CN101939651A

CN101939651A - 用于检测严重有害的心血管和脑血管事件的方法

Info

Publication number: CN101939651A
Application number: CN2008801210762A
Authority: CN
Inventors: P·蒙滕丹; R·巴拉苏布拉马尼安; R·迈尔斯
Original assignee: BG Medicine Inc
Current assignee: BG Medicine Inc
Priority date: 2007-10-10
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2011-01-05
Also published as: WO2009049189A2; EP2210108A2; IL204922A0; AU2008310669A1; US20110045514A1; CA2702268A1; JP2011501133A; WO2009049189A3; EP2210108B1; ES2374762T3; ATE536553T1

Abstract

本发明涉及评估人严重有害的心血管或脑血管事件概率的方法。该方法可包括在人的基于血液的样品中测量被分析物集合的浓度，所述被分析物例如为甲胎蛋白、癌抗原125、谷胱甘肽S-转移酶和组织因子。该方法还可包括测定被分析物集合的MACCE指数，如果MACCE指数大于零，则鉴定该人为具有增加的严重有害的心血管或脑血管事件的可能性，或如果MACCE指数小于或等于零，则鉴定该人为具有降低的严重有害的心血管或脑血管事件的可能性。

Description

用于检测严重有害的心血管和脑血管事件的方法

相关申请

本申请依据35U.S.C.119(e)章节，要求于2007年10月10日提交的美国临时专利申请顺序号60/998,563和2007年10月11日提交的美国临时专利申请顺序号60/998,756的优先权和利益，所述申请各自的整体内容在此引作参考。

发明领域

本申请涉及用于预测人是否将罹患严重有害的心血管或脑血管事件(或MACCE)的方法。更具体地说，本申请涉及通过使用一种或更多种被分析物来筛选处于具有或发展严重有害的心血管或脑血管事件风险中的个体的方法。

背景

心脏病发作是死亡的单一首要原因(参见www.americanheart.org)。在美国每5例死亡中有一例由心脏病发作引起。2004年，在美国有452,327例死亡是由于大约1,200,000例新发生的和复发性的心血管事件产生的心脏病发作所致。

中风在美国是第三位死亡原因(参见www.americanheart.org)。在2004年，由大约700,000件新发生的及复发性脑血管事件造成的中风杀死了150,147个人。在美国中风是严重长期残疾的首要原因。美国有约5,700,000名中风生还者今天仍活着。2,400,000名为男性，3,300,000名为女性。

心脏病发作和某种类型的中风可由脆弱的动脉粥样硬化斑的破裂引起(Naghavi等，Circulation 108：1664-72&108：1772-8，2003)。目前，在一般人群中通过考虑某些临床和生化风险因子来评估具有心脏病发作或中风的风险(Wilson等，Circulation 97：1837-47，1998；ATP III，JAMA 285：2486-97，2001)，但这些特征并不能完全说明心血管风险(Khot等，JAMA 290：898-904，2003；Greenland等，JAMA 290：891-7，2003)。

如果能改进预测未来发生心脏病发作或中风的能力，那么将可能对具有这样的风险的个体采取预防性措施，这些死亡的主要原因的总发生率将降低。

对个体血液中多种蛋白质和代谢物的测量提供了观察该个体生化状态的“窗口”，可能对于他或她的心血管系统的状态及受试者经历未来心脏病发作或中风的可能性提供较好的指示(Vasan，Circulation113：2335-62，2006)。根据该原理，我们进行了目的如下的研究：发现血液或血浆中的分子生物标记谱(例如蛋白质集合、代谢物集合、蛋白质及代谢物集合或可包括蛋白质和/或代谢物的其它被分析物集合)；发现预测近期严重有害的心血管或脑血管事件(MACCE)的相关算法。

因此，仍需要用于预测严重急性心脏事件的诊断方法。具体而言，需要可靠并有成本效益的方法和组合物来为严重有害的心血管和脑血管事件提供诊断和/或预测。

发明简述

本发明(the present teachings)涉及用于预测个体将罹患严重有害的心血管或脑血管事件(或MACCE)的方法。该方法涉及测量源自该个体的血液样品的血浆或血清样品中某些被分析物(例如蛋白质和代谢物)中的一种或更多种的水平，然后采用判定算法来预测个体是否将可能经历MACCE。

业已在血液中鉴定了可用于预测受试者严重有害的心血管或脑血管事件可能性的标记。当这些标记水平不同于标准时，预示严重有害的心血管或脑血管事件。本发明方法利用一种或更多种被分析物来预测严重有害的心血管或脑血管事件。具体来说，可通过使用这些被分析物中的一种或更多种并测定这些被分析物水平是否不同于标准，来筛选处于发展严重有害的心血管或脑血管事件风险中的受试者。

本发明的被分析物并不仅仅可用于预测严重有害的心血管或脑血管事件的可能性。所述被分析物可用于筛选预防严重有害的心血管或脑血管事件的候选药物。所述被分析物还可用于鉴别需要监测其健康的受试者。同样地，所述被分析物可用于验证用于冠状动脉病或脑血管疾病的动物模型。

在一方面，本发明提供评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法。该方法包括在人的基于血液的样品中测量被分析物集合的浓度。被分析物集合可包括甲胎蛋白、癌抗原125、谷胱甘肽S-转移酶和组织因子。该方法进一步包括测定被分析物集合的MACCE指数，如果MACCE指数大于零，则鉴定该人为具有增加的严重有害的心血管或脑血管事件的可能性，或如果MACCE指数小于或等于零，则鉴定该人为具有降低严重有害的心血管或脑血管事件的可能性。

在另一方面，本发明提供评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，其中所述方法包括基于所测量的人的基于血液的样品中被分析物集合的浓度，来测定具有指示严重有害的心血管或脑血管事件可能性的值的MACCE指数。被分析物集合可包括甲胎蛋白、癌抗原125、谷胱甘肽S-转移酶和组织因子。该方法还包括至少将MACCE指数、严重有害的心血管或脑血管事件的可能性或其等同物之一，传输、显示、存储或输出到使用者的接口设备、计算机可读存储介质或者本地或远程计算机系统。

在又一方面，本发明提供治疗人的方法。该方法包括基于所测量的人的基于血液的样品中被分析物集合的浓度，测定具有指示严重有害的心血管或脑血管事件可能性的值的MACCE指数。被分析物集合可包括甲胎蛋白、癌抗原125、谷胱甘肽S-转移酶和组织因子。如果该人被鉴定为具有增加的严重有害的心血管或脑血管事件的可能性，则该方法可进一步包括推荐、批准或给予治疗。

根据不同实施方案，被分析物集合还可包括CD40、纤维蛋白原、IL-3、IL-8、SGOT和血管假性血友病因子(von Willebrand factor)。根据某些实施方案，测定被分析物集合的MACCE指数可包括使所测量的每种被分析物的浓度标准化，以获得标准化的浓度，将每种被分析物的标准化浓度乘以被分析物常数，获得被分析物的值，然后将每种被分析物的被分析物值相加，获得MACCE指数。根据某些实施方案，使所测量的浓度标准化可包括从所测量的浓度中减去群体平均值以获得结果，用该结果除以群体平均值的标准偏差。

在某些实施方案中，该方法包括在人的基于血液的样品中测量被分析物集合的浓度，其中被分析物集合可由以下物质构成：甲胎蛋白、癌抗原125、CD40、纤维蛋白原、谷胱甘肽S-转移酶、IL-3、IL-8、SGOT、组织因子和血管假性血友病因子。该方法进一步包括测定被分析物集合的MACCE指数，如果MACCE指数大于零，则鉴定该人为具有增加的严重有害的心血管或脑血管事件的可能性，或如果MACCE指数小于或等于零，则鉴定该人为具有降低严重有害的心血管或脑血管事件的可能性。

在又一方面，本发明提供评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，其中该方法包括基于所测量的人的基于血液的样品中被分析物集合的浓度，测定具有指示严重有害心血管或脑血管事件可能性的值的MACCE指数。被分析物集合可由以下物质构成：甲胎蛋白、癌抗原125、CD40、纤维蛋白原、谷胱甘肽S-转移酶、IL-3、IL-8、SGOT、组织因子和血管假性血友病因子。该方法还包括将MACCE指数、严重有害心血管或脑血管事件可能性或其等同物中至少之一，传输、显示、存储或输出到使用者的接口设备、计算机可读存储介质或者本地或远程计算机系统。

本发明的另一方面提供治疗人的方法，其中该方法包括基于所测量的人的基于血液的样品中被分析物集合的浓度，测定具有指示严重有害心血管或脑血管事件可能性的值的MACCE指数。被分析物集合可由以下物质构成：甲胎蛋白、癌抗原125、CD40、纤维蛋白原、谷胱甘肽S-转移酶、IL-3、IL-8、SGOT、组织因子和血管假性血友病因子。如果该人被鉴定为具有增加的严重有害心血管或脑血管事件可能性，该方法还可包括推荐、批准或给予治疗。

根据本发明的各种实施方案，测定被分析物集合的MACCE指数可包括使所测量的各被分析物的浓度标准化，以获得标准化的浓度，将各被分析物的标准化浓度乘以被分析物的常数，获得被分析物的值，然后将各被分析物的被分析物值相加，获得MACCE指数。根据某些实施方案，使所测量的浓度标准化包括从所测量的浓度中减去群体平均值以获得结果，用该结果除以群体平均值的标准偏差。

在其它方面，本发明提供评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，其中该方法包括在人的基于血液的样品中测量被分析物集合中至少一种被分析物的浓度。被分析物集合由以下物质组成：半胱氨酸、血管假性血友病因子、IL-8、16:0/18:1磷脂酰胆碱、N-羧基-丙氨酸、纤维蛋白原、MMP-2、18:0/20:4磷脂酰乙醇胺、载脂蛋白A1、16:0/22:6磷脂酰乙醇胺、18:1/18:0/18:0三酰甘油、α-1抗胰蛋白酶、18:2/18:1/17:0三酰甘油、20:1/18:1/18:1三酰甘油、16:0/16:0磷脂酰胆碱、20:4溶血磷脂酰胆碱、16:0鞘磷脂、SHBG、18:1/17:1，16:0三酰甘油、阿拉伯糖和18:1/18:1/17:0三酰甘油。该方法进一步包括基于比较所测量的浓度与预定阈值，来鉴定该人为具有增加的或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性。

在另一方面，本发明提供评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，其中该方法包括将所测量的人的基于血液的样品中被分析物集合中的至少一种被分析物的浓度与预定的阈值比较，以鉴别严重有害心血管或脑血管事件的可能性。被分析物集合选自以下：半胱氨酸、血管假性血友病因子、IL-8、16:0/18:1磷脂酰胆碱、N-羧基-丙氨酸、纤维蛋白原、MMP-2、18:0/20:4磷脂酰乙醇胺、载脂蛋白A1、16:0/22:6磷脂酰乙醇胺、18:1/18:0/18:0三酰甘油、α-1抗胰蛋白酶、18:2/18:1/17:0三酰甘油、20:1/18:1/18:1三酰甘油、16:0/16:0磷脂酰胆碱、20:4溶血磷脂酰胆碱、16:0鞘磷脂、SHBG、18:1/17:1，16:0三酰甘油、阿拉伯糖和18:1/18:1/17:0三酰甘油。该方法还可包括将所测量的浓度、预定的阈值、严重有害心血管或脑血管事件可能性中至少之一，传输、显示、存储或输出到使用者的接口设备、计算机可读存储介质或者本地或远程计算机系统。

在再一方面，本发明提供评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，其中该方法包括测量人的基于血液的样品中的选自以下的被分析物集合中的至少一种被分析物的浓度：16:0/18:1磷脂酰胆碱、18:0/20:4磷脂酰乙醇胺、16:0/22:6磷脂酰乙醇胺、18:1/18:0/18:0三酰甘油、18:2/18:1/17:0三酰甘油、20:1/18:1/18:1三酰甘油、16:0/16:0磷脂酰胆碱、20:4溶血磷脂酰胆碱、16:0鞘磷脂、18:1/17:1/16:0三酰甘油和18:1/18:1/17:0三酰甘油。该方法还可包括基于比较所测量的浓度与预定阈值，鉴定该人为具有增加的或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性。

在又一方面，本发明提供评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，其中该方法包括将所测量的人的基于血液的样品中的被分析物集合中的至少一种被分析物的浓度与预定的阈值比较，以鉴别严重有害心血管或脑血管事件的可能性。被分析物选自：16:0/18:1磷脂酰胆碱、18:0/20:4磷脂酰乙醇胺、16:0/22:6磷脂酰乙醇胺、18:1/18:0/18:0三酰甘油、18:2/18:1/17:0三酰甘油、20:1/18:1/18:1三酰甘油、16:0/16:0磷脂酰胆碱、20:4溶血磷脂酰胆碱、16:0鞘磷脂、18:1/17:1/16:0三酰甘油和18:1/18:1/17:0三酰甘油。该方法还可包括将所测量的浓度、预定的阈值、严重有害心血管或脑血管事件可能性中至少之一，传输、显示、存储或输出到使用者的接口设备、计算机可读存储介质或者本地或远程计算机系统。

根据各种实施方案，以下每一种被分析物的预定的阀值可为表4中各个相应被分析物的第四四分位数的下限：半胱氨酸、血管假性血友病因子、IL-8、16:0/18:1磷脂酰胆碱、N-羧基-丙氨酸、纤维蛋白原、MMP-2、18:0/20:4磷脂酰乙醇胺、16:0/22:6磷脂酰乙醇胺、18:1/18:0/18:0三酰甘油、α-1抗胰蛋白酶、18:2/18:1/17:0三酰甘油、20:1/18:1/18:1三酰甘油、16:0/16:0磷脂酰胆碱、16:0鞘磷脂、SHBG、18:1/17:1，16:0三酰甘油和18:1/18:1/17:0三酰甘油，其中所测量的落入第四四分位数内的浓度增加严重有害心血管或脑血管事件可能性。根据某些实施方案，以下每一种被分析物的预定阀值可为表4中各个相应被分析物的第三和第四四分位数的下限：半胱氨酸、血管假性血友病因子、IL-8、16:0/18:1磷脂酰胆碱、N-羧基-丙氨酸、纤维蛋白原、MMP-2、18:0/20:4磷脂酰乙醇胺、16:0/22:6磷脂酰乙醇胺、18:1/18:0/18:0三酰甘油、α-1抗胰蛋白酶、18:2/18:1/17:0三酰甘油、20:1/18:1/18:1三酰甘油、16:0/16:0磷脂酰胆碱、16:0鞘磷脂、SHBG、18:1/17:1，16:0三酰甘油和18:1/18:1/17:0三酰甘油，其中所测量的落入第三和第四四分位数内的浓度增加严重有害心血管或脑血管事件可能性。

根据各种实施方案，被分析物载脂蛋白A1、20:4溶血磷脂酰胆碱和阿拉伯糖各自的预定阀值可为表4中各个相应被分析物的第一四分位数的上限，其中所测量的落入第一四分位数内的浓度增加严重有害心血管或脑血管事件可能性。根据某些实施方案，被分析物载脂蛋白A1、20:4溶血磷脂酰胆碱和阿拉伯糖各自的预定阀值可为表4中各个相应被分析物的第一个和第二四分位数的上限，其中所测量的落入第一和第二四分位数内的浓度增加严重有害心血管或脑血管事件可能性。

在本发明的各种实施方案中，基于血液的样品可为血清或血浆。

在又一方面，本发明提供用于预测人严重有害的心血管或脑血管事件的方法，其中该方法可包括从人获得至少一种基于血液的样品，在来自该人的样品中测量附录1中鉴定的一种或更多种被分析物的绝对浓度，并基于所述附录1中鉴定的一种或更多种被分析物的绝对浓度，将该人鉴定为具有增加或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性。

在又一方面，本发明提供用于预测人严重有害的心血管或脑血管事件的方法，其中该方法包括在来自人的样品中测量附录1中鉴定的一种或更多种被分析物的绝对浓度，将该绝对浓度与预定的阀值比较，并基于所述附录1中鉴定的一种或更多种被分析物的绝对浓度，将该人鉴定为具有增加或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性，并将严重有害心血管或脑血管事件可能性、绝对浓度、预定的阈值或其等同物中至少之一，传输、显示、存储或输出到使用者的接口设备、计算机可读存储介质或者本地或远程计算机系统。

在某些方面，本发明提供用于预测人严重有害的心血管或脑血管事件的方法，其中该方法包括从人获得至少一种基于血液的样品，在来自人的所述样品中测量附录1中鉴定的一种或更多种被分析物的相对浓度，基于所述附录1中鉴定的一种或更多种被分析物的相对浓度，将该人鉴定为具有增加或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性。

在又一方面，本发明提供用于预测人严重有害的心血管或脑血管事件的方法，其中该方法包括在来自人的样品中测量附录1中鉴定的一种或更多种被分析物的相对浓度，将该相对浓度与预定的阀值比较，基于所述附录1中鉴定的一种或更多种被分析物的相对浓度，将该人鉴定为具有增加或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性，并将严重有害心血管或脑血管事件可能性、该相对浓度、预定的阈值或其等同物中至少之一，传输、显示、存储或输出到使用者的接口设备、计算机可读存储介质或者本地或远程计算机系统。

根据所述方法的各种实施方案，将MACCE指数、严重有害心血管或脑血管事件可能性、所测量的浓度、预定的阈值或其等同物显示在屏幕或有形介质上，或将MACCE指数传输给医药工业人员、提供医疗保险的人或医生。

在另一方面，本发明提供治疗的方法，其中该方法可包括基于在基于血液的样品中所测量的附录1中所鉴定的一种或更多种被分析物的浓度，鉴别某人为具有增加或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性，如果该人被鉴定为具有增加的严重有害心血管或脑血管事件可能性，则推荐、批准或给予治疗。

在又一方面，本发明提供鉴别不应该接受治疗的人的方法，其中该方法可包括基于在基于血液的样品中所测量的附录1中所鉴定的一种或更多种被分析物的浓度，鉴别某人为具有增加或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性，除非该人被鉴定为具有增加的严重有害心血管或脑血管事件可能性，否则拒绝推荐、批准或给予治疗。

从以下附图、描述、实施例和权利要求书中将更全面地理解本发明前述的以及其它的特征和优点。

附图简述

当与附图一起阅读时，从以下各种阐明性实施方案的描述将更全面地理解本发明前述和其它目的、特征和优点。附图中，例如参考文字通常指不同视野的同一部分。应该理解，以下所述附图仅为说明目的。附图并非意欲以任何方式限制本发明范围。

图1为描绘预测两年内发生MACCE的接受者工作特性(ROC)曲线，其使用本发明例示性实施方案的血浆样品中的表5的前20种被分析物的水平。

图2为描绘预测两年内发生MACCE的接受者工作特性(ROC)曲线，其使用本发明例示性实施方案中血浆样品中的表6的前10种蛋白质被分析物的水平。

详述

业已鉴定了预示严重有害的心血管或脑血管事件的被分析物。当这些被分析物中的一种或更多种以不同于标准量的量存在于来自个体的体液样品中时，它们可以指示个体处于具有或发展严重有害的心血管或脑血管事件的风险。本申请在此将以下每一专利申请的整体内容引作参考：2007年10月10日提交的美国临时专利申请顺序号60/998,563和2007年10月11日提交的美国临时专利申请顺序号60/998,756。

在整个说明书中，当组合物被阐述为具有、包括或包含特定组分时，或当方法被阐述为具有、包括或包含特定方法步骤时，意指本发明组合物也基本上由或由所述的组分组成，并本发明方法也基本上由或由所述方法步骤组成。

在本申请中，当认为某一要素或组分被包括在和/或选自所述要素或组分列表时，应该理解，该要素或组分可为所述要素或组分的任何一种，并可选自两种或更多种所述要素或组分中的两种或更多种。另外，应该理解，本文所述组合物、仪器或方法的要素和/或特点，可在不偏离本发明精神和范围(不管是本文明示还是暗示的)时以各种各样的方式组合。

除非明确指出不是这样，否则术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”的使用通常应该理解为开放式的而非限制性的。

除非明确指出不是这样，否则本文单数的使用包括复数(反过来也一样)。另外，除非明确指出不是这样，否则当术语“约”在数值之前使用时，本发明还包括其本身的具体数值。本文所用术语“约”指名义值的±10％偏差。

应该理解，步骤次序或实施某些行为的次序是不重要的，只要仍然可实施本发明就行。此外，可同时实施两步或更多步步骤或行为。

鉴定了七百二十三(723)种被分析物。本发明的某些方法利用这些被分析物中的两种或更多种来预测严重有害的心血管或脑血管事件。具体来说，在这些方法中，可筛选受试者样品以确定样品中这七百二十三(723)种被分析物中两种或更多种中每一种的水平是否不同于标准样品。如果样品含有的这些被分析物中的两种或更多种中的每一种的量不同于这些被分析物的标准量，则认为该筛选为“阳性筛选”(即个体处于罹患严重有害的心血管或脑血管事件风险中)。在对严重有害的心血管或脑血管事件样品分类时可获得更高的灵敏度和特异性，通常通过使用更多被分析物种类来获得。可能含有这些被分析物的样品可来自从多种来源(例如全血、血浆、血清、尿、脑脊髓液、上皮细胞和内皮细胞)获得的多种生物学样品(例如体液、组织、细胞)。应该理解，在本发明方法中可使用本文公开的七百二十三(723)种被分析物(不仅仅是表5中鉴定的五十(50)种被分析物)的所有可能组合。

使用实施例1中详细阐述的方法鉴定了七百二十三(723)种被分析物。简言之，通过特定的分类分析方案，分析了七百二十三(723)种被分析物集合，获得了波谱峰。附录1到4提供了包含所分析的这七百二十三(723)种被分析物的特定分子。这些峰表征了特定分子。用这些峰(其包括所有723种被分析物)鉴定了五十个峰(以及下述其它优选峰)。就峰表征分子而言，从数量大得多的峰中鉴别出50个峰，意指被分析物选自包括多于对应于所述50种被分析物的50种分子的一组分子。被分析物(即分子)可为任何类型的分子。被分析物(分子)包括但不限于：蛋白质、肽、氨基酸、脂类、类固醇、核酸、代谢物和元素。表5提供包含所述50个峰(即鉴别所选择的被分析物)的特定分子。表5的第2栏按权重排列峰的次序。因此，权重最高的峰排在第1，权重最低的峰排在第50。

既然知道了被分析物(即已鉴定的七百二十三种被分析物中的任何一种、或优选的50种被分析物中的任何一种)，那么可将它们用于筛选个体以测定个体样品中的这些被分析物中的两种或更多种的每一种的量或绝对浓度是否不同于该两种或更多种标准被分析物中每一种的量，来测定与标准比较个体样品中所述两种或更多种被分析物的每一种的相对浓度，以某种特异性和灵敏度将该个体界定为具有或处于发展严重有害的心血管或脑血管事件的风险。当然，在比较前可使所测量的被分析物的量或浓度标准化。基于所检查的被分析物的数量，可选择测定所需的灵敏度和特异性。标准可为实际样品或先前产生的经验数据。标准可来自已知正常的人。已知正常的人可为健康的人，并可在取样前的预定时间摄入了预定饮食。此外，样品可从与受试者同样性别的已知正常的人获得。或者，可将被分析物与已知严重有害的心血管或脑血管事件受试者的被分析物比较，在这种情况下将检查这两种样品之间的相似性，或与标准比较的被分析物的相对浓度。可由医学从业人员将各种技术和/或试剂盒用于筛选受试者样品，以便测定受试者样品中特定被分析物的水平和/或量。在下面阐述所述测定的实例，所述测定包括但不限于免疫测定、质谱、色谱、化学分析、比色分析、分光光度分析、电化学分析和核磁共振。另外，可对任何生物学样品实施所述测定，所述样品包括全血、血浆、血清、脑脊髓液、唾液、尿、精液、乳头分泌物、胰液及其组合。基于其最适合检测特定被分析物以及最适合使用特定生物学样品来选择这些测定。因此，可使用多种测定来检测所期需被分析物，并且可分析来自一种或更多种来源的样品。

可通过使用一种或更多种分离方法来检测和/或定量被分析物。例如，合适的分离方法可包括质谱分析方法，例如电离喷雾质谱法(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)ⁿ(n为大于零的整数)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、表面加强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)、硅表面解吸/电离(DIOS)、二次离子质谱(SIMS)、四极时间飞行(Q-TOF)、大气压化学电离质谱(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS)ⁿ、大气压光电离质谱(APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS)ⁿ。其它质谱分析方法可包括除此之外的四极、傅立叶变换质谱(FTMS)和离子阱。还可使用的波谱测定技术包括磁共振波谱和光学波谱。

其它合适的分离方法包括化学提取分配、柱色谱法、离子交换色谱法、疏水(反相)液相色谱法、等电聚焦、单向聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)或其它色谱技术(例如薄层、气相或液相色谱法)或其任何组合。在一个实施方案中，待测定的生物学样品可在施用分离方法之前分级分离。

色谱(例如液相色谱法(“LC”))和质谱分析(“MS”)串联可用于检测和定量一种或更多种被分析物。LC可用于对在来自个体的样品中可能包括被分析物的分子进行分离。可将溶解于溶剂中的少量样品注入到可保持在高温的LC设备的注入端口。所述设备的LC柱含有可为极性或非极性的固体基质。因为样品中分子的极性不同，分子对于柱中固态基质的亲合力就不同，所以将在不同时间洗脱。分子对基质的亲合力越强，分子在柱中的保留时间就越长。当分子从柱中出来时，它们进入质谱仪。质谱仪使分子电离。在串联质谱分析模式中，如果可使系统合适地标准化，则进入质谱仪的每种化合物断裂为各种质量和丰度的离子，形成对于该物质而言独特的标记图(signature pattern)。通过将串联质谱仪的每一峰与计算机化的数据库比较，计算机通常能够以高可信度鉴别出所述分子。作为备选或另外，这种比较可通过人工检测进行。一旦确定了身份，则计算机将每一峰下面积积分，由此测定混合物中各分子的相对量。当所述分子中的任一种都可被鉴定为被分析物时，可将被分析物的量与来自标准的被分析物的量比较，以确定是否有差别。

还可通过不需要将被分析物本身进行物理分离的方法来检测和/或定量被分析物。例如，核磁共振(NMR)波谱可用于解析来自复合分子混合物的被分析物概况(profile)。例如，NMR界定肿瘤的类似应用公开于Hagberg，NMR Biomed.11：148-56(1998)中。另外的方法包括核酸扩增技术，其可用于不进行个体分子的物理分离来测定被分析物概况。(例如参见Stordeur等，J.Immunol.Methods 259：55-64(2002)和Tan等，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 99：11387-11392(2002))。

例如，还可检测和/或定量样品中的被分析物，例如通过将被分析物与能够特异性结合被分析物的结合部分结合来检测和/或定量样品中的被分析物。结合部分可包括例如配体-受体对(即能够具有特异性结合作用的分子对)成员。结合部分还可包括例如特异性结合对成员，所述特异性结合对例如抗体-抗原、酶-底物、核酸-核酸、蛋白质-核酸、蛋白质-蛋白质或本领域已知的其它特异性结合对。可设计对靶标的亲合力提高的结合蛋白。任选地，所述结合部分可连接可检测标记，例如酶标记、荧光标记、放射性标记、磷光标记或有色粒子标记。可检测标记的复合物，例如通过目视或借助于分光光度计或其它检测仪来检测，和/或可定量标记的复合物。

也可用本领域可用的凝胶电泳技术检测和/或定量被分析物。在双向凝胶电泳中，分子首先在pH梯度凝胶中按照其等电点分离。然后将得到的凝胶置于第二个聚丙烯酰胺凝胶上，按照分子量分离分子(参见例如，O′Farrell J. Biol.Chem.250：4007-4021(1975))。可首先通过从怀疑处于严重有害的心血管或脑血管事件风险的个体获得的样品分离分子，然后通过双向凝胶电泳分离分子以产生特征性双向凝胶电泳图谱，来检测严重有害的心血管或脑血管事件的被分析物。然后将该图谱与在同样或相似条件下分离从标准品(例如健康或严重急性心脏事件受试者)分离的分子所产生的标准凝胶图谱比较。标准凝胶图谱可储存在电泳图谱电子数据库并从中取回。因此，其可确定受试者中所述标记的量是否不同于标准品中的量。在双向凝胶上以不同于已知正常标准中的量存在多种(例如2-50种)严重有害的心血管或脑血管事件被分析物，则指示表明个体严重有害的心血管或脑血管事件的阳性筛选。因此，该检测允许预测和治疗严重有害的心血管或脑血管事件。

可用本领域有用的多种免疫测定技术中的任何一种检测和/或定量被分析物。例如，夹心免疫测定形式可用于检测和/或定量受试者样品中的被分析物。或者，可用一种或更多种标记的结合蛋白将常规免疫组织化学程序用于检测和/或定量样品中被分析物的存在。

在夹心免疫测定中，通常使用两种能够结合被分析物的抗体，例如一种固定在固体支持体上，另一种游离在溶液中并用可检测的化学化合物标记。可用于第二抗体的化学标记的实例包括放射性同位素、荧光化合物和酶、或当与反应物或酶底物接触时产生有色产物或电化学活性产物的其它分子。当将含有被分析物的样品置于该系统中时，被分析物既与固定化抗体结合又与标记的抗体结合，在支持体表面形成“夹心”免疫复合物。通过洗掉未结合的样品组分和过量的标记抗体，并测量与支持体表面的被分析物形成复合物的标记抗体的量，来检测形成复合物的被分析物。或者，可通过用结合游离抗体或例如偶联在其上的半抗原的可检测部分标记的第三抗体，来检测可用化学部分(例如半抗原)标记的游离在溶液中的抗体。

夹心免疫测定和组织免疫组织化学方法都高度特异性并极为灵敏的，前提是使用具有良好检测限的标记。可在本领域大量教科书中找到免疫测定设计、理论及方案的详细综述，所述教科书包括Butt，W.R.，Practical Immunology，Marcel Dekker编辑，New York(1984)和Harlow等Antibodies，A LaboratoryApproach，Cold Spring HarborLaboratory编辑(1988)。

一般而言，免疫测定设计考虑的事情包括制备对靶标具有足够高的结合特异性以形成能可靠地与非特异性相互作用的产物区别开的复合物的抗体(例如单克隆或多克隆抗体)。本文所用术语“抗体”应理解为意即结合蛋白，例如抗体或对靶标具有适当的结合亲合力和特异性的包含免疫球蛋白可变区样结合结构域的其它蛋白质。抗体结合特异性越高，可被检测的靶标浓度就越低。本文所用术语“特异性结合”应理解为意即结合部分(例如结合蛋白)对于靶标的结合亲合力大于约10⁵M^-1、更优选大于约10⁷M^-1。

使用本领域众所周知并经阐述的标准免疫学程序，可产生了用于预测个体严重有害的心血管或脑血管事件测定的针对分离的靶标被分析物的抗体。参见例如Practical Immunology，见上述。简言之，分离的被分析物可用于在异种宿主中产生抗体，异种宿主例如为小鼠、山羊或其它合适的哺乳动物。被分析物可与能够提高宿主中抗体产量的合适的佐剂联合，并可通过例如腹膜内给药注射到宿主中。可使用适于刺激宿主免疫应答的任何佐剂。常用佐剂为完全弗氏佐剂(包含灭活并干燥的微生物细胞的乳液，可自例如Calbiochem Corp.，San Diego或Gibco，Grand Island，NY获得)。在需要注射多种抗原时，随后的注射可包含与不完全佐剂(例如无细胞的乳液)组合的抗原。通过提取含针对目的蛋白的抗体的血清，可从产生抗体的宿主分离多克隆抗体。单克隆抗体可如下产生：分离产生所需抗体的宿主细胞，用免疫领域已知标准程序让这些细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选与靶标起特异性反应并具有所需结合亲合力的杂种细胞(杂交瘤)。

也可经生物合成产生抗体结合结构域，操纵结合结构域的氨基酸序列以提高与靶标优选表位的结合亲合力。具体的抗体方法可被很好的理解并在文献中阐述。关于其制备的更详细说明可在例如Practical Immunology(见上述)中找到。

另外，可用本领域已知的遗传工程改造的生物合成抗体结合位点如BABS或sFv的结合位点，来测定样品是否含有被分析物。在例如美国专利第5,091,513号、第5,132,405号、第4,704,692号和第4,946,778号中公开了制备和使用BABS的方法，所述BABS包含：(i)非共价缔合或经二硫键连接的V_H和V_L二聚体；(ii)共价连接的V_H-V_L单链结合位点；(iii)单独的V_H或V_L结构域；或(iv)单链抗体结合位点。此外，可通过从组合基因文库克隆噬菌体抗体，得到对被分析物具有必要的特异性的BABS(参见例如Clackson等Nature352：624-628(1991))。简言之，根据对固定化的被分析物的结合活性，对噬菌体进行筛选，其中所述噬菌体每一种都在其衣壳表面表达BABS，所述BABS具有由源自用分离的被分析物或其片段预免疫的小鼠的可变区基因序列编码的免疫球蛋白可变区。收获结合固定化被分析物的噬菌体，可对编码BABS的基因进行序列测定。可用常规表达系统来表达所得的编码目的BABS的核酸序列，以产生BABS蛋白。

分离的被分析物还可用于开发诊断和其它组织评估试剂盒和测定，以监测组织或流液样品中被分析物的水平。例如，试剂盒可包括抗体或其它特异性结合蛋白，所述结合蛋白与一种或更多种被分析物特异性结合，并使得可检测和/或定量组织或流液样品中的所述一种或更多种被分析物的存在情况和/或量。

适用于检测一种或更多种被分析物的试剂盒计划包括但不限于：容器或用于捕获待评估的样品的其它工具(means)和用于检测样品中本文所述的一种或更多种被分析物的存在情况和/或量的工具。在一个实施方案中用于检测的工具包括但不限于对这些被分析物特异性的一种或更多种抗体和通过例如本文所述标准夹心免疫测定检测抗体与这些被分析物结合的工具。当要检测位于细胞内(例如来自组织样品)的被分析物的存在情况时，试剂盒还可包括用于破坏细胞结构以便暴露细胞内组分的工具。

本发明的被分析物可包括特定序列的核酸。可通过测定(用例如实时定量PCR(RT-PCR))样品中被分析物核酸的量或绝对浓度，并将所测量的量与标准比较，以确定样品中被分析物核酸的相对浓度，来检测和/或定量一种或更多种被分析物。RT-PCR有效测量因PCR而产生的被分析物核酸的量。阳性结果代表所测量的被分析物核酸的量不同于来自标准的被分析物的量，或代表其值高于或低于零的相对浓度。

可开发与特定核酸被分析物的核酸序列互补的引物。这些引物指导聚合酶复制并扩增该特定核酸。RT-PCR检测在反应期间扩增的核酸被分析物的累积量。在PCR反应的指数期，可测量累积的核酸被分析物。可用具有已知核酸浓度的校准标准来制备标准曲线，从该标准曲线中可推算测试样品中核酸被分析物的量。

一旦知道样品中核酸被分析物的量或绝对浓度，就将其可与来自标准的被分析物的量比较，以测定样品中核酸被分析物的相对浓度。通过经验方法可确定用于界定严重有害的心血管或脑血管事件受试者的标准。例如，可通过扩增来自一个或多个已知正常的个体之群体的样品中的核酸被分析物，并定量分析群体中核酸被分析物的量来测定该量。

同样，可实施另外形式的样品化学分析。例如，可进行指示样品中各被分析物的量或绝对浓度的定量测试。比色法是定量化学分析法，其测量通过样品与试剂反应产生的颜色强度，所述颜色强度作为样品中待测物质的量的标示。可提供与被分析物反应时在测试样品中产生颜色的试剂。颜色强度可依赖样品中被分析物的量。通过与校准的颜色卡和/或标准比较强度，可测定样品中被分析物的量。然后可将该量与来自标准(例如来自已知正常的人)的被分析物的量比较，以测定样品中被分析物的相对浓度。

另外，尿分析可用于测定尿样品中被分析物的量或绝对浓度。用多种不同的仪器和技术测试尿样品。某些测试用试纸条(dipstick)，试纸条是在某些特殊物质存在下改变颜色的薄塑料条。试纸条可用于测量被分析物的量。

将至少两种被分析物中每一种的绝对水平或浓度与来自标准的所述两种被分析物中每一种的水平比较，以测定每一种所述被分析物的相对浓度，这不仅可以诊断具有或处于具有严重有害的心血管或脑血管事件风险，而且这种同样的比较方法也可适用于其它应用。例如，被分析物可用于筛选治疗严重有害的心血管或脑血管事件的候选药物。在这种情况下，可通过监测被分析物水平来监测候选药物治疗。当被分析物绝对浓度从该患病水平回到标准水平，由此相对浓度达到零时，就可确定有效。此外，对于已经发现有效治疗严重有害的心血管或脑血管事件的任何药物，某些受试者可能是响应者，某些可能不是响应者。因此，在治疗期间可监测被分析物，以通过测定被分析物绝对水平或浓度是否回到标准水平，藉此相对浓度接近零，来确定药物是否有效。当然，可能没有任何目前已知的响应者和非响应者群体，因此可随时间监测药物治疗对任何严重有害的心血管或脑血管事件受试者的功效。当其无效时，可终止其应用，代之提供另一种药物。

此外，可通过将至少两种被分析物中每一种的绝对水平或浓度与来自标准的两种被分析物中每一种的水平比较来测定相对浓度，作为预防性筛选测量，而不仅是当观察到有害的心血管或脑血管事件时(即在疾病可能已经发展后)来测量。例如，假定受试者没有有害心血管或脑血管事件的证据，为了在尽可能早的时间获得具有或处于具有严重有害的心血管或脑血管事件风险的诊断，可在某一年龄后并以预定的间隔监测受试者。在筛选为阳性时，医学专业人员可建议进一步监测疾病进展，和/或医学专业人员可开始用药物或其它疗法治疗。

包括例如每一种被分析物的量或绝对浓度、每一种被分析物相对于标准的相对浓度和/或具有或处于具有严重有害的心血管或脑血管事件风险可能性在内的分析结果，可被显示或输出到使用者的接口设备、计算机可读存储介质或者本地或远程计算机系统。显示或输出结果或诊断，意即使用任何介质(例如口头、书面、直观显示等)、计算机可读介质或计算机系统将任何前述分析的结果与使用者交流。本领域技术人员将明了输出结果不仅仅限于输出给使用者或所连接的外部部件(例如计算机系统或计算机存储器)，而且可备选地或另外输出到内部组件(例如任何计算机可读介质)。计算机可读介质可包括但不限于硬盘、软盘、CD-ROM、DVD和DAT。计算机可读介质不包括用于数据传输的载波或其它波形式。本领域技术人员将明了，本文公开并要求保护的各种样品的评估和诊断方法，可以但不必用计算机执行，并例如可实施显示或输出步骤，例如通过口头或书面(例如以文字书写)与个体交流。

此外，所述被分析物可用于验证严重有害的心血管或脑血管事件的动物模型。例如，在任何特定模型中，可以分析样品以确定动物中被分析物的水平是否与已知严重有害的心血管或脑血管事件受试者的被分析物水平相同。这将验证模型，例如以便以上述方式测试候选药物。

实施例1

本实施例阐述鉴别严重有害的心血管或脑血管事件的被分析物所用的方法。简言之，本研究包括一百三十六(136)名受试者。通过鉴定在指标-心脏插管(index cardiac catheterization)的2年内经历了严重有害的心血管或脑血管事件的受试者，实现了将受试者界定为疾病类或对照类，所述严重有害的心血管或脑血管事件定义为：心肌梗死、经皮冠状动脉介入治疗或死亡。

冷冻血浆样品来自对在杜克大学医学中心(CATHGEN研究)经历心导管术的个体的长期研究中获得的收集样品。血浆样品来自136名研究受试者，其中68名病例和68名相匹配的对照(如下定义)。根据其冠状动脉病(CAD)指数、年龄、性别和种族来匹配病例和对照。病例组和对照组中的某些研究受试者在心导管术和血管造影术时都不表现冠状动脉病体征。其它受试者具有由较高的CAD指数分值所示的不同的冠状动脉狭窄严重程度。

所记录的所有样品的临床参数为下表1中所示参数。这些参数(不是在病例和对照匹配时的那些参数)在某些统计学分析中作为附加临床因子(如下所述)包括在内。

表1：研究受试者的临床参数

特性	类别/单位	说明
			年龄	年	插管术时的年龄(整数)
种族	·白种人·非洲裔美国人·其它
			CAD指数		冠状动脉病严重程度指数
BMI	·＜25·25-29.9·＞＝30	体重指数
			血脂异常	·是·否	血脂异常史
家族史	·是·否	冠心病家族史
			高血压	·是·否	是＝高血压史或收缩BP＞140或舒张BP＞90
糖尿病	·是·否	是＝I或II型糖尿病
			吸烟状态	·是·否	吸烟史
肌氨酸酐清除率	连续测量	基于年龄、质量、血浆肌氨酸酐和性别的Cockcroft-Gault近似值
			每日服用阿司匹林	·是·否	从专业治疗药物表获得

使用他汀类

·是·否

从专业治疗药物表获得

病例鉴定为具有以下特点：在指标插管(index catheterization)之前，受试者没有冠状动脉搭桥术(CABG)、因心脏事件而进行的经皮冠状动脉介入治疗(PCI)或心肌梗死(MI)的历史；受试者后来没有CABG；受试者的射血分数≥40％(在指标插管时)并且不降低；在指标插管和血液取样后2年内发生MI、PCI或死亡。将明显为非冠状动脉病相关的死亡(即肺高血压、癌症等)的那些受试者排除在外。将指标插管7天内具有PCI相关事件的那些受试者排除在外。

对照例鉴定为具有以下特点：在指标插管之前，受试者没有冠状动脉搭桥术(CABG)、因心脏事件而进行的经皮冠状动脉介入治疗(PCI)或心肌梗死(MI)的历史；受试者后来没有CABG；受试者的射血分数≥40％(在指标插管时)并且不降低；在指标插管和血液取样后至少2年时间内不发生MI、PCI或死亡。

用以下表2提供并在下文详述的平台对样品进行综合生物分析。

表2：生物分析程序

蛋白质组学	在统计学分析中使用的被分析物醋
		LC-MALDI-MS/MS发现蛋白质组学	217
定向蛋白质组学(多元免疫测定)	66
		代谢物组学
脂类LC/MS代谢物组学	125
		极性LC/MS代谢物组学	164
GC/MS代谢物组学	130
		游离脂肪酸	21

在本研究的生物分析部分成功地测量了总共723种被分析物。每一生物分析平台对该总数的贡献示于上表2。对每个平台的生物分析平台结果进行分析，也将所述结果联合为用于随后统计学分析的单一综合数据集(参见下文的论述)。

脂类液相色谱(“LC”)串联质谱分析(“LC/MS”)代谢物组学

本方法使用的液相色谱和质谱分析条件是为解析和检测脂类分子而优化的条件。

按照该方法使用以下材料。包括水、甲醇和异丙醇和二氯甲烷(HPLC级)在内的溶剂和试剂购自VWR(USA)。甲酸(99％)、乙酸铵、二氯甲烷和利血平购自Sigma-Aldrich(Milwaukee，WI)。HPLC保护柱(Symmetry 300C4

3.5μ2.1x10mm)和分析柱(C4

3.5μ2.1x150mm)购自Waters(Milford，Ma)。自动进样瓶、300μL总回收瓶和螺帽购自Waters(Milford，Ma)。用于储存的500μL Eppendorf管购自VWR。脂类内标17:0LPC、24:0PC和40:0PC购自Avanti PolarLipids(Alabaster，AL)，而30:0PC和51:0TG购自Sigma-Aldrich(Milwaukee，WI)。

样品按以下方案提取。为了使数据标准化将5种内标加到提取溶液中。在1:9的DCM/IPA溶液中将适当称量的各种内标化合物溶解来制备内标储液，以获得视具体脂类而定为1-3mg/ml范围的终浓度。将5种储液每一种的300μL等份样加到300mL的1:9DCM/IPA溶液中来制备提取溶液(参考SOP：BG-QC27R01)。将该溶液用作脂类提取溶液，其含有5种内标-分别以2∶1∶2∶3∶2(μg/mL)的浓度比率加入的17:0LPC、24:0PC、30:0PC、40:0PC、51:0TG。

用于LC/MS分析的样品按以下方案制备。将每批样品连同质量对照样品一起从冰箱取出，放在冰上融化。将适当体积的提取溶液加到各个含有10μL血浆的样品瓶中。轻轻旋涡振荡小瓶，在24℃以14,000RPM离心10分钟。将上清液转移到中间小瓶，由旋涡振荡器再混合若干秒，将每一种的2份60μL的等份样作为重复样品吸取到两个条形码自动进样瓶用于LC/MS分析。将其余的上清液储存在-40℃用于LC/MS/MS分析。丢弃其余含有沉淀的提取物。

按以下方案进行高效液相色谱(HPLC)分析。色谱仪器由以下部分组成：带有四元梯度系统的Waters 2795Alliance HPLC系统、自动进样器、设置为45℃的外柱加热器和带有内置前置柱的HPLC分析柱。分离被分析物，以350μL/分钟的流速输送到质谱仪。以由95％H₂O和5％MeOH构成的溶剂A和由99％MeOH和1％H₂O构成的溶剂B用二元梯度(0分钟-20％B、2分钟-20％B、4分钟-80％B、20分钟-100％B、25分钟-100％B、25.1分钟-20％B、35分钟-20％B)进行被分析物分离。两种溶剂流都含有10mM乙酸铵和0.1％甲酸。将5μL样品注射到20μL样品环中，在由分析柱分离之前上样到前置柱上。在每一样品之间，用异丙醇/MeOH溶液洗涤注射针头、样品环和注射器。

在配有LockSpray ESI源的Waters/Micromass四极杆时间飞行仪(Waters，Q-ToF^TM)上实施LC/MS分析。将ESI源块温度保持在120℃，脱溶剂气温度设置在320℃。用处于609.2814的利血平(reserpine)峰使MS信号灵敏度最佳化。在MS模式中使用质子化的聚丙氨酸峰实施质量校准。用3-5ppm的LockMass校准精确度使约8500的平均仪器分辨率定向5种IS峰。在先前研究的基础上，在LC洗脱期间的7-23分钟获得MS数据。通过在0.3秒内扫描m/z 300-1000以质心模式(centroid mode)获得所有LC/MS数据。

随后在具有相同LC条件的相同LC/MS系统上实施MS/MS分析，以鉴定被分析物。用聚丙氨酸母体(precursor)峰碎片在m/z 1084时进行MS/MS校准。通过在1或2秒内扫描m/z 100-1000以质心式获得所有MS/MS数据。必要时对靶标列表(target list)进行LC保留时间校正。通过定向分析收集MS/MS数据。

按以下方案进行峰检测。对所接受的运行原始数据文件进行峰的挑选和积分。只有达到限定阀值的峰才进入比对过程。各峰以m/z值和保留时间表征，例如，将在m/z 510检测到并在7.88分钟洗脱的峰标记为510_0788。各个样品独立进行。

在挑选完峰后，让通过选峰算法产生的.MLL文档彼此“比对”。程序使用来自所有注入的内标峰设定保留时间窗口，然后基于参考峰的平均保留时间符合逻辑地“比对”该批次内的各被分析物。在该过程结束时，物理保留时间可从510_0785漂移到510_0788，对于峰面积可施用另外的阀值。

通过多种测量来评估各批的质量控制(QC)，所述测量包括计算内标对所有样品的相对标准偏差百分比(％RSD)、用内标峰的提取面积(extracted area)(强度)作为时间的函数作图，以鉴别趋势并核查在比对前后两者间的保留时间变化。在分析期间也对每次注入进行目视QC检查。这些检查集中在重复注入的覆盖情况怎样、QC样品随时间的行为和总体仪器趋向。在研究期间可能出现的保留时间及峰面积的小变化可在数据标准化过程中得到校正(例如微小短暂的趋向)，但更显著的变化(例如局部注入)可能需要重新分析。

在LC/MS测量过程中，每一目的分子物质通常呈现为多种化学实体。这可能是由于以下若干因素所致：首先，构成元素存在多种稳定的同位素；其次，被分析物经由与钠(Na)、钾(K)、铵(NH₄)形成加合物而形成假分子离子；和其它被分析物产生多种类型的离子。另外，质谱离子化过程通常可伴随原来分子断裂。因此，所获得的数据集比代表被分析物的峰数目扩大一个数量级。这些额外的峰信息量多，促进噪音进入，降低了统计学的功效，遮盖了生物信息学分析的效果，并因为有大量的峰，可能使得得出明确的科学结论更加困难。在选峰和比对波谱后，并在将数据标准化及统计学分析之前或同时，使用自动化的计算机平台，该平台按照其推定的起始化合物将所测实体集合在一起。核心算法按照具有窄移动时间窗口的保留时间(RT)扫描数据。按照已知质量差异型式，根据平台的特定化学特性将保留时间相似的候选峰集合在一起。

在峰检测和比对后，在数据可用于单变量和多变量统计学分析之前需要几个另外的数据处理步骤。这些步骤包括除去指定为样品/研究空白的峰及其它背景峰、批校正和标准化。这些步骤的结束表示被称为“锁定数据集(Locked Data Set)”的重要阶段。

质谱分析概况(profiling)及接着进行的数据处理产生了用于随后的统计学分析的被分析物列表。用与初始概况分析实验相同或相似的LC/MS设置来对主要的被分析物(通常是各被分析物家族的最丰富的峰)进行定向MS/MS。以质心式获得定向LC/MS/MS波谱。通过联合保留时间、质量、氮规则、脂肪酸(FA)侧链特异性片段离子并与来自脂类MS/MS库的参考波谱进行比较，来解释通过定向MS/MS分析被分析物而获得的MS/MS波谱。

气相色谱串联质谱分析(GC/MS)代谢物组学

GC具有高分离效率及不变的保留时间优点，并联合灵敏且具选择性(电子冲击)的质量检测。然而，很多化合物含有极性官能团，这些官能团或者在其分离所需温度时热不稳定，或者完全不挥发。另外，具有极性官能团的化合物的峰形可因为不想要的柱相互作用(如不可逆吸附)而令人不满意。为了解决这些问题，必须在GC分析前将化合物衍生化。

按照该方法使用以下材料。溶剂和试剂包括甲醇、吡啶、乙氧基胺盐酸盐和N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺(MSTFA)。内标包括：亮氨酸-D3；苯基丙氨酸-D5；谷氨酸-D3；葡萄糖-D7；胆酸-D4；丙氨酸-D4；三氟乙酰蒽(TFAA)；二氟联苯(DFBP)；和邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)。

在室温融化样品，加入10μL的250ng/μL亮氨酸-D3、苯基丙氨酸-D5、谷氨酸-D3和葡萄糖-D7标准的水溶液，接着加入400μL甲醇(用于蛋白质沉淀)。旋涡振荡样品，以10000rpm离心10分钟，将上清液转移到自动进样瓶。在氮干燥步骤后，加入10μL的250ng/μL胆酸D4和丙氨酸-D4标准的吡啶溶液。在盖上自动进样瓶盖子之前，加入30μL的乙氧基胺盐酸盐吡啶溶液，让样品在40℃孵育90分钟。

肟化后加入其余内标：10μL的250ng/μL二氟联苯、邻苯二甲酸二环己酯和三氟乙酰蒽标准的吡啶溶液。通过加入100μL MSTFA并在40℃加热50分钟使样品甲硅烷基化。在将样品注入GC前，以3500rpm将其离心10分钟。

GC/MS分析采用配有PTV(程序升温汽化器)注射器和CTCAnalytics Combi-Pal自动进样器的Agilent 6890N气体色谱仪。使用Agilent 5973Mass Selective检测仪进行检测。由Enhanced ChemstationG1701CA Version D.01.02软件来控制系统。

以全扫描方式检测从GC/MS柱洗脱的所有化合物。各峰以其保留时间和多种碎片(m/z值)表征。通过使用定向处理程序减少数据的量(即变量数)。

定向法将变量数减少至至多1/20。可通过不将这些峰包括在靶标表中来从数据中除去大部分程序产物。为了本研究汇编了研究特有的靶标表。在该过程中使用来自先前的人血浆GC/MS项目的信息。从研究样品(包括极端样品)选择了多个代表性的色谱图，以便将在本研究中观察到的近可能多的峰包括在靶标表中。在该项目的初始阶段，不知道这些峰的身份，将它们标为‘未知1’到‘未知x’，每一峰以其保留时间和一种定量离子表征。将在程序空白中发现的峰从靶标表中除去。在不确定峰来源的情况下，将峰留在靶标列表中以避免可能丢失有关被分析物。

在研究样品中，将在代表性色谱图中发现的不同于内标的个体被分析物/化合物与参考化合物数据库(保留时间和质谱)匹配。在该匹配步骤后，基于参考数据库指定多种化合物的试验性ID。

当使用定向处理方法时，不需要比对峰的保留时间。在观察到保留时间漂移(内标用作‘标志’)情况下，可调整靶标表。首先用标准积分设置对靶标表中存在的所有化合物进行积分。这些设置并不适用于所有化合物和样品，可能导致某些化合物的积分结果错误。业已开发了发现积分错误的程序。对于所有靶标，可计算峰面积与(所有研究样品及QC样品的)平均值的偏差。将结果作图，用于检测问题峰(跨越多种样品的那些峰的积分错误)和问题样品(样品内多个峰的积分)。对于问题样品，进行手动积分。对于问题峰，在调整积分设置后进行自动积分。

在样品制备和分析的各个步骤中，为了在分析后监测数据的质量，加入一种或更多种内标。每一批次后，在所有样品中评估校正DCHP后的内标响应。如果每一内标校正后的峰面积与该批次平均值的偏差小于20％，则可认可该批次。如果一个或多个样品的偏差大于20％，则在下一批重新分析这些样品。最后可产生GC/MS分析的锁定数据集。

第一个鉴别步骤可以是让靶标化合物列表与参考标准数据库匹配。可通过与参考数据库比较并分析参考标准，鉴定并确证多种来自靶标列表的化合物。在单变量和多变量分析后，首先通过核查原始数据和QC结果，评估优先未知者。将它们分为两类：i)在QC标准中具有极低强度和/或高RSD的化合物；和ii)在一种或更多种样品中具有良好信号并在QC标准中具有低RSD的化合物。用第二类开始鉴别。对于这两类，都要实施程序产物的另外的核查。

在该分析后，视个体(待鉴定)化合物来选择另外的鉴别方法。对于某些化合物，可在商业波谱库中搜寻发现，无需另外的ID实验。对于其它化合物，进行化学电离、精确质量或其它衍生实验。

极性LC/MS代谢物组学

根据该方法使用以下材料：甲醇，Biosolve，LC-MS级，货号13687801或等同物；HCl，Merck，37％，货号1.00317或等同物；正丁醇，Baker，货号8017或等同物；Milli-Q水，用ELGA系统纯化的水或等同物；二硫苏糖醇DTT，Sigma 99％，货号D9779或等同物；甲酸，Merck，货号1.00264或等同物；乙腈，Biosolve HPLC-S梯度级，货号12000701或等同物；苯丙氨酸-d5，CDN同位素99原子％D，货号D-1597或等同物；谷氨酰胺-d3，CDN同位素99原子％D，货号D-1196或等同物；亮氨酸-d3，CDN同位素99原子％D，货号D-1973或等同物；丙氨酸-d3，CDN同位素99原子％D，货号D-1462或等同物；肌氨酸-d3，CDN同位素99原子％D，货号D-1462或等同物；甲硫氨酸-d4，CDN同位素99原子％D，货号D-1462或等同物；甲基-(d3)-组氨酸，CDN同位素99原子％D，货号D-1462或等同物；酪氨酸-d7，CDN同位素99原子％D，货号D-1462或等同物。

根据该方法使用以下仪器：旋涡振荡器；离心机；烘箱；蒸发仪；ThermoFinnigan Surveyor或Surveyor Plus HPLC；配有E SI源的ThermoFinnigan LTQ离子阱质谱仪。

向小Eppendorf瓶的10μl血浆样品中加入10μlIS-工作溶液，短暂旋涡振荡样品。在加入DTT溶液和除去样品中的蛋白质后，冻干上清液。然后在65℃用HCl-丁醇衍生样品。通过冻干除去过量试剂。用含有未衍生化的酪氨酸D7作为内标的DTT水溶液重建样品。

按以下说明实施高效液相色谱法：

柱： Varian/Chrompack Inertsil5μmODS-3100*3mm

保护柱： Varian/Chrompack R210×2mm内径

流动相A： 0.1％甲酸

将1ml甲酸加到1000ml水中，混合并通过超声5分钟脱气。

流动相B：80％乙腈/0.1％甲酸

将800ml乙腈加水到1000ml，加1ml甲酸混合并通过超声5分钟脱气。

柱温：25℃-30℃

自动进样器温度：10℃

进样体积：10μl

用大约4∶1的分离比进行质谱分析，意即约75μl流到ESI源。ESI和MS设置为：

ESI喷雾电压： 4kV

加热毛细管： 250-300℃

套气： 50-60

辅助气体： 5

极性：正

扫描范围： 125-1250

微扫描数量： 5-6

最大注入时间： 200ms

源CID： 0-5V

源距离： C位置

分析所选样品的精确质量。为此目的，选择来自每一衍生批次的两个QC样品和多种“极端”样品。在ThermoFinnigan LTQ-FTMS仪器上用与上述相同的设置进行精确质量实验。在FTMS中进行离子检测。在m/z400时的分辨率为约100,000。

以全扫描模式检测从LC/MS柱洗脱的所有化合物。各个峰以其保留时间和多种离子(m/z值)表征。通过施用定向处理程序降低数据的量(即变量数)，此处色谱图中的每一化合物在大多数情况下都由靶标表中唯一一个条目代表。

定向方法将变量数减少至至多1/20。可通过不将这些峰包括在靶标表中来从数据中除去大部分程序产物。

汇编了用于本研究的研究特有的靶标表。通过挑选所有QCY峰并来自最先几个批次的研究样品来完成这一点。基于强度对得到的峰表进行分类，选择了1000个最高峰。从这个部分表中，除去同位素峰和所知的加合物。在此阶段尚不知峰的身份，它们以保留时间(分钟)标记为m/z。

当使用定向处理方法时，不需要比对峰的保留时间。在观察到保留时间漂移(内标用作‘标志’)情况下，可调整靶标表。

在完成所有轮次的分析后，首先用标准积分设置对靶标表中存在的所有化合物进行积分。这些设置并不适用于所有化合物和样品，可能导致某些化合物的积分结果错误。业已开发了发现积分错误的程序。对于所有靶标，可计算峰面积与(所有研究样品及QC样品的)平均值的偏差。

基于除空白外的所有样品的IS反应和对QCY和CTRL样品中所有靶标化合物的相对标准偏差的检查来进行全部数据集的质量控制。将这些结果与先前研究中观察的结果比较。在完成这些步骤后，可产生极性LC/MS平台的“锁定数据集”。这些数据集形成了以后的所有统计学分析的基础。

第一个鉴别步骤是让靶标化合物列表与含有多种氨基酸和相关化合物的参考标准数据库匹配。比较保留时间和精确质量，必要时比较MS/MS波谱。

其余靶标化合物仅在被列入优先列表后鉴定(单变量/多变量)。首先通过核查原始数据和QC结果，评估优先未知者。将它们分为两类：i)在QC标准中具有极低强度和/或高RSD的化合物；和ii)在一种或更多种样品中具有良好信号并在QC标准中具有低RSD的化合物。用第二类开始鉴别。对于两类，都要实施程序产物的另外的核查；检查空白分析中这些化合物的存在情况。

为了进一步鉴定，使用保留时间、精确质量和MS/MS数据。基于精确质量和关于所用衍生的知识，在KEGG、Merck和Chemfinder数据库中搜寻可能的元素组成。评估可能的击中，为此目的，使用保留时间和MS/MS波谱。在若干情况下，购买标准并在将标准加入到研究样品中后在溶液中分析。

游离脂肪酸的LC/MS概况分析

除去血浆中的蛋白质并用IPA对血浆进行提取。在分析柱上分离游离脂肪酸，以负离子模式通过电喷雾使其电离，以全扫描模式检测。以外标分析多种游离脂肪酸，如果需要测定血浆中的真正浓度，则用校准标准计算(近似)。

用以下材料制备并分析样品。仪器包括eppendorf管离心机、Thermo Electron LTQ、带自动进样器和柱加热炉的Thermo ElectronSurveyor HPLC和旋涡振荡器。化学物质包括软化水(ELGA系统4或任何其它系统制备，例如Millipore)；异丙醇p.a.，(Baker 6068或等同物)；甲醇(HPLC级，Chromasolve 34966)；二氯甲烷p.a.，(Baker 7053或等同物)；乙酸铵p.a.，(Fluka 09690或等同物)；和甲酸p.a.，(Merck1.00264.1000或等同物)。

材料包括Alltech Prosphere C4

HPLC柱(150x 3.0mm，内径为5μm)，零件号(partno.)35548；Symmetry 300C4保护柱(10x 2.1mm内径3.5μm)，零件号186000278；自动进样瓶(Alltech零件号AV055201，32*11.6mm)；Eppendorf管；和移液管(例如Eppendorf)。

使用以下标准：十七烷酸C17:0FA(Sigma-Aldrich，H3500)；C14:0FA肉豆蔻酸(Sigma M3128)；C16:0FA棕榈酸(Sigma P5585)；C16:1FA棕榈油酸(Sigma P9417)；C18:0FA硬脂酸(Sigma S4751)；C18:1FA油酸(Sigma O1008)；C18:2FA亚油酸(Sigma L1376)；和C20:4FA花生四烯酸酸(Sigma A9673)。

按以下方法制备内标溶液。通过在5mL容量瓶中称重5mg十七烷酸C 17:0FA，加入500μL DCM，超声溶解，用IPA填充到5mL，来制备十七烷酸C17:0FA(1mg/mL)储液。在含有C17:0FA的IPA中以1μg/mL浓度制备IS工作溶液(用于蛋白质沉淀和脂类提取)。

按以下方法制备样品。将300μL的IS工作溶液加到eppendorf杯中的10μL融化的血浆样品中并旋涡振荡。以10,000rpm让溶液进行eppendorf离心3-5分钟，分2次每次转移50μL的清澈上清液到两个带有内插管(insert)的自动进样瓶中，将剩余提取物储存在＜-18℃。

用Alltech Prosphere C4

HPLC柱(150x 3.2mm内径5μm)和Phenomenex Widepore C4保护柱(4x 3mm内径5μm)实施液相色谱和质谱分析。流动相A由5％甲醇的缓冲液组成；流动相B由含有2mM NH₄Ac的甲醇组成；针头洗液由60％IPA/MeOH组成。梯度如下：

时间(分钟)	流速(mL/分钟)	％A	％B
				0	0.4	70	30
2	0.4	70	30
				6	0.4	30	70
10	0.4	0	100
				15	0.4	0	100

15.1	0.4	70	30
				20	0.4	70	30

柱温为40℃；自动进样器温度为20℃；进样体积为20μL。

对于质谱分析程序，用以下校准标准调整LC/MS仪器：

仪器	ThermoFinnigan LTQ
		模式	负
加热器毛细管	250℃
		喷雾电压	3.5kV
套气	35arb
		辅助气体	15arb
喷雾位置	C
		扫描范围	180-400
扫描速度	自动
		倍增器	自动

用Therno XCalibur LCQuan V 2.0对所选靶标被分析物进行积分。用含有至少以下脂肪酸(基于先前研究)的靶标表处理数据：C12:0FA、C12:1FA、C14:0FA、C14:1FA、C16:0FA、C16:1FA、C16:2FA、C18:0FA、C18:1FA、C18:2FA、C18:3FA、C20:0FA、C20:1FA、C20:2FA、C20:3FA、C20:4FA、C20:5.FA、C22:5FA、C22:6FA和C22:7FA。

获得来自靶标表的所有化合物的积分数据。结果为含有每一靶标化合物的积分值的Excel表格。

LC-MALDI-MS/MS发现蛋白质组学

蛋白质组学工作流程基于多维液相色谱法-由血浆样品产生的肽的MS/MS分析。该方法的优点包括对血浆蛋白的多重多相性不敏感，这种多重多相性导致在基于双向凝胶的方法、液相色谱技术准备自动化和利用稳定的同位素标记肽的可能性方面有困难。

最近提出的iTRAQTM方法(iTRAQ为Applied BioSystems的商标)尤其适于本研究，这是因为标记反应易于进行到完成，该反应是通用的，几乎所有的肽都获得iTRAQ标记，并且每一实验允许多重定量测定至多4种样品。后者在本研究中很重要，在本研究中样品间的相同蛋白的一致定量(及鉴定)为关键的要求。稳定同位素标记的另一重要优点是该方法在样品间的肽的液态色谱行为变化(一旦合并差异标记库时)方面的稳健性。

在iTRAQ方法中，用试剂(N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯)处理来自蛋白质样品的酶消化物，所述试剂对肽的游离伯氨基(N-末端(如果未被封闭)和赖氨酸残基)进行衍生化。该试剂的四个不同种类的特征为具有相同质量但稳定同位素标记位置不同。因此，在MS模式中，当离子信号反映肽分子量时，所有四种不同标记的肽作为单一组份出现。在MS/MS模式中，标记物结构中的微细差异变得可见，而肽主链片段(所谓的a、b和y)仍为同质异构的，产生分别对应于m/z 114、115、116和117的四种不同报告片段。通过测定这些报告离子的相对强度，可完成对来自四个不同样品的肽的相对定量测定。

在本研究中，使用MALDI TOF/TOF质谱仪(ABI 4800)，其中通过自动部分收集程序将样品放置在MALDI盘中。MALDI LC-MS/MS的特别的优势是LC-MS偶联的离线特色。在以MS/MS模式产生肽鉴定及定量测量数据前，首先以MS模式分析整个2D LC分离物是可能的。当在大量样品中必须测量恒定系列的肽时，这种特点可能非常方便。

分析血浆样品的一个独特方面是由丰富的血浆蛋白(白蛋白、免疫球蛋白等)代表的巨大背景。为了解决这一挑战，使用了很多消除技术(deplete technique)。在本研究中，使用鸡IgY抗体柱来从样品中消除十二种丰富蛋白。在反相柱上回收不保留在抗体柱上的蛋白质。将回收的蛋白质还原、烷基化并用胰蛋白酶消化。用iTRAQ试剂标记得到的肽混合物，并与指定用于同一iTRAQ混合物的三种其他样品合并。首先在强阳离子交换色谱上分级分离合并的四重(four-plex)混合物。从SCX洗脱中收集10个流分。这些流分在合并某些流分后通过HPLC MS/MS进一步分析。

iTRAQ分析使得可以在单一2D LC-MS/MS实验(四元)中测量四种不同样品的相对定量。然而，指派四种初始样品到iTRAQ四元混合物中不允许比较指定到不同iTRAQ混合物的两种初始样品。这一点如下解决：制作按照该项目所分析的iTRAQ混合物数量等份分样的参考库(reference pool)；每一iTRAQ混合物的恒定组分；连同同一iTRAQ混合物中的其它3个成员一起进行该参考等份样的样品制备；并用117试剂标记。

通过从该研究中分析的每一初始研究样品的大约25％的组合来制备参考库。将来自参考库的等份样称为QCR样品。

可通过既用于包含又用于排除的MS母体列表来指导MS/MS数据采集。初始包含列表源自在研究登记期进行的分析。在该阶段，经由完整蛋白质组学工作流程处理几种来自样品QC库的样品。在鉴别肽和匹配来自这些混合物的蛋白质后，汇编包含列表及排除列表。

包含列表内容包括：完全烷基化并经iTRAQ标记的胰蛋白酶处理肽；完全烷基化并经iTRAQ标记的半胰蛋白酶处理肽，且排除由于糜蛋白酶活性(在F、Y和W处裂解)产生的那些肽；和手动鉴定为具有翻译后修饰但不能由Mascot常规搜寻的肽。

排除列表内容包括：2,000个最丰富的未鉴定组分，包括具有不完全iTRAQ标记或烷基化的肽；含有多个错过的胰蛋白酶裂解位点的超过3,000Da分子量的肽；由胰蛋白酶的糜蛋白酶副活性产生的肽；在包含列表中呈M+H⁺形式的丰富的肽的可能M+K⁺形式；和胰蛋白酶的自溶肽。

使用定制软件应用来考虑包含/排除标准，并，基于列出选择包含或排除的母体清单的单独的文本文件，在AB4800上产生MS/MS数据采集。软件也包括自动调整可能的HPLC保留时间漂移。在首次分析所包括的母体后采集时间允许时，以机会的方式获得另外的MS/MS波谱。

在冰上融化每日12个批次的样品，12个批次由9个初始样品和3个参考库样品组成，以一个参考库样品接着3个初始样品连续处理样品(即样品1、2、3，然后R、4、5、6、R等)。一旦样品完全融化，使其脱脂。样品用PBS稀释，用三氯三氟乙烷(Freon 13)提取，接着是离心步骤。将顶部水相转移到新试管中并短暂储存在冰上，然后置于已经冷冻的LC系统自动进样器中，用于丰富蛋白清除。

采用丰富蛋白清除(APR)，除去脱脂样品中12种所述最丰富的血浆蛋白蛋白。该程序使用两柱方法(2DLC)，其中通过亲合IgY柱靶向包括白蛋白、IgG、IgA、转铁蛋白、α-1抗胰蛋白酶、触珠蛋白家族、纤维蛋白原、α-1酸性糖蛋白、IgM、α-2巨球蛋白和HDL(载脂蛋白A-I和AII)在内的12种蛋白，而被清除的物质流过反相(RP)柱，并在反相(RP)柱上被捕获。独立洗涤RP柱并分步洗脱。在分部收集器中收集由洗涤出的被清除物质组成的洗脱峰，随后通过真空离心蒸发浓缩(speed vacuum)干燥，用于在工作流程中进一步处理。然后用反提取液洗涤RP柱，反提取液消除遗留到下一轮的残留物。然后独立洗脱IgY柱，在下一轮之前将其中和。在24小时内处理12个脱脂样品(单批次)，接着对收集的流分进行过夜真空离心蒸发浓缩。

将经过清除的血浆样品还原、烷基化、消化并经iTRAQ标记。将干燥的经清除样品重新悬浮于1M TEAB缓冲液pH 8.5中。加入TCEP和SDS来使样品变性和还原。在71℃孵育1小时后，用碘乙酰胺在室温避光让样品烷基化30分钟。加入悬浮在N-乙酰基-L-半胱氨酸中的胰蛋白酶，让样品在48℃过夜消化。第二天，融化iTRAQ试剂并重新悬浮于100％乙醇中。用特定的iTRAQ试剂标记样品。在室温孵育所述标记1小时后，加入4微升1M碳酸氢铵来终止乙酰化反应。合并同一混合物中的iTRAQ标记样品，在重新悬浮用于阳离子交换色谱之前在Speedvac中干燥。

在Vision Chromatography Station(Applied Biosystems)上用4.6x50mm聚磺乙基强阳离子交换柱对合并的iTRAQ混合物实施强阳离子交换分级分离。该分离使用两柱方法，其中首先将肽库上样到PorosR2反相柱，以便除去大量的iTRAQ水解产物。

通过用35％ACN含量的SCX加样缓冲液将肽洗脱到SCX柱。通过高有机洗涤将粘在RP柱上的疏水性较强的材料(即残留的胰蛋白酶)除去。对结合在SCX柱上的肽进行梯度洗脱。在注入样品之前，用1N HCl将样品pH调整到3.5。从SCX分离收集0.8mL的10个流分(A1到A10)。在Speedvac中干燥这些流分，并重新悬浮于HPLC加样缓冲液中。

LC-MALDI-MS/MS发现蛋白质组学

通过部分收集到MALDI靶标上来离线实施HPLC和MALDI偶联。设备为来自Dionex-LC Packings(Hercules，CA)的配有ProbotMALDI点样装置(spotting device)的UltiMate色谱系统。分部收集器上的集成注射泵使得可在放置到MALDI盘(plate)之前共混合HPLC洗脱物和MALDI基质。为了确保MALDI MS波谱良好的质量校准，将内标-ACTH(18-39)肽；MH⁺＝2465.199-加到基质溶液中。

以将三轮HPLC放置到单个4800MALDI盘的方式来配置MALDI盘上的点样。每一轮HPLC都含有6x35阵列的流分(210种流分/HPLC)。将代表iTRAQ混合物的六轮HPLC点样到两个MALDI盘中。

以下列出HPLC-MALDI操作参数。HPLC级水和分析级乙腈来自Burdick&Jackson，乙酸铵、柠檬酸铵、TFA和α-氰基-4-羟基肉桂酸来自Sigma。

HPLC MALDI参数

HPLC缓冲液A： 95％水、5％乙腈、0.1％TFA

HPLC缓冲液B： 10％水、90％乙腈、0.1％TFA

HPLC加样缓冲液： 95％水、5％乙腈、0.1％TFA、2mM乙酸铵

基质溶液：于15％水、85％乙腈中的10g/Lα-氰基-4-羟基肉桂酸

-0.1g/L柠檬酸二铵

内部质量校准标准： 200费摩尔/L的ACTH(18-39)肽(在基质溶液中)

HPLC解析柱： 0.180x150mm C18(Dionex-LC Packings)

HPLC捕获柱： 0.3x5mm C 18(Dionex-LC Packings)

HPLC流速： 2微升/分钟

基质流速： 2微升/分钟

流分收集间隔： 9秒

HPLC梯度程序如下：

0-5％B 8分钟内

5-10％B 2分钟内

10-37.5％B 30分钟内

37.5-100％B 2分钟内

用45-nL流式细胞监测280nm波长来记录UV图录。

测定每一SCX流分的注入量，以使样品上样量最大化但避免使HPLC柱超载。在预备性登记实验中测定这些量。

在代表来自iTRAQ混合物的MALDI样品的每组6次注射之前，注入肽标准混合物(来自Michrom)以监测HPLC保留时间的一致性。注意通过母体选择程序来不停地处理HPLC洗脱时间适度调整，该程序通过自动比对相邻SCX流分的LC-MS运行来进行。在注入标准QC混合物后，注入6种SCX流分，产生2个MALDI盘。

以两个MALDI盘为一组，将盘安置到AB4800仪器的自动上样器中。每个盘以MS模式通过以下次序运行：

·用点样在盘上8个“校准”位置的4800标准混合物(Applied Biosystems)产生盘模型并更新缺省校准；

·用m/z 2465.199(肽标准品)峰和m/z 568.136(基质三聚体)峰以MS模式用内部质量校准运行LC流分。

母体选择的主要目的旨在使采集时间最小化(排除多余母体)，消除MS波谱中邻近峰的干扰，并一致地选择用于所有iTRAQ混合物的相同母体。对MS/MS取数及处理参数进行优化，以在m/z 114、115、116、117时产生iTRAQ报告峰的最好的可能测量结果。除非仅在1,050个发射后iTRAQ信号就超过信噪比标准，否则注意设定MS/MS数据采集以积聚2,100个激光发射。以该方式可减少采集时间，而不会使iTRAQ峰面积测量冒质量风险。

用由流水线控制软件驱动的定制Perl script，从位于数据采集控制计算机上的Oracle数据库获取AB4800MS/MS波谱。将MS/MS峰处理为两个不同的文档，以分开记录定量iTRAQ峰数据及肽裂解峰。通过特有的数据库峰表ID及特有的MALDI盘数据库(从其中采集数据)ID来鉴定每一单独MS/MS波谱。这两个值允许进一步与在采集的数据和内部实验室信息管理系统(LIMS)两者中记录的其他信息结合。将iTRAQ定量信息转移到称为PeptidedB的来自第一文档的数据库。第二输出为MGF(Mascot Generic Format)文档，其含有肽裂解峰和使得可以在Mascot结果和输入MS/MS波谱之间跟踪的另外的相关注解行。

过滤包括在MGF档案中的峰，以便：除去高质量的峰(在64Da内或母体MH⁺)；除掉低质量的峰(＜146Da)；和限制峰“密度”为每200Da窗口15个片段质量。

制作在AB4800上作业的每次MS/MS作业运行的单独的MGF档案(MS/MS作业可由从同一MALDI盘采集的1个到成千上万个单独MS/MS数据采集构成)。在开始Mascot搜寻前将对应于同一iTRAQ混合物的单独的MGF档案并置。

在PeptideDB中将每一MS/MS波谱与m/z 114、115、116和117离子信号的离子强度相关联。如上所述，测定相对于m/z 117强度(因为该标记用于参考库)的iTRAQ比。比率计算为：4800数据的峰面积比率(并非Applied BioSystems软件所用的丛面积(cluster area))及QToF数据的峰计数比率。

在数据库搜寻后，与MS/MS波谱匹配的肽序列继承了指派给该MS/MS波谱的鉴定编号(quantification number)。蛋白质比源自以平均比率(或在Applied BioSystems软件中的平均比率)指派给该蛋白质的肽的比率。然而，直到完成每一iTRAQ混合物的肽鉴定，才会在BGM工作流程中进行最终肽-蛋白质指派。在此时，不仅仅对蛋白质指派进行整理，而且可基于整个研究的定量信息将个体蛋白质分成多个节点(即解析蛋白质同工型、提供多态位点的肽序列、等位基因变体等)。然后蛋白质节点-其最终用于统计学分析和关联网络分析-以与其匹配的平均肽比率来表示。

当将肽比率传播为蛋白质比率或蛋白质节点比率时，只考虑以下情况：(a)完全修饰到预期程度的那些肽；即完全被iTRAQ标记并且若它们含有半胱氨酸则完全烷基化；或(b)不与由APR所定向的蛋白质匹配、或不与胰蛋白酶、血红蛋白(这些蛋白质被认为是污染物)匹配的肽。

用市购Mascot数据库搜寻程序(MatrixScience Ltd.，UK)、由科学家进行的专家确认和MS/MS波谱匹配程序这种三管齐下的方法，来进行肽/蛋白质鉴定。

在完成研究的整个蛋白质组学组分的数据采集并将Mascot搜寻结果上载到PeptideDB中后，立即进行波谱匹配程序。目的是发现按照在蛋白质组学项目中分析的任何iTRAQ混合物中的自动确认标准与肽序列匹配的MS/MS波谱。基于以下严密匹配的：母体质量；SCX流分编号和HPLC保留时间；和丰度最高的碎片离子的质量，来确定肽身份。这样有可能挽救不符合Mascot的自动确认标准的、但在其它iTRAQ混合物中有自动确认或专家确认情况的大量MS/MS波谱。所述程序的重要性是增加在蛋白质组学研究中尽可能多的样品中测量的肽和蛋白质的表现。

在整个研究(具有可能的最完全的肽集合)中完成肽鉴别后，运行蛋白质确认工具以鉴别解释所有已确认的肽序列的最小蛋白质集合。在蛋白质确认工具术语中，将肽序列指派给：(a)代表基因组中独特基因的蛋白质类别；或(b)在某一蛋白质类别中(在剪接变体、多态形式等之中)代表优选(通常为具有最大注释信息的那个)序列实例的蛋白质原型(protein exemplar)。

将大量数据处理步骤应用于整个数据集，这些步骤影响本研究报告的蛋白质/肽的数量及鉴定规格(qualitification metrics)。这些数据处理步骤包括：

整理肽测量结果：将来自同一iTRAQ混合物中同一肽(相同序列和相同修饰)的多次MS/MS测量的iTRAQ信号相加，并从该点开始用单一比率测量结果。

消除异常值：除去5％的异常肽测量值的标准统计学程序。如果肽测量结果完全落在与同一蛋白质匹配的所有肽测量结果分布外(大于两个标准偏差)，则认为该肽测量结果为异常值。

最后蛋白质／节点指派：完成蛋白质确认工具分析后，马上用整个项目的定量分析结果最后确定了用于单变量和多变量统计学分析的蛋白质列表。最终蛋白质确定了相关网络分析的节点。该过程对于正确跟踪蛋白加工后的形式(即来自补体C3的C3a和C3b、来自纤维蛋白原α链的血纤维蛋白肽A、α-微球蛋白和来自AMBP_HUMAN的bikunin等)和蛋白质的多态变体是必需的。

通过与同一蛋白质匹配的肽比率的一致性来评估定量性能。这些肽测量结果的相对标准偏差表明蛋白质测量结果(作为匹配肽测量结果的平均值)的精确程度。这些程序将肽相对标准偏差降低几个百分点。

定向蛋白质组学：多元免疫测定

在多元免疫测定系统(Rules Based Medicine，Austin，TX，USA)中测量下表3所示的89种靶标蛋白的浓度[McDade&Fulton，DeviceDiagn Ind 19：75-82，1997；Fulton等，Clin Chem 43：1749-56，1997]。该系统通过用流式细胞仪和数字式信号处理器以实施多种基于微球体的测定的实时分析，来进行大量同时发生的反应。该系统的3个主要组成部分为台式流式细胞仪、微球体和计算机硬件及软件。在这些测量中使用的血浆体积为50微升。可将由流式细胞仪记录的每一靶标蛋白的荧光信号与标准曲线比较，来计算每一靶标蛋白的浓度。在本分析中包括质量控制样品。

表3：在多元免疫测定中测量的89种蛋白质

1.脂连蛋白	30.GST	60.淋巴细胞趋化因子
			2.α-1抗胰蛋白酶	31.G-CSF	61.MDC
3.甲胎蛋白	32.GM-CSF	62.MIP-1α
			4.α-2巨球蛋白	33.生长激素	63.MIP-1β
5.载脂蛋白A-1	34.触珠蛋白	64.MMP-2
			6.载脂蛋白C-III	35.免疫球蛋白A	65.MMP-3
7.载脂蛋白H	36.免疫球蛋白E	66.MMP-9
			8.β-2微球蛋白	37.免疫球蛋白M	67.MCP-1

9.BDNF	38.胰岛素	68.髓过氧化物酶
			10.C-反应性蛋白	39.IGF-1	69.肌红蛋白
11.降钙素	40.ICAM-1	70.PAI-1
			12.癌抗原19-9	41.干扰素-γ	71.PAPP-A
13.癌抗原125	42.白介素-1α	72.游离PSA
			14.癌胚抗原	43.白介素-1β	73.前列腺酸磷酸酶
15.CD40	44.白介素-1ra	74.RANTES
			16.CD40配体	45.白介素-2	75.血清淀粉样P
17.补体3	46.白介素-3	76.SGOT
			18.CK-MB	47.白介素-4	77.性激素结合球蛋白
19.内皮素-1	48.白介素-5	78.干细胞因子
			20.嗜酸细胞趋化因子	49.白介素-6	79.血小板生成素
21.表皮生长因子	50.白介素-7	80.甲状腺结合球蛋白
			22.ENA-78	51.白介素-8	81.甲状腺刺激激素
23.红细胞生成素	52.白介素-10	82.组织因子
			24.ENRAGE	53.白介素-12p40	83.TIMP-1
25.VII因子	54.白介素-12p70	84.肿瘤坏死因子-α
			26.脂肪酸结合蛋白	55.白介素-13	85.肿瘤坏死因子-β
27.铁蛋白	56.白介素-15	86.肿瘤坏死因子RII
			28.纤维蛋白原	57.白介素-16	87.VCAM-1
29.碱性FGF	58.瘦蛋白	88.VEGF
				59.脂蛋白(a)	89.血管假性血友病因子

定向蛋白质分析在来自病例和对照的样品集合中产生关于66种蛋白质浓度的有用信息。这66种蛋白质的数据集用于该个体生物分析平台的单变量和多变量分析，并与其它生物分析平台数据集联合以产生包含723种被分析物的综合数据集。

统计学方法

进行了统计学分析以解决本研究的主要目标，即在血液或血浆中发现分子被分析物(集合)、和预测近期MACCE的相关算法。将在2年随访期内发生MACCE的受试者指称为病例，而在2年随访期内没有发生MACCE的受试者指称为对照。

统计学分析包括以下组成部分：

1.研究受试者的基线特征；

2.主成分分析(PCA)，以从每一平台所概述的数据中显现病例和对照之间的分离(如果有的话)；

3.单变量模型，用于检测，在根据常规风险因子进行调整后在统计学上显著与近期MACCE概率有关联的个体被分析物；

4.多变量模型：获得最佳被分析物子集的分类器，其中所述最佳被分析物子集在考虑或不考虑常规风险因子时在统计学上显著与近期MACCE概率有关联。比较了基于考虑或不考虑常规临床因素时分类器所产生结果的接受者工作特性(ROC)曲线。

基线特征：计算病例和对照的基线特征平均值和比例。病例和对照之间基线特征的统计学显著性基于Wilcoxon秩和检验(连续变量)和卡方检验(对于比例值和RxC表)。

主成分分析：对于从本研究中的每一代谢组学和蛋白质组学平台获得的数据制作了PCA分值图。这些被分析物的机能(motivations)包括显现病例和对照之间的分离、鉴定异常值样品和评估数据集的质量。

单变量方法：基本的单变量分析基于条件逻辑斯蒂回归，考虑病例与对照的1对1匹配。单变量分析由回归模型组成，该模型在根据相关临床协变量进行调整后评估每一血浆被分析物单独与结果关联的统计学显著性(病例对对照情况)。由于病例在年龄、种族、性别和CAD指数方面与对照匹配，因此这些变量不出现在回归模型中。条件逻辑斯蒂回归模型根据不包括在匹配策略中的混杂因子进行调整。包含到模型中的常规风险因子的选择基于医学文献中最近论文的综述，所述论文报告关于来自调查被分析物对心血管结果之影响的研究结果。基于被分析物在对照受试者中的分布，将每一血浆被分析物设计成四分位数。用似然比检验来评估每一被分析物在预测结果中的统计学显著性。基于Storey的方法(J.R.Statist.Soc.B 64：479-498，2002)根据多次比较进行调整。从该单变量分析中排除在病例或对照中具有大于50％漏测值的特例。

进行第二组单变量分析，其中将被分析物的值转化为二进制变量，其中0表示漏测值，1表示无漏测(otherwise)。如同先前的单变量分析，用似然比检验评估每一被分析物在预测结果中的统计学显著性。基于Storey的方法(J.R.Statist.Soc.B 64：479-498，2002)根据多次比较进行调整。

也制作了统计学上显著的每一被分析物的盒须图(box-and-whisker plot)图形表示，其分别描绘病例和对照。

制作了经过FDR调整过的p值与原始p值比较的图。将在图中所观察到的p值分布用作选择p-值阀值的基础，所述p-值阀值用于在每一平台中选择推定的被分析物。当来自所有平台的数据都可得到时，通过整合来自所有平台数据产生经FDR调整过p值。从该综合分析中产生最终的单变量被分析物列表。所选结果如下表4所示。

表4：单变量分析结果(第1部分)

平台	ID	单位	P值	优势比(OR₄)	病例平均浓度与对照平均浓度的比率
						极性LC/MS	半胱氨酸	任意单位(AU)	＜0.01	15.70	1.17
定向蛋白质组学	血管假性血友病因子	微克/ml	＜0.01	17.67	1.44
						定向蛋白质组学	IL-8	pg/ml	＜0.01	15.57	1.25
脂类LC/MS	16:0/18:1PC	AU	＜0.01	17.67	1.12
						GCMS	N-羧基-丙氨酸	AU	＜0.01	14.31	1.16
定向蛋白质组学	纤维蛋白原	mg/ml	＜0.01	7.55	1.28
						定向蛋白质组学	MMP-2	ng/ml	＜0.01	17.85	1.47
脂类LC/MS	18:0/20:4PE	AU	＜0.01	27.53	1.15
						定向蛋白质组学	载脂蛋白A1	mg/ml	＜0.01	0.09	0.86
脂类LC/MS	16:0/22:6PE	AU	0.01	14.87	1.08
						脂类LC/MS	18:1/18:0/18:0TG	AU	0.01	11.43	1.20
定向蛋白质组学	α-1抗胰蛋白酶	mg/ml	0.01	5.59	1.12

脂类LC/MS	18:2/18:1/17:0TG	AU	0.01	69.36	1.11
						脂类LC/MS	20:1/18:1/18:1TG	AU	0.02	12.64	1.27
脂类LC/MS	16:0/16:0PC	AU	0.02	6.93	1.12
						脂类LC/MS	20:4LPC	AU	0.02	0.22	0.87
脂类LC/MS	16:0SM	AU	0.02	7.91	1.08
						定向蛋白质组学	SHBG	nmol/ml	0.03	6.81	1.25
脂类LC/MS	18:1/17:1/16:0TG	AU	0.03	11.84	1.11
						GCMS	阿拉伯糖	AU	0.03	0.14	0.87
脂类LC/MS	18:1/18:1/17:0TG	AU	0.03	10.68	1.16

表4B：单变量分析结果(第2部分)

平台	ID	第一四分位数	第二四分位数	第二四分位数	第四四分位数
						极性LC/MS	半胱氨酸	＜2041.1	2041.2-2699.2	2699.3-3675.9	＞3675.9
定向蛋白质组学	血管假性血友病因子	＜35.2	35.2-47.7	47.8-69.0	＞69.0
						定向蛋白质组学	IL-8	＜14.1	14.1-17.4	17.5-21.4	＞21.4
脂类LC/MS	16:0/18:1PC	＜30075.8	30075.9-35320.5	35320.5-61392.4	＞61392.4
						GCMS	N-羧基-丙氨酸	＜3431.4	3431.4-3853.5	3853.6-4324.6	＞4324.6

定向蛋白质组学	纤维蛋白原	＜3.5	3.5-4.3	4.3-5.2	＞5.2
						定向蛋白质组学	MMP-2	＜1037.5	1037.5-1520.0	1520.1-2157.5	＞2157.5
脂类LC/MS	18:0/20:4PE	＜1861.8	1861.8-2138.4	2138.5-2429.0	＞2429.0
						定向蛋白质组学	载脂蛋白A1	＜0.30	0.30-0.36	0.37-0.46	＞0.46
脂类LC/MS	16:0/22:6PE	＜1811.8	1811.8-2066.1	2066.2-2476.7	＞2476.7
						脂类LC/MS	18:1/18:0/18:0TG	＜15038.4	15038.4-17619.3	17619.4-22441.1	＞22441.1
定向蛋白质组学	α-1抗胰蛋白酶	＜1.50	1.50-1.69	1.70-1.96	＞1.96
						脂类LC/MS	18:2/18:1/17:0TG	＜1963.7	1963.7-4369.5	4369.6-12667.6	＞12667.7
脂类LC/MS	20:1/18:1/18:1TG	＜44210.6	44210.6-54354.2	54354.3-68063.3	＞68063.3
						脂类LC/MS	16:0/16:0PC	＜4859.1	4859.1-6019.0	6019.1-8158.0	＞8158.0
脂类LC/MS	20:4LPC	＜4203.5	4203.5-5082.6	5082.7-6311.4	＞6311.4
						脂类LC/MS	16:0SM	＜4289.8	4298.8-5239.6	5239.7-6554.6	＞6554.6
定向蛋白质组学	SHBG	＜25.8	25.8-38.8	38.9-62.9	＞62.9
						脂类LC/MS	18:1/17:1/16:0TG	＜1649.8	1649.8-1861.9	1862.0-2189.9	＞2189.9
GCMS	阿拉伯糖	＜26944.7	26944.7-33111.6	33111.7-43695.4	＞43695.4
						脂类LC/MS	18:1/18:1/17:0TG	＜1827.5	1827.5-2473.7	2473.8-3245.7	＞3245.7

在上表4中，PC意指磷脂酰胆碱，PE意指磷脂酰乙醇胺，TG意指三酰甘油，SM意指鞘磷脂，LPC意指溶血-磷脂酰胆碱，IL意指白介素，而x:y指含有x个碳原子和y个双键的脂肪酸链。栏中标示为‘优势比(odds ratio)’的条目为对应于被分析物浓度落入第四四分位数的受试者相对于被分析物浓度落入第一四分位数的受试者的比较的优势比，其中所述四分位数是本研究的所有受试者中被分析物浓度总体分布的四分位数。对于通过质谱法测量的被分析物而言，测量单位标示为‘任意单位’或‘AU’。源自质谱仪的浓度测量结果代表质谱仪器的检测仪所检测的经处理的离子计数。对于通过质谱法测量的被分析物而言，没有进行绝对定量。

以下脂肪酸被分析物与MACCE风险相关联，其中在所鉴定的被分析物列表内，第一种被分析物具有最强的MACCE风险相关性，最后一种被分析物具有最弱的MACCE风险相关性：18:2/18:1/17:0TG、18:0/20:4PE、16:0/18:1PC、16:0/22:6PE、20:4LPC、20:1/18:1/18:1TG、18:1/17:1/16:0TG、18:1/18:0/18:0TG、18:1/18:1/17:0TG、16:0SM和16:0/16:0PC。

对于表4中鉴定的每一种脂肪酸被分析物而言，除了20:4LPC外，脂肪酸浓度越高，可能与MACCE风险的相关性越强(例如，落入18:0/20:4PE的群体分布的第四四分位数的受试者，比落入最低的即第一四分位数的受试者更可能罹患MACCE)。对于20:4LPC，可能正好相反：落入20:4LPC群体分布的最低的或第一四分位数的受试者，比落入最高的即第四四分位数的受试者更可能罹患MACCE。

根据某些实施方案，临床医生可将具有落入上表4中第四四分位数范围内的被分析物测量结果的受试者，鉴定为可能处于在2年内具有MACCE高风险的个体(除优势比小于1的载脂蛋白A1、20:4LPC或阿拉伯糖外，优势比小于1意指具有第一四分位数值的受试者处于更高风险)。根据另一实施方案，临床医生可将被分析物测量结果落入以上表4中的第二、第三或第四四分位数范围内的受试者，鉴定为可能处于在2年内具有MACCE高风险的个体。根据再一实施方案，临床医生可将被分析物测量落入以上表4中的第三或第四四分位数范围内的受试者，鉴定为可能处于在2年内具有MACCE高风险的个体。

多变量分类方法

监督多变量预测模型：构建多变量预测模型，其中待预测的结果是在指标插管2年内发生MACCE。该模型输入变量为：(i)生物分析平台-特异性血浆被分析物；和(ii)由所有生物分析平台一起概述分析的血浆被分析物。构建了有或无根据常规临床因子调整的每种种多变量模型。

将多变量分类程序Random Forest(Breiman，Machine Learning45：5-32，2001)应用于所述数据，以获得预言MACCE的多变量指纹。为了评估得到的模型的统计学显著性，进行了外部交叉确认和标记置换检验(Ambroise&McLachlan，Proc.Natl.Acad.Sci.99：6562-2，2002)。自每一分类器可获得以下输出：

1.报告了在‘病例’组和‘对照’组中用于MACE预测的预测性多变量血浆被分析物候选者，被分析物按分类准确重要性进行排序；

2.每一分类器的灵敏度对特异性的ROC曲线(例如参见图1和2)。

从该多变量分析中排除在病例或对照中具有大于50％漏测值的特例。在病例和对照中有小于50％漏测值的特例具有用Troyanskaya等所述方法输入的漏测值(Bioinformatics 17(6)520-525，2001)。

按方法鉴定的被分析物

通过使用多变量统计学分类器分析方法(Random Forests-Breiman，Machine Learning 45：5-32，2001)和723种被分析物的联合生物分析数据集，我们发现了可用于预测个体从获得血液样品的时间点起2年内发生严重有害的心血管或脑血管事件的被分析物集合和算法。下面的表5以其在Random Forests分类器中的次序或重要性给出了总共723种被分析物的列表中的50种最重要的被分析物，其中所述次序或重要性基于一个起始种子(分析#1)。在标记“分析#2的重要性次序”的栏中显示了部分被分析物重要性列表，其来自Random Forests分析和递归特征消除法，用与分析#1相同的起始种子获得仅含50种被分析物组分的分类器。在分析#3、#4和#5栏中显示了部分被分析物的重要性列表，它们来自另外3个Random Forests分析和递归特征消除法，获得了含有源自不同起始种子的仅50种被分析物组分的分类器。不论Random Forests分析使用何种起始种子或无论是否使用递归特征消除以获得固定的50种被分析物组分分类器，最重要的20种被分析物几乎总是在根据来自分析#1的重要性排序的前50种被分析物内。

表5：50种最重要的预测MACCE的被分析物

被分析物	来自分析#1的重要性次序	来自分析#2的重要性次序	来自分析#3的重要性次序	来自分析#4的重要性次序	来自分析#5的重要性次序
						组织因子	1	3	3	2	3
癌抗原125	2	2	1	3	2
						谷胱甘肽S-转移酶	3	1	2	1	1
甲胎蛋白	4	4	4	4	4
						IPI00028413(ITIH3)	5	6	12	9	11
IL-3	6	9	8	7	8
						103_0at233(阿拉伯糖相关片段(M))	7	7	7	10	10
血管假性血友病因子	8	5	6	5	7
						IPI00011264(CFHR1)	9	12	15	12	12
IL-8	10	*	10	11	14

178_1at107(半胱氨酸M+H(M))	11	11	*	6	5
						114_Oat120(乙酰乙酸相关片段	12	13	11	18	17
(M))
						VII因子	13		27	23	*
IPI00019755(GSTO1)	14	25	17	35	21
						292_0at200(赤糖酸(erythronic acid)相关片段(M))	15	16	25	*	20
IPI00022417(LRG1)	16	30	37	15	15
						MMP-2	17	14	9	14	6
纤维蛋白原	18	8	5	8	9
						TNF RII	19	19	13	*	*
TNF-β	20	10	16	21	16
						IPI00550991(SERPINA3)	21	20	29	19	18
IPI00298971(VTN)	22	21	23	27	*
						IPI00641737(HP)	23	*	34	20	27
IPI00296176(F9)	24	46	*	*	32
						202_0at311(L-色氨酸M+H(M))	25	*	30	36	*
ICAM-1	26	28		25	19
						217_0at294(肌醇相关片段(M))	27	*	31	*	*

103_0at114(乙酰乙酸相关片段(M))	28	*	36	28	33
						259_Oat375(未知的P7478_uk15相关片段(M))	29	*	*	*	43
IPI00167093(CFHR1)	30	48	*	*	*
						IPI00021885(FGA)	31	*	*	*	*
IPI00022429(ORM1)	32	*	*	*	*
						IPI00019943(AFM)	33	17	35	34	30
226_2at018(甲基组氨酸M+H(M))	34	44	39	44	31
						IPI00647915(TAGLN2)	35
191_0at110(3-羟基丁酸相关片段(M))	36	*	*	*	*
						361_0at372(蔗糖相关片段(M))	37	*	*	*	*
230_0at194(L-4-羟基脯氨酸	38	*	*	*	*
						相关片段(M))
1880at097(丙酮酸相关片段(M))	39	*	*	*	*
						IPI00290283(MASP 1)	40	*	*	*	*
IPI00654888(KLKB 1)	41	35	*	*	*
						IPI00020996(IGFALS)	42	*	*	*	*
IPI00029658(EFEMP 1)	43	24	20	30	28
						764_1213(16:0/22:6PEM+H(M))	44	33	*	37	*

IPI00745872(ALB)	45	*	18	17	26
						SGOT	46	15	19	13	13
278_2at143	47	*	*	*	*
						IPI00745933	48	*	*	*	*

^＊在特定分析中被分析物不是前50种被分析物成员

来自用4个起始种子的Random Forests分析的全部被分析物列表示于附录1-4中，此外来自用同样四个起始种子的Random Forests加递归特征消除法的前50种被分析物示于附录5-8中。

通过使用个体的血浆样品中来自分析#1的前20种被分析物的水平连同算法，将能够以87％的灵敏度和87％的特异性对该个体2年内MACCE的发生情况作出预测。这由图1所示的接受者工作特性(ROC)曲线来阐明。

通过使用多变量统计学分类器分析方法(Random Forests-Breiman，Machine Learning 45：5-32，2001)和66种被分析物的个体定向蛋白质组学生物分析数据集，我们发现了可用于预测个体从获得血液样品的时间点起2年内心脏病发作发生情况的被分析物集合和算法。以下表6给出了在被分析物的一个所述子集中的10种最重要的被分析物以及它们在源自多变量分析的分类器中的次序或重要性。

表6：预测MACCE的10种最重要的被分析物

蛋白质被分析物	在分类器中变量的重要性
		谷胱甘肽S-转移酶	0.048
癌抗原125	0.045
		组织因子	0.04
甲胎蛋白	0.028
		血管假性血友病因子	0.023
纤维蛋白原	0.02
		SGOT	0.015

IL-3	0.014
		IL-8	0.013
CD40	0.008

通过使用来自个体的血浆样品中这前10种被分析物的水平连同算法，将能够以82％的灵敏度和87％的特异性对个体2年内MACCE的发生情况作出预测。这由图2所示的接受者工作特性(ROC)曲线来阐明。

根据某些实施方案，MACCE指数可通过以下线性方程用前十种(10)被分析物来限定：

y＝c₁x₁+c₂x₂+c₃x₃+c₄x₄+c₅x₅+c₆x₆+c₇x₇+c₈x₈+c₉x₉+c₁₀x₁₀

[方程1]

其中c₁到c₁₀值对应于以下表9中所列的值，变量x₁到x₁₀代表以下表7所列的被分析物测量结果。被分析物如以上定向蛋白质组学：多元免疫测定一节所述方法进行测量。每一被分析物的测量单位列入下表中。在将测量值代入到方程1之前，必须使值标准化。也就是说，每一个测量值减去源自整个研究群体(即所有病例和对照受试者)的所有值的平均数，随后将结果除以源自整个研究群体(即所有病例和对照受试者)的被分析物测量的标准偏差。方程1的所述10种被分析物的相应值(即群体平均值及标准偏差)列于表8中。

使用如方程1这样的方程，具有这10种被分析物的测量值(每一测量值如上所述用表8中的适当值标准化)、从以上方程中得到结果值y即MACCE指数大于零的受试者，将被界定为在2年内处于MACCE风险中，否则将被界定为在2年内不处于MACCE风险中。

表7：方程1，x变量

方程1中的变量	被分析物	测量单位
			x1	甲胎蛋白	纳克/毫升(ng/ml)
x2	癌抗原125	单位/毫升(U/ml)
			x3	CD40	ng/ml
x4	纤维蛋白原	mg/ml
			x5	谷胱甘肽S-转移酶	ng/ml
x6	IL-3	ng/ml
			x7	IL-8	皮克/毫升(pg/ml)

x8	SGOT	微克/毫升
			x9	组织因子	ng/ml
x10	血管假性血友病因子	微克/毫升

表8：标准值

方程1中提出的被分析物	群体平均值(以表7中的测量单位计)	标准偏差(以表7中的测量单位计)
			甲胎蛋白	1.729	1.138
癌抗原125	20.180	45.201
			CD40	1.195	2.916
纤维蛋白原	4.515	1.603
			谷胱甘肽S-转移酶	1.877	0.971
IL-3	0.555	0.139
			IL-8	19.795	12.619
SGOT	26.108	7.069
			组织因子	3.392	2.135
血管假性血友病因子	54.738	29.320

表9：方程1，c变量

c1	-0.26243
		c2	0.0947013
c3	0.00672228
		c4	-0.102292
c5	0.138434
		c6	-0.0191226

c7	-0.121236
		c8	0.0659886
c9	0.181278
		c10	-0.0900255

另一MACCE指数可通过以下线性方程用前四(4)种被分析物来限定：

y＝c₁x₁+c₂x₂+c₃x₃+c₄x₄ [方程2]

其中c₁到c₄值呈现以下表11中所列的值，变量x₁到x₁₀代表以下表10的被分析物测量结果。被分析物如上文定向蛋白质组学：多元免疫测定一节所述测量。每一被分析物的测量单位列入下表中，在将测量值代入到方程2之前，必须使值标准化。也就是说，每一个测量值减去源自整个研究群体(即所有病例和对照受试者)的所有值的平均数，随后将结果除以源自整个研究群体(即所有病例和对照受试者)的被分析物测量的标准偏差。方程2的4种被分析物的相应值(即群体平均值及标准偏差)列于以上表8中。

表10：方程2，x变量

方程2中的变量	被分析物	测量单位
			x1	甲胎蛋白	纳克/毫升(ng/ml)
x2	癌抗原125	单位/毫升(U/ml)
			x3	谷胱甘肽S-转移酶	ng/ml
x4	组织因子	ng/ml

表11：方程2，c变量

c1	-0.240085
		c2	0.0331361
c3	0.17824
		c4	0.207721

使用如方程2这样的方程，具有这四(4)种被分析物的测量值(每一测量值如上所述用表8中的适当值标准化)、以上方程中这4种被分析物的结果值y即MACCE指数大于零的受试者，将被界定为在2年内处于MACCE风险中，否则将被界定为在2年内不处于MACCE风险中。

将另外的多变量分类分析方法-微阵列预测分析(PAM，Tibshirani等，PNAS 99：6567-6572，2002)应用于723种被分析物的综合平台数据集。这种分析产生用于界定病例或对照的最佳的最小被分析物集合。在以上Random Forests情况下用与分析#2、#3、#4和#5相同的四种种子进行的四(4)种PAM分析的被分析物集合示于下表中：

表12：种子#1

种子#1

灵敏度＝83.8％；特异性＝83.8％

表13：种子#2

种子#2

灵敏度＝82.4％；特异性＝80.9％

表14：种子#3

种子#3

灵敏度＝80.9％；特异性＝80.9％

表15：种子#4

种子#4

灵敏度＝80.9％；特异性＝82.4％

PAM的这种可供选择的多变量分类器分析对于每种不同的起始种子产生基本上相同的被分析物集合，被分析物的重要性排名次序尽管与Random Forests分析不同，但却一致。

本发明包括被分析物集合的身份，所述被分析物集合可在来自个体的血液样品中测量，并与算法联合使用从而计算MACCE指数和预测血液取样后2年内该个体MACCE的发生情况。

本发明还包括算法，该算法可与被分析物集合的血液、血浆或血清水平信息一起使用，以计算MACCE指数及预测该个体从血液取样时起2年内MACCE的发生情况，如关于被分析物集合(例如Breiman的集合)所述的(Machine Learning 45：5-32，2001)。

本发明还包括仪器，其可从个体的血液、血浆或血清样品测量被分析物集合水平，所述被分析物集合水平可与算法一起使用以计算MACCE指数并预测血液取样后2年内该个体MACCE的发生情况。

本发明还包括试剂(抗体和其它类型的亲合试剂)，所述试剂可用于测量血液、血浆或血清的被分析物集合水平的测定中，所述被分析物集合水平可与算法一起使用以计算MACCE指数并预测血液取样后2年内该个体MACCE的发生情况。

本发明涵盖不偏离其精神或基本特性的其它具体形式的实施方案。因此，在所有方面皆应认为前述实施方案为阐述性的而非限制本文所述发明教导。因此，本发明范围由所附的权利要求而不是由前述说明来指出，落在所述权利要求等同内容的含义及范围的所有变化意欲包含在其中。

Claims

1.评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，所述方法包括：

在人的基于血液的样品中测量被分析物集合的浓度，所述被分析物集合包含甲胎蛋白、癌抗原125、谷胱甘肽S-转移酶和组织因子；

测定所述被分析物集合的MACCE指数；和

若所述MACCE指数大于零，则鉴定所述人为具有增加的严重有害心血管或脑血管事件可能性；或所述MACCE指数小于或等于零，则鉴定所述人为具有降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性。

2.评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，所述方法包括：

基于所测量的人的基于血液的样品中被分析物集合的浓度，测定具有指示严重有害心血管或脑血管事件可能性的值的MACCE指数，其中所述被分析物集合包含甲胎蛋白、癌抗原125、谷胱甘肽S-转移酶和组织因子；和

将所述MACCE指数、严重有害心血管或脑血管事件可能性或其等同物中至少之一，传输、显示、存储或输出到使用者的接口设备、计算机可读存储介质或者本地或远程计算机系统。

3.治疗人的方法，所述方法包括：

如果所述人被鉴定为具有增加的严重有害心血管或脑血管事件可能性，则推荐、批准或给予治疗。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述被分析物集合进一步包含CD40、纤维蛋白原、IL-3、IL-8、SGOT和血管假性血友病因子。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中测定所述被分析物集合的MACCE指数包括：

使所测量的各被分析物的浓度标准化，以获得标准化的浓度；

将所述各被分析物的标准化浓度乘以被分析物的常数以获得被分析物的值；和

将各个被分析物的被分析物值相加获得所述MACCE指数。

6.权利要求5的方法，其中使所测量的浓度标准化包括从所测量的浓度减去群体平均值以获得结果，然后用所述结果除以群体平均值的标准偏差。

7.评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，所述方法包括：

在人的基于血液的样品中测量被分析物集合的浓度，所述被分析物集合由甲胎蛋白、癌抗原125、CD40、纤维蛋白原、谷胱甘肽S-转移酶、IL-3、IL-8、SGOT、组织因子和血管假性血友病因子组成；

测定所述被分析物集合的MACCE指数；和

8.评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，所述方法包括：

基于所测量的人的基于血液的样品中被分析物集合的浓度，测定具有指示严重有害心血管或脑血管事件可能性的值的MACCE指数，其中所述被分析物集合由甲胎蛋白、癌抗原125、CD40、纤维蛋白原、谷胱甘肽S-转移酶、IL-3、IL-8、SGOT、组织因子和血管假性血友病因子组成；和

9.治疗人的方法，所述方法包括：

10.权利要求7-9中任一项的方法，其中测定所述被分析物集合的MACCE指数包括：

将各个被分析物的被分析物值相加获得所述MACCE指数。

11.权利要求10的方法，其中使所测量的浓度标准化包括从所测量的浓度减去群体平均值以获得结果，然后用所述结果除以群体平均值的标准偏差。

12.评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，所述方法包括：

在人的基于血液的样品中测量选自以下的被分析物集合中的至少一种被分析物的浓度：半胱氨酸、血管假性血友病因子、IL-8、16:0/18:1磷脂酰胆碱、N-羧基-丙氨酸、纤维蛋白原、MMP-2、18:0/20:4磷脂酰乙醇胺、载脂蛋白A1、16:0/22:6磷脂酰乙醇胺、18:1/18:0/18:0三酰甘油、α-1抗胰蛋白酶、18:2/18:1/17:0三酰甘油、20:1/18:1/18:1三酰甘油、16:0/16:0磷脂酰胆碱、20:4溶血磷脂酰胆碱、16:0鞘磷脂、SHBG、18:1/17:1，16:0三酰甘油、阿拉伯糖和18:1/18:1/17:0三酰甘油；和

基于所测量的浓度与预定阈值的比较，鉴定所述人为具有增加的或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性。

13.评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，所述方法包括：

将所测量的人的基于血液的样品中的被分析物集合中的至少一种被分析物的浓度与预定的阈值比较，以鉴别严重有害心血管或脑血管事件可能性，其中所述被分析物集合选自以下：半胱氨酸、血管假性血友病因子、IL-8、16:0/18:1磷脂酰胆碱、N-羧基-丙氨酸、纤维蛋白原、MMP-2、18:0/20:4磷脂酰乙醇胺、载脂蛋白A1、16:0/22:6磷脂酰乙醇胺、18:1/18:0/18:0三酰甘油、α-1抗胰蛋白酶、18:2/18:1/17:0三酰甘油、20:1/18:1/18:1三酰甘油、16:0/16:0磷脂酰胆碱、20:4溶血磷脂酰胆碱、16:0鞘磷脂、SHBG、18:1/17:1，16:0三酰甘油、阿拉伯糖和18:1/18:1/17:0三酰甘油；和

将所测量的浓度、预定的阈值和严重有害的心血管或脑血管事件中至少之一，传输、显示、存储或输出到使用者的接口设备、计算机可读存储介质或者本地或远程计算机系统。

14.评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，所述方法包括：

在人的基于血液的样品中测量选自以下的被分析物集合中的至少一种被分析物的浓度：16:0/18:1磷脂酰胆碱、18:0/20:4磷脂酰乙醇胺、16:0/22:6磷脂酰乙醇胺、18:1/18:0/18:0三酰甘油、18:2/18:1/17:0三酰甘油、20:1/18:1/18:1三酰甘油、16:0/16:0磷脂酰胆碱、20:4溶血磷脂酰胆碱、16:0鞘磷脂、18:1/17:1/16:0三酰甘油和18:1/18:1/17:0三酰甘油；和

15.评估人严重有害的心血管或脑血管事件的概率的方法，所述方法包括：

将所测量的人的基于血液的样品中的被分析物集合中的至少一种被分析物的浓度与预定的阈值比较，以鉴别严重有害心血管或脑血管事件可能性，其中所述分析物选自：16:0/18:1磷脂酰胆碱、18:0/20:4磷脂酰乙醇胺、16:0/22:6磷脂酰乙醇胺、18:1/18:0/18:0三酰甘油、18:2/18:1/17:0三酰甘油、20:1/18:1/18:1三酰甘油、16:0/16:0磷脂酰胆碱、20:4溶血磷脂酰胆碱、16:0鞘磷脂、18:1/17:1/16:0三酰甘油和18:1/18:1/17:0三酰甘油；和

16.权利要求12-15中任一项的方法，其中以下所述每一种被分析物预定的阈值为表4中各相应被分析物的第四四分位数的下限：半胱氨酸、血管假性血友病因子、IL-8、16:0/18:1磷脂酰胆碱、N-羧基-丙氨酸、纤维蛋白原、MMP-2、18:0/20:4磷脂酰乙醇胺、16:0/22:6磷脂酰乙醇胺、18:1/18:0/18:0三酰甘油、α-1抗胰蛋白酶、18:2/18:1/17:0三酰甘油、20:1/18:1/18:1三酰甘油、16:0/16:0磷脂酰胆碱、16:0鞘磷脂、SHBG、18:1/17:1，16:0三酰甘油和18:1/18:1/17:0三酰甘油，其中所测量的落入第四四分位数内的浓度增加严重有害心血管或脑血管事件可能性。

17.权利要求12-15中任一项的方法，其中以下所述每一种被分析物预定的阈值为表4中各相应被分析物的第三及第四四分位数的下限：半胱氨酸、血管假性血友病因子、IL-8、16:0/18:1磷脂酰胆碱、N-羧基-丙氨酸、纤维蛋白原、MMP-2、18:0/20:4磷脂酰乙醇胺、16:0/22:6磷脂酰乙醇胺、18:1/18:0/18:0三酰甘油、α-1抗胰蛋白酶、18:2/18:1/17:0三酰甘油、20:1/18:1/18:1三酰甘油、16:0/16:0磷脂酰胆碱、16:0鞘磷脂、SHBG、18:1/17:1，16:0三酰甘油和18:1/18:1/17:0三酰甘油，其中所测量的落入第三个及第四四分位数内的浓度增加严重有害心血管或脑血管事件可能性。

18.权利要求12-15中任一项的方法，其中载脂蛋白A1、20:4溶血磷脂酰胆碱和阿拉伯糖每一种被分析物的预定阈值为表4中各相应被分析物的第一四分位数的上限，其中所测量的落入第一四分位数内的浓度增加严重有害心血管或脑血管事件可能性。

19.权利要求12-15中任一项的方法，其中载脂蛋白A1、20:4溶血磷脂酰胆碱和阿拉伯糖每一种被分析物的预定阀值为表4中各相应被分析物的第一及第二四分位数的上限，其中所测量的落入第一及第二四分位数内的浓度增加严重有害心血管或脑血管事件可能性。

20.前述权利要求任一项的方法，其中所述基于血液的样品包含血清或血浆。

21.用于预测人严重有害的心血管或脑血管事件的方法，所述方法包括：

从人获得至少一种基于血液的样品；

在来自所述人的样品中测量附录1中所鉴定的一种或更多种被分析物的绝对浓度；和

基于所测量的附录1所鉴定的一种或更多种被分析物的浓度，将所述人鉴定为具有增加或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性。

22.用于预测人严重有害的心血管或脑血管事件的方法，所述方法包括：

在来自所述人的样品中测量附录1中所鉴定的一种或更多种被分析物的绝对浓度；

将所述绝对浓度与预定的阈值比较；

基于所测量的附录1所鉴定的一种或更多种被分析物的浓度，将所述人鉴定为具有增加或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性；和

将所述严重有害心血管或脑血管事件可能性、绝对浓度、预定的阈值或其等同物中至少之一，传输、显示、存储或输出到使用者的接口设备、计算机可读存储介质或者本地或远程计算机系统。

23.用于预测人严重有害的心血管或脑血管事件的方法，所述方法包括：

从人获得至少一种基于血液的样品；

在来自所述人的样品中测量附录1中所鉴定的一种或更多种被分析物的相对浓度；和

基于所测量的附录1所鉴定的一种或更多种被分析物的相对浓度，将所述人鉴定为具有增加或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性。

24.用于预测人严重有害的心血管或脑血管事件的方法，所述方法包括：

在来自所述人的样品中测量附录1中所鉴定的一种或更多种被分析物的相对浓度；

将所述相对浓度与预定的阈值比较；

基于所述附录1所鉴定的一种或更多种被分析物的相对浓度，将所述人鉴定为具有增加或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性；和

25.权利要求2、8、13或15的方法，其中将所述MACCE指数、严重有害心血管或脑血管事件可能性、所测量的浓度、预定的阈值或其等同物显示在屏幕或有形介质上。

26.权利要求2、8、13或15的方法，其中将所述MACCE指数、严重有害心血管或脑血管事件可能性、所测量的浓度、预定的阈值或其等同物传输给医药工业人员。

27.权利要求26的方法，其中将所述MACCE指数、严重有害心血管或脑血管事件可能性、所测量的浓度、预定的阈值或其等同物传输给提供医疗保险的人或医生。

28.治疗方法，所述方法包括：

基于所测量的某人基于血液的样品中在附录1中所鉴定的一种或更多种被分析物的浓度，鉴别所述人为具有增加或降低的严重有害心血管或脑血管事件可能性；和

29.鉴别不应该接受治疗的人的方法，所述方法包括：

除非所述人被鉴定为具有增加的严重有害心血管或脑血管事件可能性，否则拒绝推荐、批准或给予治疗。