CN114674969A - 尿液中生物标志物检测试剂在制备新冠肺炎诊断试剂盒中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及尿液中生物标志物检测试剂在制备新冠肺炎诊断试剂盒中的用途。本发明用尿液作为生物样本，极大地方便了检测样本的采集，降低了新冠病毒的传染风险；由于尿液的采集是非侵入性的，这也极大的提高了待检者的顺应性；由于检测的尿液指标少，还显著降低了检测费用，缩短了检测所需时间，更加方便医疗机构开展，同时检测尿液指标少，但检测准确度与传统方法相当。从而能够较好地满足临床对于无创新冠肺炎检查的迫切需求。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及尿液中生物标志物检测试剂在制备新冠肺炎诊断试剂盒中的用途。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，简称“新冠肺炎”，世界卫生组织命名为“2019冠状病毒病”，新型冠状病毒肺炎以发热、干咳、乏力等为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。值得注意的是重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。轻型患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现。从目前收治的病例情况看，多数患者预后良好，少数患者病情危重。老年人和有慢性基础疾病者预后较差。儿童病例症状相对较轻。
目前确诊新型冠状肺炎的标准是核酸检测阳性，一般通过咽拭子的检测来诊断，有一部分人群咽拭子检测是阴性，或者是多次阴性，但是临床考虑新冠肺炎的可能性大，在检测4-5次以后也会发现是阳性的诊断结果，或者是通过支气管镜取深部的痰，得到核酸检测阳性。可见，目前的新冠肺炎病毒核酸检测由于取样的不规范性，容易出现假阴性和假阳性，同时采样人员受传染风险高，且对受试者实施侵入性操作易导致其身体不适。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的诊断新冠肺炎的生物标志物，以及该标志物的检测试剂在制备新冠肺炎诊断试剂盒和/或新冠肺炎诊断装置中的用途。
本发明的技术方案包括：
一种尿液中生物标志物检测试剂在制备诊断新冠肺炎试剂盒和/或新冠肺炎诊断装置中的用途，其特征在于：所述生物标志物为氧代戊二酸、吲哚酚和/或2-苯基乙酰胺。
进一步地，所述尿液中生物标志物检测试剂为液相色谱-质谱分析试验用试剂。
更进一步地，所述尿液中生物标志物检测试剂为高效液相色谱-飞行时间质谱分析试验用试剂。
本发明还提供了一种诊断新冠肺炎试剂盒，它包括用于检测尿液中生物标志物的试剂；所述生物标志物为氧代戊二酸、吲哚酚和/或2-苯基乙酰胺。
进一步地，所述检测尿液中生物标志物的试剂为液相色谱-质谱分析试验用试剂。
更进一步地，所述检测尿液中生物标志物的试剂为高效液相色谱-飞行时间质谱分析试验用试剂。
本发明还提供了一种用于诊断新冠肺炎的装置，所述装置包括：
1)检测装置；所述检测装置内置检测尿液中如下生物标志物的试剂：氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺；
2)分析装置；
所述分析装置内置数据输入端口，用于接收前述检测装置的检测结果；
所述分析装置内置机器学习算法，可基于已知新冠肺炎和非新冠肺炎群体尿液的氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺的检测结果，得到区分新冠肺炎和非新冠肺炎的二分类模型；
所述分析装置还能将待检者尿液的氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺的检测结果代入前述二分类模型，计算与已知新冠肺炎和非新冠肺炎群体尿液的氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺检测结果的相似度分数，得出新冠肺炎或非新冠肺炎的诊断结果。
进一步地，所述检测装置为高效液相色谱-飞行时间质谱仪。
进一步地，所述检测结果为生物标志物的丰度值。
进一步地，所述机器学习算法为随机森林算法。
本发明最后提供了一种前述的装置在制备诊断新冠肺炎的仪器中的用途。
相对现有技术的咽拭子核酸检测，本发明用尿液作为生物样本，极大地方便了检测样本的采集，降低了新冠病毒的传染风险；由于尿液的采集是非侵入性的，这也极大的提高了待检者的顺应性；由于检测的尿液指标少，还显著降低了检测费用，缩短了检测所需时间，更加方便医疗机构开展，同时检测尿液指标少，但检测准确度与传统方法相当。从而能够较好地满足临床对于无创新冠肺炎检查的迫切需求。
本发明的关键在于对待检测尿液生物标志物集合，不在于检测生物标志物的具体技术手段，因为具体检测生物标志物的技术手段都是本领域常规手段。检测尿液中氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺这3个生物标志物的试剂，在用于制备诊断新冠肺炎试剂盒的用途，无论具体试剂是什么，均在本发明的保护范围内。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1尿液代谢标志物鉴别COVID-19患者与健康人群(HC)的潜力[(a)PCA分析显示COVID-19患者(红点)和HC(蓝点)之间的总体代谢组学特征存在显著差异；(b)使用cut-off值(如果p<0.05和VIP>1.0，则认为结果具有统计学意义)确定了COVID-19患者和HC的39种差异代谢物；(c)尿液代谢标志物组与其他标志物(T细胞组和细胞因子组)的ROC曲线；(d)评估诊断模型性能的混淆矩阵；(e)使用随机森林分类器，尿液代谢物模型显示出优异的识别诊断性能，低误诊率(12.75％)和漏诊率(0.81％)，高约登指数(YI：0.82))，注释：假如A是患者被诊断为阳性的例数，即真阳性；B是非患者被诊断为阳性的例数，即假阳性；C是患者被诊断为阴性的例数，即假阴性；D是非患者被诊断为阴性的例数，即真阴性。误诊率(％)＝B/(B+D)×100％，漏诊率(％)＝C/(A+C)×100％，约登指数＝A/(A+C)+D/(B+D)－1]。
具体实施方式
实施例1本发明用于诊断新冠肺炎的装置
1)检测装置；所述检测装置包括高效液相色谱-飞行时间质谱仪；检测装置内置检测尿液中如下生物标志物的试剂：氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺；
2)分析装置；
所述分析装置内置数据输入端口，用于接收前述检测装置的检测结果，即生物标志物的丰度值；
所述分析装置内置随机森林算法，可基于已知新冠肺炎和非新冠肺炎群体尿液的氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺的检测结果，得到区分新冠肺炎和非新冠肺炎的二分类模型；
所述分析装置还能将待检者尿液的氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺的检测结果代入前述二分类模型，计算与已知新冠肺炎患者和非新冠肺炎群体尿液的氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺检测结果的相似度分数，得出新冠肺炎患者或非新冠肺炎患者的判断结果；
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果
试验例1尿液中生物标志物氧代戊二酸(oxoglutaric acid)、吲哚酚(indoxyl)和/或2-苯基乙酰胺(phenylacetamide)与新冠肺炎的关系
一、临床资料
本发明共纳入SARS-COV-2感染患者248例，其中非重症患者(包括轻、中度患者)161例，无症状患者60例，重症患者(包括重症和危重型患者)27例。健康组(HC)为102例的健康个体，其中女性40例，男性62例，中位年龄41.0岁。HC组与COVID-19组无人口学差异(性别:P＝0.125，卡方检验；年龄：P＝0.952，t检验)。收集重庆市公共卫生医疗中心248例新冠肺炎患者的横断面尿液样本。
二、用于代谢组学的尿液样本制备
所有COVID-19患者和HC的尿样RT-PCR均为阴性。尿液样本56℃灭活灭菌30min，并进行一些修饰前处理。150微升的尿液样本、450微升甲醇-氯仿混合物溶液(甲醇和氯仿的体积比是1：2)和10微升的内参溶液(0.3毫克/毫升2-cl-phe，甲醇作为溶剂)混匀，放置在-20℃2h，收集150微升上清液，用于UPLC-Q-TOF/MS检测，-80℃保存，待分析。取每个代谢产物样品(10微升)的等份上清汇集在一起作为质量控制样品(QC)。
三、高效液相色谱/飞行时间质谱分析(UPLC-Q-TOF/MS)
代谢产物样品采用UPLC-Q-TOF/MS分析，采用Waters I-Class Acquity UPLC(Waters,UK)+Vion IMS QToF(Waters，UK)，BEH酰胺柱(100mm×2.1mm,1.7μm)(Waters,UK)进行HILIC分离。流动相A为10mM甲酸铵水溶液，流动相B为乙腈与10mM甲酸铵水溶液(乙腈与水的体积比为95：5)。在以下条件下，梯度洗脱分离代谢产物：0.0min，92％B；0.5min，92％B；5.0min，80％B；9.0min，70％B；10.0min，50％B；11.0min，20％B；12.0min，20％B；12.5分钟，92％B；15.0min，92％B；流速0.4mL/min。柱内注射2μl，柱温保持在45℃。加热电喷雾电离质谱(HESI)在正负两种模式下工作。
仪器参数如下：加热器温度350℃；护套气流量，50arb；辅助气体流量，15arb；喷雾电压，3.2KV(正模式)和2.8KV(负模式)；毛细管temp，320℃；S-Lens射频，50％；MS1扫描范围，67-1000。全扫描分辨率，70000；MS/MS的分辨率，17500。
四、代谢组学分析
通过代谢组学处理软件Progenesis QI(Waters Corporation)进行基线过滤、峰识别、整合、保留时间校正、峰对齐和归一化，利用原始数据获得保留时间、质量-电荷比和峰强度的数据矩阵。准确识别的分子通过KEGG代谢途径数据库进一步注释。生物功能分析采用在线软件MetaboAnalyst 5.0。利用在线数据库IPA Version 13.0提供代谢物的疾病相关信息。
将归一化代谢产物数据矩阵导入SIMCA-P+14.0软件包(Umea,Umea,Sweden)进行无监督主成分分析(non-supervised principal components analysis,PCA)，观察样本的总体分布和分析过程的稳定性。然后，使用监督(正交)偏最小二乘法PLS-DA来区分总体代谢谱的差异，并识别组间的代谢产物差异。在预测变量重要度(VIP)得分大于1的变量被认为是差异变量。为防止模型过拟合，采用7个交互验证周期和200个响应排序试验对模型的质量进行了研究。
采用UPLC-Q-TOF/MS对102例健康人群(HCs)和248例COVID-19患者的尿液样本分析，识别出775种代谢物与SARS-CoV-2感染相关，进一步采用PCA等多元统计方法评估整体代谢组学特征发现，COVID-19患者与HC两组队列之间存在显著差异尿液代谢物，共鉴别出39种差异代谢物(图1a～1b)。
五、尿液代谢标志物组的建立
使用一个随机森林分类器(Python的scikit-learn包)来识别具有潜在预测价值的代谢物，生成分类模型，并评估预测器面板的性能。获得受试者工作特征(receiveroperating characteristic,ROC)曲线(MedCalc V19)用于显示所构建的模型，然后用曲线下面积(area under The curve,AUC)表示ROC效应。此外，通过误诊率、漏诊率和约登指数(YI)来评估COVID-19患者中存在的潜在生物标志物的筛查效果。所有筛选模型采用五倍交叉验证作为内部验证。为了调整合并症(高血压和糖尿病)的影响，我们进行了额外的统计，排除了高血压或糖尿病患者。当代谢物在无合并症患者和HC之间的比较变得不显著时，将其排除。
通过随机森林分类器，使用并量化了39种差异尿液代谢物对COVID-19感染的临床诊断筛查能力。经过反复优化，确定了仅包含3种尿液微生物源代谢物(氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺)的二分类模型，它可以有效地识别和区分COVID-19与HC(AUC＝0.963，95％CI，0.930-0.983，准确度＝0.957，图1c)。此外，计算了混淆矩阵和评估每个模型的参数。该诊断模型的特点是诊断性能出色(误诊率：12.75％，漏诊率：0.81％，约登指数(YI)：0.82图1d-e)。
七、模型准确性验证
从248例COVID-19阳性患者和102例正常人群的尿液中，随机挑选70人的尿液，挑选5次，采用高效液相色谱/飞行时间质谱分析检测尿液中的氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺三种代谢物。将尿液中三种代谢物的丰度值输入二分类模型中，分别输出检测准确率。模型计算样品丰度值与数据库中新冠肺炎的相似度分数，并根据相似度分数与0.5的大小关系判断是否为新冠肺炎。即相似度分数结果大于0.5，则为新冠肺炎患者；小于0.5，则为健康人。
5次诊断的内验证准确性(准确性是指该代谢物组合诊断模型的分析测定值与其“真值”之间的一致性，此处用五折交叉计算的平均准确度，即抽样计算5次，每次用Pythonscikit-learn计算出预测准确度，共计算5次后求平均值)分别为：0.84507042、0.78873239、0.77142857、0.82608696、0.72463768；平均准确性为0.7911912052022279。从结果可见，基于氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺三种代谢物的二分类模型，可有效的鉴别COVID-19患者与健康人群。
综上，本发明用尿液作为生物样本，极大地方便了检测样本的采集，降低了SARS-CoV-2的传播风险；由于尿液的采集是非侵入性操作，这也极大的提高了待检者的顺应性；由于检测的尿液指标少，还显著降低了检测费用，缩短了检测所需时间，更加方便医疗机构开展；同时检测尿液指标少，可联合检测分析，同时检测准确度与传统方法相当，更易实现高通量筛查新冠肺炎病毒感染者，能够较全面地满足临床对于无创新冠肺炎检查的迫切需求。
Claims (10)
1.尿液中生物标志物检测试剂在制备新冠肺炎诊断试剂盒和/或新冠肺炎诊断装置中的用途，其特征在于：所述生物标志物为氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述尿液中生物标志物检测试剂为液相色谱-质谱分析试验用试剂。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述尿液中生物标志物检测试剂为高效液相色谱-飞行时间质谱分析试验用试剂。
4.一种诊断新冠肺炎试剂盒，其特征在于，它包括用于检测尿液中生物标志物的试剂；所述生物标志物为氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测尿液中生物标志物的试剂为液相色谱-质谱分析试验用试剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述检测尿液中生物标志物的试剂为高效液相色谱-飞行时间质谱分析试验用试剂。
7.一种用于诊断新冠肺炎的装置，其特征在于：所述装置包括：
1)检测装置；所述检测装置内置检测尿液中如下生物标志物的试剂：氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺；
2)分析装置；
所述分析装置内置数据输入端口，用于接收前述检测装置的检测结果；
所述分析装置内置机器学习算法，可基于已知新冠肺炎和非新冠肺炎群体尿液的氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺的检测结果，得到区分新冠肺炎和非新冠肺炎的二分类模型；
所述分析装置还能将待检者尿液的氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺的检测结果代入前述二分类模型，计算与已知新冠肺炎和非新冠肺炎群体尿液的氧代戊二酸、吲哚酚和2-苯基乙酰胺检测结果的相似度分数，得出新冠肺炎或非新冠肺炎的诊断结果。
8.如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述检测装置包括高效液相色谱-飞行时间质谱仪。
9.如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述检测结果为生物标志物的丰度值；所述机器学习算法为随机森林算法。
10.权利要求7～9任一项所述的装置在制备诊断新冠肺炎的仪器中的用途。
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