TWI710766B - 使用口服肉鹼耐量試驗以測定一個體內氧化三甲胺產能之檢測方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種使用口服肉鹼耐量試驗以測定一個體內氧化三甲胺產能之檢測方法，其包含下列步驟：(a)使一個體攝入一特定劑量之肉鹼；(b) 於該個體攝入該肉鹼後之特定時間點，取得該個體之一體液檢體，並檢測該體液檢體中之TMAO含量。本發明有別於一般市面上技術檢測僅檢測腸道菌相組成，本技術可直接檢測腸道菌在人體內產生氧化三甲胺的能力，並且相較於直接檢測血液中氧化三甲胺濃度有更好的腸道菌功能表型的預測效果。

Description

使用口服肉鹼耐量試驗以測定一個體內氧化三甲胺產能之檢測方法
本發明係關於一種測定一個體內氧化三甲胺產能之檢測方法，特別係關於一種使用口服肉鹼耐量試驗以測定一個體內氧化三甲胺產能之檢測方法。
腸道微生物群在心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)的發展中起著至關重要的作用。研究顯示，腸道中產生的一些微生物衍生的代謝產物參與了心血關疾病的發病機制。腸道微生物代謝產物如：氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide,TMAO)、短鍊脂肪酸及次級膽汁酸(secondary bile acid)可作為心血管疾病相關之慢性疾病(如：動脈粥狀硬化、肥胖及第二型糖尿病)的媒介。
左旋肉鹼(L-carnitine)是肉類產品中富含的營養素，尤其在紅肉中，其功能是攜帶脂肪酸穿過粒線體內膜進行β-氧化。然而，肉鹼可能會被腸道微生物群代謝，而增加冠狀動脈疾病患者心血管事件的風險。在腸道中，腸道微生物群將未吸收的肉鹼轉化為三甲胺，接著經肝臟代謝 成TMAO，TMAO進入循環並被腎臟有效率地排泄。流行病學前瞻研究中發現，血漿中TMAO濃度升高與心血管疾病進程呈正相關。在一組患有冠狀動脈疾病的患者(n=2595)中，高肉鹼濃度與3年內心肌梗塞、中風及死亡事件的風險有相關性，但是僅在伴隨有高TMAO濃度的病患中有顯著差異。這些發現可以作為紅肉消費與心血管疾病風險增加間關聯性的合理解釋。在動物研究中，長期膳食的肉鹼暴露增加了血漿中TMAO濃度、腸道微生物群的三甲胺合成能力以及動脈粥狀硬化的進程。TMAO對動脈粥狀硬化的影響機制包括泡沫細胞形成增加、膽固醇逆向轉運減少及血小板聚集增加。
最近，空腹血漿TMAO亦被證明是急性冠狀動脈綜合症或中風患者短期和長期心血管事件的預後標誌物。然而，對於這些負面結果並無明確的血漿TMAO臨界值。再者，由於TMAO在血液中快速由尿液中排出的特性以及血中濃度的波動性質，空腹血液中的TMAO或許不適合作為代表個體中腸道菌TMAO產能的標的。
本發明的目的在於解決習知技術中，過去腸道菌研究技術主要是以次世代基因定序分析腸道菌的菌種組成，然而，由於絕大部分的腸內菌的生物特性目前都尚未明瞭，因此檢測腸道菌的菌種組成通常無法推論其對人體健康扮演的功能角色。此外，過去曾有國外團隊利用單次檢測空腹血液中腸道菌代謝產物TMAO的濃度，作為判斷心血管疾病預後的方法，但由於血中TMAO會由腎臟代謝排出，因此無法可靠地代表腸道菌在人體內生成TMAO的能力。
此外，在臨床研究的劑量反應統合分析中，每增加10μM之血漿TMAO，總死亡率風險增加7.6%。在最近的動物和人血小板聚集研究中，血漿TMAO的濃度大於10至30μM會顯著增加血栓形成的可能性。然而，對於建康和病患群體，腎功能正常的受試者其空腹血漿TMAO濃度很少超過10μM。
有鑑於此，餐後血漿TMAO理論上反映了TMAO的病理生理濃度，是以，本發明建立了口服肉鹼耐量試驗(oral carnitine challenge test,OCCT)以模擬餐後血漿TMAO，並且以功能性的方式來顯現個體中來自飲食-腸道菌-宿主間交互作用，所產生的TMAO合成能力。
本發明提供一種使用口服肉鹼耐量試驗以測定一個體內氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide,TMAO)產能之檢測方法，其包含下列步驟：(a)使一個體攝入一特定劑量之肉鹼；(b)於該個體攝入該肉鹼後之特定時間點，取得該個體之一體液檢體，並檢測該體液檢體中之TMAO含量。
於一較佳實施例，該特定劑量為1000~2000mg。
於一較佳實施例，該肉鹼為左旋肉鹼。
於一較佳實施例，該左旋肉鹼為左旋肉鹼富馬酸鹽型態。
於一較佳實施例，該個體於步驟(a)前，禁食至少8小時，並於該步驟(a)前取得該個體之一禁食體液檢體，並量測該禁食體液檢體之TMAO含量做為OCCT試驗前個體之TMAO含量基準點。
於一較佳實施例，該特定時間點係攝入該肉鹼後之4小時、8小時、12小時、24小時、36小時及48小時。
於一較佳實施例，該特定時間點係攝入該肉鹼後之24小時及48小時。
於一較佳實施例，該個體於攝入該肉鹼後之特定時間點時禁止食用富含肉鹼食品。
於一較佳實施例，該個體之體液檢體係血液或尿液。
於一較佳實施例，該TMAO含量係與心血管疾病、治療藥物的效果評估及個人化飲食相關。
本發明之使用口服肉鹼耐量試驗以測定一個體內氧化三甲胺產能之檢測方法具有以下優勢功效：
1.本發明之方法利用口服肉鹼耐量試驗，給予受測個體服用特定劑量之肉鹼，之後檢測特定時間點體液檢體(如：血液及/或尿液)的TMAO濃度，即可以計算出其腸道菌在體內生成TMAO的能力。
2.本發明建立之方法中，受測個體在同樣的檢體採集時間點，血液與尿液之TMAO濃度具有高度相關性，亦即可以使用尿液檢體取代血液檢體作為口服肉鹼耐量試驗之臨床用途。
3.本發明之方法中，口服肉鹼耐量試驗之檢測結果可作為開發TMAO生成相關之新穎微生物標記之參考依據。
4.本發明之方法毋須使用同位素標定之肉鹼。
綜上所述，本發明之方法可作為臨床上人體腸道菌叢的功能性檢測方法，可辨別受測者之腸道菌叢在人體內將肉鹼代謝並生成氧化三甲胺的能力，藉此評估受測者之腸道菌對於心血管疾病所產生風險，檢測結果可提供受測者飲食建議與藥物治療參考等臨床用途，並可提供腸道菌與氧化三甲胺生成相關生物標記之研發方向。
S01:使一個體攝入一特定劑量之肉鹼
S02:於該個體攝入該肉鹼後之特定時間點，取得該個體之一體液檢體
S03:檢測該體液檢體中之TMAO含量
圖1，係本發明一較佳實施態樣之流程示意圖。
圖2，係本發明一較佳實施態樣之流程示意圖。
圖3，係本發明一較佳實施例之素食者及葷食者之間飲食模式的差異對腸道微生物組成和多樣性分析。(3A)所示為葷食者及素食者的膳食微量營養素熱點圖(q值<0.1)，群集營養素顏色由6種營養素類別標記，紅色=豐度較高；藍色=豐度較低。(3B)所示為素食者和雜食者的肉鹼和膽固醇攝取濃度長條圖。(3C)所示為食物頻率問卷營養素數據分析圖(排列多變量方差分析，permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA；p<0.001)。(3D)所示為素食者和葷食者中腸道微生物群的成分特徵分析圖，使用Bray-Curtis距離計算(PERMANOVA：p=0.3528)。(3E)所示為素食者與葷食者的α多樣性指數的比較。(3F)所示為葷食者和素食者的厚壁菌門/擬桿菌門比例。所有長條圖中的數據表示為平均值±SEM。藉由學生t檢定分析長條圖和箱型圖中所有的統計數據。
圖4，係本發明一較佳實施例之OCCT的藥物動力學(pharmacokinetic,PK)試驗。(4A)試驗者血液檢查結果。(4B)左圖顯示不同志願者的OCCT中AUC的長條圖，右圖顯示同一名志願者進行不同PK試驗結果。(4C)在相同和不同個體中的不同藥物動力學試驗的AUC之標準化相異性。(D)收集時間點驗證和簡化OCCT之示意圖。AUC：曲線下面積；CCT：肉鹼耐量試驗；TMAO：氧化三甲胺。
圖5，係本發明一較佳實施例，其中顯示葷食者和素食者表現出不同程度的將左旋肉鹼轉化為體內TMAO的能力。(5A)對23名素食者和34名葷食者進行本發明之方法，其血漿TMAO濃度分析圖，數據表示為平均值±SEM； *p<0.05。(5B)在素食者和葷食者群組空腹血漿TMAO濃度的統計分析。(5C)葷食者OCCT的AUC值和血漿TMAO最大值統計分析。(5D)根據OCCT的AUC值將受測者分為四個四分位數，具有Q1級AUC值標記為低TMAO生產者，在Q4中受測者標記為高TMAO生產者，Q2和Q3之間的受測者則標記為中間生產者。(5E)高TMAO生產者及低TMAO生產者中葷食者、素食者佔比。(5F)顯示在高TMAO生產者及在低TMAO生產者中葷食者的比例。所有長條圖中數據表示為平均值±SEM。
圖6，係本發明一較佳實施例，經由OCCT分組的功能表型與腸道微生物群組成、多樣性、特徵和功能分析。(6A)顯示為高TMAO生產者和低TMAO生產者OCCT曲線。數據表示為平均值±SEM。(6B)顯示高TMAO生產者和低TMAO生產者間空腹血漿TMAO濃度。(6C)顯示高TMAO生產者和低TMAO生產者AUC值和最大OCCT值。(6D)顯示階層式聚集的熱點圖。(6E)顯示高TMAO生產者和低TMAO生產者間F/B比例。(6F)顯示高TMAO生產者和低TMAO生產者間的Shannon指標及Chao1指標的α多樣性。(6G)顯示高TMAO生產者和低TMAO生產者間腸道微生物群概況的主座標分析。(6H)顯示LDA(linear discriminant analysis，線性判別分析)得分排序之高TMAO生產者與低TMAO生產者的特徵譜系類群。(6I)顯示人源化含特定菌小鼠模型的TMAO產能表型。數據表示為平均值±SEM。。
圖7，係本發明一較佳實施例之樣品分析結果。上圖為171個血漿樣本的對數TMAO值與來自相同受測者和取樣時間的尿液樣本之對應TMAO值。下圖為57名受測者中血漿TMAO的對數AUC值與同一OCCT中尿液TMAO的AUC值。
有關本發明之詳細說明及技術內容，現就配合圖式說明如下。再者，本發明中之圖式，為說明方便，其比例未必照實際比例繪製，該等圖式及其比例並非用以限制本發明之範圍，在此先行敘明。
除非另有說明，本文所述之「或」表示「和/或」之意。本文中所稱之「包含或包括」意指不排除一或多個其他組件、步驟、操作和/或元素的存在或添加至所述之組件、步驟、操作和/或元素。本文所述之「包含」、「包括」、「含有」、「囊括」、「具有」也可互相代換而不受限制。
本文所述之「一」意指該物的語法對象為一或一個以上(即，至少為一)。相似地，本文及申請專利範圍所述單數格式之「一」、「一個」、「一種」及「該」包含複數指涉。
除非另有定義，本文中所有技術和科學用語與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解的含義相同。此外，在本申請中所使用的以下術語具有如下涵義。
以下請一併參照「圖1」及「圖2」，其所示為本發明之檢測方法較佳實施態樣之流程示意圖，如圖所示：
如圖1所示，本發明提供一種使用口服肉鹼耐量試驗以測定一個體內氧化三甲胺產能之檢測方法，其包含下列步驟：(a)使一個體攝入一特定劑量之肉鹼S01；(b)於該個體攝入該肉鹼後之特定時間點，取得該個體之一體液檢體S02，並檢測該體液檢體中之TMAO含量S03。
如圖2所示，於一較佳實施態樣中，該個體在步驟(a)前，禁食至少8小時S01.1，並於該步驟(a)前取得該個體之一禁食體液檢體S01.2，並量測該 禁食體液檢體之TMAO含量做為OCCT試驗前個體之TMAO含量基準點S01.3；接著進行步驟(a)使一個體攝入一特定劑量之肉鹼S01。較一較佳實施態樣中，該個體在步驟(b)前，該個體於攝入該肉鹼後之特定時間點時禁止食用富含肉鹼食品S02.1；接著進行步驟(b)於該個體攝入該肉鹼後之特定時間點，取得該個體之一體液檢體S02，並檢測該體液檢體中之TMAO含量S03。
本文所述之「肉鹼(carnitine)」是一種胺基酸衍生物，其功能是攜帶脂肪酸穿過粒線體內膜進行β-氧化，其具有兩種立體異構物包括左旋肉鹼(或稱L-肉鹼，L-carnitine)及右旋肉鹼(或稱D-肉鹼，D-carnitine)。於一較佳實施態樣中，本發明之方法中所用的肉鹼耐量試驗(oral carnitine challenge test,OCCT)之該肉鹼為左旋肉鹼。於一較佳實施態樣中，本發明之方法中所用的肉鹼耐量試驗之該肉鹼為左旋肉鹼富馬酸鹽型態(L-carnitine fumarate)。
因肉鹼是肉類產品中富含的營養素，故本文所述之「富含肉鹼食品」是指肉類食品及/或肉類產品，尤其是在紅肉及海鮮中，更進一步可包括乳製品；前述紅肉係指於烹飪前呈現出紅色的肉，具體例如但不限於：豬肉、牛肉、羊肉、鹿肉等哺乳動物的肉；前述海鮮(或稱海產)例如但不限於：魚類、甲殼類(如：蝦、蟹)、貝類、軟體動物、棘皮動物、海帶等，本文所述之海鮮類並不限於新鮮的海產食物，亦包括經乾燥脫水處理的海產食物。
本文於步驟(a)中所述之「攝入」以進行口服肉鹼耐量試驗的途徑，較佳係為口服劑之方式(但是，本文中不排除以其他方式例如注射劑取代口服以進行相當於口服之肉鹼耐量試驗)，使個體獲得特定量之肉鹼。於一較佳實施態樣中，本發明步驟(a)該個體攝入該特定劑量之肉鹼為1000至2000mg，例如但不 限於：1000mg、1050mg、。1100mg、1150mg、1200mg、1250mg、1300mg、1350mg、1400mg、1450mg、1500mg、1550mg、1600mg、1650mg、1700mg、1750mg、1800mg、1850mg、1900mg、1950mg或2000mg等。
肉鹼可能會被腸道微生物群代謝，在腸道中，腸道微生物群將未吸收的肉鹼轉化為三甲胺(trimethyl-amine,TMA)，接著經肝臟中的黃素單氧化酶(flavin monooxygenase,FMO3)氧化成TMAO，本文所述之「氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide,TMAO)」即是指肉鹼經個體內腸道菌轉化經肝臟代謝後所產生的產物。肉鹼代謝細菌例如但不限於：含有cntA/B的細菌如大腸桿菌(E.coli)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella spp)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter spp)等。本發明發現尿液排泄和飲食習慣會影響個體內TMAO波動，從OCCT獲得的個體內TMAO值有助於從日常飲食-腸道菌群間相互作用展現血漿TMAO的病理生理水平。於一較佳實施態樣中，利用本發明之方法測定的該TMAO含量係與心血管疾病、治療藥物的效果評估及個人化飲食相關。
本發明步驟(b)中，於該個體攝入該肉鹼後之特定時間點，取得該個體之一體液檢體，本文所述之「特定時間點」係選自由攝入該肉鹼後之1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、13小時、14小時、15小時、16小時、17小時、18小時、19小時、20小時、21小時、22小時、23小時、24小時、25小時、26小時、27小時、28小時、29小時、30小時、31小時、32小時、33小時、34小時、35小時、36小時、37小時、38小時、39小時、40小時、41小時、42小時、43小時、44小時、45小時、46小時、47小時、48小時、49小時、50小時、51小時、52小時、53小時、54小時、55小時、56小時、57小時、58小時、59小時、60小時、61小時、62小時、63小時、 64小時、65小時、66小時、67小時、68小時、69小時、70小時、71小時及72小時所組成之群組中至少一個時間點。於一較佳實施態樣中，該特定時間點係攝入該肉鹼後之24小時及48小時。
本文所述之「體液檢體」例如但不限於：血液、腦脊髓液、腹膜液、胸膜液、關節液、透析液、羊膜液、支氣管抽吸物、支氣管肺泡沖洗液、膽汁、臍帶血、十二指腸液、黴菌血液培養、留置導尿管尿液、胃液、淋巴液、鼻咽抽取液、經皮腎開口尿液、精液、痰液、汗液、尿液、陰道分泌物或水泡液等。於一較佳實施態樣中，該個體之體液檢體係血液或尿液。
下文中，將進一步以詳細說明及實施態樣描述本發明，然而，應理解這些實施態樣僅用於幫助可更加容易理解本發明，而非用以限制本發明之範圍。
[實施例1]-血漿檢體
本實施例利用藥物動力學的方式進行OCTT條件的優化，並且招募不同食性(葷食與素食)的個體(以下亦稱為受試者)進行確效實驗。本實施例將57位受試者糞便檢體分別進行了16S rDNA的定序分析獲得菌相組成，並且與OCTT的結果數值、宿主基因型、飲食頻率、血中生化數值一起進行整合性的分析。
A.材料與方法
葷食與素食受測群體：招募57位健康志願者，其中包括23位素食者及純素食者及34位葷食者。於本實施例中，自我報告在過去2年或更長時間內沒有吃過任何肉類或海鮮產品的受測者被定義為素食者。所有受 測者均使用健康史調查表進行篩選，納入標準為：(1)年齡
Figure 108128635-A0305-02-0013-34
20歲；(2)在過去一個月內未曾接觸抗生素、益生菌或肉鹼補充劑。有以下狀況的受測者被排除於試驗外：若受測者報告最近有胃腸道不適(例如：腹痛或腹瀉)或慢性疾病史，包括重症肌無力症、糖尿病、慢性腎病、副甲狀腺機能亢進症、癲癇和嚴重貧血。每位受測者皆完成膳食評估FFQ，並簽署了國立臺灣大學醫院機構審查委員會提供的受試者知情同意過程記錄。
膳食評估：受測者的飲食使用半定量FFQ進行評估。本實施例中使用的FFQ已在之前的研究中得到驗證；調查問卷顯示出對於確定臺灣素食者和葷食者飲食中主要營養成份的可靠性和有效性。在本實施例中，用於計算FFQ結果的營養素分析程序是基於臺灣的食品成份數據庫。肉鹼攝入量是根據之前公佈的數值計算。營養素和食物攝入量的群組是經由線性回歸標準化為Z分數，調整總卡路里攝入量，以殘值中心化。
口服肉鹼耐量試驗(Oral carnitine challenge test,OCCT)：所有受測者在OCCT之前禁食過夜(>8小時)。收集空腹血液和和單次尿液(spot urine)樣本作為基線，然後將3片富馬酸鹽型態左旋肉鹼(L-carnitine fumarate，供應商：GNC)口服施予受測者。隨後，受測者在口服肉鹼耐量24小時和48小時後進行時間序列抽血同時進行單次尿液收集。要求受測者在採集血液後2小時內提供尿液樣本。要求所有受測者在肉鹼耐量試驗期間避免攝取紅肉、海鮮和任何藥物。前述血漿及尿液樣本在以3000rpm離心後分裝，並儲存在-20℃冰箱中。藉由HPLC檢查10個肉鹼片劑(供應商：GNC)以驗證OCCT中使用左旋肉鹼的量。每片中富馬酸鹽型態肉鹼的平均劑量為693.5(SD±63.2)mg(
Figure 108128635-A0305-02-0013-35
400mgL-carnitine/tablet)。
口服肉鹼對血漿TMAO的藥物動力學研究：招募13名獨立志願者進行OCCT的藥物動力學研究。在口服肉鹼耐量後，於第4、8、12、24、36及48小時收集血液樣本。6名志願者同意在3個月後再次參加相同的藥物動力學試驗。所有志願者皆簽署了國立臺灣大學醫院機構審查委員會提供的受試者知情同意過程記錄。
統計分析：使用雙尾學生T檢定或Wilcoxon無母數分析以比較認為適當的群組平均。使用邏輯斯迴歸模式計算葷食者和素食者作為高TMAO生產者和對應95%信賴區間的勝算比(Odds ratio,OR)。使用皮爾森相關以計算兩個變量間的關聯性。所有統計使用統計軟體R(V.3.4.1)或GraphPad Prism(V.7)分析。
B.結果1：
個體血漿中肉鹼含量：人口統計學數據和生化數據值的比較顯示出，葷食者和素食者之間的幾種代謝參數，即，血漿肉鹼、血清總膽固醇、低密度脂蛋白、尿素氮、空腹血糖及天冬氨酸轉胺酶(aspartate transaminase)等之濃度(level)存有顯著差異(如表1所示)。在比較的參數中，葷食者和素食者之間的肉鹼和膽固醇濃度表現出最顯著的差異(p<0.0001)。然而，葷食者和素食者之間的尿液肉鹼濃度並未顯示出顯著差異。通常，尿液TMAO濃度顯著高於血漿TMAO濃度，而肉鹼在血漿樣品中較為豐富。此一發現可顯示出人體傾向於將肉鹼作為營養物質保存，並通過泌尿系統排泄TMAO作為廢物。葷食者(血液：3.54±0.96μM；尿液：68.13±20.70nmol/mmol)的血液和尿液中空腹TMAO濃度均高於素食者(血液：1.87±0.21μM；尿液：33.98±3.49nmol/mmol)；然而，差異並未 達統計學意義(見表1)。
Figure 108128635-A0305-02-0015-1
Figure 108128635-A0305-02-0016-3
葷食者和素食者間明顯不同的飲食模式造成腸道微生物群(gut microbiome)的微小差異：在使用食物頻率問卷(food frequency questionnaire,FFQ)計算的87種營養素濃度中，其中43種在葷食者和素食者之間差異顯著(p<0.05)，FDR<0.1。圖3顯示素食者及葷食者之間飲食模式的差異對腸道微生物組成和多樣性沒有顯著差異。葷食者比素食者攝取更多的膽固醇、肉鹼、飽和脂肪和動物蛋白(圖3A、B)，圖3B中素食者和雜食者的肉鹼和膽固醇攝取濃度呈現出相當顯著地差異。因此，葷食者表現出較高的血清膽固醇、肉鹼、LDL及尿素氮濃度(表1)。使用FFQ計算所有營養素的主成分分析結果也顯示出葷食者和素食者間存在顯著不同的飲食模式(圖3C)。然而，如圖3D素食者和葷食者中腸道微生物群的成分特徵顯示，使用Bray-Curtis距離計算的主座標分析證明沒有顯著差異(PERMANOVA：p=0.3528)。圖3E為素食者與葷食者的α多樣性指數的比較。圖3F葷食者和素食者的F/B ratio沒有顯著差異。是以，根據主座標分析(principle coordinate analysis)，α多樣性和厚壁菌門/擬桿菌門比例(Firmicutes/Bacteroidetes ratio,F/B ratio)的結果(圖3D至F)，葷食者和素食者之間的腸道微生物群概況和 指標並無顯著差異，雖然在次要腸道微生物群落(<2%物種)中有中度顯著差異。LEfSe(linear discriminant analysis effect size)分析的結果顯示，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)在素食者的腸道微生物群中普遍存在，而在葷食者的腸道微生物群具有梭菌科(Clostridiaceae)、擬桿菌屬(Bacteroidales)S24及優桿菌屬(Eubacterium)的特徵分類群。這些發現與先前的研究結果一致。
血漿TMAO在OCCT的24至48小時的時間間隔內達到峰值：本實施例假設血液中的TMAO形成發生在OCCT大約24小時，基於腸傳輸所需的時間、微生物分解代謝和肝FMO3的酶反應(enzymatic reaction)以將攝入的肉鹼轉化為血漿TMAO。本實施例對OCCT進行了藥物動力學研究，以證實此一假設(圖4)。於本試驗中，招募13名志願受測者，每位攝入3片富馬酸鹽型態左旋肉鹼(供應商：General Nutrition Centers,GNC，美國賓夕法尼亞州)，大約1200mg左旋肉鹼，之後於指定時間點(第0、4、8、12、24、36及48小時)收集血液樣本，共接受了7次血液檢查。藉由高效液相層析儀(HPLC)驗證每一片劑的肉鹼量，以確保每次試驗中左旋肉鹼的劑量皆一致。在OCCT後，血漿TMAO濃度在波谷值水平保持穩定12小時，在24小時後峰值開始出現(圖4A)。血漿肉鹼濃度在OCCT後4小時達到峰值，而血漿中的TMA和γ-丁基甜菜鹼(γ-butyrobetaine)保持在非常低的濃度。圖4B顯示不同志願者的OCCT中AUC的長條圖。在此13名受測者中，6名受測者參加了3個月後另外的藥物動力學研究(第二次PK試驗)，並且在結果中再現了每個個體的原始趨勢和數值(圖4B、C)。如圖4C在相同和不同個體中的不同藥物動力學試驗的AUC之標準化相異性(定義|AUC1-AUC2|/[AUC1+AUC2]，AUC1：第一次PK試驗的AUC；AUC2：第二次PK試驗的AUC)，這些數據表示TMAO產能的趨勢可以在同一個體中定期重現。因此，根據藥物動力學試驗的結果充分收 集時間點驗證和簡化OCCT，OCCT被簡化為涉及三個樣本收集時間：基線(空腹血糖TMAO)、24小時和48小時(圖4D)。
OCCT有效區分葷食者和素食者之間的腸道微生物群媒介(gut microbiota-mediated)之TMAO產能：經由本發明之方法，葷食者和素食者間空腹血漿TMAO濃度差異為中度。因此，本實施例所提供的OCCT可用於確定由腸道微生物群媒介的個體TMAO產能。所有葷食和素食受測者皆參與了簡化的OCCT，在基線、24小時及48小時收集血液和尿液。圖5顯示葷食者和素食者表現出不同程度的將左旋肉鹼轉化為體內TMAO的能力，藉由學生t檢定分析OCCT中特定時間點的血漿TMAO濃度和禁食血漿TMAO數據；藉由Mann-Whitney U檢定分析OCCT中TMAO和TMAOMAX的AUC。圖5A對23名素食者和34名葷食者進行本發明之方法，與基線相比，素食者和葷食者間血漿TMAO濃度的差異出現在24小時和48小時。圖5B在素食者和葷食者群組間並未發現空腹血漿TMAO濃度的顯著差異。換言之，在OCCT曲線中，葷食者和素食者的血漿TMAO濃度在24小時和48小時時出現差異，但空腹TMAO濃度則維持相似(圖5A、B)。與禁食TMAO的值相反，葷食者的OCCT曲線下面積(AUC)及最大值顯著高於素食者(圖5C)。
葷食者較素食者更有可能成為高TMAO生產者：為進一步確定用於TMAO生產的腸道微生物群的功能表型，本實施例繪製了來自全部57個受測者的OCCT結果的AUC值，並將AUC值分組為四分位數。具有Q1級AUC值的14名受測者標記為低TMAO生產者，而在Q4中的14名受測者標記為高TMAO生產者(圖5D)，Q1和Q4之間的受測者(即Q2和Q3)則標記為中間生產者。圖5E顯示，高TMAO生產者中葷食者佔35.3%，素食者佔8.7%，低TMAO生產者中葷食者佔 14.7%，素食者佔39.1%。換言之，在葷食受測者中，有35.3%被歸類為高TMAO生產者，14.7%被歸類為低TMAO生產者；相較之下，只有8.7%素食者被歸類為高TMAO生產者，39.1%被歸類為低TMAO生產者。關於由OCCT定義的TMAO產能表型，圖5F顯示在高TMAO生產者中，12/14(86%)為葷食者，在低TMAO生產者中，5/14(36%)為葷食者，與素食組相比，葷食組的受測者表現出10倍的OR(OR：10.8、95% CI：1.69至68.94)作為高TMAO生產者。然而，儘管長期(>10年)堅持嚴格素食，一些素食者在服用高劑量的肉鹼時，表現出相當大的TMAO產能。
經TMAO產能的功能表型分析後，腸道微生物群特徵變得不同，圖6顯示經由OCCT分組的功能表型與腸道微生物群組成、多樣性、特徵和功能的差異顯著相關，其中藉由學生t檢定分析OCCT中特定時間點的血漿TMAO濃度、禁食血漿TMAO、F/B比例、Shannon指標及Chao1指標、血漿d9-TMAO及d9-TMA數據；藉由Mann-Whitney U檢定分析OCCT中TMAO和TMAOMAX的AUC；其中*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001。在本實施例中，使用OCCT測定高TMAO生產者(n=14)和低TMAO生產者(n=14)的功能表型對應於不同的OCCT曲線和顯著差異的AUC及TMAO最大值(TMAOmax)(圖6A至C)。然而，高TMAO生產者和低TMAO生產者間空腹血漿TMAO濃度的差異仍為中度(圖6B)。該發現表示，在臨床評估中應考慮使用本發明之耐量試驗而非單次的血液測試，以確定產生TMAO的腸道微生物群的功能表型。此外，圖6D階層式聚集的熱點圖顯示關聯細菌分類群的濃度，顯著區分高、低TMAO生產者(p<0.01)。與低TMAO生產者相比，高TMAO生產者的後壁菌門(Firmicutes phylum)(粉紅色)顯示為相對較高的分類群，對於擬 桿菌門(Bacteroidetes phylum)(黃色)顯示相反的結果。圖6G高TMAO生產者和低TMAO生產者間腸道微生物群概況(profiles)的主座標分析表示存在顯著差異。如熱點圖和主座標分析所示，高TMAO生產者和低TMAO生產者中腸道微生物群的組成模式是不同的(圖6D、G)。其他常見的腸道微生物群功能指標，包括F/B比、Shannon指標及Chaol指標，亦顯示高TMAO生產者和低TMAO生產者之間的顯著差異(圖6E、F)。高TMAO生產者其較高的α多樣性表示腸道微生物群的組成複雜性較高，以獲得TMA合成功能。高TMAO生產者中較高的F/B比與先前研究中高風險CVD病患的發現相對應。此外，關於高TMAO生產者和低TMAO生產者間特徵細菌分類群LEfSe分析的結果與先前控制良好小鼠實驗中檢測到的類群(標記於紅框中)結果相似(圖6H)。
在人源化含特定菌小鼠模型中(humanised gnotobiotic mice model)再現使用OCCT以測定個體內TMAO產能表型：使用OCCT以測定一個體內TMAO產能的功能表型是基於複雜的飲食-腸道微生物群-宿主相互作用。因此，本實施例使用人源化含特定菌小鼠模型來重建體內這些複雜的相互作用。藉由使用來自本試驗群組之高TMAO生產者及低TMAO生產者的糞便，對無菌小鼠(germ-free mice)進行糞便微生物移植(Fecal microbiota transplantation,FMT)。在動物模型中，飲食和宿主因素得到良好控制。將8隻9週齡雄性無瘤小鼠分為兩組(每組n=4)，並使用來自兩個人類供體(高TMAO生產者及低TMAO生產者)的糞便樣本在每組小鼠中進行胃管飼法FMT，移植供體的糞便為生物群作為人源化含特定菌小鼠模型。所有小鼠都接受補充肉鹼的飲食(於水中13%)5週，之後通過胃管飼法(oral gavage)接受d9-肉鹼口服激發試驗。結果顯示，在小鼠中顯著地再現 了供體的TMAO產能表形，腸道微生物群的移植將人類宿主產生TMAO的表型傳遞給小鼠宿主(圖61)。
C.結果2：
以尿液樣本作為OCCT測定一個體內TMAO產能之檢測方法：經前述試驗，已證明利用OCCT是測量個體中TMAO產能的標準。不過血漿TMAO濃度通常在OCCT之24小時後達到峰值，且所需的連續血液採樣可能對臨床實踐和病患順從性有所挑戰。因此，本發明進一步比較同時收集的171對血液和尿液樣本。如圖7所示，樣品分析結果顯示出尿液TMAO濃度與血漿TMAO濃度有強烈相關性，171個血漿樣本的對數TMAO值與來自相同受測者和取樣時間的尿液樣本之對應TMAO值強烈相關。此外，進一步對來自接受OCCT受測者的57對血液和尿液樣本的AUC值進行比較，結果亦顯示57名受測者中血漿TMAO的對數AUC值與同一OCCT中尿液TMAO的AUC值兩者具有高度顯著的相關性。前述兩個變數間的關聯性使用Pearson相關進行計算。以上結果表示，尿液收集可以替代OCCT中的血液採集，此方案可增加本發明之方法用於臨床實踐的可行性。
呈上所述，本發明使用OCCT以測定一個體內TMAO產能之檢測方法可就其TMAO產能而言確定個體腸道微生物群的功能狀態。本發明中OCCT根據其TMAO產生能力成功地區分了葷食及素食受測者。使用本發明之方法，可進一步表徵高TMAO生產者及低TMAO生產者的腸道微生物群，並且利用糞便微生物移植法於無菌小鼠中再現產生TMAO的表型。此外，本發明更進一步提供以尿液TMAO作為血漿TMAO的替代生物標誌物，可促進用於臨床實踐的可行性。在精準醫學時代，本發明之方法可作為CVD患者的個性化飲食指導、新藥開發 治療工作的評估工具、飲食誘發血栓形成風險調查的標準方法以及研究糞便中與TMAO相關生物標誌物的潛在基準。
本發明中OCCT可用於從腸道微生物群鑑定個體TMAO產能，以作為涉及個體減少產生TMAO的指導參考，例如，對於CVD病患，可以向高TMAO生產者建議採用低肉鹼飲食指南。此外，OCCT可以模擬餐後TMAO並反映受測者血漿TMAO的生理水平。先前有研究對於18名健康志願者接受連續膽鹼(choline)補充一個月，結果顯著增加了空腹血漿TMAO濃度以及增強血小板高反應性。因此，本發明中OCCT也可用於反映飲食誘導的TMAO，並評估相關的血栓形成潛力。最後，由於OCCT可以展現TMAO生產者表型，故亦可作為進一步的TMAO相關微生物標誌物調查和驗證的基準。
綜上所述，本發明之方法利用口服肉鹼耐量試驗，給予受測個體服用特定劑量之肉鹼，之後檢測特定時間點體液檢體的TMAO濃度，即可以計算出其腸道菌在體內生成TMAO的能力，且經實施例驗證血液與尿液之TMAO濃度具有高度相關性，亦即可以使用尿液檢體取代血液檢體作為口服肉鹼耐量試驗之臨床用途。本發明利用口服肉鹼耐量試驗之檢測結果可作為開發TMAO生成相關之新穎微生物標記之參考依據，並且毋須使用同位素標定之肉鹼。據此，本發明之方法可作為臨床上人體腸道菌叢的功能性檢測方法，可辨別受測者之腸道菌叢在人體內將肉鹼代謝並生成氧化三甲胺的能力，藉此評估受測者之腸道菌對於心血管疾病所產生風險，檢測結果可提供受測者飲食建議與藥物治療參考等臨床用途，並可提供腸道菌與氧化三甲胺生成相關生物標記之研發方向。
以上已將本發明做一詳細說明，惟以上所述者，僅惟本發明之一較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即凡依本發明 申請專利範圍所作之均等變化與修飾，皆應仍屬本發明之專利涵蓋範圍內。
S01:使一個體攝入一特定劑量之肉鹼
S02:於該個體攝入該肉鹼後之特定時間點，取得該個體之一體液檢體
S03:檢測該體液檢體中之TMAO含量

Claims (10)

  1. 一種使用口服肉鹼耐量試驗(oral carnitine challenge test,OCCT)以測定一個體內氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide,TMAO)產能之檢測方法，其包含下列步驟：(a)使一個體攝入一特定劑量之肉鹼；(b)於該個體攝入該肉鹼後之複數個特定時間點，取得該個體之一體液檢體，並檢測該體液檢體中之TMAO含量；其中該個體為人體。
  2. 如請求項1之方法，其中該特定劑量為1000~2000mg。
  3. 如請求項1之方法，其中該肉鹼為左旋肉鹼。
  4. 如請求項3之方法，其中該左旋肉鹼為左旋肉鹼富馬酸鹽型態。
  5. 如請求項1之方法，其中該個體於步驟(a)前，禁食至少8小時，並於該步驟(a)前取得該個體之一禁食體液檢體，並量測該禁食體液檢體之TMAO含量做為OCCT試驗前個體之TMAO含量基準點。
  6. 如請求項1至5任一項之方法，其中該特定時間點係攝入該肉鹼後之4小時、8小時、12小時、24小時、36小時及48小時。
  7. 如請求項1至5任一項之方法，其中該特定時間點係攝入該肉鹼後之24小時及48小時。
  8. 如請求項7之方法，其中該個體於攝入該肉鹼後之特定時間點時禁止食用富含肉鹼食品。
  9. 如請求項8之方法，其中該個體之體液檢體係血液或尿液。
  10. 如請求項9之方法，其中該TMAO含量係與心血管疾病、治療藥物的效果評估及個人化飲食相關。
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