do tempo de aquisição. Nos varrimentos de baixa energia, a energia de colisão foi estabelecida para 4 eV, enquanto nos varrimentos com energia elevada aumentou de 20 para 43 eV. Este modo permite a precisa medição de massa de péptidos intactos assim como fragmentos, e conservação do perfil cromatográfico para péptidos intactos e fragmentos. A precisão na massa foi mantida ao longo da análise pela utilização de um aparelho LockSpray. Um composto de referência (Glu-Fibrinopeptide B, Sigma, St. Louis MO) foi continuamente infusionado utilizando o LockSpray e varrido intermitentemente todos os 30 segundos. Durante o processamento de dados, o espectro do analito foi corrigido com base na diferença entre o pico detectado m/z e o pico teórico m/z (785, 8426 [m+2H]+) de Glu-Fibrinopeptide B.

Processamento de Dados e Identificação de Proteína

Os dados brutos, adquiridos em formato continuo, foram processados utilizando o programa de computador ProteinLynx Global Server software versão 2.3 (também conhecido como

IdentityE) (Waters, Milford MA) . A informação quantitativa e qualitativa foram produzidas automaticamente pelo software, utilizando os parâmetros de defeito. 28

Informação Quantitativa

As medições de intensidade foram obtidas por integração do volume total do ião de cada ião extraído, com redução de estado de carga, com remoção de isótopo e com massa corrigida na massa espectrométrica e no volume cromatográfico (uma versão tridimensional do método do cromatograma do ião extraído). Neste tipo de aquisição, o perfil cromatográfico é mantido de forma reprodutível ao longo do conjunto de amostras, deste modo é possível comparar directamente as intensidades de iões precursores ao longo de todas as injecções de todas as amostras, após normalização com base no padrão interno (digeridas com enolase de Saccharomyces cerevisiae) que foi adicionado a cada amostra. 0 conjunto de dados foi depois filtrado utilizando o software package R (www.r-project.org) livre e apenas péptidos que foram detectados em, pelo menos, 2 das 3 injecções de cada amostra e, pelo menos, 70% das amostras foram incluídas na análise. Estes péptidos que não passam estes critérios de filtração foram excluídos da análise dado que a informação quantitativa que estes produzem é de baixa confiança devido a fraca replicação.

As intensidades dos péptidos correlacionados de cada proteína identificada foram submetidos a cálculo da média para produzir intensidade de proteína total ao longo de todas as amostras em que foram detectadas, como descrito por Schwarz et al. 2007.

Foi efectuado um teste T de Student de duas caudas com base nas intensidades de proteína com uma significância de exclusão 29 de P<0,05. Os valores de p determinados foram corrigidos para teste de múltiplas hipóteses de acordo com Benjamini e Hochberg, significância de Q<0,05.

Resultados

Nome da Proteína Acesso Teste t (valor de p) Factor 13 de coagulação P05160|F13B_HUMAN 0, 014 Apoliproteína Cl P 0 2 6 5 4|AP0C1_HUMAN 0, 044 Apoliproteína D P 0 5 0 9 0|APOD_HUMAN 0,024 Importina 9 Q96P70|IP09_HUMAN 0,0066 Serina/treonina proteína Q9NRM7|LAT S 2_HUMAN 0, 033 Cinase Membro 6 da subfamília B Q9NP58|ABCB6_HUMAN 0, 035 da cassete de ligação de ATP mitocondrial Ligase da proteína Q8IWV8|UBR2_HUMAN 0,038 ubiquitina E3 NALP8 Q86W28|NALP8_HUMAN 0,0045 Proteína S dependente da PO 7225 PROS_HUMAN 0, 046 vitamina K Alfa-l-antiquimiotripsina PO 1011|AACT_HUMAN 0,0064 Lumicano P518 8 4|LUM_HUMAN 0,0169 Helicase Q15477|SKIV2_HUMAN 0, 019 Haptoglobina PO 0 738|HPT_HUMAN 0,043 Relacionados com PO 0 739|HPTR_HUMAN 0,0022 Haptoglobina 30 (continuação)

Nome da Proteína Acesso Teste t (valor de p) Proteína 2 contendo o domínio AAA da família de ATPase Q6PL18|ATAD2_HUMAN 0,0070 Cadeia da beta espectrina, eritrócito P11277|SPTB1_HUMAN 0,0084 Ligase LRSAM1 da proteína ubiquitina E3 Q6UWE0|LRSM1_HUMAN 0,0121 Membro 1B da família C do tipo ANKRD26 A5A3E0|A26CB_HUMAN 0,0124 Proteína 2B contendo o domínio AAA da família ATPase Q9ULI0|ATD2B_HUMAN 0,0144 proteína C9orf93 não caracterizada Q6TFL3|C10 9 3_HUMAN 0,0177 Proteína da matriz oligomérica da cartilagem P 4 9 7 4 7|COMP_HUMAN 0,0241 Globulina que se liga a tiroxina PO5543|THBG_HUMAN 0,0256 Membro AI da família contendo o domínio EF-mão Q8IYU8|EFHA1_HUMAN 0,0264 Proteína C de ligação a manose P112 2 6|MBL 2_HUMAN 0,0289 Sintase do semi-aldeído alfa aminoadípico, mitocondrial Q9UDR5|AASS_HUMAN 0,0307 Integrina beta-3 P051061|TB3_HUMAN 0,0318 31 (continuação)

Nome da Proteína Acesso Teste t (valor de p) Fosfodiesterase gama 1 de PI 9174|PLCG1_HUMAN 0,0332 1-fosfatidilinositol-4,5- bifosfato carboxipeptidase 2 Q5U5Z8|CBPC2_HUMAN 0,0341 citossólica Alfa-l-antiquimiotripsina PO 1011|AACT_HUMAN 0,0344 Proteína 2 associada a P1113 7|MAP 2_HUMAN 0,0349 microtúbulos Proteína FLJ36157 não Q8N9V7|YCO 0 9_HUMAN 0,0388 caracterizada Catepsina L2 0609111CATL2_HUMAN 0,0390 Atractina 0758821ATRN_HUMAN 0,0409 Rootletina Q5TZA2|CROCC_HUMAN 0,0414 Componente 7 do PI 0 643|C0 7_HUMAN 0,021981 complemento Factor B do complemento P 0 0 7 51|CFAB_HUMAN 0,027791 Componente 5 do PO 1031 C0 5_HUMAN 0,028466 Complemento IgMu P01871|MUC_HUMAN 0,031597 Afamina P 4 3 6 5 2|AFAM_HUMAN 0,038915 Proteína tipo quinesina Q9ULI4|K12 6 A_HUMAN 0,0381939 Vitronectina; proteína S P 0 4 0 0 4|VTNC_HUMAN 0,00111 Clusterina (ApoJ) P10909|CLUS_HUMAN 0,04233 Polimerase 1 de poli[ADP- P 0 9 8 7 4|PARP1_HUMAN 0,01680 ribose (PARP1] Proteína 2 de ligação a Q1452 0|ΗABP 2_HUMAN 0,02213 Hialuronano 32 (continuação)

Nome da Proteína Acesso Teste t (valor de p) Região C da cadeia gama 1 de Ig PO 1857|IGHG1_HUMAN 0, 03141 Paraoxonase/arilesterase 1 do soro P27169|P0N1_HUMAN 0,04709 Cadeia pesada H2 do inibidor de Inter-alfa-tripsina P19823|ITIH2_HUMAN 0,01793 Cadeia pesada H4 do inibidor da Inter-alfa-tripsina Q14624|ITIH4_HUMAN 0,01890 Apoliproteína C-III PO2656|APOC3_HUMAN 0,00538 Proteína da Zona da Gravidez P2G742|PZP_HUMAN 0,0445 Topoisomerase 2-alfa de ADN P11388|T 0P 2 A_HUMAN 0,0241 Cofactor 2 da heparina PO5546|HEP2_HUMAN 0,0424 Subcomponente Clr do complemento PO 0 736|C1R_HUMAN 0,0489

Lisboa, 8 de Agosto de 2013 33

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização in vitro de Importina 9, como um biomarcador para esquizofrenia ou predisposição para esta.
2. 2. Utilização in vitro de acordo com a reivindicação 1, compreendendo adicionalmente a utilização de um ou mais péptidos adicionais seleccionados de, NALP8, Proteína S dependente da vitamina K, Alfa-l-antiquimiotripsina, Lumicano, Helicase, Relacionados com haptoglobina, Membro 1B da família C tipo ANKRD26, Proteína 2B contendo o domínio AAA da família ATPase, Proteína C9orf93 não caracterizada, Globulina que se liga a tiroxina, Membro Al da família contendo o domínio EF-mão, Sintase do semi-aldeído alfa aminoadípico, mitocondrial, fosfodiesterase gama 1 de 1-fosfatidilinositol-4,5-bifosfato, Carboxipeptidase 2 citossólica, Proteína FLJ36157 não caracterizada, Atractina, Rootletina, Componente 7 do complemento, Afamina, Proteína tipo quinesina, Polimerase 1 de poli [ADP-ribose (PARP1], região C da cadeia gama 1 de Ig, paraoxonase/arilesterase 1 do soro, Cadeia pesada H2 inibidora de inter-alfa-tripsina, Cadeia pesada H4 do inibidor da Inter-alfa-tripsina, Apoliproteína C-III, Proteína da Zona da Gravidez, Cofactor 2 da heparina e Subcomponente do complemento Clr, como um biomarcador para a esquizofrenia ou predisposição para esta.
3. 3. Utilização in vitro de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, compreendendo adicionalmente a utilização de um ou mais péptidos adicionais seleccionados de ligase LRSAM1 da proteína ubiquitina E3, IgMu, Factor 13 de 1 coagulação, Apoliproteína Cl, Apoliproteína D, de Serina/treonina proteína Cinase, membro 6 da subfamília B da cassete de ligação de ATP mitocondrial, Ligase da proteína ubiquitina E3, Haptoglobina, Proteína 2 contendo o domínio AAA da família de ATPase, Cadeia beta da espectrina do eritrócito, Proteína da matriz oligomérica da cartilagem, Proteína C de ligação a manose, Integrina beta-3, Proteína 2 associada a microtúbulos, Catepsina L2, Factor B do complemento, Componente 5 do complemento, Vitronectina; proteína S, Clusterina (ApoJ), Proteína 2 de ligação a hialuronano e topoisomerase 2-alpha de ADN, como um biomarcador para esquizofrenia ou predisposição para esta.
4. 4. Método de diagnóstico ou monitorização de esquizofrenia ou predisposição para esta, compreendendo a detecção e/ou quantificação, numa amostra de um indivíduo de teste, do biomarcador listado na reivindicação 1.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, compreendendo adicionalmente a detecção e/ou quantificação, numa amostra de um indivíduo de teste, de um ou mais dos biomarcadores peptídicos adicionais listados na reivindicação 2 ou reivindicação 3.
6. 6. Método de monitorização de eficácia de uma terapia num indivíduo que tem, é suspeito de ter ou está predisposto a esquizofrenia, compreendendo a detecção e/ou quantificação, numa amostra do referido indivíduo, do biomarcador listado na reivindicação 1. 2
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, compreendendo adicionalmente a detecção e/ou quantificação, numa amostra do referido indivíduo, de um ou mais dos biomarcadores peptídicos adicionais listados na reivindicação 2 ou reivindicação 3.
8. 8. Método de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 7, que é conduzido em amostras retiradas em duas ou mais ocasiões de um indivíduo de teste.
9. 9. Método de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 8, compreendendo ainda uma comparação do nível do biomarcador presente em amostras retiradas em duas ou mais ocasiões.
10. 10. Método de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 9, compreendendo uma comparação da quantidade do biomarcador na referida amostra de teste com a quantidade presente em uma ou mais amostras retiradas do referido indivíduo antes de ter começado a terapia, e/ou uma ou mais amostras retiradas do referido indivíduo num estádio mais precoce da terapia.
11. 11. Método de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 10, compreendendo ainda a detecção de uma alteração na quantidade do biomarcador em amostras retiradas em duas ou mais ocasiões.
12. 12. Método de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 11, compreendendo a comparação da quantidade de biomarcador 3 13. presente na referida amostra de teste com um ou mais controlos. Método de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 12, em que amostras são retiradas antes e/ou durante e/ou após a terapia para a esquizofrenia. 14 . Método de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 13, em que a amostra biológica é fluido cérebroespinal, sangue total, soro de sangue, plasma, urina, saliva ou outro fluido corporal, ou hálito, hálito condensado, ou um seu extracto ou purificação, ou uma sua diluição. 15. Utilização de um kit para monitorização ou diagnóstico de esquizofrenia, em que o referido kit compreende um biossensor que detecta e/ou quantifica o biomarcador listado na reivindicação 1, em que o referido biossensor compreende um ligando capaz de se ligar especificamente ao biomarcador listado na reivindicação 1. Lisboa, 8 de Agosto de 2013 4