CN108027354A

CN108027354A - 冠心病的生物标志物

Info

Publication number: CN108027354A
Application number: CN201580082502.6A
Authority: CN
Inventors: 冯强; 刘志鹏; 王俊
Original assignee: Shenzhen BGI Life Science Research Institute
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd; Shenzhen BGI Life Science Research Institute
Priority date: 2015-08-20
Filing date: 2015-08-20
Publication date: 2018-05-11
Anticipated expiration: 2035-08-20
Also published as: HK1248813A1; EP3339858A1; CN108027354B; CN108027361A; WO2017028817A1; CN108027361B; WO2017028308A1; HK1249180A1; EP3339858A4

Abstract

用于预测与代谢物相关的疾病(特别是冠心病)的风险的生物标志物和方法。

Description

冠心病的生物标志物

相关申请的交叉引用

无

领域

本发明涉及用于预测与代谢物相关的疾病(特别是冠心病)的风险的血浆生物标志物和方法。

背景

冠心病(CHD)是现代社会的首要危险因素，其年死亡率超过所有类型癌症的总和。MaGiCAD团队的一个五年随访研究(Graninger,D.J.和Mosedale,D.E.Metabolomics incoronary heart disease.Heart.Metab.55,8–12(2012)，通过引用并入本文)显示，大多数心血管疾病的死亡与人们对其自身医疗状况的认知程度相关，并且由缺乏及时治疗而导致。CHD的早期诊断和预防的挑战在于缺乏可靠的非侵入性生物标志物。目前CHD诊断的“金标准”仍然是侵入性的并伴有许多致命的副作用的冠状动脉造影，这限制了大规模的人群筛查和早期的CHD风险预测。

许多研究指出脂肪酸在心脏代谢中起重要作用；它们是正常生理条件下由线粒体氧化磷酸化所介导的心脏ATP生成中的主要底物，占心脏ATP合成的60-90％。心血管疾病(CVD)，如冠心病和心力衰竭，会在内因性和外因性干扰的共同作用下发生“代谢转变”。高密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高已被认为CHD的主要风险因素之一。心血管疾病中的核心缺陷是脂质代谢的这一事实(Fernandez,C.等Plasma lipid composition and risk ofdeveloping cardiovascular disease.PLoS ONE 8,e71846(2013)，通过引用并入本文)使代谢组学成为一种颇具前景的研究这些类型的疾病的方法。

代谢组学是一种创新的高通量生物分析方法，其旨在鉴定和定量存在于任何生物系统或任何特定生理状态中的小分子(分子量小于1500道尔顿)。近十年来，两种主要的分析技术核磁共振(NMR)和质谱(MS)以指数递增的速度在内源化合物的检测中被广泛使用。自2005年以来，与NMR相比，基于MS的技术取得了迅速的进展，并且使用频率更高，这是因为其具有以下有利方面：更高的灵敏度，更广的代谢组覆盖范围，提高的代谢物鉴定和鉴别能力，以及执行化合物类别特定分析的模块性(Griffiths，WJ等，Targeted metabolomicsfor biomarker discovery.Angew.Chem.Int.第49版，5426–5445(2010)，通过引入并入本文)。MS主要与色谱结合使用，诸如气相色谱质谱(GC-MS)和液相色谱质谱(LC-MS)。

发明内容

本发明的目的在于提供用于评估CHD风险或CHD的诊断或早期诊断的生物标志物组合物和方法，具体包括以下方面。

本发明的第一方面涉及生物标志物组合物，其包含选自以下的一种或多种：

生物标志物1，其m/z为518.32±1.00，保留时间(RT)为12.71±1.00分钟；

生物标志物2，其m/z为480.34±1.00,保留时间(RT)为13.48±1.00分钟；

生物标志物3，其m/z为482.32±1.00,保留时间(RT)为12.92±1.00分钟；

生物标志物4，其m/z为496.33±1.00,保留时间(RT)为13.19±1.00分钟；

生物标志物5，其m/z为468.3±1.00,保留时间(RT)为12.69±1.00分钟；

生物标志物6，其m/z为494.32±1.00,保留时间(RT)为12.82±1.00分钟；

生物标志物7，其m/z为524.36±1.00,保留时间(RT)为13.69±1.00分钟；

生物标志物8，其m/z为516.31±1.00,保留时间(RT)为13.21±1.00分钟；

生物标志物9，其m/z为590.31±1.00,保留时间(RT)为12.86±1.00分钟；

生物标志物10，其m/z为546.35±1.00,保留时间(RT)为14.22±1.00分钟；

生物标志物11，其m/z为570.35±1.00,保留时间(RT)为13.05±1.00分钟；

生物标志物12，其m/z为518.32±1.00,保留时间(RT)为13.19±1.00分钟；

生物标志物13，其m/z为524.36±1.00,保留时间(RT)为14.27±1.00分钟；

生物标志物14，其m/z为522.35±1.00,保留时间(RT)为13.33±1.00分钟；

生物标志物15，其m/z为181.07±1.00,保留时间(RT)为9.05±1.00分钟；

生物标志物16，其m/z为544.33±1.00,保留时间(RT)为13.34±1.00分钟；

生物标志物17，其m/z为175.11±1.00,保留时间(RT)为1.83±1.00分钟；和

生物标志物18，其m/z为324.04±1.00,保留时间(RT)为9.33±1.00分钟。

在本发明的一个实施方案中，生物标志物1～18如表1所示。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物1，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物2～生物标志物18。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物2，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物1和生物标志物3～18。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物3，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物1～2和生物标志物4～18。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物4，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物1～3和生物标志物5～18。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物5，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物1～4和生物标志物6～18。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物6，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物1～5和生物标志物7～18。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物7，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物1～6和生物标志物8～18。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物1～7，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物8～18。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含选自以下的一种或多种：

生物标志物1，其m/z为518.32±1.00，保留时间(RT)is 12.71±1.00分钟；

生物标志物5，其m/z为468.3±1.00,保留时间(RT)为12.69±1.00分钟；

生物标志物6，其m/z为494.32±1.00,保留时间(RT)为12.82±1.00分钟；和

生物标志物7，其m/z为524.36±1.00,保留时间(RT)为13.69±1.00分钟。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物1，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物2～生物标志物7。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物2，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物1和生物标志物3～7。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物3，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物1～2和生物标志物4～7。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物4，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物1～3和生物标志物5～7。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物5，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物1～4和生物标志物6～7。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物6，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物1～5和生物标志物7。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物7，以及一种或多种选自下列的生物标志物：生物标志物1～6。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物包含生物标志物1～7。

在本发明的一个实施方案中，其中：

生物标志物1是LysoPC(18:3(6Z,9Z,12Z))；

生物标志物2是LysoPC(P-16:0)；

生物标志物3是LysoPC(15:0)；

生物标志物4是1-棕榈酰甘油磷脂酰胆碱(1-Palmitoylglycerophosphocholine)；

生物标志物5是LysoPC(14:0)；

生物标志物6是LysoPC(16:1(9Z))；

生物标志物7是LysoPC(0:0/18:0)；

生物标志物8是LysoPC(18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))；

生物标志物9是LysoPC(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))；

生物标志物10是LysoPC(20:3(5Z,8Z,11Z))；

生物标志物11是LysoPC(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))；

生物标志物12是LysoPC(18:3(9Z,12Z,15Z))；

生物标志物13是LysoPC(18:0)；

生物标志物14是1-油酰甘油磷脂酰胆碱(1-Oleoylglycerophosphocholine)；

生物标志物15是副黄嘌呤(Paraxanthine)；

生物标志物16是LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))；

生物标志物17是L-精氨酸；和/或

生物标志物18是N-乙酰基-D-葡糖胺6-磷酸(N-Acetyl-D-glucosamine 6-phosphate)。

在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物组合物来自于血液、血浆或血清样品。

在本发明的一个实施方案中，与参考值相比，选自生物标志物1～16中的一种或多种生物标志物(优选为选自生物标志物1～7中的一种或多种)的减少表明受试者处于CHD风险之中或患有CHD。

在本发明的一个实施方案中，与参考值相比，生物标志物17和/或生物标志物18的增加表明受试者处于CHD风险之中或患有CHD。

在本发明的一个实施方案中，通过质谱法测定所述生物标志物组合物中每种生物标志物的水平。优选地，通过质谱联用色谱法(如气相色谱质谱法(GC-MS)或液相色谱质谱法(LC-MS))测定。

本发明的第二方面涉及试剂组合物，其包含用于检测根据本发明第一方面任一项所述的生物标志物组合物中的每种生物标志物的试剂。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂包含用于质谱检测根据本发明第一方面任一项所述的生物标志物组合物的物质。

在本发明的一个实施方案中，用于检测所述生物标志物的样品选自血液、血浆和血清。

本发明的第三方面涉及试剂盒，其包含根据本发明的第一方面任一项所述的生物标志物组合物和/或根据本发明的第二方面任一项所述的试剂组合物。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒还包含CHD患者和健康对照的根据本发明第一方面任一项所定义的生物标志物组合物中每种生物标志物的水平的训练数据集(例如，如表7所示的)。

本发明的第四方面涉及根据本发明第一方面任一项所述的生物标志物组合物和/或根据本发明第二方面任一项所述的试剂组合物在制备试剂盒中的用途，其中该试剂盒用于评估受试者发展CHD的风险，或用于在受试者中诊断CHD。

在本发明的一个实施方案中，所述评估或诊断包括以下步骤：1)测定来自受试者的样品中的根据本发明第一方面任一项所定义的生物标志物组合物中的每种生物标志物的水平；2)将步骤1)中所述的水平与参考数据集或参考值(例如健康对照的参考值)进行比较。优选地，所述参考数据集包含来自CHD患者和健康对照的样品中的根据本发明第一方面任一项所定义的生物标志物组合物中的每种生物标志物的水平。

在本发明的一个实施方案中，所述样品选自血液、血浆和血清。

在本发明的一个实施方案中，在将步骤1)中所述的水平与参考数据集进行比较的步骤中还包括执行多元统计模型以输出疾病概率的步骤。优选地，所述多元统计模型是随机森林模型。

在本发明的一个实施方案中，如果所述疾病概率≥0.5，则确定受试者处于发展CHD的风险中或患有CHD。

在本发明的一个实施方案中，当与参考值比较时，选自生物标志物1～16中的一种或多种生物标志物(优选为选自生物标志物1～7中的一种或多种)的减少表明所述受试者处于发展CHD的风险中或患有CHD。

在本发明的一个实施方案中，当与参考值比较时，生物标志物17和/或生物标志物18的增加表示所述受试者处于发展CHD的风险中或患有CHD。

在本发明的一个实施方案中，通过质谱法测定每种生物标志物的水平。优选地，通过质谱联用色谱法(如气相色谱质谱法(GC-MS)或液相色谱质谱法(LC-MS))测定每种生物标志物的水平。

在本发明的一个实施方案中，在步骤1)之前，该方法还包括处理所述样品的步骤。

在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒还包含CHD患者和/或健康对照的包含根据本发明第一方面任一项所定义的生物标志物组合物中每种生物标志物的水平的训练数据集(例如如表7所示的)。

本发明的第五方面涉及评估受试者发展CHD的风险或在受试者中诊断CHD的方法，其中所述方法包括以下步骤：1)测定来自受试者的样品中的根据本发明第一方面任一项所定义的生物标志物组合物中的生物标志物的水平；2)将步骤1)中所述的水平与参考数据集或参考值(例如健康对照的参考值)进行比较。优选地，所述参考数据集包含来自CHD患者和健康对照的样品中的根据本发明第一方面任一项所定义的生物标志物组合物中的生物标志物的水平。

在本发明的一个实施方案中，如果所述疾病概率≥0.5，则确定所述受试者处于发展CHD的风险中或患有CHD。

在本发明的一个实施方案中，当与参考值比较时，生物标志物17和/或生物标志物18的减少表明所述化合物是用于治疗受试者的CHD的候选化合物，或者所述疗法对受试者的CHD有效。

在本发明的一个实施方案中，在步骤1)之前，所述方法还包括处理所述样品的步骤。

在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括建立CHD患者和/或健康对照的包含根据本发明第一方面任一项所定义的生物标志物组合物中生物标志物的水平的训练数据集(例如如表7所示的)。

本发明进一步涉及根据本发明的第一方面任一项所述的生物标志物组合物，其用于评估受试者发展CHD的风险或在受试者中诊断CHD的方法。

在本发明的一个实施方案中，所述评估或诊断方法包括以下步骤：1)测定来自受试者的样品中的根据本发明第一方面任一项所定义的生物标志物组合物中的生物标志物的水平；2)将步骤1)中所述的水平与参考数据集或参考值(例如健康对照的参考值)进行比较。优选地，所述参考数据集包括来自CHD患者和健康对照的样品中的根据本发明第一方面任一项所定义的生物标志物组合物中的生物标志物的水平。

在本发明的一个实施方案中，在将步骤1)中所述的水平与参考数据集相比较的步骤中，还包括执行多元统计模型以输出疾病概率的步骤。优选地，所述多元统计模型是随机森林模型。

在本发明的一个实施方案中，当与参考值比较时，生物标志物17和/或生物标志物18的增加表明所述受试者处于发展CHD的风险中或患有CHD。

在本发明的一个实施方案中，通过质谱法测定每种生物标志物的水平。优选地通过质谱联用色谱法(如气相色谱质谱法(GC-MS)或液相色谱质谱法(LC-MS))测定每种生物标志物的水平。

本发明进一步涉及根据本发明的第一方面任一项所述的生物标志物组合物和/或根据本发明的第二方面任一项所述的试剂组合物在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于筛选治疗受试者的CHD的候选化合物，或者用于评估疗法对受试者的CHD的效果。

在本发明的一个实施方案中，所述筛选或评估的方法包括以下步骤：1)在向所述受试者施用所述候选化合物或疗法之后，测定来自所述受试者的样品中的根据本发明的第一方面任一项所定义的生物标志物组合物中的每一种生物标志物的水平；2)将步骤1)中所述的水平与向所述受试者施用所述候选化合物或疗法之前的上述生物标志物的水平进行比较。

在本发明的一个实施方案中，选自生物标志物1～16中的一种或多种生物标志物(优选为选自生物标志物1～7中的一种或多种)的增加表明所述化合物是用于治疗受试者的CHD的候选化合物，或者所述疗法对受试者的CHD有效。

在本发明的一个实施方案中，生物标志物17和/或生物标志物18的减少表明所述化合物是用于治疗受试者的CHD的候选化合物，或者所述疗法对受试者的CHD有效。

本发明进一步涉及筛选用于治疗受试者的CHD的候选化合物或者用于评估疗法对受试者的CHD的效果的方法，其中所述方法包括以下步骤：1)在向所述受试者施用所述候选化合物或疗法之后，测定来自所述受试者的样品中的根据本发明的第一方面任一项所定义的生物标志物组合物中的每种生物标志物的水平；2)将步骤1)中所述的水平与向所述受试者施用所述候选化合物或疗法之前的上述生物标志物的水平进行比较。

在本发明的一个实施方案中，通过质谱法测定每种生物标志物的水平。优选地，通过质谱联用色谱法(如气相色谱质谱法(GC-MS)或液相色谱质谱法(LC-MS))测定每种生物标志物水平。

本发明进一步涉及根据本发明的第一方面任一项所述的生物标志物组合物，其用于筛选治疗受试者的CHD的候选化合物或者评估疗法对受试者的CHD的效果的方法。

在本发明的一个实施方案中，所述筛选或评价的方法包括以下步骤：1)在向所述受试者施用所述候选化合物或疗法之后，测定来自受试者的样品中的根据本发明的第一方面任一项所定义的生物标志物组合物中的生物标志物的水平；2)将步骤1)中所述的水平与向所述受试者施用所述候选化合物或疗法之前的上述生物标志物的水平进行比较。

本发明进一步涉及建立用于评估受试者发展CHD的风险或在受试者中诊断CHD的质谱模型的方法，该方法包括鉴定在CHD患者与健康对照的血液样品之间差异表达的物质的步骤，其中所述差异表达的物质包括选自生物标志物1～18中的一种或多种。优选地，所述差异表达的物质包括选自生物标志物1～7中的一种或多种。

本文使用的术语具有与本发明相关的领域中的普通技术人员通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。

根据本发明，术语“冠心病(coronary heart disease,CHD)”，也称为“冠状动脉疾病(coronary artery disease,CAD)”，是一组包括稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、心肌梗塞和心源性猝死等在内的疾病。在本发明中，CHD患者由冠状动脉造影技术诊断。

根据本发明，质谱(MS)可分为离子阱、四极杆、轨道阱和飞行时间质谱，偏差分别为0.2amu、0.4amu、3ppm、5ppm。在本发明中，MS数据是用轨道阱质谱法获取的。

根据本发明，生物标志物的水平由MS中的峰强度表示。

根据本发明，质荷比(m/z)和保留时间(RT)具有与现有技术已知的含义相同的含义。在本发明中，m/z的单位是amu，其是指原子质量单位，也被称为道尔顿。道尔顿是用来表示原子或分子尺度上的质量(原子质量)的标准单位。一个统一原子质量单位等同于1g/mol。其被定义为处于未结合状态的中性碳12在其核和电子基态时的质量的十二分之一。

本领域技术人员已知，当使用不同的检测方法或LC-MS仪器时，m/z和保留时间的值将在一定范围内变化。例如，m/z可以在±3.00或±2.00或±1.00的范围内变化，保留时间可以在±60s或±45s或±30s或±15s的范围内变化。

在本发明的一个实施方案中，参考数据集是指训练数据集。

根据本发明，训练数据集和验证数据集具有与现有技术已知的含义相同的含义。在本发明的一个实施方案中，所述训练数据集是指来自CHD患者和健康对照的生物样品中生物标志物水平的数据集合。在本发明的一个实施方案中，所述验证数据集是指用于测试训练数据集的性能的数据的集合。在本发明的一个实施方案中，根据测定方法生物标志物的水平可以被表示为绝对值或相对值。例如，当使用质谱来测定所述生物标志物的水平时，峰的强度可以代表所述生物标志物的水平，其为相对值。

在本发明的一个实施方案中，参考值是指健康对照的参考值或正常值。本领域技术人员已知，当样本容量足够大时，可利用本领域公知的检测和计算方法获得样品中每个生物标志物的正常值(绝对值)的范围。因此，当采用质谱法以外的其他方法(例如，抗体或ELISA)来检测生物标志物的水平时，可将样品中的生物标志物水平的绝对值直接与正常值进行比较，以评估CHD的风险以及诊断或早期诊断CHD，任选地，可以包括统计方法。

根据本发明，术语“生物标志物”，也称为“生物学标志物”，是指受试者的生物状态或状况的可测量指标。此类生物标志物可以是受试者中的任何物质，例如核酸标志物(例如DNA)、蛋白质标志物、细胞因子标志物、趋化因子标志物、碳水化合物标志物、抗原标志物、抗体标志物、物种标志物(物种/属标志物)和功能标志物(KO/OG标志物)等，只要它们与受试者的特定生物学状态或状况(诸如疾病)相关。生物标志物的检测和评估经常被用于检查正常生物学过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应，并且在许多科学领域中是有用的。

根据本发明，术语“生物标志物集”是指一组生物标志物(即，两种或更多种生物标志物的组合)。

根据本发明，术语“受试者”是指动物，特别是哺乳动物，诸如灵长类动物，优选人。

根据本发明，术语“血浆”是指全血的流体组分。取决于所使用的分离方法，血浆可以完全不含细胞组分，或者可以含有不同量的血小板和/或少量的其他细胞组分。

根据本发明，尿样品中的低分子量代谢物(<1500Da)被提取出来并用于HPLC-MS实验。所述提取的方法在本领域中是公知的。在本发明的一个实施方案中，使用有机溶剂(例如，甲醇)沉淀蛋白质，将获得的混合物离心，然后通过HPLC-MS对上清液进行处理从而进行代谢谱分析(metabolic profiling)。

在本发明的一个实施方案中，将Shimadzu Prominence HPLC系统(Shimadzu)与分辨率设置为30000的LTQ Orbitrap Velos仪(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)连接使用以获得HPLC-MS数据。并且使用Agilent ZORBAX ODS C18柱(150mm×2.1mm，3.5μm，Agilent，USA)。样品分析以正离子模式进行，喷雾电压为4.5kV，毛细管温度为350℃。质量扫描范围为50-1500m/z。氮气鞘气和氮气辅助气的流速分别设定为30L/分钟和10L/分钟。HPLC-MS系统以二元梯度模式运行。溶剂A为0.1％(v/v)甲酸/水，溶剂B为0.1％(v/v)甲酸/甲醇。梯度如下：0分钟时为5％B，5分钟时为5％B，8分钟时为100％B，9分钟时为100％B，18分钟时为5％B，20分钟时为5％B。流速为0.2mL/分钟。为确保系统平衡，合并的“质量控制”(QC)样品被用于监测系统稳定性。

术语诸如“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”不旨在仅指单一实体，而是包括可使用其特定实例进行说明的一般类别。

本领域技术人员将理解，除了如权利要求中所概述的之外，本文中的术语是为了更好地理解本发明而提供的，而不无意限定本发明。

本发明基于本发明人的以下发现：

目前迫切需要非侵入性且高度准确的方法以诊断和预测冠心病。为了探查与CHD相关的潜在特征性代谢标志物，应用非靶向代谢组学技术来分析血浆、尿样品，并且应用宏基因组学技术及来自CHD患者和健康受试者的粪便宏基因组学数据进一步验证代谢物及其潜在来源。工作流程如图1所示。统计学和生物信息学方法被用来鉴定可区分CHD病例与健康对照的显著不同的质荷比(m/z)。分层聚类分析(HCA)被用来鉴定有助于表型分离的m/z簇，spearman相关分析被用来鉴定潜在生物标志物与异常功能之间的相关性。所鉴定的发生显著变化的代谢物使用购买的标准进行验证。在ECs、KOs和物种水平上，几种显著不同的代谢物与肠道菌群相关。本研究证明了对患者生物体液中的潜在非侵入性生物标志物的探究以及代谢组学和宏基因组学的综合分析将为揭示宿主与肠道微生物组之间的相互作用铺平道路。

在本发明中，使用非靶向代谢组学技术分析来自CHD患者和对照健康人的血浆和尿样品。在血浆中，18种显著变化的代谢物(13种LPC、2种甘油磷脂酰胆碱(glycerophosphocholine)、L-精氨酸、GlcNAc-6-P和副黄嘌呤)被鉴定为潜在的生物标志物。在尿中，4种显著变化的代谢物(GlcNAc-6-P、甘露醇、肌酸、植物鞘氨醇)被鉴定为CHD患者中的潜在生物标志物。为了获得这些潜在生物标志物的临床相关性，通过ROC评估这22种代谢物的诊断能力。GlcNAc-6-P表现为最具判别力的生物标志物，其展现出相对优良的诊断能力，FN为0.153，FP为0.208。潜在生物标志物与生化临床数据之间的相关性分析提示，血浆LPC与胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDLC)和总蛋白(TP)呈显著正相关，而GlcNAc-6-P和L-精氨酸与CHOL、HDLC和TP呈负相关。这表明代谢物可以潜在地影响我们身体的正常代谢途径。在这59例CHD患者中，有32例患者先前已接受过经皮冠状动脉介入治疗(PCI)，但在这32例术后患者组与27例未手术患者组之间没有观察到差异(如图2中的PCA评分图所示)，这提示PCI并不影响患者的全身代谢模式。

据估计，人体内超过30％的代谢物来源于肠道微生物，并且可能会导致宿主疾病。在本研究中，代谢组学和宏基因组学技术被联合使用，并且首次揭示了微生物物种及其相关代谢物参与CHD疾病的证据。首先，甘露醇被鉴定为CHD患者的潜在尿生物标志物。迄今为止在果糖和甘露糖的代谢中没有发现与之相关的智人(homo sapiens)的酶，这一事实表明甘露醇应该属于微生物代谢物家族。先前报道甘露醇是由乳酸菌和恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)产生的。在目前的研究中，KO、物种和甘露醇的Spearman相关分析表明，三种肠道菌群种类，包括梭菌HGF2(Clostridium sp.HGF2)、链球菌M334(Streptococcus sp.M334)和链球菌M143(Streptococcus sp.M143)，在甘露醇代谢中起重要作用。这被PTS系统的甘露糖特异性IIB组分(EC:2.7.1.69)进一步验证，所述甘露糖特异性IIB组分被发现是上述三种CHD富集的肠道微生物物种中的共同酶。其次，一种内源性的微生物代谢物GlcNAc-6-P，在CHD患者的血浆和尿样品中被鉴定出来。GlcNAc-6-P参与糖代谢，并且具有调节宿主心血管活性的双重功能。以前的文献表明，大肠杆菌可将从环境或其自身细胞壁获得的脱水-N-乙酰胞壁酸代谢为N-乙酰葡糖胺-磷酸(Uehara,T.,Suefuji,K.,Jaeger,T.,Mayer,C.&Park,J.T.Mur Q etherase is required by Escherichia coliin order to metabolize anhydro-N-acetylmuramic acid obtained either from theenvironment or from its own cell wall.J.Bacteriol.188,1660-1662(2006)，通过引用并入本文)，然后其在氨基糖和核苷酸糖的代谢中被转化为GlcNAc-6-P。我们的研究发现，GlcNAc-6-P的代谢通过NagA(EC:3.5.1.25)和N-酰基葡糖胺-6-磷酸2-差向异构酶(EC:5.1.3.9)与梭菌HGF2(Clostridium sp.HGF2)显著相关。GlcNAc-6-P被NagA(EC:3.5.1.25)酶转化成葡糖胺-6-P，所述酶在微生物细胞壁合成和糖酵解中发挥核心作用。

上述两种微生物代谢物(甘露醇和GlcNAc-6-P)及其相关微生物群在CHD患者中的发现具有两个重要的意义。首先，其证实了微生物代谢物可以与其他传统代谢物一起用作CHD诊断的潜在生物标志物。例如，尿中的GlcNAc-6-P表现出相对强的CHD诊断能力，在验证数据集的ROC分析中，AUC为0.88，FN为0.153，FP为0.208。其次，微生物代谢物反映了宿主肠道微生物群的异常，因此可以通过调节患者的肠道生态系统来开发新的CHD治疗策略。将来，微生物及其相关代谢物可作为CHD诊断和治疗的新指标和靶点。

综上所述，本研究结合非靶向代谢组学技术和宏基因组学技术进行CHD研究。这种组合研究不仅导致了CHD的候选生物标志物这一重要发现，而且将人类系统与肠道微生物群联系起来，并为与CHD有关的微生物物种提供了新的见解。

通过下面的非限制性实施例进一步举例说明本发明。除非另有说明，否则份数和百分比均以重量计，度数为摄氏度。所用的试剂全部可商购。对于本领域普通技术人员显而易见的是，这些实施例虽然指示了本发明的优选实施方案，但仅作为示例给出。

附图简述

根据附图和下列详细描述，本公开的这些和其他方面和有利方面将变得明显且更容易理解，其中：

图1|本研究的工作流程。首先，在血浆和尿中探索潜在的生物标志物。其次，对潜在生物标志物与肠道菌群进行途径分析和关联性分析。最终，发现了与肠道菌群物种相关的潜在生物标志物。

图2|32例术后患者、27例未经手术患者与43例健康对照的PCA评分曲线。(a)在汇集在一起的术后CHD患者和未经手术CHD患者的血浆样本中，未发现它们之间存在显著差异。(b)来自术后CHD患者和未经手术CHD患者的尿样品所呈现出的分散分布也表明它们之间无显著差异。

图3|血浆代谢组学中潜在生物标志物的发现。血浆代谢物谱的云图。上部圆圈和下部圆圈分别表示CHD患者的血浆样品中相较于健康对照强度增加(倍数变化>1.2，196种代谢物)和减小(倍数变化<0.8，319种代谢物)的代谢物。颜色的深度与调整后的p值(命名为q值)相关：从白色到深黑色表示逐渐减小的调整的p值。圆圈面积与强度变化幅度相关：在上部，圆圈越大，则相较于健康对照的血浆样品，CHD患者的血浆样品中富集的代谢物越多。而在下面部分，圆圈越大，健康对照中富集的代谢物就越多。

图4|血浆代谢组学统计分析。在Veen-plot图中，Volcano-plot图和S-plot图被整合在一起，并且存在202个重叠的m/z，这些m/z在CHD患者的血浆样品与健康对照的血浆样品之间显著不同。

图5|15种胆碱代谢物的箱式图(boxplot)。

图6|尿代谢物谱的云图。

图7|尿代谢组学统计分析。在Veen-plot图中，通过Volcano-plot图和S-plot分析的整合，重叠的391个m/z是CHD尿样品与对照尿样品之间显著不同的代谢物。

图8|血浆和尿中所有显著差异的代谢物的Veen图。

图9|潜在生物标志物的受试者工作特征(ROC)分析。7个经鉴定的血浆潜在生物标志物(a-g)和2个经鉴定的尿潜在生物标志物(h-i)的ROC分析和箱形图，所述血浆潜在生物标志物和尿潜在生物标志物分别在另外的176个血浆样品(98个对照对比78个CHD患者)和395个另外的尿样品(173个对照对比222个CHD患者)中展现出良好诊断能力。

图10|7个经鉴定的血浆潜在生物标志物的ROC分析，所述血浆潜在生物标志物在血浆验证数据集(78个CHD患者血浆样品对比98个健康对照血浆样品)中展现出良好的诊断能力。

图11|2个经鉴定的尿潜在生物标志物的ROC分析，所述尿潜在生物标志物在尿验证数据集(222个CHD患者的尿样品对比173个健康对照的尿样本)中展现出良好的诊断能力。

图12|LysoPC(0:0/18:0)、LysoPC(18:3(6Z,9Z,12Z))、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(15:0)、LysoPC(P-16:0)及LysoPC(14:0)的串联质谱图(MS/MS spectrums)。

实施例

实施例1.鉴定和验证用于评估CHD相关疾病的风险的生物标志物

1.1材料。甲酸和甲醇(HPLC级)购自Fisher Scientific Corporation(Loughborough，UK)。实验中使用的水获自Milli-Q超纯水系统(Millipore，Billerica，MA)。Agilent ZORBAX ODS C-18柱(150mm×2.1mm，3.5μm,Agilent,USA)用于所有分析。

1.2临床样品。经冠状动脉造影技术确诊的冠心病患者均来自广东省总医院。参加本研究的所有对照人群在同一时期中的医学检查中没有临床上明显的CHD。

来自同一CHD患者(n＝59)的血浆、尿和粪便样品和来自同一健康对照(n＝43)的血浆、尿和粪便样品均获自广东省总医院。进行冠状动脉造影技术以诊断本研究中招募的CHD患者。健康对照在同一家医院进行了体检。患者和对照在样品采集之前一个月内没有接受益生菌或抗生素。在这59位CHD患者中，32位患者曾经接受过经皮冠状动脉介入治疗(PCI)。参与者的临床信息提供于补充表1(Supplementary Table 1)中。除此以外，176个额外的血浆样品(98位对照对比78位CHD患者)和395个另外的尿样品(173位对照对比222位CHD患者)被用于潜在生物标志物的诊断能力分析中。所有参与者在早餐前于早晨收集静脉血和中段尿液。将由Vacuette EDTA血液采集管收集的静脉血在4℃以2200x g离心5分钟以获得血浆样品。将血浆和尿样品储存在-80℃直至使用。

同一天在医院从CHD患者(n＝59)和健康对照(n＝43)收集相应的新鲜粪便样品。样品用无菌刮刀机械均化，然后使用Sarstedt粪便取样系统(Sarstedt,Nümbrecht,Germany)获取等分试样，每个等分试样含有1g粪便并放置在无菌12ml冻存管中。然后将等分试样储存在-20℃的冷冻箱中，并在收集后48小时内将其放置在冷藏包中运输到实验室。之后，将粪便样品储存在-80℃直至使用。这些方案由BGI-深圳的机构审查委员会审查。在收集样品之前，患者被告知并获得了他们的书面知情同意。

用于HPLC-MS实验的样品制备。为了提取血浆和尿样品中的低分子量代谢物(<1500Da)，对先前报道的方法进行了一些修改((Luan,H.等Serum metabolomics revealslipid metabolism variation between coronary artery disease and congestiveheart failure:a pilot study.Biomarkers.18,314-321(2013)，通过引用并入本文)。在实验之前，将所有血浆和尿样品在冰上解冻，从每个血浆或尿样品中取出等体积(10μL)样品并混合均匀，将其作为“质量控制”(QC)样品，该样品用于估计一个能够代表在分析过程中所遇到的所有分析物的“平均”谱(profile)。然后使用以下程序从血浆和尿样品中提取低分子量代谢物(<1500Da)：将血浆样品与甲醇(1:2v/v)混合，同时将尿样品与甲醇(1:1v/v)混合以沉淀蛋白质。将血浆和尿样品混合物在4℃以14000x g离心10分钟，然后将上清液转移至1.5mL聚丙烯管中用于通过HPLC-MS进行代谢谱分析。

HPLC-MS实验。将Shimadzu Prominence HPLC系统(Shimadzu)与分辨率设置为30000的LTQ Orbitrap Velos仪(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)连接使用以获得HPLC-MS数据。使用Agilent ZORBAX ODS C18柱(150mm×2.1mm，3.5μm，Agilent，USA)。样品分析以正离子模式进行，喷雾电压为4.5kV，毛细管温度为350℃。质量扫描范围为50-1500m/z。氮气鞘气和氮气辅助气的流速分别设定为30L/分钟和10L/分钟。HPLC-MS系统以二元梯度模式运行。溶剂A为0.1％(v/v)甲酸/水，溶剂B为0.1％(v/v)甲酸/甲醇。梯度如下：0分钟时为5％B，5分钟时为5％B，8分钟时为100％B，9分钟时为100％B，18分钟时为5％B，20分钟时为5％B。流速为0.2mL/分钟。为确保系统平衡，开始时将合并的QC样品注射五次。在样品检测期间，每检测五个样品注射一次QC样品，以进一步监测系统稳定性。

HPLC-MS数据分析。采用与我们以前发表的工作(Luan,H.等Serum metabolomicsreveals lipid metabolism variation between coronary artery disease andcongestive heart failure:a pilot study.Biomarkers.18,314-321(2013)，通过引用并入本文)相同的方法进行获得的MS数据预处理，包括峰采集、峰分组、保留时间校正、第二峰分组以及同位素和加合物(adducts)的注释。将LC-MS原始数据文件被转换为mzXML格式，然后由R软件(v3.1.1)的XCMS和CAMERA工具箱进行处理。每个离子通过联合保留时间(RT)和m/z数据来鉴定。记录每个峰的强度，并生成包含任意指定的峰值索引(保留时间-m/z对)、样品名称(观察值)和离子强度信息(变量)的三维矩阵。

为了获得一致的结果，去除具有超过80％缺失值(离子强度＝0)的峰和来自每个组的同位素离子的那些峰，以进一步减化所获得的矩阵。作为代谢谱分析中的质量保证策略，使用Robust Loess信号校正(R-LSC)并基于对标准生物质量控制样品(QC样品)以及真实血浆和尿样品的周期分析，将所有保留峰标准化至QC样品，以确保在分析运行中数据质量高(Dunn,W.B.等Procedures for large-scale metabolic profiling of serum andplasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to massspectrometry.Nat.Protoc.6,1060-1083(2011)，通过引用并入本文)。QC样品中代谢物的相对标准偏差(RSD)值设定在为30％的阈值，所述阈值被接受作为代谢组学数据集的重复性评估中的标准。

非参数单变量方法(Mann-Whitney-Wilcoxon检验)被用于测量和发现CHD患者和对照受试者中的显著变化的代谢物，然后通过假发现率(FDR)进行校正，以确保代谢物峰可被重复检测到。并进行多元统计分析(PCA，PLS-DA)以区分CHD样品与对照受试者。基于来自7折交叉验证的PLS-DA模型的为1的变量投影重要性(VIP)阈值，获得造成CHD患者和对照受试者的代谢谱扫描差异的代谢物。使用R统计工具箱中的FDR测试(临界p值的设定不高于0.05)，在单变量水平上验证PLS-DA模型。使用R中的“vegan”包进行置换多元方差分析(PERMANOVA)(一种多元方差分析的基于置换的形式)，以测试代谢谱与个体表型之间的统计学显著性差异(Anderson,M.J.A new method for non-parametric multivariateanalysis of variance.Aust.Ecol.26,32-46(2001)，通过引用并入本文)。还进行了三维PLS-DA分析以显示CHD样品与对照受试者之间的差异。进行表型分析以将那些显著分布的代谢物聚类。在那些显著改变的血浆代谢物、尿代谢物中进行Spearman相关分析，并用Cytoscape软件3.0.2分析CHD患者和对照组的临床数据和代谢物的相关性。另外，利用在线工具ROCCET(http://www.roccet.ca)(Xia,J.G.,Broadhurst,D.I.,Wilson,M.&Wishart,D.S.Translational Biomarker Discovery in Clinical Metabolomics:AnIntroductory Tutorial.Metabolomics 9,280-299(2012)，通过引用并入本文)，将受试者工作特征(ROC)分析用于评估已鉴定的潜在生物标志物的诊断能力。

代谢物鉴定和验证。使用在线HMDB数据库(http://www.hmdb.ca)和KEGG数据库(www.genome.jp/kegg/)，通过将样品的精确分子量数据(m/z)与来自该数据库的那些分子量数据匹配来鉴定代谢物。如果观测值与数据库值之间的质量差异小于10ppm，则代谢物将被鉴定，并且代谢物的分子式将通过同位素分布测量来进一步验证。购买了参考标准，并将其用于验证和确认那些显著改变的代谢物(通过比较它们的MS/MS谱图和保留时间)。

血浆和尿样品的代谢谱

对来自59位CHD患者和43位健康对照的血浆和尿样品进行非靶向代谢组学分析。参加者的临床资料列于补充表1。具体工作流程如图1所示。分别在血浆和尿样品中获得总共1347个m/z(质荷比，93.67％)和2858个m/z(96.68％)。通过在整个实验期间测量的QC样品来评估当前数据的稳定性和再现性。分别获得血浆和尿样品的QC样品的主成分分析(PCA)评分图示。在阳离子模式下获得的代谢物谱中未观察到漂移，表明我们当前代谢组学数据集的良好稳定性和再现性。

血浆样品的结果

对于血浆样品，总共1347个m/z的云图分析(图3)显示，196个m/z(14.55％)的强度在CHD患者的血浆样品中增加(倍数变化>1.2)，并且23.68％(319个m/z)在CHD患者中降低(倍数变化<0.8)。这些血浆样品的PCA评分图和三维偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)(Triba,M.N.等PLS/OPLS models in metabolomics:impact of permutation of datasetrows on the K-fold cross-validation quality parameters.Mol.Biosyst.11,13-19(2015)，通过引用并入本文)评分图均显示，在59个CHD患者样品与43个健康对照样品之间存在显著差异。CHD患者血浆样品区别于健康对照组，PC1、PC2、PC3值分别为15.32％、10.62％、13.73％。采用置换多元方差分析(PERMANOVA)测试个体表型与其代谢特征的关系，发现CHD状态对正离子模式中的代谢谱具有显著影响(P<0.001，1000次置换)。

S-plot分析用于选择潜在感兴趣的代谢物生物标志物((Miao,H.等UrinaryMetabolomics on the biochemical profiles in diet-induced hyperlipidemia ratusing ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight SYNAPT high-definition mass spectrometry.J.Anal.Methods.Chem.2014,ID184162(2014)，通过引用并入本文)。使用变量投影重要性(VIP)大于1的标准，S-plot图中的230个变量被选择出来。在调整p值<0.05，倍数变化>1.2或<0.8的条件下，Volcano-plot图中的414个变量被保留。综合这两个结果，得到了202个共有的m/z(图4)。通过将显著的峰的分子量数据(m/z)与在线数据库：HMDB和KEGG比对，鉴定了总共109种潜在代谢物(在CHD患者中，20种增加和89种减少)。

为了从109个m/z中进一步鉴定潜在代谢物，使用精确质量和质谱裂解模式来搜索HMDB和HMDB SERUM数据库(Chen,J.等Practical approach for the identification andisomer elucidation of biomarkers detected in a metabonomic study for thediscovery of individuals at risk for diabetes by integrating thechromatographic and mass spectrometric information.Anal.Chem.80,1280-1289(2008)，通过引用并入本文)。我们从上述数据库中发现了18个匹配的代谢物，包括13个溶血磷脂酰胆碱(LPC)、2个甘油磷脂酰胆碱、L-精氨酸、N-乙酰基-D-葡糖胺6-磷酸(GlcNAc-6-P)和副黄嘌呤(列于表1中)。LysoPC(0:0/18:0)、LysoPC(18:3(6Z,9Z,12Z))、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(15:0)、LysoPC(P-16:0)及LysoPC(14:0)的串联质谱图(MS/MS spectrums)如图14所示。

13种溶血磷脂酰胆碱(LPC)、2种甘油磷脂酰胆碱和副黄嘌呤(Paraxanthine)的强度在CHD患者中较低(如图5所示)。

为了研究这109种显著变化的代谢物的潜在关系，还进行了spearman相关分析。在CHD富集的代谢物或对照富集的代谢物中具有较小的调整的p值的显著改变的血浆代谢物具有相对较强的相关性。这18种鉴定的代谢物中的分析显示LysoPC(18:0)与以下代谢物具有强正相关性：LysoPC(18:0)对比LysoPC(P-16:0)(rho＝0.861,q值＝0)、LysoPC(20:3(5Z,8Z,11Z))(rho＝0.831,q值＝0),LysoPC(0:0/18:0)(rho＝0.802,q值＝0)。LysoPC(16:1(9Z))与LysoPC(14:0)(rho＝0.854，q值＝0)和LysoPC(18:0)(rho＝0.815，q值＝0)具有强正相关性。另一方面，L-精氨酸与1-棕榈酰甘油磷脂酰胆碱(1-Palmitoylglycerophosphocholine)负相关(rho＝-0.558，q值＝1.07E-08)。

尿样品的结果

在尿云图(图6)中，存在870个(30.44％)在CHD患者具有增加的强度的m/z(倍数变化>1.2)，而557个m/z(19.49％)的水平下降(倍数变化<0.8)。使用PCA和PLS-DA模型进行分析，其分析结果示于PCA评分图和三维PLS-DA评分图(PC1(4.34％)、PC2(8.25％)、PC3(2.99％)中。该结果表明，CHD患者的尿样品与健康受试者的显著不同。PERMANOVA分析表明CHD对代谢谱有重大影响。此外，S-plot分析和Volcano-plot图分析被用于探究潜在生物标志物。使用这些标准(VIP>1，经FDR校正后的Mann-Whitney-Wilcoxon检验产生的调整后的p值<0.05，倍数变化>1.2或<0.8)，发现处于S-plot图中的558个m/z和Volcano-plot图中的559个m/z的交集中的391个m/z在CHD组中显著改变，相交分别在S曲线和Volcano曲线中分别为558m/z和559m/z，上述结果如Veen图所示(图7)。

使用HMDB和KEGG数据库对上述391个m/z进行比对和注释。在160种被注释的代谢物中，在CHD患者中96种代谢物的强度增加，64种代谢物的强度下降。这160种代谢物被用于对102个样品进行表型分析。CHD患者的代谢与健康对照明显不同。通过与商购可得的参考标准比较MS/MS谱图和保留时间，验证了4种代谢物，结果列于表2中。GlcNAc-6-P和甘露醇的水平在CHD患者中升高，倍数变化分别为165.99和8.45。同时，肌酸和植物鞘氨醇的水平降低，倍数变化分别为0.41和0.39。

GlcNAc-6-P的水平在血浆和尿样品均升高。GlcNAc-6-P可由人体的酶和肠道细菌的酶产生，所以其来源有待进一步确定。GlcNAc-6-P在尿和血液中均增加这一相似模式表明宿主和肠道菌群的相互作用在CHD发展中是重要的。甘露醇是由几种微生物产生的多元醇或糖醇。迄今为止在果糖和甘露糖的代谢中没有发现与之相关的智人的酶，这一事实表明甘露醇可能属于微生物代谢物家族。甘露醇可以由许多微生物诸如乳酸菌(Carvalheiro,F.,Moniz,P.,Duarte,L.C.,Esteves,M.P.&Gírio,F.M.Mannitolproduction by lactic acid bacteria grown in supplemented carob syrup.J.IndMicrobiol.Biotechnol.38,221-7(2011)，通过引用并入本文)和恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)(Kets,E.P.Galinski,E.A.,de Wit,M.,de Bont,J.A.&Heipieper,H.J.Mannitol,a novel bacterial compatible solute in Pseudomonas putidaS12.J.Bacteriol.178,6665-6670(1996)，通过引用并入本文)产生。在CHD患者尿样品中还发现肌酸减少。其是由人体从氨基酸自然产生的含氮有机酸。在生物系统中，肌酸可以提高磷酸肌酸水平，并在组织缺氧期间改善ATP含量的维持，并且其还具有清除自由基和减少氧化应激的能力。CHD患者尿中的减少的肌酸表明在CHD患者中存在明显的能量紊乱，更多的自由基和更多的氧化应激反应。在CHD患者尿中还发现植物鞘氨醇水平降低。植物鞘氨醇是一种磷脂，并且是哺乳动物组织生物膜的主要组分。植物鞘氨醇的合成可以由人体和肠道微生物群在鞘氨醇代谢中进行。植物鞘氨醇可诱导人T细胞淋巴瘤和非小细胞肺癌细胞的非caspase依赖性细胞凋亡。尿中植物鞘氨醇的减少提示CHD患者的鞘脂代谢异常。

为了评估160种被注释的尿代谢物之间的相关性，进行了spearman相关分析。结果显示，显著改变(具有较小的调整后的p值)的尿代谢物与血浆显著代谢物相比具有更强的相关性。另外，在这4种经验证的代谢物中，甘露醇与GlcNAc-6-P呈相对高的正相关(rho＝0.775，q值＝9.40E-21)，这可能是紊乱的肠道微生物群的信号。

血浆与尿显著代谢物之间的相关性。

为了将代谢组学应用于临床诊断、治疗或病理生理学研究，需要阐明代谢物的生理功能及其之间的关系，并且需要建立所有潜在生物标志物的相关网络(Liu,P.等Biomarkers of primary dysmenorrhea and herbal formula intervention:anexploratory metabonomics study of blood plasma and urine.Mol.BioSyst.9,77—87(2013)，通过引用并入本文)。为此，根据利用Cytoscape软件分析的spearman相关分析，将显著改变的血浆和尿代谢物联系起来。这109个被注释的显著改变的血浆代谢物和160个被注释的显著改变的尿代谢物参与不同的途径，并且可以分成8类：碳水化合物代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、胆汁酸代谢、嘌呤/嘧啶代谢、维生素代谢、微生物相关代谢等等。脂质代谢与微生物相关代谢呈显著负相关，而其他6个代谢类别与微生物相关代谢呈显著正相关。

在保留时间误差小于1分钟且m/z误差小于0.01道尔顿(通过MS/MS比较)的条件下，在血浆和尿中均发现包括GlcNAc-6-P在内的七种显著改变的代谢物(补充表2)。在图8中提供了显示血浆和尿中显著改变的代谢物中的常见代谢物的Veen图。两种代谢物(m/z：185.04,202.04)在CHD患者中减少，而其他五种代谢物(m/z:125.01,309.05,310.04,311.05,324.04)在CHD患者中增加。

为了评估7种常见代谢物之间的相关性，采用系数大于0.90的标准进行Spearman相关分析。首先，获得血浆代谢物之间的相关性。m/z 311.05与m/z 309.05(rho＝0.929，q值＝9.31E-45)、m/z 310.04(rho＝0.911，q值＝5.70E-40)、m/z 324.04(rho＝0.900，q值＝1.53E-37)呈强相关；m/z 309.05也与m/z 310.04(rho＝0.929，q值＝9.31E-45)呈强相关。第二，获得尿代谢物之间的相关性，GlcNAc-6-P(m/z 324.04)与m/z 310.04(rho＝0.933，q值＝1.26E-45)、m/z 311.05(rho＝0.910，q值＝1.17E-39)、m/z 125.01(rho＝0.903，q值＝3.43E-38)强相关，而m/z 125.01也与尿代谢物(m/z 310.0(rho＝0.918,q值＝1.28E-41)呈强相关。另外，还对这些代谢物在血浆和尿中的相关性进行了评估。结果显示血浆代谢物与尿中相同的代谢物具有强的正相关性(补充表3)。其中，经验证的GlcNAc-6-P(324.04)与自身呈非常强的正相关(rho＝0.747，q值＝5.60E-19)。

血浆和尿的潜在代谢物的临床关联性

受试者工作特征分析

为了评估已鉴定的代谢物(18种血浆和4种尿代谢物)作为生物标志物的潜能，对176个另外的血浆样品(98个健康对照对比78个CHD患者)和395个另外的尿样品(173个健康对照对比222个CHD患者)进行了受试者工作特征分析(ROC)。

在血浆验证数据集中，6种LPC和1种甘油磷脂酰胆碱代谢物显示大于0.80的曲线下面积(AUC)，并且在CHD患者中是显著不同的(表3，图12A-F)。如图9a-g所示，LysoPC(18:3(6Z,9Z,12Z))、LysoPC(P-16:0)、LysoPC(15:0)、1-棕榈酰甘油磷脂酰胆碱、LysoPC(14:0)、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(0:0/18:0)在CHD患者中降低，变化倍数分别为0.26、0.58、0.51、0.65、0.49、0.62、0.42，AUC分别为0.91、0.88、0.88、0.88、0.84、0.83、0.83。在另一方面，除了LysoPC(20:3(5Z,8Z,11Z))变得正常、GlcNAc-6-P甚至未被检测到之外，其他9种血浆潜在生物标志物显示相同的富集方向(数据示于表3中)。这些结果证实了LPC可能成为未来CHD诊断和治疗的生物标志物和靶点。

在尿验证数据集中，GlcNAc-6-P和甘露醇显示分别为0.88、0.81的AUC，并且倍数变化分别为36.91和2.62(如图9h、9i和表4中所示)。然而，肌酸和植物鞘氨醇在训练和验证数据集中均未显示良好的诊断能力。尿中GlcNAc-6-P和甘露醇的存在表明肠道菌群活性与宿主代谢之间存在相互作用。这些结果也证实了GlcNAc-6-P和甘露醇可能成为未来CHD诊断和治疗的生物标志物和靶点。

在这些具有大于0.80的AUC的7种胆碱代谢物和2种尿代谢物当中，GlcNAc-6-P是最具判别力的生物标志物，其在训练数据集和验证数据集中显示相对良好的诊断能力，假阴性率(FN)分别为0.051、0.153，假阳性率(FP)分别为0.047、0.208。LysoPC(18:3(6Z,9Z,12Z))、LysoPC(P-16:0)、LysoPC(15:0)，1-棕榈酰甘油磷脂酰胆碱、LysoPC(14:0)、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(0:0/18:0)和甘露醇在训练数据集中显示诊断能力(其FN分别为0.271、0.169、0.136、0.068、0.119、0.119、0.085、0.153并且FP分别为0.233、0.163、0.256、0.233、0.209、0.140、0.279、0.093)，在验证数据集中显示诊断能力(其FN分别为0.013、0、0、0.013、0.013、0.013、0、0.135，并且FP分别为0.582、0.755、0.673、0.694、0.612、0.684、0.714、0.416)。采用R软件的“随机森林”和“pROC”软件包，分别基于表7和表8中所示的训练数据集的强度，对7种胆碱代谢物和2种尿代谢物的FN和FP均进行分析。随机森林模型分类输出预测结果(疾病概率；截止值(cutoff)为0.5，如果疾病概率≥0.5，则受试者处于发展CHD的风险中)。

利用R软件的pROC包，将7种潜在的血浆生物标志物组合用于在血浆训练数据集(59个CHD患者血浆样品对比43个健康对照血浆样品)和血浆验证数据集(78个CHD患者血浆样品对比98个健康对照血浆样品，图10，表9，表11)中进行ROC分析。在血浆训练数据集和验证数据集中，FN和FP分别为(0,0)和(0,0.724)。利用R软件的pROC包，将2种潜在尿生物标记物组合用于在尿训练数据集(59个CHD患者尿样品对比43个健康对照尿样品)和尿验证数据集(222个CHD患者尿样品对比173个健康对照尿样品，图11，表10，表11)中进行ROC分析。尿训练数据集和验证数据集中的FN和FP分别为(0.016,0)和(0.121,0.225)。使用R软件的“随机森林”和“pROC”包，分别基于表7和表8中所示的训练数据集的强度，对7种胆碱代谢物组合和2种尿代谢物组合的FN和FP进行分析。随机森林模型分类输出预测结果(疾病概率；截止值为0.5，如果疾病概率≥0.5，则受试者处于发展CHD的风险中)。

表9验证数据集的两个样品中的7种血浆生物标志物的离子强度

表10验证数据集的两个样品中的2种尿生物标志物的离子强度

表11分别由7种血浆生物标志物和2种尿生物标志物预测的验证数据集的疾病概率

实施例2.潜在代谢生物标志物与临床表型的关联

为了评价患者的协变量(诸如年龄和临床生化因素)对代谢谱的影响，进行了PERMANOVA分析。发现白蛋白(ALB)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总蛋白(TP)、低密度脂蛋白(LDLC)、胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDLC)、载脂蛋白b(APOB)和载脂蛋白a(APOA)在CHD患者中具有显著差异(补充表1)。

此外，还针对个体表型，对18种潜在血浆生物标志物和4种潜尿生物标志物进行了Spearman相关分析。CHOL、HDLC和TP与血浆LPC呈显著的正相关(补充表4)。

LysoPC(18:0)与CHOL(rho＝0.518，q值＝7.89E-07)、HDLC(rho＝0.548，q值＝1.29E-07)和TP(rho＝0.573，q值＝5.16E-08)相关。LysoPC(P-16:0)与HDLC(rho＝0.561，q值＝7.39E-08)呈正相关。同时，两种潜在尿生物标志物GlcNAc-6-P和甘露醇与CHOL、HDLC、TP和APOB呈显著负相关(q值<0.01)。这些结果表明在CHD患者中LPC代谢显著异常，因此我们推测通过适当增加在CHD患者中显著降低的这些额外LPC的摄入有益于减少CHD发生。

因此，本发明人通过基于相关代谢物的随机森林模型，鉴定和验证了用于CHD的早期和非侵入性诊断的7种血浆代谢物和2种尿代谢物。并且本发明人已经构建了基于这些相关代谢物评估CHD风险的方法。

尽管已经详细地显示和描述了示例性实施方案，但是本领域技术人员将理解，上述实施方案是说明性的，并且不旨在以任何方式限制本公开，并且可以在不脱离本公开的精神、原理和范围的情况下对所述实施方案进行变化、替换和修改。

Claims

1.一种生物标志物组合物，其包含选自以下的一种或多种：

生物标志物5，其m/z为468.3±1.00,保留时间(RT)为12.69±1.00分钟；

2.权利要求1所述的生物标志物组合物，其包含选自以下的一种或多种：

生物标志物5，其m/z为468.3±1.00,保留时间(RT)为12.69±1.00分钟；

3.权利要求1所述的生物标志物组合物，其中：

生物标志物1是LysoPC(18:3(6Z,9Z,12Z))；

生物标志物2是LysoPC(P-16:0)；

生物标志物3是LysoPC(15:0)；

生物标志物5是LysoPC(14:0)；

生物标志物6是LysoPC(16:1(9Z))；

生物标志物7是LysoPC(0:0/18:0)；

生物标志物8是LysoPC(18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))；

生物标志物9是LysoPC(22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z))；

生物标志物10是LysoPC(20:3(5Z,8Z,11Z))；

生物标志物11是LysoPC(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))；

生物标志物12是LysoPC(18:3(9Z,12Z,15Z))；

生物标志物13是LysoPC(18:0)；

生物标志物15是副黄嘌呤(Paraxanthine)；

生物标志物16是LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))；

生物标志物17是L-精氨酸；和/或

4.一种试剂组合物，其包含用于检测根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物中的每种生物标志物的试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂组合物，其中所述试剂包括用于质谱检测根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物的物质。

6.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物和/或根据权利要求4或5所述的试剂组合物。

7.根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物和/或根据权利要求4或5所述的试剂组合物在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于评估受试者发展CHD的风险，或用于在受试者中诊断CHD。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述评估或诊断包括以下步骤：1)测定来自所述受试者的样品中的根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物中每种生物标志物的水平；2)将步骤1)中所述的水平与参考数据集或参考值(例如健康对照的参考值)进行比较；优选地，所述参考数据集包括来自CHD患者和健康对照的样品中的根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物中的生物标志物的水平。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述样品选自血液、血浆和血清。

10.根据权利要求8或9所述的用途，其中在将步骤1)中所述的水平与参考数据集进行比较的步骤中，还包括执行多元统计模型以输出疾病概率的步骤；优选地，所述多元统计模型是随机森林模型。

11.根据权利要求10所述的用途，其中如果所述疾病概率≥0.5，则所述受试者被确定为处于发展CHD的风险中或患有CHD。

12.根据权利要求8或9所述的用途，其中当与参考值比较时，选自生物标志物1～16中的一种或多种生物标志物(优选为选自生物标志物1～7中的一种或多种)的减少表明所述受试者处于发展CHD的风险中或患有CHD。

13.根据权利要求8或9所述的用途，其中当与参考值比较时，生物标志物17和/或生物标志物18的增加表明所述受试者处于发展CHD的风险中或患有CHD。

14.根据权利要求8或9所述的用途，其中通过质谱法测定每种生物标志物的水平；优选地，通过质谱联用色谱法(如气相色谱质谱法(GC-MS)或液相色谱质谱法(LC-MS))测定每种生物标志物的水平。

15.根据权利要求8所述的用途，其中在步骤1)之前，所述方法还包括处理所述样品的步骤。

16.一种用于评估受试者发展CHD的风险或在受试者中诊断CHD的方法，其中所述方法包括以下步骤：1)测定来自所述受试者的样品中的根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物中的每种生物标志物的水平；2)将步骤1)中所述的水平与参考数据集或参考值(例如健康对照的参考值)进行比较；优选地，所述参考数据集包括来自CHD患者和健康对照的样品中的根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物中的生物标志物的水平。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述样品选自血液、血浆和血清。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其中在将步骤1)中所述的水平与参考数据集进行比较的步骤中，还包括执行多元统计模型以输出疾病概率的步骤；优选地，所述多元统计模型是随机森林模型。

19.根据权利要求16或17所述的方法，其中如果所述疾病概率≥0.5，则所述受试者被确定为处于发展CHD的风险中或患有CHD。

20.根据权利要求16或17所述的方法，其中，当与参考值比较时，选自生物标志物1～16中的一种或多种生物标志物(优选为选自生物标志物1～7中的一种或多种)的减少表明所述受试者处于发展CHD的风险中或患有CHD。

21.根据权利要求16或17所述的方法，其中，当与参考值比较时，生物标志物17和/或生物标志物18的增加表明所述受试者处于发展CHD的风险中或患有CHD。

22.根据权利要求16或17所述的方法，其中通过质谱法测定每种生物标志物的水平；优选地，通过质谱联用色谱法(如气相色谱质谱法(GC-MS)或液相色谱质谱法(LC-MS))测定每种生物标志物的水平。

23.根据权利要求16或17所述的方法，其中在步骤1)之前，所述方法还包括处理所述样品的步骤。

24.根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物或根据权利要求4或5所述的试剂组合物，其用于评估受试者发展CHD的风险或在受试者中诊断CHD的方法。

25.根据权利要求24所述的生物标志物组合物，其中所述评估或诊断方法包括以下步骤：1)测定来自所述受试者的样品中的根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物中的每种生物标志物的水平；2)将步骤1)中所述的水平与参考数据集或参考值(例如健康对照的参考值)进行比较；优选地，所述参考数据集包括来自CHD患者和健康对照的样品中的根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物中的生物标志物的水平。

26.根据权利要求25所述的生物标志物组合物，其中所述样品选自血液、血浆和血清。

27.根据权利要求25或26所述的生物标志物组合物，其中在将步骤1)中所述的水平与参考数据集进行比较的步骤中，还包括执行多元统计模型以输出疾病概率的步骤；优选地，所述多元统计模型是随机森林模型。

28.根据权利要求25或26所述的生物标志物组合物，其中如果所述疾病的概率≥0.5，则所述受试者被确定为处于发展CHD的风险中或患有CHD。

29.根据权利要求25或26所述的生物标志物组合物，其中当与参考值比较时，选自生物标志物1～16中的一种或多种生物标志物(优选为选自生物标志物1～7中的一种或多种)的减少表明所述受试者处于发展CHD的风险中或患有CHD。

30.根据权利要求25或26所述的生物标志物组合物，其中当与参考值比较时，生物标志物17和/或生物标志物18的增加表明所述受试者处于发展CHD的风险中或患有CHD。

31.根据权利要求25或26所述的生物标志物组合物，其中通过质谱法测定每种生物标志物的水平；优选地，通过质谱联用色谱法(如气相色谱质谱法(GC-MS)或液相色谱质谱法(LC-MS))测定每种生物标志物的水平。

32.根据权利要求25或26所述的生物标志物组合物，其中在步骤1)之前，所述评估方法还包括处理所述样品的步骤。

33.根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物和/或根据权利要求4或5所述的试剂组合物在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于筛选治疗受试者的CHD的候选化合物，或者用于评估疗法对受试者的CHD的效果。

34.根据权利要求33所述的用途，其中所述筛选或评估包括以下步骤：1)在向所述受试者施用所述候选化合物或疗法之后，测定来自所述受试者的样品中的根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物中的每种生物标志物的水平；2)将步骤1)中所述的水平与向所述受试者施用所述候选化合物或疗法之前的上述生物标志物的水平进行比较。

35.根据权利要求34所述的用途，其中所述样品选自血液、血浆和血清。

36.根据权利要求34或35所述的用途，其中所述选自生物标志物1～16中的一种或多种生物标志物(优选为选自生物标志物1～7中的一种或多种)的增加表明所述化合物是用于治疗所述受试者的CHD的候选化合物，或者所述疗法对所述受试者的CHD有效。

37.根据权利要求34或35所述的用途，其中所述生物标志物17和/或生物标志物18的减少表明所述化合物是用于治疗所述受试者的CHD的候选化合物，或者所述疗法对所述受试者的CHD有效。

38.根据权利要求34或35所述的用途，其中通过质谱法测定每种生物标志物的水平；优选地，通过质谱联用色谱法(如气相色谱质谱法(GC-MS)，或液相色谱质谱法(LC-MS))测定每种生物标志物的水平。

39.根据权利要求34或35所述的用途，其中在步骤1)之前，所述方法还包括处理所述样品的步骤。

40.一种用于筛选用于治疗受试者的CHD的候选化合物或者用于评估疗法对受试者的CHD的效果的方法，其中所述方法包括以下步骤：1)在向所述受试者施用所述候选化合物或疗法之后，测定来自所述受试者的样品中的根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物中的每种生物标志物的水平；2)将步骤1)中所述的水平与向所述受试者施用所述候选化合物或疗法之前的上述生物标志物的水平进行比较。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述样品选自血液、血浆和血清。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述选自生物标志物1～16中的一种或多种生物标志物(优选为选自生物标志物1～7中的一种或多种)的增加表明所述化合物是用于治疗所述受试者的CHD的候选化合物，或者所述疗法对所述受试者的CHD有效。

43.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述生物标志物17和/或生物标志物18的减少表明所述化合物是用于治疗所述受试者的CHD的候选化合物，或者所述疗法对所述受试者的CHD有效。

44.根据权利要求40或41所述的方法，其中通过质谱法测定每种生物标志物的水平；优选地，通过质谱联用色谱法(如气相色谱质谱法(GC-MS)或液相色谱质谱法(LC-MS))测定每种生物标志物水平。

45.根据权利要求40或41所述的方法，其中在步骤1)之前，所述方法还包括处理所述样品的步骤。

46.根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物或根据权利要求4或5所述的试剂组合物，其用于筛选治疗所述受试者的CHD的候选化合物或者评估疗法对受试者的CHD的效果的方法。

47.根据权利要求46所述的生物标志物组合物，其中所述筛选和评估方法包括以下步骤：1)在向所述受试者施用所述候选化合物或疗法之后，测定来自所述受试者的样品中的根据权利要求1-3任一项所述的生物标志物组合物中的每种生物标志物的水平；2)将步骤1)中所述的水平与向所述受试者施用所述候选化合物或疗法之前的上述生物标志物的水平进行比较。

48.根据权利要求47所述的生物标志物组合物，其中所述样品选自血液、血浆和血清。

49.根据权利要求47或48所述的生物标志物组合物，其中所述选自生物标志物1～16中的一种或多种生物标志物(优选为选自生物标志物1～7中的一种或多种)的增加表明所述化合物是用于治疗所述受试者的CHD的候选化合物，或者所述疗法对所述受试者的CHD有效。

50.根据权利要求47或48所述的生物标志物组合物，其中所述生物标志物17和/或生物标志物18的减少表明所述化合物是用于治疗所述受试者的CHD的候选化合物，或者所述疗法对所述受试者的CHD有效。

51.根据权利要求47或48所述的生物标志物组合物，其中通过质谱法测定每种生物标志物的水平；优选地，通过质谱联用色谱法(如气相色谱质谱法(GC-MS)或液相色谱质谱法(LC-MS))测定每种生物标志物的水平。

52.根据权利要求47或48所述的生物标志物组合物，其中在步骤1)之前，所述方法还包括处理所述样品的步骤。

53.一种建立用于评估所述受试者发展CHD的风险或用于在受试者中诊断CHD的质谱模型的方法，所述方法包括鉴定CHD患者与健康对照的血液样品之间差异表达的物质的步骤，其中所述差异表达的物质包括选自生物标志物1～18中的一种或多种；优选地，所述差异表达的物质包括选自生物标志物1～7中的一种或多种。