CN104311655A

CN104311655A - 一种检测冠心病的血清学生物标志物及其应用

Info

Publication number: CN104311655A
Application number: CN201410623721.8A
Authority: CN
Inventors: 雷桅; 陈灿; 税晓容
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2014-11-07
Publication date: 2015-01-28

Abstract

本发明涉及一种检测冠心病的血清学生物标志物及其应用，属于检验医学、临床医学、生物技术及生物化学领域；该生物标志物为人Samd3蛋白；其与冠心病的发生发展密切相关，利用Samd3蛋白作为预测冠心病发生和判断冠心病发展程度的生物标志物，与目前常规的病理分型诊断冠心病发病和预后相比，可以更加个体化、准确地预测冠心病的早期发病情况和恶性程度；此外，该标志物可以用于制备筛查冠心病或辅助冠心病病理鉴定、临床诊断和亚型辨别的试剂盒。

Description

一种检测冠心病的血清学生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测冠心病的血清学生物标志物及其应用，具体涉及一种冠心病的生物标志物——血清Samd3蛋白及其在冠心病筛查与临床诊断中的应用，属于检验医学、临床医学、生物技术及生物化学领域。

背景技术

近年来，随着人们生活水平的提高，人口老龄化比例不断上升，在全球范围内，高血压、冠心病、糖尿病、肺动脉高压等心血管疾病的发病率呈显著上升趋势，成为严重威胁人类健康的主要疾病之一。据世界卫生组织的最新统计，全世界每年有约1730万人死于各种心脑血管疾病，约占总死亡率的30%，远高于包括癌症、艾滋病在内的其它疾病，被称为第二次卫生革命的头号敌人（WHO, 2012）。

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是心血管疾病中发病率和致死率最高的病种，其中约有80%左右的心源性猝死是由冠状动脉粥样硬化性心脏病（AS）所引起的，而余下20%的源于心肌病、左心室肥厚、Brugada综合征等疾病，如何降低冠心病的发病率、致残率和死亡率一直是医学工作站研究的焦点。近期研究表明冠心病是一种免疫、环境与遗传等多因素交互作用的炎症性疾病，其发病具有明显的家族聚集性，大量的遗传易感基因在疾病的发生发展过程中起着重要作用。由于冠心病的危险性相关突变所涉及的条件十分复杂，并且存在遗传异质性、种族差异和节俭基因型等因素，因此该疾病确切的发病机制尚不清楚。目前对冠心病的诊断还局限在常规心电图、血清特异性敏感因子（如心肌酶，肌钙蛋白等）、冠状动脉造影等有限手段，仅能应用于当AS发展到一定程度，出现血管狭窄、血供不足、心绞痛甚至心肌梗塞等临床症状后，而且相应的药物和手术治疗大多只是暂时救命、缓解患者的身体痛苦，延迟病变的发作及发展而已，并不能从根本上完全有效控制该病的发生和降低死亡率。所以对冠心病的诊治必须着眼于早预防、早发现和早诊断，从而在早期遏止该病的进行性发展，提高患者的治愈率和生存率。心血管疾病的生物标志物应具备以下特点：具有高度的特异性和敏感性，血液中的心肌损伤标志物浓度与损伤程度呈一定关系；心脏标志物在血液中的持续时间应足够长，以利于临床检测应用，检测方法应该操作简便且反应迅速。

中国发明101792746A 公开一种用于冠心病诊断的血管过氧化酶ELISA试剂盒，该发明用于检测人血清、血浆、脑脊液或其他组织匀浆中得血管过氧化物酶浓度。但是该方法通过过氧化物酶浓度来判断，准确度不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测冠心病的血清学生物标志物及其应用，特别是一种具有高靶向性、稳定性及高效率诊断和检测冠心病的血清学生物标志物及其用途。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

提供一种检测冠心病的血清学生物标志物，所述生物标志物为人血清Samd3蛋白。

本发明的另一目的是提供人血清Samd3蛋白的用途：

（1）作为判断冠心病发生的生物标志物试剂的应用，包括制备用于筛查冠心病或辅助冠心病病理鉴定、临床诊断和生化分析的试剂盒。

（2）作为表征冠心病分型的生物标志物试剂的应用，包括制备用于检测冠心病或辅助冠心病恶性程度检测与病种分级的试剂盒。

本发明相对于现有技术的有益效果是：

本发明涉及生物标志物Samd3蛋白与冠心病的发生发展密切相关，利用Samd3蛋白作为预测冠心病发生和判断冠心病发展程度的生物标志物，与目前常规的病理分型诊断冠心病发病和预后相比，可以更加个体化、准确地预测冠心病的早期发病情况和恶性程度。

附图说明

图1 血清中Samd3蛋白检测的标准曲线；

图2冠心病组与对照组（Non-CAD）血清Samd3水平比较（***P < 0.0001）；

图3 AMI、SAP、UAP、对照组四组间Samd3水平比较（***P < 0.0001, *P < 0.05）；

图4 血清Samd3的ROC曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

受试群体

本发明所使用的研究方案也得到了医院伦理委员会的批准，并取得参试患者的知情同意，时间为2013年。

本实验临床样本包括冠心病组279例和对照组268例，冠心病组分为3个亚组：急性心肌梗死（AMI）、稳定型心绞痛组（SAP）和不稳定型心绞痛组（UAP）。样本分别来源于广东医学院附属医院心内科及体检中心。两组在年龄和性别上匹配。

冠心病组入选标准：（满足以下条件之一即可）

（1）既往支架植入术（PCI）或冠状动脉搭桥术（CABG）治疗史；

（2）经冠状动脉造影术（CAG）证实3支主要冠状动脉中至少一支冠脉管腔狭窄大于50%；

（3）本次住院期间经诊断明确的AMI病史并行CAG术。

其中：

① 心肌梗死患者参照心肌梗死诊断指南。心脏生物标志物（首选cTn）水平升高和（或）降低超过参考值上限（URL）99百分位值，同时至少伴有下述心肌缺血证据之一：（1）缺血症状；（2）心电图（ECG）提示新发缺血性改变；（3）ECG提示病理性Q波形成；（4）影像学证据提示新发局部室壁运动异常或存在心肌丢失。

② 心绞痛组入选标准为患者有胸痛症状，并经冠脉造影确诊为冠心病，急性心肌梗死除外，其中疼痛更剧烈且持续时间更长的为UAP。

对照组入选标准：（满足以下三点）

（1）无冠心病家族史；

（2）既往无冠心病临床症状（如胸痛、胸闷、呼吸困难等）；

（3）ECG正常。

排除标准：脑卒中、外周血管疾病、急性或慢性传染病、炎症疾病、严重肝或肾功能障碍、恶性肿瘤、血液系统恶性患者。在病例收集过程中，仔细询问冠心病家族史，家族中有疑似冠心病的患者不能入组。

实施例2

生理指标测试和血液采集

所有参试者都在采样前经历了一次标准的临床体检。登记信息和检测指标包括：性别、年龄、体重指数（BMI）、吸烟、高血压、糖尿病（DM）、房颤（AF）、脑卒中、高总胆固醇（High TC）、高甘油三酯（High TG）、低-高密度脂蛋白胆固醇（Low HDL）、高-低密度脂蛋白胆固醇（High LDL）、脂蛋白（Lp(a)）、血尿素氮（BUN）、血清肌酐(Scr)、血清尿酸（SUA）、葡萄糖（Glu）、总胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）、载脂蛋白A1（ApoA1）、载脂蛋白B（ApoB），其中BMI =体重/身高2。吸烟者界定为到目前为止至少有一年的吸烟史。高血压则界定为收缩压≥ 140 mm Hg或者正在进行降压治疗者。体内葡萄糖含量≥ 11.1 mmol/L被界定为患有糖尿病。

依据候选样本标准，每位受试者采血量约5 mL，EDTA抗凝，于4℃保存。3天内完成血清分离和生化检测，其结果如表1和表2。

表1 研究人群的临床和生化指标

表2 不同冠心病程度患者和对照组的临床和生化指标

注：数据表示为平均数 ± 标准误

# P < 0.05 vs SAP 或 UAP，* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001 vs 对照

实施例3

Samd3含量水平测定

血清Samd3含量测定方法如下：

将采集到的外周血血清进行ELISA检测，其中冠心病组279例，对照组268例。所有血液样本均在病人体检后24 h内采集，采集量为3~5 ml，并于采集后24h内离心分离血清，分离条件为3000 bpm、10 min、4℃。然后按照ELISA方法进行检测Samd3含量，详细实验步骤如下：

（1）标准品的稀释与加样：在目的抗体包被的酶标板上设标准品15孔，在第1、第2、第3孔分别加标准品100 μl，然后在在第1、第2、第3空分别加标准品稀释液50 μl，混匀；然后从第1、第2、第3孔各取100 μl分别加到第4、第5、第6孔，再在第4、第5、第6孔分别加标准品稀释液50 μl，混匀；然后在第4、第5、第6孔先各取50 μl弃掉，再各取50 μl分别加入第7、第8、第9孔，再于第7、第8、第9孔中各加入标准品稀释液50 μl，混匀；混匀后从7、第8、第9孔中各取50 μl分别加入第10、第11、第12孔中，再在第10、第11、第12孔中各加入标准品稀释液50 μl，混匀；混匀后从第10、第11、第12孔中各取50 μl加入到第13、第14、第15孔中，再于第13、第14、第15孔中分别加入标准品稀释液50 μl，混匀后从第13、第14第15空中分别吸取50 μl弃掉。稀释后各孔加样量都为50 μl，Smad3标准浓度依次为：30 ng/l，20 ng/l，10 ng/l，5 ng/l，2.5 ng/l。

（2）加样：分别设空白孔（空白孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤相同）、待测样品孔（每个样本设3个复孔）。在酶标板上先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl（样品最终稀释浓度为5倍）；

（3）温浴：用封板膜封板后于37℃温浴30 min；

（4）配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍后备用；

（5）洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，重复5次，拍干；

（6）加酶：每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外；

（7）温浴：同（3）；

（8）洗涤：同（5）；

（9）显色：每孔加入显色剂A50 μl，再加入显色剂B 50 μl，混匀，37℃避光显色15 min；

（10）终止：每孔加入终止液50 μl，终止反应；

（11）测定：以空白孔调零，450 nm波长测定吸光度值（OD值）；

按照上述步骤共完成所有病例共进行了6批次实验，每批次单独做标准曲线进行计算，标准曲线由CurveExpert 1.3软件进行分析。将所测得吸光度值按照标准曲线经CurveExpert 1.3软件得出其相应浓度值。

实施例4

Samd3与冠心病易感性的关联分析

分类和连续变量分别用百分数和标准误表示。所有浓度值进行冠心病组与对照组、冠心病亚组之间、冠心病亚组与对照组的进行统计学分析。由GraphPad Prism 5进行统计分析与制图，两组之间定量资料用非配对t检验，定性资料用卡方检验，多组之间用单因素方差分析和卡方检验，多组之间单因素方差分析两两比较采用Bonferroni比较法；相关性分析用SPSS软件进行logistic回归分析。血清中Samd3与冠心病及其风险因素的相关性用多元逻辑回归模型进行分析，并通过ROC曲线等统计学方法与目前常见临床生化标志物进行比较和评估各Smad3对冠心病的识别能力及诊断价值。

结果显示，Samd3含量在冠心病患者（11.47 ± 0.6161 ng/l）中显著高于对照组（5.157 ± 0.1965 ng/L）。而两者的相关性分析揭示它们之间呈显著相关性，高Smad3患者患冠心病的相对危险性分别为1.175（95%CI 1.111，1.243），且P值小于0.0001，进一步表明Smad3是冠心病的重要为危险因素，可作为冠心病的潜在临床生化标志物，用于冠心病的诊断（表2）。

基于ROC曲线的Smad3对冠心病的预测性分析表明，相比于一系列传统的临床生化检测指标Lpa（AUCROC：0.574，95% CI：0.525–0.623）、ApoA1（AUCROC：0.561，95% CI：0.512–0.609）、尿酸（AUCROC：0.663，95% CI：0.617–0.710）、 BUN（AUCROC：0.581，95% CI：0.533–0.630）和TG（AUCROC：0.545，95% CI：0.496–0.594），SMAD3（AUCROC：0.715，95% CI：0.672–0.758）可作为冠心病更有力的新型生物标志物，其预测可靠性甚至更高（表4）。

表3 各种因素与冠心病Logistic相关性分析统计

分组	冠心病	对照组	P	OR(95%CI)
					SMAD3	11.47±0.6161	5.157±0.1965	<0.0001	1.175 (1.111, 1.243)

表4 变量统计学参数表

Claims

1.一种检测冠心病的血清学生物标志物，其特征在于：生物标志物为人血清Samd3蛋白。

2.一种检测冠心病的血清学生物标志物的应用，其特征在于：所述的人血清Samd3蛋白是作为判断冠心病发生的生物标志物试剂的应用，包括制备用于筛查冠心病或辅助冠心病病理鉴定、临床诊断和生化分析的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的一种检测冠心病的血清学生物标志物的应用，其特征在于：所述的人Samd3蛋白是作为表征冠心病分型：急性心肌梗死、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛的生物标志物试剂的应用，包括制备用于检测冠心病或辅助冠心病恶性程度检测与病种分级的试剂盒。