CN114924073A - 结直肠进展期肿瘤诊断标志物组合及其应用 - Google Patents

结直肠进展期肿瘤诊断标志物组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了结直肠进展期肿瘤诊断标志物组合及其应用。该代谢标志物选自3β‑脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P‑18:0)、石胆酸、DL‑2‑氨基辛酸、3β‑猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4‑氨基丁酸、羟基癸酸、20‑羧基花生四烯酸、L‑焦谷氨酸、顺式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸、对称N,N‑二甲基精氨酸、S‑腺苷同型半胱氨酸、α‑亚麻酸、马尿酸、甘氨酰‑L‑亮氨酸、12‑羟基二十碳四烯酸、L‑缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸‑3‑硫酸盐、甘氨石胆酸、γ‑鼠胆酸、DL‑Β‑苯乳酸、鹅脱氧胆酸的一种或多种组合。本发明提供的代谢标志物能精确诊断结直肠进展期肿瘤(结直肠癌和/或进展期腺瘤)，灵敏度高。

Description

结直肠进展期肿瘤诊断标志物组合及其应用
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种结直肠进展期肿瘤诊断标志物组合及其应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal Cancer,CRC)又称大肠癌，是消化系统常见的恶性肿瘤。
结直肠癌的发展是一个缓慢的发展过程，在早期通常无症状并且难以检测，绝大多数患者在出现便血、腹痛等症状后才到医院就诊，失去了最佳的手术治疗时机，就算进行了手术治疗，患者的5年生存率也大大降低。
结直肠癌的形成一般会经历正常粘膜增生、进展期腺瘤(恶性)、腺癌(恶性)的发展过程，一般需要5-10年的时间，这就为结直肠癌的预防提供了极有利的机会。据估计，结直肠癌的5年生存率可达到65％以上，早期诊断并治疗的患者5年生存率可达到 90％以上，而晚期患者的5年生存率不到15％。因此，早期筛查、诊断和治疗是降低结直肠癌死亡率最有效的手段(Miller,K.D.,Nogueira,L.,Mariotto,A.B.et al.Cancer treatment andsurvivorship statistics,2019.CA Cancer J Clin.2019,69(5):363-385)。尤其是，如果能够在息肉腺瘤(恶性)阶段就进行干预，就能有效防止结直肠癌的发生。
进展期腺瘤(AA)是一种癌前病变，是指大小≥1cm或者具有≥25％的任何大小的绒毛状组分或高度发育异常，随时间推移，很容易发展为结直肠癌。若能够在结直肠癌发生的早期阶段，寻找到具有一定预警作用的肿瘤生物标志物，对结直肠癌和/或进展期腺瘤(恶性肿瘤)进行诊断，对于提高患者的治疗效果，改善患者预后有着重要的意义。
目前，结直肠癌诊断方法主要依靠影像学检查、生化检验和病理学检查，其中结直肠镜检查是结直肠癌诊断的金标准，是癌前病变和发病最有效的筛查方法。其中，结肠镜检查的优点是高灵敏度，缺点是侵入性检查会引起肠道不适，并且依赖于大型设备和医生的专业知识水平。因此，结肠镜检测筛查的依从性差，不适用在普通人群中进行大规模推广。CT结肠成像术使用辐射使结肠可视化、具有高灵敏度的优点，但是其属于半侵入式检查，同时存在辐射的危险。大便潜血测试(FOBT)和粪便免疫化学测试(FIT) 检测技术是近些年发展起来的，具有非侵入性、成本低的优点，但是容易出现假阳性，漏诊率高。粪便脱落标记物检测是新检测技术，比如基因突变和基因甲基化检测，但是该类粪便脱落标记物检测费用昂贵，难以用于大规模人群筛查。另外，针对如糖抗原 (CA19-9)以及血浆癌胚抗原(CEA)等血浆标志物检测具有低侵入性、简单、快捷的有点，但是这些血浆标志物最大的缺陷就是其特异度和灵敏度很低，对结直肠癌无特异性，早期诊断效果不明显。上述检查技术针对进展期腺瘤的灵敏度更低，不到40％，远远低于结直肠癌的检测灵敏度。因此，开发一种具有灵敏度高、低成本的尤其是进展期腺瘤、结直肠癌筛查和早期诊断的方法迫在眉睫。
发明内容
基于此，有必要提供一种结直肠进展期肿瘤诊断标志物组合及其应用，该代谢标志物组合可在制备用于诊断或监测进展期腺瘤及结直肠癌(简称结直肠进展期肿瘤)的试剂(盒)中进行应用。
目前，虽然有研究者利用公共数据库的代谢物信息采用非靶向代谢组检测技术筛选得到的一些代谢物，但是该非靶向代谢组学筛选的代谢物实际针对具体疾病诊断或监测的特异性不强，并且大多数研究都是样本量较少，单一样本来源，实际临床意义十分有限。血浆分析是临床上常用的一种疾病诊断方法，因其简便、快速、经济且相对无创的优点而被广泛采用。目前尚未有人使用血浆代谢物水平对结直肠癌和/或进展期腺瘤进行诊断。应用血浆靶向代谢组学寻找代谢标志物以诊断结直肠癌和/或进展期腺瘤，对于结直肠癌临床早期快速确诊具有重要意义。
而本申请首次通过构建结结直肠进展期肿瘤血浆特异性代谢组数据库进行血浆靶向定量代谢组学研究，获得大量与疾病相关的特异性代谢物，并且通过多个医学中心来源样本对代谢标志物进行验证，从而寻找灵敏度高、特异性好、稳定可靠的结直肠结直肠进展期肿瘤诊断血浆代谢标志物。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一组进展期腺瘤和/或结直肠癌诊断代谢标志物，该代谢标志物为以下代谢标志物中的任意一种或多种组合：丙酰左旋肉碱盐酸盐、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0/0:0)、羟基癸酸、DL-2-氨基辛酸、DL-Β-苯乳酸、20-羧基花生四烯酸、3β-猪去氧胆酸、甘氨石胆酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、γ-鼠胆酸、12-羟基二十碳四烯酸、假尿苷、α-亚麻酸、4-氨基丁酸、琥珀酸、S-腺苷同型半胱氨酸、L-焦谷氨酸、L-缬氨酸、甘氨酰-L-亮氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、不对称二甲基精氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、石胆酸、3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0/0:0)、马尿酸、鹅脱氧胆酸、谷氨酸、肌醇。
进一步地，代谢物组合至少包含任意两个、任意三个、任意四个、任意任意五个、任意六个、任意七个、任意八个、任意九个、任意十个及以上的代谢物。
在其中一些实施例中，所述代谢标志物至少选自3β-脱氧胆酸、石胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸中的至少一种，用于区分诊断结直肠癌患者和健康人。
在其中一些实施例中，所述代谢标志物至少选自溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、肌醇、 4-氨基丁酸、L-焦谷氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐中的至少一种，用于区分诊断进展期腺瘤和非结直肠进展期肿瘤。
在其中一些实施例中，所述代谢标志物至少选自石胆酸、3β-猪去氧胆酸、肌醇、假尿苷、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、马尿酸、12-羟基二十碳四烯酸、鹅脱氧胆酸中的至少一种，用于区分诊断结直肠进展期肿瘤和非结直肠进展期肿瘤。
在其中一些实施例中，所述代谢标志物至少选自3β-脱氧胆酸、石胆酸、3β-猪去氧胆酸、肌醇、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L- 缬氨酸、不对称二甲基精氨酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸中的至少一种，用于区分诊断结直肠进展期肿瘤和健康人。
本发明目的提供了一种含有上述适合于结直肠癌和/或进展期腺瘤诊断的诊断标志物的试剂产品，包括所述代谢标志物的标准品，提取富集所述代谢标志物的溶剂，可用于结直肠癌和/或进展期腺瘤诊断。本发明提供的试剂盒可以用于诊断结直肠癌患者，还可以用于诊断进展期腺瘤，提高诊断便利性，对结直肠癌进行早诊早治。
本发明的有益效果：
本发明提供的一组血浆代谢物能对结直肠癌患者进行有效诊断。ROC曲线评价方法中，单个代谢物ROC曲线下的面积AUC值均在0.7以上。任意代谢物组合的性能明显优于单个代谢物，ROC曲线下的面积AUC值为0.716～0.991。
本发明提供的一组血浆代谢物能对进展期腺瘤患者进行有效诊断。ROC曲线评价方法中，单个代谢物ROC曲线下的面积AUC值均在0.6以上。任意代谢物组合的性能明显优于单个代谢物，ROC曲线下的面积AUC值均在0.6以上，灵敏度达到50％～80％。
本发明构建了结直肠癌血浆特异性代谢组数据库，诊断代谢标志物更具代表性。本发明仅通过取血检测就能实现诊断，无需额外采集组织样本，能够很好地替代或辅助现有肠镜检测。本发明简便、快捷、相对无内创，有利于结直肠癌和/或进展期腺瘤的早期筛查，具有很好的临床使用和推广价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
关键仪器信息分别见下表1：
表1实验仪器信息
名称 型号 品牌
HPLC-MS/MS QTRAP 6500+ SCIEX
HPLC-TOF-MS TripleTOF 6600 SCIEX
离心机 5424R Eppendorf
离心浓缩仪 CentriVap LABCONCO
涡旋混合器 VORTEX-5 Kyllin-Be11
实施例1构建结直肠进展期肿瘤血浆特异性代谢物离子对数据库
本实施例提供一种构建结直肠进展期肿瘤血浆特异性代谢物离子对数据库的方法，包括如下步骤：
S1，采集样品
本研究在取得患者同意后，收集健康对照、非进展期腺瘤患者、进展期腺瘤患者、结直肠癌患者各20例样本的外周静脉血血浆。其中，健康对照来源于体检后无肠道疾病的人群；疾病组均经过结直肠镜检查和术后确诊。所有样本均无其它任何恶性肿瘤病史、无其他全身性重大疾病、无长期用药的慢性病史。各组样本间的年龄和性别均相匹配，非结直肠癌组包括健康对照和非进展期腺瘤患者。采血时间均为清晨空腹状态。
所有血浆样本离心后置于-80℃冰箱内保存，研究时取出血浆样本解冻后进行后续分析。
S2，样品预处理
从-80℃冰箱中取出样品于冰上解冻至样本中没有冰块(后续操作都要求在冰上进行)；样本解冻后，涡旋10s混匀，取样本50μL加入到对应编号的离心管中；分别加入300μL纯甲醇内标提取液；涡旋5min，静置24h，12000r/min，4℃条件下离心10 min；吸取上清液270μL浓缩24h；加入100μl复溶液(由体积比1:1的乙腈和水混合制成)，每个样本各取50μL混合成mix检测液。
S3，建库流程
液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)实现从利用色谱进行物质分离到利用质谱进行物质鉴定的整个流程。迈维代谢基于广泛靶向代谢组方法，利用上述mix检测液建立结直肠癌血浆特异性代谢物离子对数据库，代谢物离子对主要有以下四种来源：MIM-EPI采集，TOF采集，迈维标准品数据库和结直肠癌相关文献代谢物。
其中，通过MIM-EPI检测模式共采集到1065个离子对，TOF检测模式共采集到1232个离子对，迈维标准品数据库共采集到572个离子对，以及结直肠癌文献相关代谢物71 个，汇总和去重上述所有来源离子对信息，最终获得恶性肿瘤(包括进展期腺瘤和结直肠癌)血浆特异性代谢物离子对2832个。
实施例2筛选结直肠进展期肿瘤代谢标志物
本实施例提供一种结直肠进展期肿瘤代谢标志物的筛选方法，包括如下步骤：
S1，采集样品
本研究在取得患者同意后，从3个独立的临床医学中心共收集了795例健康对照、393例非进展期腺瘤患者、193例进展期腺瘤患者、494例结直肠癌患者的外周静脉血血浆。其中健康对照来源于体检后无肠道疾病的人群；疾病组均经过结直肠镜检查和术后确诊。所有样本均无其它任何恶性肿瘤病史、无其他全身性重大疾病、无长期用药的慢性病史。各组样本间的年龄和性别均相匹配，非结直肠癌组包括健康对照和非进展期腺瘤患者。采血时间均为清晨空腹状态。所有血浆样本离心后置于-80℃冰箱内保存，研究时取出血浆样本解冻后进行后续分析。
S2，血清广泛靶向代谢组学分析
(1)样品预处理
从-80℃冰箱中取出步骤S1采集的样品，于冰上解冻至样本中没有冰块(后续操作都要求在冰上进行)；样本解冻后，涡旋10s混匀，取样本50μL加入到对应编号的离心管中；加入300μL纯甲醇内标提取液(含100ppm浓度的L-2-苯丙氨酸，[2H3]-L- 肉碱-d3盐酸盐，4-氟-L-2-苯基甘氨酸，L-苯基丙氨酸，[2H5]-马尿酸，[2H5]-犬尿酸，[2H5]- 苯氧基乙酸内标)；涡旋5min，静置24h，再于12000r/min、4℃条件下离心10min；吸取上清液270μL浓缩24h；再加入100μL由乙腈和水按照体积比1:1组成的复溶液中，用于LC-MS/MS分析。每个样本各取20μL混合成质控样本(QC)，每间隔15个样本采集一次。
(2)样品代谢物检测分析
表2实验试剂
化合物 CAS编号 品牌
L-2-苯丙氨酸 103616-89-3 百灵威
[2H3]-L-肉碱-d3盐酸盐 350818-62-1 isoreag
4-氟-L-2-苯基甘氨酸 19883-57-9 TCI
L-苯基丙氨酸 63-91-2 isoreag
[2H5]-马尿酸 53518-98-2 isoreag
[2H5]-犬尿酸 350820-13-2 isoreag
[2H5]-苯氧基乙酸 154492-74-7 isoreag
甲醇 67-56-1 Merck
乙腈 75-05-8 Merck
乙酸 64-19-7 Aladdin
确定液相色谱条件如下：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm，2.1mm*100mm；柱温为40℃；进样量为2μL。
流动相：A相为含0.1％乙酸水溶液，B相为含0.1％乙酸的乙腈溶液。洗脱梯度程序为：0min，A相与B相的体积比为95:5；11.0min，A相与B相的体积比为10:90；12.0 min，A相与B相的体积比为10:90；12.1min，A相与B相的体积比为95:5；14.0min， A相与B相的体积比为95:5V/V。流速0.4mL/min。
确定质谱条件如下：
电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)温度500℃，质谱电压5500V(positive) 或者-4500V(negative)，离子源气体I(GS I)55psi，气体II(GS II)60psi，气帘气 (curtain gas,CUR)25psi，碰撞诱导电离(collision-activated dissociation，CAD)参数设置为高。
在三重四极杆(Qtrap)中，每个离子对是根据优化的去簇电压(declusteringpotential， DP)和碰撞能(collision energy，CE)进行MRM模式扫描检测。
按照确定的液相色谱条件和质谱条件分别对样本进行分析检测。
(3)图谱峰面积预处理和积分
基于进展期腺瘤、结直肠癌血浆特异性代谢物数据库，对样本的代谢物进行质谱定性定量分析。通过液相色谱能够分离不同分子量的代谢物。通过三重四极杆的多反应监测模式(MRM)筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度(CPS)。用MultiQuant 3.0.3软件打开样本下机质谱文件，进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积(Area)代表对应物质的相对含量，设置S/N>5，保留时间偏移不超过0.2 min的峰保留，最后导出所有色谱峰面积积分数据保存。
(4)实验质量控制
通过对不同质控QC样本质谱检测分析的总离子流图进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取和检测的重复性，即技术重复。仪器的高稳定性为数据的重复性和可靠性提供了重要的保障。CV值即变异系数(Coefficient of Variation)，是原始数据标准差与原始数据平均数的比，可反映数据离散程度。使用经验累积分布函数(Empirical CumulativeDistribution Function,ECDF)可以分析小于参考值的物质CV出现的频率，QC样本的CV 值较低的物质占比越高，代表实验数据越稳定：QC样本CV值小于0.5的物质占比高于85％，表明实验数据较稳定；QC样本CV值小于0.3的物质占比高于75％，表明实验数据非常稳定。同时监测检测过程中所有内标CV值变化情况，内标CV值的变化小于 20％，表明检测过程中仪器稳定性好。
(5)数据处理和分析
利用峰面积积分数据在两组间进行差异代谢物分析，并设定P value<0.05为差异显著性标准，筛选差异代谢物作为诊断结直肠癌的候选代谢标志物。同时使用机器学习随机森林(Random Forest，RF)算法对两组间代谢物积分数据进行分析，将上述结直肠癌患者样本及非结直肠癌患者血浆样本数据的2/3作为训练集，1/3作为测试集。对训练集进行决策树建模，然后组合多个决策树的预测，通过投票得出最终预测结果，该代谢物模型可有效诊断结直肠癌患者。通过测试集样本对上述模型进行验证，所筛选的代谢物成为候选代谢标志物。组间差异分析筛选的代谢物和机器学习筛选代谢物的并集作为诊断结直肠癌的候选代谢标志物集合。两组间比较，包括但不限于结直肠癌组和非结直肠进展期肿瘤组(健康对照和非进展期腺瘤)、结直肠癌组和健康人、进展期腺瘤组和非结直肠进展期肿瘤组(健康对照和非进展期腺瘤)、进展期腺瘤组和健康人、结直肠进展期肿瘤组(进展期腺瘤和结直肠癌组)和非结直肠进展期肿瘤组、结直肠进展期肿瘤组(进展期腺瘤和结直肠癌组)和健康人。
(6)血浆代谢物解谱
上述差异分析和随机森林模型筛选的代谢标志物集合，根据其保留时间，一级和二级推测标志物的分子质量和分子式，并且与代谢物谱图数据库中的谱图信息进行比对，从而对代谢物进行定性鉴定。
进一步采购上述所鉴定代谢物非同位素标准品，核对血浆样本中代谢物和对应非同位素标准品在高效液相色谱串联质谱检测中的保留时间，一级和二级质谱信息的一致性，以确定代谢物定性的准确性。
根据上述鉴定方法，我们成功鉴定出29种血浆代谢标志物作为适于结直肠进展期肿瘤的诊断标志物，见表3：
表3 29种结直肠进展期肿瘤血浆代谢标志物
Figure BDA0003569264410000081
Figure BDA0003569264410000091
实施例3：构建血浆靶向代谢组结直肠进展期肿瘤诊断模型
S1，采集样品
本研究在取得患者同意后，从3个独立的临床医学中心共收集了311例健康对照，100例非进展期腺瘤患者，100例进展期腺瘤患者和355例结直肠癌患者的外周静脉血血浆。其中健康对照来源于体检后无肠道疾病的人群；疾病组均经过结直肠镜检查确诊。所有样本均无其它任何恶性肿瘤病史，无其他全身性重大疾病，无长期用药的慢性病史。各组样本间的年龄和性别均相匹配，非结直肠癌组包括健康对照和非进展期腺瘤患者，恶性肿瘤组包括进展期腺瘤患者和结直肠癌患者。采血时间均为清晨空腹状态。所有血浆样本离心后置于-80℃冰箱内保存，研究时取出血浆样本解冻后进行后续分析。
S2，样品代谢检测分析
本步骤所采用的实验试剂见下表4：
表4试验试剂
Figure BDA0003569264410000092
Figure BDA0003569264410000101
(1)样品预处理
从-80℃冰箱中取出样品于冰上解冻至样本中没有冰块(后续操作都要求在冰上进行)；样本解冻后，涡旋10s混匀，取50μL项目样本加入150μL提取液(提取液含有浓度为100ppm的同位素内标混合液)，涡旋3min，12000rpm，4℃离心10min，-20 冰箱低温静置过夜；12000rpm，4℃离心5min，取上清170μL，按顺序转移入96孔板内，过完蛋白沉淀板封口用于LC-MS/MS分析。每个样本各取20μl混合成质控样本(QC)，每间隔15个样本采集一次。
(2)确定检测条件进行检测
鉴于代谢标志物性质的差异，靶向定量检测使用T3柱和Amide柱两种方法进行代谢物分离，以保证代谢物定量的准确性。
确定T3柱液相色谱条件：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm，2.1mm*100mm；柱温40℃；进样量2μL。
流动相：A相为含0.04％的乙酸溶液，B相为含0.04％乙酸的乙腈溶液；洗脱梯度程序：0min，A相与B相的体积比为95:5；11.0min，A相与B相的体积比为10:90；12.0 min，A相与B相的体积比为10:90；12.1min，A相与B相的体积比为95:5；14.0min， A相与B相的体积比为95:5V/V。流速0.4mL/min。
Amide柱液相色谱条件：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm，2.1mm*100mm；柱温40℃；进样量2μL。
流动相：A相为超纯水(10mM乙酸铵+0.3％氨水+1mg亚甲基二磷酸)，B相为90％乙腈水(包含1mg亚甲基二磷酸)；洗脱梯度程序：0min，A相与B相的体积比为10:90； 9.0min，A相与B相的体积比为40:60；10.0min，A相与B相的体积比为60:40；11.0min， A相与B相的体积比为60:40；11.1min，A相与B相的体积比为10:90；15.0min，A相与B相的体积比为10:90。流速0.4mL/min。
质谱条件：
T3柱和Amide柱质谱采集条件相同，主要包括：电喷雾离子源(electrosprayionization， ESI)温度500℃，质谱电压5500V(positive)，-4500V(negative)，离子源气体I (GS I)55psi，气体II(GS II)60psi，气帘气(curtain gas,CUR)25psi，碰撞诱导电离(collision-activated dissociation，CAD)参数设置为高。在三重四极杆(Qtrap)中，每个离子对是根据优化的去簇电压(declustering potential，DP)和碰撞能(collisionenergy， CE)进行MRM模式扫描检测。
(3)图谱峰面积预处理和积分
采用MultiQuant 3.0.3软件处理质谱数据，参考标准品的保留时间与峰型信息，对待测物在不同样本中检测到的质谱峰进行积分校正，以确保定性定量的准确。
对所有样本进行定性定量分析，每个色谱峰的峰面积(Area)代表对应物质的相对含量，代入线性方程和计算公式，最终得到所有样本中待测物的定性定量分析结果。
(4)代谢物浓度计算
配制0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL不同浓度的标准品溶液，获取各个浓度标准品的对应定量信号的质谱峰强度数据；以对应代谢物的外标与内标浓度比 (ConcentrationRatio)为横坐标，外标与内标峰面积比(Area Ratio)为纵坐标，绘制不同物质的标准曲线。将检测到的所有样本的积分峰面积比值代入标准曲线线性方程进行计算，进一步代入计算公式计算后，MultiQuant 3.0.3中稀释因子设置为3，最终样本中积分峰面积比值代入标准曲线得到的浓度值(ng/mL)即实际样本中该物质的含量数据。
(5)实验质量控制
通过对不同质控QC样本质谱检测分析的总离子流图进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取和检测的重复性，即技术重复。仪器的高稳定性为数据的重复性和可靠性提供了重要的保障。CV值即变异系数(Coefficient of Variation)，是原始数据标准差与原始数据平均数的比，可反映数据离散程度。使用经验累积分布函数(Empirical CumulativeDistribution Function,ECDF)可以分析小于参考值的物质CV出现的频率，QC样本的CV 值较低的物质占比越高，代表实验数据越稳定：QC样本所有的物质CV值小于0.3，表明实验数据较稳定；QC样本CV值小于0.2的物质占比高于90，表明实验数据非常稳定。同时监测检测过程中同位素内标CV值变化情况，内标CV值的变化小于20％，表明检测过程中仪器稳定性好。
(6)数据处理和分析
结直肠癌组和非结直肠癌组两组间代谢物浓度进行差异显著性分析，并设定Pvalue <0.05为差异显著性标准。筛选的差异代谢使用二元逻辑回归算法构建分类模型，得到结直肠癌的诊断模型。单个代谢标志物变化倍数结果见表5：
表5结直肠进展期肿瘤组VS非结直肠进展期肿瘤组代谢物变化倍数
Figure BDA0003569264410000121
Figure BDA0003569264410000131
该诊断模型包含以下29种代谢物：3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4-氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式 -4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸。
这29个差异代谢物单个用于诊断区分结直肠进展期肿瘤和非结直肠进展期肿瘤的能力较强，ROC曲线下面积(AUC)均大于0.7，具有临床诊断意义；这29个差异代谢物联合用于诊断时，AUC进一步提高，29个联合起来诊断结直肠进展期肿瘤的AUC达0.991。单个代谢标志物用于结直肠进展期肿瘤诊断的结果见表6：
表6结直肠进展期肿瘤组VS非结直肠进展期肿瘤组单个代谢物的AUC值
编号 中文名称 AUC 灵敏度 特异性
1 3β-脱氧胆酸 0.823 79.70％ 80.80％
2 溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0) 0.814 78.50％ 79.70％
3 石胆酸 0.806 77.60％ 79.00％
4 DL-2-氨基辛酸 0.797 76.80％ 78.50％
5 3β-猪去氧胆酸 0.795 76.40％ 78.30％
6 溶血磷脂酰胆碱(14:0) 0.785 76.20％ 77.90％
7 肌醇 0.776 75.90％ 77.40％
8 谷氨酸 0.765 74.00％ 76.30％
9 假尿苷 0.757 73.10％ 75.40％
10 丙酰左旋肉碱盐酸盐 0.754 72.90％ 74.90％
11 4-氨基丁酸 0.748 72.60％ 74.50％
12 羟基癸酸 0.742 72.20％ 74.10％
13 20-羧基花生四烯酸 0.736 72.10％ 73.90％
14 L-焦谷氨酸 0.731 71.90％ 73.40％
15 顺式-4-羟基-L-脯氨酸 0.729 71.80％ 73.30％
16 对称N,N-二甲基精氨酸 0.727 71.70％ 73.10％
17 S-腺苷同型半胱氨酸 0.726 71.50％ 72.90％
18 α-亚麻酸 0.723 71.30％ 72.40％
19 马尿酸 0.721 71.20％ 72.20％
20 甘氨酰-L-亮氨酸 0.719 71.00％ 72.00％
21 12-羟基二十碳四烯酸 0.716 70.70％ 71.60％
22 L-缬氨酸 0.713 70.40％ 71.40％
23 琥珀酸 0.711 70.20％ 71.00％
24 不对称二甲基精氨酸 0.710 70.10％ 70.60％
25 牛磺石胆酸-3-硫酸盐 0.709 69.90％ 70.40％
26 甘氨石胆酸 0.706 69.70％ 70.00％
27 γ-鼠胆酸 0.703 69.50％ 69.90％
28 DL-Β-苯乳酸 0.702 69.40％ 69.90％
29 鹅脱氧胆酸 0.703 69.30％ 69.80％
实施例4：使用2个血浆代谢标志物进行结直肠进展期肿瘤诊断模型的构建
本实施例与实施例3的研究对象、检测分析方法相同，仅在步骤(6)二元逻辑回归建模时使用上述任意2个血浆代谢标志物。
经构建模型统计分析：任意2个差异代谢物单个用于诊断区分结直肠进展期肿瘤和非结直肠进展期肿瘤的能力较强，ROC曲线下面积(AUC)均大于0.7，具有临床诊断意义。其中，部分统计结果示例如下：
3β-脱氧胆酸和溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)联合起来诊断结直肠癌的AUC为0.862。
L-焦谷氨酸和顺式-4-羟基-L-脯氨酸联合起来诊断结直肠癌的AUC为0.751。
DL-Β-苯乳酸和鹅脱氧胆酸联合起来诊断结直肠癌的AUC为0.716。
实施例5：使用5个血浆代谢标志物进行结直肠进展期肿瘤诊断模型的构建
本实施例与实施例3的研究对象、检测分析方法相同，仅在步骤(6)二元逻辑回归建模时使用上述任意5个血浆代谢标志物。
经构建模型统计分析：任意5个差异代谢物单个用于诊断区分结直肠进展期肿瘤和非结直肠进展期肿瘤的能力较强，ROC曲线下面积(AUC)均大于0.7，具有临床诊断意义。其中，部分统计结果示例如下：
3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸和3β-猪去氧胆酸联合用于诊断结直肠进展期肿瘤的AUC为0.892。
20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸联合用于诊断结直肠进展期肿瘤的AUC为0.776。
牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸和鹅脱氧胆酸联合用于诊断结直肠进展期肿瘤的AUC为0.738。
实施例6：使用9个血浆代谢标志物进行结直肠进展期肿瘤诊断模型的构建
本实施例与实施例3的研究对象、检测分析方法相同，仅在步骤(6)二元逻辑回归建模时使用上述任意9个血浆代谢标志物。
经构建模型统计分析：任意9个差异代谢物单个用于诊断区分结直肠进展期肿瘤和非结直肠进展期肿瘤的能力较强，ROC曲线下面积(AUC)均大于0.7，具有临床诊断意义。其中，部分统计结果示例如下：
3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸和假尿苷联合用于诊断结直肠进展期肿瘤的 AUC为0.925。
4-氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸和马尿酸联合用于诊断结直肠进展期肿瘤的AUC为0.791，
12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸和鹅脱氧胆酸联合用于诊断结直肠进展期肿瘤的AUC为0.751。
实施例7：使用12个血浆代谢标志物进行结直肠进展期肿瘤诊断模型的构建
本实施例与实施例3的研究对象、检测分析方法相同，仅在步骤(6)二元逻辑回归建模时使用上述任意12个血浆代谢标志物。
经构建模型统计分析：任意12个差异代谢物单个用于诊断区分结直肠进展期肿瘤和非结直肠进展期肿瘤的能力较强，ROC曲线下面积(AUC)均大于0.7，具有临床诊断意义。其中，部分统计结果示例如下：
3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4-氨基丁酸和羟基癸酸联合用于诊断结直肠进展期肿瘤的AUC为0.941。
马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸联合用于诊断结直肠进展期肿瘤的AUC为0.776。
实施例8：使用15个血浆代谢标志物进行结直肠进展期肿瘤诊断模型的构建
本实施例与实施例3的研究对象、检测分析方法相同，仅在步骤(6)二元逻辑回归建模时使用上述任意15个血浆代谢标志物。
经构建模型统计分析：任意15个差异代谢物单个用于诊断区分结直肠进展期肿瘤和非结直肠进展期肿瘤的能力较强，ROC曲线下面积(AUC)均大于0.7，具有临床诊断意义。其中，部分统计结果示例如下：
3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4-氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸和顺式-4-羟基-L-脯氨酸联合用于诊断结直肠进展期肿瘤的AUC为0.952。
顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸和鹅脱氧胆酸联合用于诊断结直肠进展期肿瘤的AUC为0.788。
实施例9：使用19个血浆代谢标志物进行结直肠进展期肿瘤诊断模型的构建
本实施例与实施例3的研究对象、检测分析方法相同，仅在步骤(6)二元逻辑回归建模时使用上述任意19个血浆代谢标志物。
经构建模型统计分析：任意19个差异代谢物单个用于诊断区分结直肠进展期肿瘤和非结直肠进展期肿瘤的能力较强，ROC曲线下面积(AUC)均大于0.7，具有临床诊断意义。其中，部分统计结果示例如下：
3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4-氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸和马尿酸联合起来诊断结直肠进展期肿瘤的 AUC达0.966。
实施例10：使用24个血浆代谢标志物进行结直肠进展期肿瘤诊断模型的构建
本实施例与实施例3的研究对象、检测分析方法相同，仅在步骤(6)二元逻辑回归建模时使用上述任意24个血浆代谢标志物。
经构建模型统计分析：任意24个差异代谢物单个用于诊断区分结直肠进展期肿瘤和非结直肠进展期肿瘤的能力较强，ROC曲线下面积(AUC)均大于0.7，具有临床诊断意义。其中，部分统计结果示例如下：
3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4-氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸和不对称二甲基精氨酸联合起来诊断结直肠进展期肿瘤的 AUC达0.975。
实施例11：血浆靶向代谢组针对性诊断区分结直肠癌和健康人诊断模型构建
本实施例的样本来源于实施例3，结直肠癌患者355例，健康人311例。代谢物检测和分析方法与实施例3相同，对以下29个代谢物进行定量检测，包括：3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱 (14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4-氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸。
进一步优选代谢标志物组合为：3β-脱氧胆酸、石胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、DL-2- 氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、顺式-4-羟基 -L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸。这些代谢物在结直肠癌患者体内发生显著变化，具体变化结果见表7：
表7结直肠癌患者VS健康人代谢物变化倍数
中文名称 差异倍数 P value
3β-脱氧胆酸 0.55 4.09E-04
石胆酸 0.62 8.77E-06
溶血磷脂酰胆碱(14:0) 0.65 2.04E-08
DL-2-氨基辛酸 0.73 2.33E-03
3β-猪去氧胆酸 0.79 6.85E-04
肌醇 0.82 7.64E-04
谷氨酸 1.48 7.78E-03
假尿苷 1.16 2.03E-02
丙酰左旋肉碱盐酸盐 0.85 9.78E-03
顺式-4-羟基-L-脯氨酸 0.80 3.23E-02
对称N,N-二甲基精氨酸 1.12 7.39E-03
S-腺苷同型半胱氨酸 1.17 3.77E-02
α-亚麻酸 1.28 1.66E-02
马尿酸 0.89 3.55E-02
这14个差异代谢物单个用于诊断区分结直肠癌患者和健康人的能力较强，并且各种代谢物组合用于诊断时，AUC进一步提高，其诊断结直肠癌患者的AUC为0.782～0.982。
实施例12：血浆靶向代谢组针对性诊断区分进展期腺瘤患者和非结直肠进展期肿瘤患者诊断模型构建
本实施例的样本来源于实施例3，进展期腺瘤患者100例。非结直肠进展期肿瘤患者 200例，包括100例健康人和100例非进展期腺瘤患者。代谢物检测和分析方法与实施例3相同，对以下29个代谢物进行定量检测，包括：3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4-氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸。
进一步优选代谢标志物溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、肌醇、4-氨基丁酸、L-焦谷氨酸、 S-腺苷同型半胱氨酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐。这些代谢物在进展期腺瘤患者体内发生显著变化，具体变化结果见表8：
表8进展期腺瘤患者VS非结直肠进展期肿瘤患者代谢物变化倍数
中文名称 差异倍数 P value
溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0) 0.80 6.37E-03
肌醇 0.88 2.79E-02
4-氨基丁酸 1.46 2.85E-03
L-焦谷氨酸 1.35 2.11E-04
S-腺苷同型半胱氨酸 1.11 6.42E-03
不对称二甲基精氨酸 1.06 9.24E-03
牛磺石胆酸-3-硫酸盐 0.81 2.79E-02
这7个差异代谢物单个用于诊断区分进展期腺瘤患者和非结直肠进展期肿瘤的能力较强，并且各种代谢物组合用于诊断时，AUC进一步提高，其诊断进展期腺瘤患者的 AUC为0.711～0.863。
实施例13：血浆靶向代谢组诊断区分进展期腺瘤患者和健康人诊断模型构建
进展期腺瘤患者100例，健康人100例。代谢物检测和分析方法与实施例3相同，对以下29个代谢物进行定量检测，包括：3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4-氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸。
进一步优选代谢标志物溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、12- 羟基二十碳四烯酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸。这些代谢物在进展期腺瘤患者体内发生显著变化，具体变化结果见表9：
表9进展期腺瘤患者VS健康人代谢物变化倍数
中文名称 差异倍数 P value
溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0) 0.78 9.58E-07
马尿酸 0.65 1.96E-02
甘氨酰-L-亮氨酸 0.95 2.19E-02
12-羟基二十碳四烯酸 0.75 1.24E-04
琥珀酸 1.54 1.71E-03
不对称二甲基精氨酸 1.07 6.06E-03
甘氨石胆酸 0.57 1.40E-02
γ-鼠胆酸 2.74 2.15E-02
这8个差异代谢物单个用于诊断区分进展期腺瘤患者和健康人的能力较强，并且各种代谢物组合用于诊断时，AUC进一步提高，其诊断进展期腺瘤患者的AUC为 0.755～0.884。
实施例14：血浆靶向代谢组诊断区分结直肠进展期肿瘤患者和非结直肠进展期肿瘤患者诊断模型构建
本实施例的样本来源于实施例3，结直肠进展期肿瘤组患者455例，包括100例进展期腺瘤患者和355例结直肠癌患者；非结直肠进展期肿瘤患者411例，包括331例健康人和100例非进展期腺瘤。代谢物检测和分析方法与实施例3相同，对以下29个代谢物进行定量检测，包括：3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4-氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、 12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸。
进一步优选代谢标志物：石胆酸、3β-猪去氧胆酸、肌醇、假尿苷、羟基癸酸、20- 羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、马尿酸、12-羟基二十碳四烯酸、鹅脱氧胆酸。这些代谢物在结直肠进展期肿瘤患者体内发生显著变化，具体变化结果见表10：
表10结直肠进展期肿瘤VS非结直肠进展期肿瘤患者代谢物变化倍数
Figure BDA0003569264410000201
Figure BDA0003569264410000211
这10个差异代谢物单个用于诊断区分结直肠进展期肿瘤患者和非结直肠进展期肿瘤患者的能力较强，并且各种代谢物组合用于诊断时，AUC进一步提高，其诊断结直肠疾病患者的AUC为0.722～0.857。
实施例15：血浆靶向代谢组诊断区分结直肠进展期肿瘤患者和健康人诊断模型构建
本实施例的样本来源于实施例3，结直肠进展期肿瘤患者455例，包括100例进展期腺瘤患者和355例结直肠癌患者；健康人100例。代谢物检测和分析方法与实施例3相同，对以下29个代谢物进行定量检测，包括：3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4-氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸。
进一步优选代谢标志物3β-脱氧胆酸、石胆酸、3β-猪去氧胆酸、肌醇、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、不对称二甲基精氨酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸。这些代谢物在结直肠癌患者体内发生显著变化，具体变化结果见表11：
表11结直肠进展期肿瘤患者VS健康人代谢物变化倍数
Figure BDA0003569264410000212
Figure BDA0003569264410000221
这12个差异代谢物单个用于诊断区分结直肠进展期肿瘤患者和健康人的能力较强，并且各种代谢物组合用于诊断时，AUC进一步提高，其诊断结直肠疾病患者的AUC为0.752～0.885。
实施例16：使用组织样本构建结直肠癌诊断模型
1研究对象
本研究在取得患者同意后，在相同条件下收集了30例结直肠癌患者肿瘤病灶区组织和30例癌旁正常组织当做健康对照。采集的组织样品先通过纱布蘸取表面的血液，随后迅速转移至液氮中短期保存，最后转移至-80℃冰箱中长期保存。
2样品预处理
(1)从-80℃冰箱中取出样品于冰上解冻至能切动的状态(后续操作都要求在冰上进行)，准备好称量组织样本需要用的刀片、镊子、钢珠、滤纸、酒精、水等；
(2)取出样本，用滤纸吸掉样本表面的血液，用手术刀切下一块样本，用镊子夹到去皮后的离心管中，称量50±2mg，记录每个样本的称量重量；
(3)向称量好的样本中加入一粒钢珠，在30HZ的条件下匀浆4次，每次30s，根据匀浆情况，可适当增加匀浆时间；
(4)向匀浆好的离心管中加入1mL 70％甲醇内标提取液；
(5)振荡5min，冰上静置15min；
(6)在4℃条件下，12000r/min离心10min；
(7)离心后吸取上清液400uL到对应的离心管中；
(8)静置于-20℃冰箱，过夜；
(9)在4℃条件下，12000r/min再离心3min；
(10)离心后取上清200μL按顺序转移入96孔板内，过完蛋白沉淀板封口用于 LC-MS/MS分析。
本实施例与实施例3的代谢物检测和分析方法相同，对以下29个代谢物进行定量检测，包括：3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4- 氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称 N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸。组织中单个代谢标志物用于结直肠癌诊断的结果见表12：
表12组织中单个代谢标志物用于结直肠癌诊断的AUC值
Figure BDA0003569264410000231
Figure BDA0003569264410000241
这29个差异代谢物单个用于诊断区分结直肠癌患者的能力较强；且各种代谢物组合用于诊断时，AUC进一步提高，其诊断结直肠癌患者的AUC值为0.781～0.999。
实施例17：使用粪便样本构建结直肠癌诊断模型
1研究对象
本研究在取得患者同意后，在相同条件下收集100例结直肠癌患者和100例健康对照粪便样本，-80℃冰箱中长期保存。
2样品预处理
(1)从-80℃冰箱中取出样品于冰上解冻至样本中没有冰块(后续操作都要求在冰上进行)；
(2)样本解冻后，称量样本50mg(±1mg)到2mL对应的离心管中，记录每个样本的称量重量；
(3)向离心管中加入500uL 70％甲醇内标提取液，涡旋3min混匀；(若样本仍是颗粒状，加入钢珠继续涡旋3min，冰水浴中超声10min，取出样本继续涡旋1min)；
(4)静置于-20℃冰箱30min；
(5)在4℃条件下，12000r/min离心10min；
(6)取250uL上清液于新的1.5mL EP管中；
(7)把上清液在4℃条件下，12000r/min离心5min；
(8)离心后取150μL上清液于对应进样瓶内衬管中，用于LC-MS/MS分析。
本实施例与实施例3的代谢物检测和分析方法相同，对以下29个代谢物进行定量检测，包括：3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4- 氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称 N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸。粪便中单个代谢标志物用于结直肠癌诊断的结果见表13：
表13粪便中单个代谢标志物用于结直肠癌诊断的AUC值
编号 中文名称 AUC 灵敏度 特异性
1 石胆酸 0.828 80.50％ 81.70％
2 3β-脱氧胆酸 0.817 79.30％ 80.60％
3 溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0) 0.810 78.30％ 80.00％
4 3β-猪去氧胆酸 0.803 77.60％ 79.40％
5 DL-2-氨基辛酸 0.798 77.30％ 79.10％
6 溶血磷脂酰胆碱(14:0) 0.796 77.00％ 78.80％
7 肌醇 0.791 76.70％ 78.30％
8 谷氨酸 0.785 75.70％ 77.60％
9 4-氨基丁酸 0.778 75.00％ 77.00％
10 丙酰左旋肉碱盐酸盐 0.771 74.50％ 76.30％
11 假尿苷 0.766 74.10％ 75.80％
12 羟基癸酸 0.761 73.50％ 75.30％
13 L-焦谷氨酸 0.753 72.90％ 74.80％
14 20-羧基花生四烯酸 0.745 72.70％ 74.30％
15 对称N,N-二甲基精氨酸 0.744 72.60％ 74.20％
16 顺式-4-羟基-L-脯氨酸 0.742 72.50％ 74.00％
17 S-腺苷同型半胱氨酸 0.741 72.30％ 73.80％
18 马尿酸 0.738 72.10％ 73.30％
19 α-亚麻酸 0.737 72.00％ 73.10％
20 甘氨酰-L-亮氨酸 0.735 71.80％ 72.90％
21 L-缬氨酸 0.733 71.50％ 72.50％
22 12-羟基二十碳四烯酸 0.732 71.20％ 72.30％
23 琥珀酸 0.729 71.00％ 71.90％
24 不对称二甲基精氨酸 0.727 70.90％ 71.50％
25 γ-鼠胆酸 0.726 70.70％ 71.30％
26 甘氨石胆酸 0.724 70.50％ 70.90％
27 牛磺石胆酸-3-硫酸盐 0.723 70.30％ 70.80％
28 鹅脱氧胆酸 0.720 70.20％ 70.80％
29 DL-Β-苯乳酸 0.718 70.10％ 70.70％
这29个差异代谢物单个用于诊断区分结直肠癌患者的能力较强；且各种代谢物组合用于诊断时，AUC进一步提高，其诊断结直肠癌的AUC值为0.741～0.991。
在实际应用中，可以按照本发明建模方法选取更多的样本进行建模，增加模型的准确度。
实施例18检测试剂盒
本实施例提供一种基于上述代谢标志物制备的检测试剂盒，该检测试剂盒包括如下成分：
代谢标志物的标准品：3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4-氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L- 脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸、甘氨酰-L- 亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸 -3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸，各标准品分别封装或标准品混合溶液封装。
血浆样本代谢物提取剂：100％纯甲醇和50％乙腈水溶液用于样品制备；50％乙腈水溶液可以用作溶解标准品的溶剂。
内标物：[2H3]-L-肉碱-d3盐酸盐，4-氟-L-2-苯基甘氨酸，L-苯基丙氨酸，[2H5]-马尿酸，[2H5]-犬尿酸，[2H5]-苯氧基乙酸。
当然，设计检测试剂盒时，并不需要完全包含上述29个标志物的标准品，可以仅使用其中几个，还可以使用其中几个或全部与其他标志物进行组合。这些标准品可以单独封装，也可以制成混合物封装。
采用本实施例提供的检测试剂盒，能够拥有诊断或监测结直肠癌。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物，其特征在于，选自3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4-氨基丁酸、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物至少选自3β-脱氧胆酸、溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、石胆酸、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物选自溶血磷脂酰胆碱(14:0)、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、4-氨基丁酸、羟基癸酸中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物选自20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物还选自甘氨酰-L-亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、琥珀酸中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物还选自牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物至少选自溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、丙酰左旋肉碱盐酸盐、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸、DL-Β-苯乳酸中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物至少选自3β-脱氧胆酸、石胆酸、溶血磷脂酰胆碱(14:0)、DL-2-氨基辛酸、3β-猪去氧胆酸、肌醇、谷氨酸、假尿苷、丙酰左旋肉碱盐酸盐、顺式-4-羟基-L-脯氨酸、对称N,N-二甲基精氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、α-亚麻酸、马尿酸中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物至少选自溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、肌醇、4-氨基丁酸、L-焦谷氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、不对称二甲基精氨酸、牛磺石胆酸-3-硫酸盐中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物至少选自溶血磷脂酰乙醇胺(P-18:0)、马尿酸、甘氨酰-L-亮氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、琥珀酸、不对称二甲基精氨酸、甘氨石胆酸、γ-鼠胆酸中的至少一种。
11.根据权利要求1所述的用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物至少选自石胆酸、3β-猪去氧胆酸、肌醇、假尿苷、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、马尿酸、12-羟基二十碳四烯酸、鹅脱氧胆酸中的至少一种。
12.根据权利要求1所述的用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物至少选自3β-脱氧胆酸、石胆酸、3β-猪去氧胆酸、肌醇、羟基癸酸、20-羧基花生四烯酸、L-焦谷氨酸、12-羟基二十碳四烯酸、L-缬氨酸、不对称二甲基精氨酸、DL-Β-苯乳酸、鹅脱氧胆酸中的至少一种。
13.权利要求1至12任一项所述的用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物在构建代谢物数据库以及制备结直肠进展期肿瘤诊断试剂产品中的应用。
14.一种试剂产品，其特征在于，包括权利要求1至12任一项所述的用于结直肠进展期肿瘤诊断或监测的代谢标志物的标准品。
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