CN103153946A - 外周限制性 faah 抑制剂 - Google Patents

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Abstract

提供了脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)的外周限制性抑制剂。该化合物能抑制FAAH活性并且增加在中枢神经系统(CNS)外的花生四烯乙醇胺水平。尽管它们相对不能进入脑和脊髓，但该化合物减弱在炎症和外周神经损伤的啮齿动物模型中表示持续性疼痛的行为反应，并且抑制了在伤害性处理过程中所涉及的脊髓区域中的有害刺激诱发的神经元激活。CB1受体阻断剂阻止了这些作用。因此，本发明还提供了用于治疗疾病状态的方法和药物组合物，其中外周FAAH的抑制是有益的。本发明的化合物为通式(I)化合物及其药物可接受的盐，其中R1为极性基团。在一些实施方案中，R1选自羟基及其生理上可水解的酯。R2和R3独立地选自氢以及取代或未取代的烃基；每一R4独立地选自卤素以及取代或未取代的烃基，并且n为0至4的整数；每一R5独立地选自卤素以及取代或未取代的烃基，并且m为0至3的整数；以及R6为取代或未取代的环己基。

Description

外周限制性 FAAH 抑制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2010年7月28日提交的第61/367,709号美国临时申请的优先权，其内容通过参考的形式整体并入本文以用于各种目的。
关于在联邦政府赞助的研究与开发下做出的关于发明权利的声明
本发明是在国立卫生研究院给予的第DA0l2413号、第DA0l2447号和第AA0l7538号基金下通过政府支持而做出的。美国政府拥有本发明的某些权利。
关于光盘上提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附件
不涉及
发明背景
外周大麻素受体对疼痛的发生发挥强大的抑制性控制，然而，通常从事这种内在的镇痛机制的内源性大麻素信号并不为人们所知。为了解决这个问题，我们开发了脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)的外周限制性抑制剂，该酶负责内源性大麻素类物质花生四烯乙醇胺的降解。称作URB937的化合物抑制FAAH活性并且增加中枢神经系统(CNS)外的花生四烯乙醇胺水平。尽管它不能进入脑和脊髓，但是在炎症和外周神经损伤的啮齿动物模型中，URB937减弱了表示持续性疼痛的行为反应，并且抑制在伤害性处理过程中所涉及的脊髓区域中的有害刺激诱发的神经元激活。CB1受体阻断剂阻止这些作用。结果表明，在外周CB1受体的花生四烯乙醇胺-介导的信号传导控制疼痛信息传递至CNS。加强这种闸门机制的脑-不渗透性FAAH抑制剂为疼痛治疗提供了新方法。
花生四烯乙醇胺，是天然产生的花生四烯酸与乙醇胺的酰胺化合物，其满足内源性大麻素类物质的所有关键条件(Devane,W.A等Science,258,1946-1949(1992)):它根据受刺激的神经元的需要而释放(Di Marzo,V.等,Nature,372,686-691(1994);Giuffrida,A.等,Nat.Neurosci.,2,358-363(1999));它以高亲和性激活大麻素受体(Devane,W.A.等.Science,258,1946-1949(1992))并且它通过由载体-介导的转运以及随后的细胞内水解组成的两步处理法而被迅速地消除(DiMarzo,V.et al.,Nature,372,686-691(1994);Beltramo,M.等,FEBSLett.,403,263-267(1997))。花生四烯乙醇胺的水解由酶脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)催化，FAAH是膜结合的丝氨酸水解酶(Cravatt,B.F.等,Nature,384,83-87(1996);Patricelli,M.P.等,Biochemistry,38,9804-9812(1999))(WO98/20119)(美国专利第6,271,015号)，它也裂解其它的生物活性的脂肪乙醇酰胺类，例如油酰基乙醇酰胺(顺式-9-十八碳烯酰胺))(Rodríguez de Fonseca,F.等Nature,414,209-212(2001))和棕榈酰乙醇酰胺(Calignano,A.等,Nature,394,277-281(1998))。缺失编码FAAH基因的突变型小鼠不能代谢花生四烯乙醇胺(Cravatt,B.F.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98,9371-9376(2001))。而且，虽然能生育并且通常是正常的，但是显示了在大麻素受体的增强的花生四烯乙醇胺活性的信号，比如减轻的痛觉(Cravatt,B.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98,9371-9376(2001))。这表明极有可能靶向FAAH的药物可提高花生四烯乙醇胺的补益作用，同时可避免由Δ9-THC和其它直接作用的大麻素激动剂产生的多重的、通常不需要的作用(Hall,W.,等,Lancet,352,1611-1616(1998);Chaperon,F.,等,Crit.Rev.Neurobiol.,13,243-281(1999))。
痛知觉可由CNS内运作的神经递质有效地控制。在脊髓的背角中已经很好地表征了这种调节，其中由伤害性(疼痛-感知)纤维运载的脉冲在它们传递到脑之前就已被处理。除了这些中枢机制外，疼痛传递的内在控制还可以在CNS外的传入神经纤维的末端发生。内源性阿片类物质提供了外周调节的一个著名实例，其在炎症期间由激活的免疫细胞释放并且通过与位于感觉神经末梢的阿片受体相互作用来抑制疼痛发生1,2。
已经提议，内源性大麻素介体可能发挥类似于阿片类物质的作用，因为外周CB1和CB2大麻素受体的药物激活抑制与疼痛相关的行为3-7而在初级伤害性神经元中的CB1受体表达的基因破坏加剧了这种行为8。此外，有证据说明，与神经性疼痛或炎症相关的临床疾病状态，如复杂性局部疼痛综合征和关节炎，可伴随有内源性大麻素类物质花生四烯乙醇胺水平的外周提高9,10。另一重要的内源性大麻素配体，2-花生四烯酸甘油(2-AG)，也参与了在CNS外的伤害性信号传导8,11。
许多关注已经涉及花生四烯乙醇胺在疼痛中的作用。美国专利申请公开第20020173550号公开了通过给予花生四烯乙醇胺和棕榈酰乙醇酰胺来治疗疼痛的方法。美国专利申请公开第20040127518号和第20030134894号公开了通过给予FAAH的抑制剂来治疗疼痛的方法。美国专利申请公开第20030149082号公开了通过给予花生四烯乙醇胺转运的抑制剂来治疗疼痛的方法。
尽管这些发现表明内源性大麻素类物质系统在伤害感受的外周调节中发挥重要功能，但它们对该功能中涉及的内源性配体或配体的特性没有提供明确的洞悉。但是，填充这个缺口是获得控制疼痛发生的内在机制的分子水平上的认识和发现新的没有中枢副作用的镇痛剂所必需的。在本研究中，我们鉴定和表征了花生四烯乙醇胺-降解酶FAAH的脑-不渗透性抑制剂，从而放大外周的花生四烯乙醇胺的作用并揭露它们在控制出现的疼痛信号中的作用12。在FAAH抑制剂的开发和治疗用途中，特别关注它们在CNS系统内调节内源性大麻素类物质系统并且引起不需要的改变精神或情绪作用的能力。
本发明通过提供外周限制性FAAH抑制剂而解决了这些和其它方面的需要，并且提供了其在治疗包括疼痛和/或炎症在内的各种疾病状态中的使用方法。
发明概述
在第一方面，本发明提供具有下列通式的化合物及其药物可接受的盐以及所述化合物的药物组合物：
Figure BDA00002959996100041
其中R1选自羟基及其生理上可水解的酯、-SH、-O-羧酰胺(-O-carboxamido)、-OC(O)R7、-O-CO-NR8R9和-NR8R9，其中R7是取代或未取代的烃基并且R8和R9独立地选自氢和(C1-C3)烷基；R2和R3独立地选自氢和烃基；每个R4独立地选自卤素和烃基并且n是0-4的整数；每个R5独立地选自卤素和烃基并且m是0-3的整数；而且R6是取代或未取代的环己基。在优选的实施方案中，化合物在接受者内的分布是外周限制性的。
在第二方面，本发明提供包含治疗有效量的本发明的化合物的药物组合物。所述组合物可被配制用于包括口服和肠胃外途径在内的任一给药途径。此外，所述组合物可以是单位剂量形式。
在第三方面，本发明提供了治疗需要外周限制性FAAH抑制剂的个体的方法(例如，本发明的FAAH抑制性化合物)。在优选的实施方案中，该个体是人。在一些实施方案中，这种需要涉及治疗个体的疼痛、炎症或免疫性病症的治疗。在一些实施方案中，疼痛可以是伤害性疼痛、炎性疼痛或神经性疼痛。优选地，外周限制性FAAH抑制性化合物是本发明的化合物。
在第四方面，本发明提供了通过给予本发明的化合物，在个体中增强内源性产生的(即，内源性大麻素类物质，如花生四烯乙醇胺、N-花生四烯酰多巴胺)或外源性提供的大麻素脂肪酸酰胺的外周活性的方法。优选地，脂肪酸酰胺是花生四烯乙醇胺、N-花生四烯酰多巴胺、油酰基乙醇酰胺、硬脂酰乙醇酰胺或棕榈酰乙醇酰胺。其中脂肪乙醇酰胺是外源性提供的，脂肪酸乙醇酰胺可在给予本发明的化合物之前、之后或同时给予个体。在一些实施方案中，所述个体需要对疼痛、炎症或免疫性病症的治疗。在优选的实施方案中，疼痛可以是伤害性疼痛、炎性疼痛或神经性疼痛。
在第五方面，本发明提供了根据其通过乳腺癌耐药性蛋白(BCRP)转运系统而从脑中排出的能力筛选化合物的方法。类似于URB937的骨架(scaffold)和本发明的化合物可用作BCRP的底物。因此，在一些实施方案中，根据其在体外通过BCRP转运系统进行转运的能力，本发明提供了分析URB937类似物和/或本发明的化合物的方法。
附图简述
图1URB937是外周限制性FAAH抑制剂。(a)在给予瑞士小鼠不同剂量的URB937(0.03-100mg-kg-1,s.c.)后1h，在肝中(黑色的圆形)和脑中(黑色的正方形)FAAH的活性。(b)对小鼠单次注射(1mg-kg-1,i.p.)之后URB937在肝中的分布(黑色的圆形)、脑中(黑色的正方形)和血清中(插图)的分布。(c)给予URB937(1mg-kg-1,i.p)之后，在肝中(黑色圆形)和脑中(黑色的正方形)FAAH活性抑制的时间进程。(d)URB937(1mg-kg-1,i.p.,黑色柱形)或介质(白色柱形)对瑞士小鼠的肝、前脑和下丘脑中的花生四烯乙醇胺和棕榈酰乙醇酰胺(PEA)水平的影响。(e)URB937对野生型C57Bl/6小鼠(+/+)和FAAH-缺失型小鼠(-/-)的肝中的花生四烯乙醇胺和PEA水平的影响。(f)URB937(1mg-kg-1,i.p.,黑色柱形)的缺乏对瑞士小鼠的2-花生四烯酰甘油(2-AG)水平的影响。结果表示为平均值±sem;n=3;*P<0.05;***P<0.001vs介质。
图2在小鼠和大鼠中URB937抑制对有害化学物质的行为反应。(a-d)小鼠中乙酸(HAc)-诱导的疼痛行为。(a)在给予介质(V)、URB937(URB,1mg-kg-1,i.p.)或吲哚美辛(IDM,1mg-kg-1,i.p.)之后1h评估的疼痛行为(翻滚发作的次数)。还阐明在没有乙酸的情况下给予的介质和URB937的作用。(b)抗伤害感受和由URB937(1mg-kg-1,i.p.)引起的肝FAAH活性抑制之间的统计相关性。(c)在野生型C57Bl/6小鼠(+/+)和FAAH-缺失型小鼠(-/-)中，URB937(1mg-kg-1,i.p.)对乙酸诱导的翻滚的作用。(d)CB1拮抗剂利莫那班(Rim,1mg-kg-1,s.c.)，而非CB2拮抗剂AM630(1mg-kg-1,s.c.)，阻止URB937的抗伤害感受作用。结果表示为平均值±s.e.m.;n=5-17.*P<0.05vs介质;**P<0.01vs介质；和***P<0.001vs介质;##P<0.01vs URB937;###P<0.001vsURB937。(e-g)在大鼠中福尔马林诱导的疼痛行为。(e)相对于介质、利莫那班(2mg-kg-1,i.p.)或URB937和利莫那班的组合，URB937(1mg-kg-1,i.p.)在综合性疼痛评分方面产生的时间依赖性变化(F14,22=1.86,P=0.039)。在时间=0时注射福尔马林。(f)在全部的福尔马林应答过程中，URB937(1mg-kg-1,i.p.)减少在疼痛行为曲线下的面积(AUC)(F3,22=3.32,P=0.039)。(g)URB937的抗伤害感受作用局限于福尔马林应答的阶段2(10-60min;F1,3=3.05,P=0.050)，而阶段1(0-10min)期间的疼痛行为没有确实地改变(F1,3=2.22,P=0.115)。结果表示为平均值±s.e.m.;n=5-7.*P<0.05,所有的组vsURB937;#P<0.05,URB937或URB937+利莫那班vs介质。
图3URB937抑制在大鼠腰椎(L4)脊髓中福尔马林诱导的Fos蛋白表达。(a-c)代表性切片显示在注射(a)介质、(b)URB937(1mg-kg-1,i.p.)或(c)URB937+利莫那班(2mg-kg-1,i.p.)后，腰椎片段中福尔马林诱导的Fos-阳性细胞。刻度条，1mm。(d)在脊髓背角浅层(薄层I,II)、后角固有核(薄层III,IV)、背角的颈部区域(薄层V,VI)和腹角中，介质(白色柱形)、URB937(黑色柱形)、利莫那班和URB937+利莫那班对Fos-阳性细胞数目的作用的定量分析。来自相同个体的行为数据显示在图2中。结果表示为平均值±s.e.m.;n=5-7.*P<0.05,所有的组vsURB937;#P<0.05,URB937+利莫那班或单独的利莫那班vs URB937;&P<0.05,介质,利莫那班vsURB937。
图4URB937减弱小鼠的外周炎症引起的疼痛行为。单独给药或与利莫那班(R,1mg-kg-1,i.p.)或AM630(AM,1mg-kg-1,i.p.)联合给药的URB937(1mg-kg-1,i.p.)对(a)角叉菜胶诱导的机械性痛觉过敏；(b)热性痛觉过敏；(c)机械性痛觉超敏；和(d)足肿胀的作用。在角叉菜胶注射(0h)之前或注射后4h和24h立即测定机械性痛觉过敏和热性痛觉过敏。机械性痛觉超敏在注射角叉菜胶之后0h和24h后测定。结果表示为平均值±s.e.m.;n=6。*P<0.05vs介质;**P<0.01vs介质;***P<0.001vs介质;#P<0.05vsURB937;###P<0.01vsURB937。
图5URB937抑制小鼠的外周神经损伤引起的疼痛行为。(a-c)单次给予介质(阴影柱形)或URB937(黑色柱形；1mg-kg-1，i.p.)对(a)机械性痛觉过敏、(b)热性痛觉过敏和(c)坐骨神经结扎诱导的机械性痛觉超敏的作用。(d-f)重复的URB937注射(1mg-kg-1，i.p，每天一次连续4天)对(d)机械性痛觉过敏、(e)热性痛觉过敏和(f)机械性痛觉超敏的作用。BL，基线(结扎前测定)；IL，身体同侧的(结扎的)爪；CL，身体对侧的(未结扎的)爪。结果表示为平均值±s.e.m.;n=6.***P<0.001vs基线；#P<0.05vs介质；##P<0.01vs介质；###P<0.001vs介质。
图6URB937(1mg-kg-1，i.p.)对瑞士小鼠组织中的花生四烯乙醇胺和棕榈酰乙醇酰胺(PEA)水平的作用。白色柱形，介质；黑色柱形，URB937。结果表示为平均值±s.e.m.,n=4-6.*,P<0.05,**,P<0.01,***,P<0.001vs介质;
图7足底内注射角叉菜胶不影响瑞士小鼠在身体对侧的(未注射)爪的机械性痛觉过敏(a)和热性痛觉过敏(b)或机械性触觉痛(c)。利莫那班(R,1mg-kg-1,i.p.)和AM630(1mg-kg-1,i.p.)无作用。结果表示为平均值±s.e.m.,
发明详述
外周大麻素受体对疼痛的发生发挥强大的抑制性控制，然而，通常从事这种内在的镇痛机制的内源性大麻素信号并不为人们所知。我们开发了脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)的新颖的外周限制性抑制剂，该酶负责内源性大麻素类物质花生四烯乙醇胺的降解。称作URB937的化合物抑制FAAH活性并且增加中枢神经系统(CNS)外的花生四烯乙醇胺水平。尽管出乎意料地相对不能(该化合物也出乎意料地易受由转运系统介导的从脑中排出的影响)进入脑和脊髓，但是在炎症和外周神经损伤的啮齿动物模型中，URB937减弱了表示持续性疼痛的行为反应，并且抑制了在伤害性处理过程中所涉及的脊髓区域中的有害刺激诱发的神经元激活。CB1受体阻断剂阻止这些作用。结果表明，在外周CB1受体的花生四烯乙醇胺-介导的信号传导控制疼痛信息传递至CNS。加强这种闸门机制的相对脑-不渗透性FAAH抑制剂为疼痛治疗提供了新方法。
痛知觉可由CNS内运作的神经递质有效地控制。在脊髓的背角中已经很好地表征了这种调节，其中由伤害性(疼痛-感知)纤维运载的脉冲在它们传递到脑之前就已被处理。除了这些中枢机制外，疼痛传递的内在控制还可以在CNS外的传入神经纤维的末端发生。内源性阿片类物质提供了外周调节的一个著名实例，其在炎症期间由激活的免疫细胞释放并且通过与位于感觉神经末梢的阿片受体相互作用来抑制疼痛发生1,2。
化合物URB937是潜在的FAAH抑制剂，其不容易进入CNS并且因此仅在外周组织中主要地中断花生四烯乙醇胺失活作用。尽管这种受限的作用范围，URB937在被CB1大麻素受体阻断剂阻止的急性和持续性疼痛的啮齿动物模型中引起显著的抗伤害感受作用。这些发现表明，外周FAAH活性的抑制放大了调节所出现的伤害感受性输入传递到脊髓和脑的内源性镇痛机制。该机制有可能通过花生四烯乙醇胺或另外的内源性脂肪酸酰胺大麻素来介导。
不受理论束缚，认为外周的花生四烯乙醇胺信号传导起调节疼痛刺激的强度的弥漫性旁分泌系统的作用，因为它们出现在受损的组织中。两种证据支持这个观点。第一，由炎症和神经损伤产生的信号能引发花生四烯乙醇胺的局部释放。例如，TRPV-1通道的膜去极化和激活各自刺激感觉神经元的培养物中花生四烯乙醇胺的产生25，而前-炎性受体Toll-样受体4的激活在巨噬细胞中引起类似的作用26。在脊髓神经损伤和炎症的动物模型中8,11以及在诸如复杂性局部疼痛综合征9和关节炎10的疼痛性人类疾病状态中证明了这些信号和可能的仍需鉴定的其它信号可能有助于外周花生四烯乙醇胺的升高。第二，虽然在脑中特别丰富，但是CB1受体广泛地分布在哺乳动物组织和器官中。特别地，它们在大型的初级感觉神经元中表达并且被转运到外周神经末梢27,28，在那里它们既是维持正常的痛阈所必需的8又足以发挥显著的抗伤害感受作用3,6。在疼痛-感知末端上的CB1受体可介导局部产生的花生四烯乙醇胺的镇痛作用，并且也可通过其对兴奋性神经肽的释放的抑制性影响而参与这种脂质介体的抗炎活性29。尽管如此，合乎情理的是，假定其它的大麻素受体和大麻素样受体也直接或间接地有助于花生四烯乙醇胺响应损伤的信号传导。两个可能的候选者是CB2受体，其能被或者花生四烯乙醇胺或者2-AG激活30，以及α型-过氧化物酶体增殖物激活受体，其被PEA和其它的脂质-衍生的介体激活7,20,21。这些受体和它们的内源性配体存在于外周感觉神经元和免疫细胞中，而且已参与伤害感受和炎症的调节中21,31,32。
FAAH在非-神经元细胞中被选择性去除但在外周和中枢神经元中保留的突变型小鼠展现显著的表型，其中正常的伤害感受性传递伴随着对促炎性引发物的减少的应答性33。该发现与本发明的结果相一致，其可能的解释是，在外周伤害性感受器处的花生四烯乙醇胺的信号传导活性受定位于它们自身的伤害性感受器处的FAAH调节，而不是受定位于相邻的非神经细胞处的FAAH调节。这与观察结果相一致，外周轴索显微外科术诱导在大型的感觉神经元中FAAH表达，预期存在能扩展FAAH与CB1受体的共区域化的应答34。
阿片受体的直接作用的激动剂在动物和人实验性疼痛模型中发挥明显的镇痛作用2,35。我们的结果表明，通过参与维持伤害感受性内平衡的基于花生四烯乙醇胺的机制活性的放大也可能实现显著的镇痛。这些发现提供了内在控制疼痛的新洞察，并且可被治疗上利用来开发在很大程度上没有中枢副作用的有效镇痛剂。
定义
这里应注意，除非上下文清楚地表明，否则本说明书和所附的权利要求书中所使用的单数形式“a”、“an”和“所述(the)”均包括复数。
“FAAH”表示哺乳动物的脂肪酸酰胺水解酶并且包括但不限于人、大鼠和小鼠形式的酶。美国专利第6,271,015号公开了分离和纯化形式的FAAH。在一组实施方案中，根据在生理学相关条件下大鼠酶的抑制来定义个体中化合物的FAAH IC50。脂肪酰胺水解酶(FAAHs)(Deutsch,D.G.,等，Prostaglandins Leukot.Essent.Fatty Acid,66,201-210(2002))是负责降解脂质乙醇酰胺的酶，(Fowler,C.J.,等，Biochem.Pharmacol.62,517-526(2001);Patricelli,M.P.,等，Vitam.Horm.,62,663-674(2001))，例如花生四烯乙醇胺(AEA,1,图1)，(Devane,W.A.,等Science258,1946-1949(1992))油酰基乙醇酰胺，(Rodríguez de Fonseca,F.,等Nature(London)414,209-212(2001);Fu,J.,等Nature(London)425,90-93(2003))和棕榈酰乙醇酰胺，(Calignano,A.,等Nature(London)394,277-281(1998);Lambert,D.M.,等Curr.Med.Chem.9,663-674(2002))，在AEA情况下伴随选择性转运到细胞内的生化过程(Di Marzo,V.,Nature(London)372,686-691(1994);Beltrama,M.,等Science277,1094-1097(1997);Piomelli,D.,等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2002))引起这些自体有效物质的细胞作用的终止。由于脂肪酸乙醇酰胺的各种及重要的生理学角色，能阻断FAAH或FAAHs但不结合诸如单酸甘油酯脂肪酶(MGL),(Dinh,T.P.,等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,10819-10824(2002))的其它内源性大麻素-代谢酶或大麻素受体的各类小分子化合物作为药理学工具和药物开发计划的原型均是有利的(Piomelli,D.,等Trends Pharmacol.Sci.21,218-224(2000);Bisogno,T.,等Curr.Pharm.Des.8,533-547(2002);Yarnell,A.,Chem.Eng.News80(49),32(2002);Smith,A.,Nat.Rev.Drug Discov.2,92(2003);Wendeler,M.,等Angew.Chem.Int.Ed.42,2938-2941(2003))。
术语“药物可接受的载体”涵盖了任何的标准的药物载体、缓冲剂和赋形剂，包括磷酸盐缓冲盐溶液、水和乳剂(如油/水或水/油乳剂)、和各种类型的润湿剂和/或辅料。在雷明顿的制药科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)(Mack Publishing Co.,Easton,第19版，1995)中描述合适的药物载体和它们的制剂。优选的药物载体取决于活性剂的预期的给药方式。在下面描述典型的给药方式。
术语“有效量”是指对于所指明的病症、疾病状态或精神状态，足以产生所期望的结果的剂量。所期望的结果可包括在接受剂量时主观或客观上的改善。至于疼痛，改善可能是疼痛病征或症状的减少。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(therapy)”等包括但不限于对接受者健康状况产生有益变化的方法和操作。该变化可以是主观或客观上的，而且可以涉及特征，例如正在治疗的疾病、病症或疾病状态的症状或病征。例如，如果患者注意到减轻的疼痛，那么疼痛的治疗就成功了。例如，如果出现肿胀数量的减少，那么炎症的有益治疗就实现了。类似地，如果临床医生注意到客观的变化，如改善的运动范围，那么对已经损害运动的疼痛或炎症的治疗也是有益的。阻止接受者状态的恶化也包括在该术语内。
治疗益处包括表明本文所讨论的正在治疗的疾病状态的有益应答或改善的众多主观或客观因素中的任何一个。
“药物可接受的”或“治疗上可接受的”是指不妨碍活性成分的有效性或生物活性，并且在所使用的量下对主体无毒性的物质，并且待给药的主体可以是人或动物。
“治疗有效量”是指足以引起所期望的生物或临床结果的活性剂的量。所述结果可以是疾病的病征、症状或起因的缓解、或生物系统的任何其它的所期望的改变。本文所用术语“治疗有效量”表示当向个体给药时，引起疾病、病症或疾病状态实质性改善的剂型的任何量。该量随正在治疗的疾病状态、疾病状态的发展阶段和应用的剂型的类型和浓度而变化。在任何给定的情况中，合适的量对于本领域所属技术人员而言是易于显而易见，或能够通过常规实验来确定。
“预防性治疗”是对不表现神经学或心理学病症或疾病状态的病征或仅表现此类病症或疾病状态的早期或轻微病征的个体给予的治疗，其中为了减少发展病理学的风险或减少恶化病症或疾病状态的风险的目的给予治疗。本发明的化合物可以作为预防性治疗来给予以预防不期望的或不想要的焦虑或惊恐发作，或降低应当发生恶化的焦虑水平。
本文所用术语“个体”包括任何动物，包括但不限于给予治疗的哺乳动物(例如大鼠、小鼠、猫、狗)，包括人。
本文所用术语“烃基”是指(C1-C8)烃基，即(C1-C8)烷基、(C1-C8)烯基、(C3-C8)环烷基、(C3-C8)环烯基、(C1-C8)杂烷基、(C1-C8)杂烯基、(C3-C8)杂环烷基或(C3-C8)杂环烯基。更优选地，在每种情况中，所述烃基是取代或未取代的(C1-C6)、(C1-C3)或(C1-C2)烃基，而且更优选未取代的(C1-C3)烷基。更优选地，在每种情况中，所述烃基是甲基或乙基或三氟甲基。术语“烃基”也包括那些具有最多1、2或3个被杂原子替换的原子的上述烃基基团，前提是烃基的杂原子互相之间不相邻并且烃基不通过烃基的杂原子与化合物的剩余部分连接。
本文所用术语“烷基”单独地或作为另一取代基的一部分，除非另有说明，其是指具有指定的碳原子数的直链或支链、饱和的烃基(即(C1-C6)表示1-6个碳)。烷基基团的实例包括甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正-丁基、叔-丁基、异丁基、仲-丁基、正-戊基、正-己基、正-庚基、正-辛基等。
本文所用术语“烷氧基”表示通过烷氧基的氧原子与分子的剩余部分连接的烷基部分。因此，烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基等。
术语“烯基”源自相应的烷基基团的名称，但在具有一个或多个双键方面不同。类似地，“炔基”基团相对于它们相应的烷基基团命名，但在具有一个或多个三键方面不同。此类不饱和烯基基团和炔基基团的非限制性实例包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基和更高的同系物和异构体。
本文所用术语“杂烷基”其名称来源于相应的烷基基团，但不同之处在于包含一个、两个或三个独立地选自N、O和S的各自代替烷基基团的碳的杂原子。杂原子氮和硫原子任选地被氧化，而且氮原子任选地季铵化。杂烷基基团通过杂烷基基团的碳原子与分子的剩余部分连接，并且杂烷基的杂原子与另一杂原子不相邻。
术语“杂烯基”其名称来源于相应的烯基基团，但不同之处在于具有1、2或3个代替烯基基团的碳的杂原子。杂原子氮和硫原子任选地被氧化，而且氮原子任选地季铵化。杂原子可与碳原子形成双键。杂烯基基团团通过烃基的碳原子与分子的剩余部分连接，并且烃基的杂原子与另一杂原子不相邻。
本文所用术语“环烷基”是指包含约3-约8个碳原子且更优选3-6个碳原子的饱和的单环烃基。术语“环烯基”是指包含约5-约6个碳原子并含有至少一个双键的单环、非-芳香性烃基。示例性环烷基基团和环烯基基团包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚-1,3-二烯基等。
本文所用术语“杂环烷基”是指包含约3-约8个碳原子且更优选3-6个碳原子的饱和的或部分不饱和的单环烃基，其中1、2或3个碳原子独立地被独立选自O、N或S的杂原子替换。氮和硫原子任选地被氧化，而且氮原子任选地季铵化。硫可以是硫代、亚硫酰基或磺酰基氧化态。术语“杂环烯基”是指含有至少一个双键的杂环烷基基团。杂环烷基或杂环烯基基团分别通过杂环烷基或杂环烯基基团的碳原子与分子的剩余部分连接；而且杂环烷基或杂环烯基基团的杂原子与杂环烷基或杂环烯基基团的另一杂原子不相邻。
本文所用术语“杂原子”意为包括氧原子(O)、氮原子(N)和硫原子(S))。
本文所用术语“卤素”或“卤代”是指碘(I)、溴(Br)、氯(Cl)和/或氟(F)。
上述烃基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂烷基、杂烯基、杂环烷基和杂环烯基基团可各自被一个、两个或三个取代基取代，其中所述取代基独立地选自未取代的(C1-C6)或(C1-C3)烷基、未取代的(C1-C6)或(C1-C3)烷氧基、未取代的氨基、未取代的(C1-C6)或(C1-C3)烷基氨基、二-未取代的(C1-C6)或(C1-C3)烷基氨基、羟基、卤素、未取代的羧酰胺基、未取代的(C1-C6)或(C1-C3)烷基羧酰胺基、氧代和硝基。烷氧基基团的非限制性实例包括甲氧基、乙氧基、叔-丁氧基、环戊基氧基、三氟甲氧基等。本文所用术语“氧代”是指=O。本文所用术语“氨基”是指-NH2。在一些实施方案中，每个烃基基团是未取代的。在一些实施方案中，烃基、烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂烷基、杂烯基、杂环烷基和杂环烯基基团中的每个是未取代的。
外周限制性化合物是较差地透过血脑屏障或更迅速地从脑中排出的化合物。因此，本发明的外周限制性化合物能以如下剂量来给药：远比在中枢(例如在脑中)的FAAH，其更能抑制在外周的FAAH活性。在一些实施方案中，在小鼠中，皮下、静脉内或口服给药的本发明的FAAH抑制剂的用于抑制外周FAAH活性(例如肝)的ED50不超过1/4、1/8或1/10的用于抑制脑FAAH活性的ED50。优选地，外周限制性FAAH抑制剂是对外周FAAH活性的降低比其对受试哺乳动物的中枢(例如在脑中)FAAH活性的降低大至少3、4、5、7-、8-倍或10-倍的抑制剂。例如，在外周的FAAH活性水平能被抑制80%(保留20%的基线或未抑制水平的FAAH活性)，而中枢FAAH活性会被抑制10%(保留90%的基线或未抑制水平的FAAH活性)，在FAAH抑制方面提供80%/10%或8-倍的差异。
生理上可裂解的酯是体内羧基酯酶的底物。生理上可裂解的酯通常被迅速水解，以致相应的醇的浓度超出在血液或血浆中酯的浓度。例如，生理上可裂解的酯是在体内被迅速水解为相应的醇和酸、并在治疗相关剂量上具有少于1/2、1、2或3小时的半衰期的化合物。
本发明的化合物
本发明的化合物具有如下通式的化合物和其药物可接受的盐：
Figure BDA00002959996100141
其中R1是极性基团。在一些实施方案中，R1选自羟基及其生理上可水解的酯类、-SH、-O-羧酰胺基、-OC(O)R7、-O-CO-NR8R9和-NR8R9，其中R7是取代的或未取代的烃基并且R8和R9独立地选自氢和取代的或未取代的烃基；R2和R3独立地选自氢和取代的或未取代的烃基；每个R4独立地选自卤素和取代的或未取代的烃基并且n是0-4的整数；每个R5独立地选自卤素和取代的或未取代的烃基并且m是0-3的整数；而且R6是取代的或未取代的环己基。在一些实施方案中，R2、R3、R7、R8和R9中的每一个独立地选自氢和未取代的烃基。在一些实施方案中，R2、R3、R7、R8和R9中的每一个独立地是氢或未取代的C1-C3烃基。在一些实施方案中，R4和R5成员各自独立地是卤素或C1-C3烃基。优选地，本发明的上述化合物是外周限制性的。
在一些适用于上述任一实施方案的实施方案中，m是0而且n是0、1、2、3或4。在其它实施方案中，m是1而且n是0、1、2、3或4。在其它的实施方案中，m是2而且n是0、1、2、3或4。在还有的实施方案中，m是3而且n是0、1、2、3或4。在一些实施方案中，m和n的总数是0、1、2或3。在还有的实施方案中，上述的每个中，每个烃基成员是未取代的。
优选地，R1是羟基或羟基的生理上可水解的酯。这些酯包括通式-OC(O)R7的那些酯，其中R7是取代的或未取代的烃基，更优选地，取代的或未取代的烷基、烯基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基和环烯基，并且还更优选取代的或未取代的(C1-C3)烷基(例如甲基、乙基、丙基、三氟甲基)或取代的或未取代的选自烯基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基和环烯基的(C1-C3)烃基。在进一步的这些实施方案中，m是0而且n是0、1、2；m是1而且n是0、1或2；或者m是2而且n是0、1或2。
在进一步的适用于上述任一实施方案的实施方案中，R2和R3是氢或取代的或未取代的选自烷基、烯基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基和环烯基的(C1-C3)烃基。在进一步的这些实施方案中，m是0而且n是0、1、2；m是1而且n是0、1或2；或者m是2而且n是0、1或2。在一些此类实施方案的进一步实施方案中，R2和R3中的至少一个或两个都是氢。在进一步的这些实施方案中，m是0而且n是0、1、2；m是1而且n是0、1或2；或者m是2而且n是0、1或2。在还有进一步的实施方案中，R2和/或R3烃基成员是未取代的。
在进一步的适用于上述任一实施方案的实施方案中，R1是羟基并且R2和R3中的至少一个是氢。在还有此类实施方案的进一步实施方案中，R2和R3两者都是氢。在其它的R1是羟基的实施方案中，R2和R3独立地选自取代的或未取代的(C1-C3)烷基(例如甲基、乙基、丙基)和H。在进一步的这些实施方案中，m是0而且n是0、1、2；m是1而且n是0、1、2；或者m是2而且n是0、1、2。
在还有进一步的适用于上述任一实施方案的实施方案中，R6是取代的或未取代的环己基。环己基的取代基包括烷基(例如甲基、乙基)、卤素(F、Cl、I、Br并且优选F或Cl)和三氟甲基。在还有其它的这些实施方案中，m是0而且n是0、1、2；m是1而且n是0、1、2；或者m是2而且n是0、1、2。
在其它的适用于上述任一实施方案的实施方案中，R4是取代的或未取代的烷基、烯基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基或环烯基，而且还更优选取代的或未取代的(C1-C3)烷基(例如甲基、乙基、丙基、三氟甲基)或取代的或未取代的选自烯基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基和环烯基的(C1-C3)烃基。在其它的实施方案中，R4选自(C1-C3)烷基(例如甲基、乙基、丙基)，而且n是0、1、2或3。在还有的此类实施方案中，每个R4是卤素或卤代烷基(例如三氟甲基)。在还有的此类实施方案中，每个R4是卤素或未取代的(C1-C3)烷基(例如甲基、乙基、丙基)。在进一步的此类实施方案中，m是0或1。
在其它的适用于上述任一实施方案的实施方案中，R5是取代的或未取代的烷基、烯基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基或环烯基，而且更优选取代的或未取代的(C1-C3)烷基(例如甲基、乙基、丙基、三氟甲基)或取代的或未取代的选自烯基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基和环烯基的(C1-C3)烃基。在其它的上述任一实施方案中，R5选自(C1-C3)烷基(例如甲基、乙基、丙基)，而且m是1、2或3。在还有的此类实施方案中，每个R5是卤素或卤代烷基(例如三氟甲基)。在还有的此类实施方案中，每个R5是卤素或未取代的(C1-C3)烷基(例如甲基、乙基、丙基)。在进一步的此类实施方案中，n是0或1。
在特别优选的实施方案中，R1是羟基或其生理上可水解的酯，其中水解作用释放相应的化合物，其中R1是羟基、R6是未取代的环己基、m是0并且n是0、1或2；或m是1并且n是0、1或2或m是2并且n是0、1或2。在一些实施方案中，此类酯具有通式-OC(O)R7，其中R7是取代的或未取代的烃基，更优选取代的或未取代的烷基、烯基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基和环烯基并且还更优选取代的或未取代的(C1-C3)烷基(例如甲基、乙基、丙基、三氟甲基)或取代的或未取代的选自烯基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基和环烯基的(C1-C3)烃基。在一些进一步的实施方案中，R7是未取代的烃基、未取代的烷基、未取代的烯基、未取代的环烷基、未取代的杂烷基、未取代的杂环烷基、未取代的杂烯基、未取代的杂环烯基或未取代的环烯基；或未取代的(C1-C3)烷基(例如甲基、乙基、丙基、三氟甲基)或未取代的选自烯基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、杂烯基、杂环烯基和环烯基的(C1-C3)烃基。
在特别优选的实施方案中，化合物具有如下结构式：
Figure BDA00002959996100171
3’-氨基甲酰基-6-羟基联苯基-3-基环己基氨基甲酸酯或是其生理上可水解的酯，其中水解作用释放3-氨基甲酰基-6-羟基联苯基-3-基环己基氨基甲酸酯及其药物可接受的盐。
在优选的实施方案中，任一上述化合物是外周限制性化合物。
本发明的化合物可包含一个或多个不对称中心，而且因此可以外消旋体和外消旋混合物、单一的对映异构体、非对映异构体混合物和单独的非对映异构体的形式存在。本发明意为涵盖本发明的化合物的所有此类异构体形式。
本发明的化合物包括任一的非对映异构体或任一的对映异构体对。非对映体例如，可通过分步结晶从例如甲醇或乙酸乙酯或其混合物的合适溶剂中获得。因而所获得的对映体对可通过常规的手段分离成单独的立体异构体，例如通过使用光学活性的酸作为拆分剂。
作为选择，本发明的此类化合物的任一对映体可通过使用已知构型的光学纯的起始材料，经立体专一性合成来获得。
本发明的化合物在其一个或多个原子上可具有非天然比例的原子同位素。例如，化合物可用同位素进行放射性同位素标记，例如氚或碳-14。本发明化合物的所有同位素变体，无论是放射性的或不是，均在本发明的范围内。
本发明的化合物可以其药物可接受的酸加成盐的形式来分离，例如衍生自使用无机酸和有机酸的盐。此类酸可包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、马来酸、琥珀酸、丙二酸等。此外，包含酸性官能的某些化合物可以是它们的无机盐形式，其中抗衡离子可选自钠、钾、锂、钙、镁等以及有机碱。术语“药物可接受的盐”是指由包括无机碱或无机酸和有机碱或有机酸在内的药物可接受的无毒的碱或酸制备的盐。
本发明也包含本发明化合物的前药，当给药时，其在变成活性的药理学物质之前通过代谢过程进行化学转化。一般来说，此类前药是本发明化合物的衍生物，其在体内容易转化成本发明的功能化合物。在例如“Design of Prodrugs(前药设计)”,ed.H.Bundgaard,Elsevier,1985中描述了选择和制备合适的前药衍生物的常规步骤。本发明也包含本发明化合物的活性代谢物。
本文所描述的一些化合物包括烯双键，而且除非另有所指，旨在包括E和Z几何异构体两者。
本文所描述的一些化合物可以氢的不同连接点形式存在，称作互变异构体。此类实例可以是酮和其烯醇形式，称为酮-烯醇互变异构体。单独的互变异构体及其混合物也包含在本发明的通式中。
高通量FAAH抑制分析
对本文所描述的化合物的分析是依照高通量筛选。因而优选的分析检测抑制剂对FAAH的结合或由诸如油酰基乙醇酰胺或花生四烯乙醇胺等物质的水解作用产生的反应产物(例如脂肪酸酰胺或乙醇酰胺)的释放。所述物质可被标记以促进检测所释放的反应产物。对特定反应产物的存在、缺乏或量化的高通量分析为本领域技术人员所熟知。因此，例如，美国专利第5,559,410号公开了蛋白质的高通量筛选方法，以及美国专利第5,576,220号和第5,541,061号公开了配体/抗体结合的高通量筛选方法。
此外，高通量筛选系统是可商购的(参见，例如Zymark Corp.,Hopkinton,MA;Air Technical Industries,Mentor,OH;BeckmanInstruments,Inc.Fullerton,CA;Precision Systems,Inc.,Natick,MA,等)。这些系统通常自动化操作整个程序，包括将所有的样品和试剂移液、液体分配、定时孵育和最后读取在适于该分析的检测器中的微孔板的读数。这些可配置的系统提供高通量和快速启动以及高度的灵活性和用户定制化服务。此类系统的制造商提供各种高通量的详细方案。因此，例如，Zymark Corp.提供了描述用于检测基因转录的调节、配体结合等的筛选系统的技术通报。
筛选具有抗伤害感受活性的化合物的方法
筛选具有抗伤害感受作用的FAAH抑制剂的方法对本领域技术人员而言是众所周知的。例如，在小鼠热板实验和小鼠福尔马林实验中将测试的化合物对个体动物给药，并且测定对热或化学组织损伤的伤害性反应。另请参阅美国专利第6,326,156号，其教导了抗伤害感受活性的筛选方法。参阅Cravatt等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:9371-9376(2001)。
药物组合物
本发明也提供了上述外周限制性FAAH抑制性化合物的药物组合物。如在药物组合物中的术语“组合物”旨在涵盖包含活性成分和组成载体的惰性成分的产品，以及直接或间接地由任意两种或多种成分的组合、复合或聚集或者由一种或多种成分的解离或者由一种或多种成分的其它类型的反应或相互作用产生的任一产品。因此，本发明的药物组合物涵盖通过将本发明的化合物和药物可接受的载体混合而制成的任一组合物。术语“药物组合物”是指适于在包括动物或人在内的个体中的医药用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂和药物可接受的载体。
组合物包括适于口服给药、直肠给药、局部给药、肠胃外(包括皮下、肌内和静脉内)给药、眼部(眼科的)给药、肺部(鼻腔或口腔吸入)给药或鼻腔粘膜给药的组合物，尽管在任一给定的情况中最适合的途径将部分地取决于正在治疗的疾病状态的特性和严重性以及活性成分的特性。给药的示例性途径是口服途径。组合物可以方便地以单位剂型的方式存在，而且通过药学领域中众所周知的任一方法来制备。
在实际应用中，根据常规的药物混合技术，可将本发明的化合物作为活性成分与药物载体以均匀混合的方式组合。依据用于给药的所需要的制剂形式，例如口服或肠胃外(包括静脉内)给药，载体可采用各种不同的形式。在制备口服剂型的组合物中，可使用任何常用的药物介质，例如，在诸如悬浮液、酏剂和溶液剂的口服液体制剂的情况下，介质例如为水、乙二醇、油、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂等；或当固体口服制剂优于液体制剂时，在诸如粉剂、硬胶囊剂和软胶囊剂和片剂的口服固体制剂的情况下，介质或载体例如为淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。
由于它们易于给药，片剂和胶囊剂代表了最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下明显使用固体药物载体。若需要，片剂可通过标准的含水或非水技术来包衣。此类组合物及制剂可包含至少0.1%的活性化合物。当然，在这些组合物中活性化合物的百分比可以变化，而且可以合宜地在约2%-约60%的单位重量之间。在此类治疗有用的组合物中活性化合物的量是将获得的治疗有效剂量。活性化合物也可以鼻腔给药，例如液滴或喷雾。
片剂、丸剂、胶囊剂等也可包含粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸氢钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸；润滑剂，如硬脂酸镁；和甜味剂，如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式是胶囊剂时，除上述类型的材料以外，其还可包含液体载体，如脂肪油。
各种其它材料可作为包衣而存在或修改剂量单位的物理形式。例如，片剂可用虫胶、糖或两者进行包衣。除活性成分以外，糖浆或酏剂还可包含蔗糖作为甜味剂、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂、染色和调味剂，如樱桃或桔子调味剂。为了防止在经过胃肠道上部的运输过程中发生分解，组合物可以是肠溶制剂。
关于用于任一各种给药途径的制剂、用于药物给药的方法和制剂已公开在雷明顿的制药科学中(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第17版，(Gennaro et al.Eds.,Mack Publishing Co.,1985)。雷明顿的制药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences),Gennaro AR ed.第20版，2000:Williams&Wilkins PA,USA。
给药
本发明的化合物也可以肠胃外给药。这些活性化合物的溶液剂或悬浮液可在适当地混有诸如羟丙基纤维素的表面活性剂的水中制备。分散液也可在油中、在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。
适用于注射应用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于即席制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，剂型必须是无菌的而且必须是可流动到容易注射的程度。在制造和储存条件下它必须是稳定的，而且必须抵抗诸如细菌和真菌等微生物的污染行为而保存。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)，其合适的混合物和植物油。本发明的化合物可在广泛的剂量范围内有效。例如，在成年人的治疗中，可需要剂量约10-约1000mg、约100-约500mg或约1-约100mg。每天使用0.05-约100mg的剂量，而且更优选约0.1-约100mg。最优选的剂量是每天约0.1mg-约70mg。在为患者选择方案时，它可能经常必须以每天约2-约70mg的剂量开始，而且当疾病状态处于控制中时减少剂量低至每天约0.1-约10mg。例如，在成年人的治疗中，每天可使用剂量约0.05-约100mg，优选约0.1-约100mg。这精确的剂量将取决于给药方式、需要的治疗、给药的剂型、待治疗的个体和待治疗的个体的体重和主管医师或兽医的偏好和经验。
一般地，本发明的化合物可以单位剂型形式进行分配，其包括优选每单位剂量约0.1-约100mg的活性成分以及药物可接受的载体。通常，适用于口服、鼻腔、肺部的或经皮给药的剂型包含约0.001mg-约100mg，优选约0.01mg-约50mg的与药物可接受的载体或稀释剂混合的化合物。对于储存和应用，这些制剂优选地包含防腐剂来防止微生物生长。
适当量的候选化合物的给药可以通过本领域熟知的任一手段来进行，例如，口服或直肠、肠胃外、腹膜内、静脉内、皮下的、真皮下、鼻腔或肌内给药。在一些实施方案中，给药是经皮给药。如本领域已知的那样，候选化合物的适当量或剂量可根据经验来确定。合适的量或治疗量是足以提供所期望的治疗作用的量(例如治疗或减轻疼痛，或治疗或减轻炎症)。每当需要减轻疼痛或减轻炎症时可给予候选化合物，例如每小时、每六个、八个、十二个或十八个小时、每天或每周给药。
适合于口服给药的制剂可包括(a)液体溶液，如悬浮在诸如水、生理盐水或PEG400的稀释剂中的有效量的包装的核酸；(b)胶囊、小袋(sachet)或片剂，每个含有预定量的活性成分，如液体、固体、颗粒或凝胶；(c)合适的液体中的悬浮液；和(d)合适的乳剂。片剂形式可包括如下的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药物相容性载体。锭剂形式可包含活性成分和例如蔗糖的调味品，以及糖果锭剂包含活性成分和惰性基质，例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶乳剂，除活性组分以外还含有本领域已知载体的凝胶剂等。
注射溶液和悬浮液可由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂来制备。例如通过关节内(在关节内)、静脉内、肌内、真皮内、腹膜内和皮下途径给药的适于肠胃外给药的制剂包括水性的或非水性的、等渗的无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与所预期的接受者的血液等渗的溶质、以及水性的或非水性的无菌悬浮液，其可包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
关于经皮给药途径，药物的经皮给药的方法公开在雷明顿的制药科学中(Remington's Pharmaceutical Sciences),Gennaro AR第20版，2000:Williams & Wilkins PA,USA。真皮或皮肤贴剂是优选的用于经皮递送本发明化合物的方法。贴剂优选地提供吸收增强剂，例如DMSO，以增加化合物的吸收。其它的经皮递送药物的方法公开在美国专利第5,962,012号、第6,261,595号和第6,261,595号中。其中每个以参考的方式整体并入本文中。
优选的贴剂包括控制药物递送至皮肤的速率的那些试剂。贴剂可提供各种给药系统，包括储库系统或单片系统。储库设计可以例如具有四层：直接接触皮肤的粘合层、控制药物分子扩散的控制膜、药物分子的储库和防水背衬。
此类设计在指定的时限内递送均匀量的药物，递送速率一定小于不同类型皮肤的饱和极限。
单片设计，例如，通常只有三层：粘合层、包含化合物的聚合物基质和防水背衬。这种设计将饱和量的药物递送给皮肤。从而，递送受皮肤来控制。当贴剂中的药物量下降到饱和水平以下时，递送速率降低。
本发明的化合物可与本发明的其它化合物联合使用，或与也可用于治疗、预防或抑制疼痛、炎症或免疫性病症的其它药物联合使用。在一个实施方案中，第二药物不是FAAH抑制剂，以及作为FAAH抑制剂指向到相同的病症。此类其它药物可通过途径以其通常使用的量与本发明的化合物同时或连续地给药。当本发明的化合物与一种或多种其它药物同时使用时，优选包含此类其它药物和该化合物的单位剂型形式的药物组合物。当与一种或多种其它活性成分联合使用时，本发明的化合物和其它活性成分能够以比各自单独使用时的剂量更低的剂量来使用。因此，本发明的药物组合物包括那些除上述公开的化合物外还包含一种或多种其它活性成分的药物组合物。
在用于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、经皮、局部或直肠给药的本发明的药物组合物中，活性成分，其自身或与其它活性成分联合，可通过与常规的药物载体混合给药的单位形式给予动物和人。合适的给药单位形式包括口服形式，例如口服的片剂、明胶胶囊、粉末剂、颗粒和溶液或悬浮液，舌下和口腔给药的形式，气溶胶，植入，皮下、肌内、静脉内、鼻腔或眼内给药的形式和直肠给药的形式。
在其它实施方案中，本发明的药物组合物、活性成分通常以剂量单位来配制。所述剂量单位包含用于每天给药的每剂量单位的0.5-1000mg，有利地1-500mg而且优选2-200mg的FAAH抑制剂。
治疗方法
疼痛控制
在一些实施方案中，可给予通式I和II的化合物来减轻或治疗个体的疼痛。治疗可以是预防性的或治疗性的。治疗可以是向人个体给药。本发明的化合物和组合物可进行单独给药来实现减轻疼痛的严重性或频率或程度的目的。治疗可以是以与另一疼痛缓解剂或抗炎剂联合治疗的形式给药。在一些实施方案中，疼痛可以是神经性疼痛，所述神经性疼痛选自后三叉神经痛、神经性腰痛、外周或多神经性疼痛、复杂性局部疼痛综合征(灼痛和反射性交感神经营养不良)、糖尿病神经病变、中毒性神经病变和由化学治疗剂引起的慢性神经病变。在其它的实施方案中，疼痛是肾和肝绞痛或纤维性肌痛。在一些神经性疼痛的实施方案中，神经系统的原发性损害或功能紊乱是由对个体神经的机械损伤引起的。在进一步的实施方案中，机械损伤是由于个体中的压迫神经、横切神经、灼痛、脊髓损伤、术后疼痛、幻肢痛或瘢痕形成而引起的。
在其它的实施方案中，疼痛是由组织的炎症或损伤引起的。响应从有害刺激中出现的组织损伤，发展了炎性疼痛。响应组织损伤，细胞因子和其它的介体被释放，这加强了伤害感受。结果，原发性痛觉过敏(对疼痛增强的敏感性)出现在损伤区域，并且继发性痛觉过敏接着出现在损伤周围的组织处。当组织痊愈时痛觉过敏随着炎症减弱。在一些进一步的实施方案中，炎症与如下疾病相关：肺水肿、肾结石、轻伤、伤口愈合、皮肤伤口愈合、阴道炎、念珠菌病、lumbarspondylanhrosis、腰脊椎关节病、血管疾病、偏头痛、窦性头痛、紧张性头痛、牙痛、结节性动脉周围炎、甲状腺炎、再生障碍性贫血、霍奇金病、硬皮病(sclerodoma)、风湿热、I型糖尿病、II型糖尿病、重症肌无力、多发性硬化症、结节病、肾病综合征、贝赫切特综合征、多肌炎、齿龈炎、超敏感性、损伤后出现的肿胀、或心肌缺血或骨关节炎。
炎症控制
在一些实施方案中，可给予通式I和II的化合物来减轻个体的炎症。治疗可以是预防性或治疗性的。治疗可以是向人个体给药。本发明的化合物和组合物可进行单独给药来实现减轻炎症的严重性或频率或程度的目的。治疗可以是以与另一疼痛缓解剂或抗炎剂联合治疗的形式给药
控制免疫病症
提供下列实施例以用作示例性目的，其不旨在限制本文所要求的发明的范围。技术人员所能想到的在示例性物品和/或方法中的任何变体均落入本发明的范围之内。
实施例
材料和方法
药物分配系数在室温(25±1°C)下，我们测定了在正-辛醇和pH7.4的缓冲水溶液之间分配溶质的Log D7.4,oct值36。
酶活性测定我们实施了所描述的标准FAAH和单酰甘油脂肪酶活性测定15,37，分别使用作为底物的[3H]-花生四烯乙醇胺(国立药物滥用研究所的礼物)和2-油酰基-sn-甘油(Nu-Check Prep,Elysian,MN)。
药物转运测定测试在Cerep Inc.(Redmond,WA)进行，在公司的网站上(http://www.cerep.fr)概述了下列方案。
组织分析我们实施了如38所描述的内源性大麻素的组织提取和液相色谱/质谱分析。如下面进一步详细描述的，使用类似的程序用于URB937的组织提取和LC/MS量化。
Fos表达在来自雄性Sprague-Dawley大鼠的腰段(L4/L5)脊髓切片上，我们通过定量免疫细胞化学5测定Fos蛋白水平。
手术我们在雄性瑞士小鼠中进行坐骨神经结扎，如前面描述的用于大鼠24的并稍作修改39。
行为测试通过在雄性瑞士和C57Bl/6(野生型或FAAH-缺失型)小鼠中i.p.注射乙酸40，在雄性瑞士小鼠中足底内注射角叉菜胶20，在雄性Sprague-Dawley大鼠中足底内注射福尔马林41，以及在雄性瑞士小鼠中39坐骨神经结扎，我们测定所诱发的疼痛反应。
FAAH抑制剂的合成URB937在很大程度上通过公开的方法来合成36。通过五个步骤获得该化合物，从3-溴-4-羟基苯甲醛开始，将其苄化(BzCl,DMF,CsCO3,rt,3h)，然后氧化并水解(m-CPBA,CH2Cl2,40°C,72h;NaOMe,EtOH,rt,1h)为4-苄氧基-3-溴苯酚；后者通过Suzuki偶联[3-氨基甲酰基苯基硼酸，甲苯，Pd(PPh3)4，Na2CO3/H2O，回流，2h]，氨基甲酸酯化(c-C6H11CNO,Et3N,甲苯/CH3CN1:1,回流,18h)和氢化脱保护为所需的化合物。通过合适的3’-氨基甲酰基-4-取代的苯酚与环己基异氰酸酯的反应合成N-环己基-O-联苯基-3-基氨基甲酸酯1c–e，同时通过Pd/C催化氢化由合适的苯酚衍生物产生的相应硝基氨基甲酸酯前体获得1f。所有的联苯酚化合物通过3-氨基甲酰基苯基硼酸和相应的3-溴-4-取代的苯酚(在1c、d的前体的情况下)或3-氯-4-氟苯酚(对1e的前体)之间的Suzuki偶联反应来合成。所有的化合物的详细的合成步骤将在下文报道。
环己基氨基甲酸3'-氨基甲酰基-6-羟基联苯基-3-基酯(URB937)的合成。向搅拌的环己基氨基甲酸3'-氨基甲酰基-6-苄氧基联苯基-3-基酯(222mg;0.5mmol)的EtOAc(2.5mL)和EtOH(2.5mL)的悬浮液中加入10%Pd/C(22mg)。在4atm下在50°C下氢化混合物4h，冷却，在硅藻土上过滤并浓缩。通过柱色谱法(环己烷/EtOAc1:9)纯化残留物并且重结晶获得白色固体URB937。收率：92%(0.163g)。Mp:128–130°C(CH2Cl2/正-己烷).MS(ESI)m/z:355.2(M+H+).1H NMR(200MHz,CDCl3)δ:=1.13–2.02(m,10H),3.55(m,1H),5.13(br d,1H),5.85(br s,1H),6.59(br s,1H),6.74–6.95(m,3H),7.07(s,1H),7.34–7.41(m,1H),7.56(m,1H),7.68–7.75(m,2H)ppm.IR(Nujol)nmax:3333、1701、1655cm-1。
其它的化学品[3H]-花生四烯乙醇胺购自American RadiolabeledChemicals,Inc.(St.Louis,MO)。2-[2H8]-AG和AM630来自CaymanChemical(Ann Arbor,MI)。花生四烯乙醇胺，[2H4]-花生四烯乙醇胺和PEA在实验室合成42。利莫那班和N-环己基联苯基-3-基乙酰胺分别是国立药物滥用研究所和Kadmus制药公司的友好礼物。
动物我们使用雄性瑞士韦伯斯特小鼠(Charles River,20-30g)、雄性C57Bl/6(Jackson实验室,20-25g)、在C57Bl/6背景上反交超过10次的雄性FAAH-缺失型小鼠(25-35g)、雄性维斯塔大鼠(Charles River,250-300g)和雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(Harlan实验室275-350g)。小鼠和维斯塔大鼠在室温下在标准的笼子中以12:12h白天:黑夜周期用无限制的摄取水和标准饲料颗粒进行群养。维斯塔大鼠典型地用于FAAH研究。所有的实验符合美国国立卫生研究院照料和使用实验动物的指南，通过加利福尼亚大学欧文分校和在雅典的佐治亚大学的实验动物护理和使用委员会批准，并且符合欧共体理事会指令86(609)EEC，并按照意大利规则(DL116/92)实施实验方案。
组织提取使用异氟烷处死小鼠并收集组织，在液氮中立即冷冻。称重冷冻的组织并在包含作为内标物的[2H4]-花生四烯乙醇胺、[2H4]-PEA、[2H8]-2-AG和N-环己基联苯基-3-基乙酰胺的甲醇(1mL)中均质化。使用氯仿(2vol)提取分析物并且用水(1vol)清洗。收集有机相并在氮气环境下干燥。未分级的有机提取物用来量化URB937。对于其它分析，有机提取物通过所描述的43开床硅胶柱色谱法进行分级。简单地说，提取物溶于氯仿并装载到填充硅胶G(60～A230–400目ASTM;Whatman,Clifton,NJ)的小玻璃柱上。花生四烯乙醇胺、PEA和2-AG用氯仿/甲醇(9:1,vol/vol)洗脱。
血清提取从断头的小鼠中收集躯干血，允许凝结并放置在冰上。凝结的血液在4°C下以18,000xg离心10min并将血清转移到玻璃小瓶中并且用蒸馏水稀释到1mL。用包含作为内标物的N-环己基联苯基-3-基乙酰胺的冰冷的丙酮(1mL)将蛋白质沉淀，并且通过在4°C下以3000xg离心10min来除掉沉淀物。将样品在氮气环境下干燥以除去丙酮并如上所述使用氯仿/甲醇来提取。
液相色谱/质谱(LC/MS)通过耦联配备有电喷雾电离接口的1946A-MS检测器(Agilent Technologies,Inc.,Palo Alto,CA)的1100-LC系统来测定花生四烯乙醇胺、PEA、2-AG和URB937的组织水平。在XDB Eclipse C18柱(50x4.6-mm内径,1.8μm,Zorbax)上，使用在B中含60%的A至B中含100%的A的线性梯度以1.0mL-min-1的流速3min内洗脱URB937和N-环己基联苯基-3-基乙酰胺(m/z=294)。流动相A由含0.25%乙酸、5mM乙酸铵的甲醇组成；流动相B由含0.25%乙酸、5mM乙酸铵的水组成。使用在水中的甲醇的梯度(在2.5min内85%甲醇至90%甲醇)以1.0mL-min-1的流速洗脱花生四烯乙醇胺、2-AG和PEA。柱温控制在40°C。MS检测是正电离模式，毛细管电压设定在3kV，而且碎裂电压在120-140V之间变化。在350°C的温度下以13L-min-1的流速使用氮气作为干燥气体。雾化气压力设定在60psi。分析物的Na+加合物([M+Na+])和内标物以选择离子监测模式进行监测。量化限度是0.4pmol。
药物转运测定转运测定在Cerep Inc.(Redmond,WA)实施。在10μM化合物的存在下、在包含1%二甲基亚砜(DMSO)的Hanks’缓冲盐溶液中，在顶点(A)到底部(B)和B-A方向上测定细胞的渗透性。流出比率计算为B-A渗透性对A-B渗透性的比。
Fos免疫组织化学将福尔马林注射到背侧的爪(dorsal paw)之后两小时，大鼠接受致死剂量的耐波他(50mg-mL-1)。使用100mL的1%肝素化的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，随后使用300mL的冰冷的4%多聚甲醛将它们通过心脏灌注。从每只大鼠收集腰-骶区的脊髓。在4°C下将脊髓经4%多聚甲醛后固定24h，然后在4°C下在30%蔗糖中低温保护24-48小时。在腰骶膨大水平(L4/L5)处将脊髓低温恒温器切成40μm切片。将自由的浮动交替的切片(free floating alternating sections)保持在一系列填充有PBS的孔中。每第四个切片进行Fos免疫反应性处理来确保相同的细胞不被计数两次。通过在过氧化氢中孵育来灭活内源性过氧化物酶。将切片用山羊血清封闭来防止非特异性结合，并且在稀释在含0.4%Triton(在37°C持续1h然后在4°C持续48h)的PBS中的Fos一级抗体(1:20,000,Abcam,Cambridge,MA,USA)的存在下将切片进行孵育。在37°C下，在生物素化的山羊抗-兔子IgG(1:600,Vector实验室,Burlingame,CA,USA)二级抗体的存在下孵育组织1h。随后，将切片在Vectastain精选ABC试剂(1:200,Vector Laboratories)中孵育1h，随后在2%镍强化的二氨基联苯胺中孵育5min。将切片放置到载玻片上、空气干燥、在上升浓度的乙醇中脱水、在二甲苯中清除、并且通过用中性树胶封片剂(Permount)固定的玻璃盖玻片进行保护。在相同实验中所有的条件同时进行处理来控制经过不同路线的免疫染色中的变化。通过从免疫染色方案中省略一级抗体以及通过证实与肽抗血清的预吸收阻断了特异性染色5确立了免疫染色特异性。
免疫反应性量化在显微镜下，选择定性地表现最大数目的Fos-阳性细胞的三个L4切片用于量化。切片的选择和Fos-阳性细胞数目的量化通过对实验情况不知情的观察者来操作。在能演示可比得上的背景染色的相似亮度/对比背景下，使用DMLB光显微镜和1,300数码相机在5x放大率下捕捉切片。在所有的切片上使用Image J软件(美国国立卫生研究院，Bethesda,Maryland,USA)描绘层状细分。脊髓灰质的细分定义为表面的浅层(薄层I和II)、后角固有核(薄层III和IV)、背角的颈部(薄层V和VI)和腹角(薄层,VII、VIII、IX和X)44。，使用Image J，不考虑染色强度，由对实验处理不知情的观察者在每一细分中计数Fos表达细胞。评分者自身信度从浅层中的93%到所有层状细分的81%。
用于体内实验的药物制备将药物溶解在聚乙二醇400/Tween-80/盐水(1/1/18;按体积)中，并且通过i.p.(5-10mL-kg-1)或s.c.注射(10mL-kg-1)来给药。对于侧面脑室注射，将URB937溶解在100%DMSO中并且以5μL的体积注射。
手术所有手术在无菌条件下进行。Implantation of cannulae forintracerebroventricular(i.c.v.)drug administration(用于脑室内(i.c.v.)药物给药的套管的植入)。使用氯胺酮(70mg-kg-1,i.p.)和甲苯噻嗪(9.33mg-kg-1,i.p.)的混合物来麻醉SD大鼠。将它们放置在立体定位架中，并且使用设置在水平面下2.4mm的柔化辊(incisor bar)通过耳棒(DavidKopf Instruments,Tujunga,CA,USA)将其固定。在实验前7天，将22-规格不锈钢引导套管植入右侧脑室。使用Paxinos和Watson大鼠脑图册来确定植入的坐标(相对于前囱，-0.9mm前/后方向和-1.5mm中间/侧面，以及在头骨的表面下3.8mm)45。将引导套管用3个不锈钢螺丝和牙科粘固粉固定于头骨，并且保持伸展，直至通过插入虚拟探针而进行注射。对于注射，移除探针，并且通过填充有PBS的PTFE24G导管(Small parts Inc,Logansport,IN)，使用与28规格不锈钢注射器连接的10μL Hamilton微量注射器，以5μL的体积输注药物或介质(vehicle)，所述注射器越过引导套管的尖端突出1mm。在PTFE24G导管的远端处吸出小气泡(3μL)以从PBS中分离注射的溶液，并用于注射的目视检查。在1分钟的时间段内进行注射，并且使注射器固定住额外的1分钟以防止倒流渗漏。在对大鼠进行安乐死之前，通过注射锥虫蓝(5μL)在实验结束时核实套管的布置。仅具有正确布置的动物包括在研究中。使大鼠在实验前恢复7至10天。使用Bennett和Xie的方法24的改编版本，在Swiss小鼠中进行坐骨神经结扎。用甲苯噻嗪(10mg-kg-1,i.p.)和氯胺酮(100mg-kg-1,i.p.)麻醉小鼠，左股被剃毛，并用
Figure BDA00002959996100301
擦洗，并且在左股的中部形成小切口(长度为2cm)以暴露坐骨神经。使用丝线(7-0)环绕神经的整个直径在两个不同的位点处(以2-mm间隔相隔开)松散地系住神经。用链霉素粉末播撒于手术区域，并且用单根肌肉缝合线和两个皮肤夹进行闭合，并且最后用
Figure BDA00002959996100311
擦洗。在假手术的动物中，暴露神经，但左侧没有结扎。将动物放置在热灯下，直至它们醒来。
行为测试在Swiss小鼠或C57Bl/6小鼠(野生型并且FAAH-缺失型)中测量乙酸诱发的挣扎扭动，如40所述并具有最小的修改。简言之，使小鼠适应实验室环境2小时。用乙酸(150μL,0.6%的盐水溶液)注射每一动物并将其放入玻璃杯中。计数腹部伸展(身体和后肢的伸展)20分钟，在乙酸注射后5分钟开始。在乙酸前1小时通过s.c.注射来给予URB937、利莫那班和AM630。由对处理情况不知情的观察者来对行为进行评分。在Sprague-Dawley大鼠中评价福尔马林诱导的伤害感受，如41所述。将大鼠单独地饲养并在12:12小时的日夜周期下保持在共享的存贮室中。它们自由地获取食物和水，并且在测试前适应设施1周。在福尔马林给药之前1小时，大鼠接受i.p.注射介质、URB937(1mg-kg-1,i.p.)、利莫那班(2mg-kg-1i.p.)或者URB937和利莫那班的组合。使它们适应观察容器(透明的树脂玻璃箱，29×29×25cm)15分钟，然后接受福尔马林(50μL,5%的盐水溶液)向右后爪的背侧面的注射。在福尔马林注射之后立即使大鼠返回观察容器，并且用摄像机记录防伤害行为60分钟。由对处理情况不知情的观察者分析记录。连续测量防伤害行为60分钟41。在5分钟储存器中记录三种不同行为分类(0、1、2)中的动物消耗的总时间，其中(0)大鼠表现出正常姿势，(1)抬起注射的爪，或(2)舔、摇动或咬注射的爪。对每个5分钟储存器分析(1)抬起和(2)舔或咬注射的爪所消耗的时间。使用综合性疼痛评分加权分数技术(CPS-WST1,2)来分析防伤害行为，该技术计算整个的观察时间(0-60分钟)，并分别计算行为反应的第一阶段(0-10分钟)和第二阶段(10-60分钟)46。使用梯形法则计算与CPS-WST1,2对应的曲线下面积(AUC)。通过在右后爪内注射50μL的包含1%λ-角叉菜胶的无菌盐水来在小鼠中诱发爪水肿。使用器官充满度测量器(Ugo Basile,Milan,Italy)测量爪体积。在角叉菜胶之前立即注射介质或URB937(1mg kg-1,i.p.)。在角叉菜胶之前30分钟注射利莫那班和AM630(1mgkg-1,i.p.)。通过从施加于其背侧面上的恒定的机械压力开始到收回爪的潜伏期来评价机械性痛觉过敏。将向锥顶点(直径=3mm)斜切的15-g校准的玻璃圆柱棒(直径=10mm)用于施加机械力。将砝码垂直悬挂在与置物台连接的两个环之间，并且自由地垂直移动。使用3分钟的截止时间。如47所述评价热性痛觉过敏，使用商购设备(Ugo Basile,Varese,Italy)，测量从辐射热的聚焦光束(热强度：红外线3.0)施用于跖面开始到收回后爪的潜伏期。截止时间设定为30秒。使用爪触觉测试仪(Dynamic Plantar Anesthesiometer)(Ugo Basile)，通过用Von Frey细丝向后爪跖面施加渐次变化的力来评价机械痛觉超敏。截止力设定为50g。
统计分析结果表示为平均值±标准误差均值(s.e.m)。通过Studentst分布检验，单因素或双因素方差分析(ANOVA)，然后若合适则进行Bonferroni post hoc检验来测定统计显著性。进行单独的单变量方差分析，测定由曲线下面积测量的实验处理对福尔马林诱导的防伤害行为的作用。对福尔马林诱导的综合性疼痛评分，进行重复测量的方差分析(处理×时间[重复因子])。将Greenhouse-Geisser修正应用于所有的重复因子。对于在脊髓L4/L5处的每一层状细分，进行单变量方差分析以测定实验处理对Fos-表达细胞数量的作用。分别对行为和Fos免疫染色数据进行Fisher LSD和Tukey post hoc检验。未满足等方差假设的post hoc比较通过自由度的分数调整来进行修正。使用SPSS统计软件(17.0版本；SPSS Incorporated,Chicago,IL,USA)来进行分析。
结果
外周限制性FAAH抑制剂的发现目前FAAH抑制剂容易透过血脑屏障12。为了产生具有限制性进入CNS的抑制剂，我们在预期小体积的亲水取代基不损害生物活性的位置15处，向改变O-芳基氨基甲酸酯URB59713,14的邻近苯环添加了的改变极性的化学基团(表1，1a)。当在大鼠脑FAAH的膜制备中进行试验时，新的化合物具有相似的效能，并且当向小鼠全身给药(1mg-kg-1,腹膜内,i.p.)时同样有效地阻断肝FAAH活性(表1,1b-1f)。然而，它们在其进入CNS的能力方面显著不同。特别地，对羟基苯基衍生物URB937(表1,1b)抑制在小鼠和大鼠的外周组织中的FAAH活性，并未影响脑FAAH活性(表1，表2)。小鼠的剂量-探索研究表明URB937对脑中的FAAH抑制的半数有效剂量(ED50)比对肝脏中的FAAH抑制的ED50高200倍(图1a)。此外，在全身给药之后，URB937(1mg-kg-1,i.p.)在血清和肝脏中迅速分布，但在脑组织中仍保持检测到(图1b)。如用其它O-芳基氨基甲酸酯所观察到的那样，已知其通过共价机制与FAAH相互作用13,16，URB937在体内迅速且持久地抑制外周FAAH活性(图1c)。
外周分离机制探索性构效关系分析表明对羟基苯基部分的极性是URB937的外周分离的必要因素。表1示出R取代基为弱极性或非极性的类似物，即化合物1c、1d和1e在小鼠的全身给药之后容易进入脑部，而R由极性氨基组成的类似物，即化合物1f很大程度上被排除。然而，URB937的相对高的亲脂性(分布系数，LogDoct,pH7.4:URB937，3.03±0.01；URB597，3.71±0.01；平均值±标准误差均值，n=3)允许分子被动扩散进入CNS，除非该过程被主动抵制。作为该想法的首要检验，我们测定了URB937通过人上皮TC7细胞的极性单层的渗透性和流出比，所述TC7细胞表达与药物从脑部排出相关的多种蛋白转运蛋白17。URB937未相等地分布穿过TC7单层的顶部(A)隔室和底部(B)隔室，如同所预期的亲脂性分子通过被动扩散来移动。然而，通过对渗透性-糖蛋白(Pgp)抑制剂维拉帕米(100μM)不敏感的机制[B-A的渗透性以nm-s-1(回收%)计:322(94%)]，化合物累积进入A隔室[渗透性，以nm-s-1(回收%)计，A-B，38(83%)；B-A，371(95%)；流出比，9.8；2次独立实验的平均值]。这些发现表明URB937通过与Pgp在药理学上显著不同的转运系统而从CNS排出。与该解释相一致，将URB937的次最大剂量(0.1mg-kg-1)注射入大鼠的侧脑室内，在1小时内产生肝FAAH的几乎完全抑制(残留活性：对照的11.3±1.9%；平均值±标准误差，n=3)。相反地，高10倍剂量的药物的全身给药(1mg-kg-1,i.p.)对大鼠脑FAAH没有可检测出的作用(表2)。
为了研究参与将URB937从CNS排出的转运系统的特性，我们向大鼠给予了血脑屏障转运蛋白的各种药理学抑制剂连同未实现脑渗透的URB937的最高全身剂量(25mg-kg-1,i.p.)(图1a)。化合物Ko-143、即乳腺癌耐药性蛋白(BCRP,ABCG1)的抑制剂的共同给药引起URB937进入脑部的剂量依赖性增加。相反，维拉帕米、即渗透性-糖蛋白(Pgp)抑制剂的共同给药或者丙磺舒、即有机阴离子转运蛋白抑制剂的共同给药没有这样的作用。结果表明URB937通过与BCRP在药理学上不能相区别的转运蛋白而从CNS排出。
外周花生四烯乙醇胺信号传导的增强URB937向小鼠的给药(1mg-kg-1,i.p.)增加了外周的花生四烯乙醇胺水平，未增加前脑或下丘脑中的该水平(图1d、图6)。该作用由FAAH活性的选择性抑制而引起，因为(i)其通过其它内源性FAAH底物、诸如棕榈酰基乙醇酰胺(PEA)的升高而实现(图1d)；以及(ii)其未在突变小鼠中观察到，在所述突变小鼠中通过同源重组已破坏faah基因的表达18(图1e)。重要地，URB937在体外未影响单酰基甘油脂肪酶活性(半数抑制浓度，IC50，>100μM；n=3)，并且在体内未改变其内源性大麻素底物、即2-AG的组织水平(图1f)。
内脏痛的调节脑渗透性FAAH抑制剂在啮齿动物中减弱对有害刺激的行为反应，即通常归因于它们能够在脑和脊髓中增强花生四烯乙醇胺信号传导的能力的性质12,13。为检测外周花生四烯乙醇胺是否促进这些作用，我们检查了URB937对通过将乙酸注射入小鼠的腹膜腔内而诱发的防伤害(避免疼痛)反应的作用。URB937的皮下给药降低了乙酸诱导的扭动，ED50为0.1mg-kg-1(图2a和数据未示出)。该作用为(i)在有效性方面可比得上由有效的非甾类镇痛剂吲哚美辛(1mg-kg-1,s.c.)引起的作用(图2a)；(ii)与外周FAAH抑制(Pearson相关系数；r=0.96，图2b)的程度相关；以及(iii)在突变的FAAH-缺失型小鼠中不存在(图2c)。URB937的抗伤害感受作用被CB1拮抗剂利莫那班所阻断，但未被CB2拮抗剂AM630所阻断(每一种为1mg-kg-1,s.c.)(图2d)。
尽管花生四烯乙醇胺是1型辣椒素瞬间受体电位(TRPV-1)通道的激动剂19，但URB937当单独给药(1mg-kg-1)时没有引发可检测的防伤害行为(图2a)，这表明在外周FAAH抑制后，由内源性花生四烯乙醇胺达到的组织浓度不能激活TRPV-1通道。此外，α-型过氧化物酶体增殖物激活受体(其能由PEA诱导20,21)的刺激不能解释URB937的抗伤害感受作用(图1d)，因为这样的作用由CB1受体阻断而阻止(图2d)。
组织损伤诱发的疼痛的调节在另一系列的实验中，在通过向大鼠背侧的后爪给予福尔马林而成的持续性疼痛的组织损伤模型中，我们评价了URB937(1mg-kg-1,i.p.)的作用。当与介质、利莫那班(2mg-kg-1,i.p.)或者利莫那班和URB937的组合比较时，福尔马林注射诱发的显著的防伤害反应由URB937以时间依赖性方式而减弱(图2e)。此外，分析显示(i)相对于所有的其它治疗组，URB937降低了福尔马林诱导的疼痛行为的曲线下面积(图2f)；以及(ii)该作用主要是由于降低了福尔马林反应的后期(阶段2)(图2g)，其中通过炎症和脊髓伤害感受性回路的中枢敏化来实现正在进入的初级传入纤维活性。
为了测定外周花生四烯乙醇胺活性的增强是否改变伤害感受性输入的脊髓处理过程，我们在进行行为测试的相同动物中测量福尔马林诱导的Fos表达。URB937降低对福尔马林的Fos响应(图3a、b)，减少在脊髓背角浅层(薄层I、II)、后角固有核(薄层III、IV)、背角的颈部区域(薄层V、VI)和腹角中Fos-阳性细胞的数量(图3d)。该作用通过CB1拮抗剂利莫那班(2mg-kg-1,i.p.)来阻止，当没有URB937而给药时，利莫那班未显著改变Fos水平(图3c、d)。尽管URB937缺乏CNS渗透，但其抑制脊髓伤害感受性处理的能力表明在它们进入脊髓之前外周花生四烯乙醇胺调节疼痛输入。
炎性和神经性疼痛的调节我们还研究了FAAH活性的外周抑制是否可以影响由炎症或神经损伤引起的持续性疼痛反应。我们通过向小鼠后爪之一内注射多糖角叉菜胶来在小鼠中诱发炎性反应。这导致机械性痛觉过敏和热性痛觉过敏(对有害刺激的敏感性提高)的发展以及局部水肿(图4)。在与角叉菜胶相同时间给予的URB937(1mg-kg-1,i.p.)的单次全身注射引起机械性痛觉过敏和热性痛觉过敏的显著降低，这在角叉菜胶处理之后4小时和24小时时评价(图4a、b)。药物还抑制机械性痛觉超敏(来自非有害刺激的疼痛)，这在角叉菜胶之后24小时时测量(图4c)。这些作用局限于发炎红肿的爪(图7)，并且由CB1拮抗剂利莫那班所阻止，但不由CB2拮抗剂AM630所阻止(每一种为1mg-kg-1,i.p.)(图4a-c)。URB937在角叉菜胶注射后4小时未影响爪的水肿，但通过对CB1和CB2受体阻断均敏感的机制，在注射后24小时逆转爪的水肿(图4d)。
在另一组小鼠中，我们通过松散地系住左坐骨神经来产生外周神经损伤24。在手术后一周给药的单一剂量的URB937(1mg-kg-1,i.p.,在测试前2h)在手术的爪中减弱了热性痛觉过敏并抑制了机械性痛觉过敏和机械性痛觉超敏(图5a-c)。尤其地，通过非手术的爪的反应性变化不实现该作用，这表明URB937选择性地使由神经损伤而改变的机械阈值和热阈值正常化(图5a-c)。最后，我们检查每天一次连续4天重复注射URB937(1mg-kg-1,i.p.,在测试前2小时)的影响，在神经结扎后3天开始。该处理引发抗伤害感受作用，这与由单次药物给药而引起的抗伤害感受作用难于区分(图5d-f)，这表明URB937减轻已有的神经性疼痛而不诱发耐受性。
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表1：O-芳基氨基甲酸酯FAAH抑制剂的体外和体内表征
Figure BDA00002959996100442
a IC50在大鼠脑部的膜制备中所测量的
b在向大鼠单次注射(1mg-kg-1,i.p.)后1小时，离体测量FAAH抑制
表2
Figure BDA00002959996100451
在心脏、骨骼、肌肉、胰腺或皮肤中检测不到FAAH活性。***P<0.001;**P<0.01;n=3

Claims (30)

1.具有下列通式的化合物及其药物可接受的盐：
其中，R1选自羟基及其生理上可水解的酯、-O-羧酰胺基、-SH、-OC(O)R7、-O-CO-NR8R9和-NR8R9，其中R7为取代或未取代的烃基，并且R8和R9独立地选自氢以及取代或未取代的烃基；
R2和R3独立地选自氢以及取代或未取代的烃基；
每一R4独立地选自卤素以及取代或未取代的烃基，并且n为0至4的整数；
每一R5独立地选自卤素以及取代或未取代的烃基，并且m为0至3的整数；
R6为取代或未取代的环己基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中R1为-OC(O)R7，其中R7为取代或未取代的烃基。
3.如权利要求1所述的化合物，其中R1为O-羧酰胺基。
4.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中R2和R3均独立地选自(C1-C3)烷基和H。
5.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中R6为未取代的环己基。
6.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中R4和R5各自独立地选自卤素以及取代或未取代的(C1-C3)烷基。
7.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中R7为取代或未取代的(C1-C3)烷基。
8.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中R1为生理上可水解的酯。
9.如权利要求1所述的化合物，其中R1为羟基，并且R2和R3中的至少一个为氢。
10.如权利要求1所述的化合物，其中R1是羟基，并且R2和R3均为氢。
11.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中m为0。
12.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中n为0。
13.如前述权利要求中任一权利要求所述的化合物，其中m和n的总和为1、2或3。
14.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有下列式及其药物可接受的盐：
Figure FDA00002959996000031
15.药物组合物，其包含权利要求1至14中任一权利要求所述的化合物。
16.权利要求1至14中任一权利要求所述的化合物在制备用于在有需要的哺乳动物中抑制FAAH的药物中的用途。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述哺乳动物需要用于疼痛、炎性病症或免疫性病症的治疗。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述疼痛为伤害性疼痛、炎性疼痛或神经性疼痛。
19.如权利要求17所述的用途，其中所述哺乳动物患有炎性病症或免疫性病症。
20.用于选择性抑制外周脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)的药物组合物，所述组合物包含权利要求1至14中任一权利要求所述的化合物以及药物可接受的赋形剂。
21.用于治疗选自疼痛、炎症和免疫性病症的疾病状态的药物组合物，所述组合物包含权利要求1至14中任一权利要求所述的化合物以及药物可接受的赋形剂。
22.治疗疼痛和/或炎症的方法，其通过向有需要的哺乳动物给予治疗有效量的权利要求1至14中任一权利要求所述的化合物来实现。
23.如权利要求22所述的方法，其中治疗所述炎症。
24.如权利要求22所述的方法，其中治疗所述疼痛。
25.治疗选自疼痛、炎症和免疫性病症的疾病状态的方法，其通过向有需要的哺乳动物给予治疗有效量的权利要求1至14中任一权利要求所述的化合物来实现。
26.在有需要的哺乳动物中提高花生四烯乙醇胺、油酰基乙醇酰胺(OEA)、棕榈酰基乙醇酰胺(PEA)或硬脂酰基乙醇酰胺(SEA)的外周水平的方法，其通过给予权利要求1至14中任一权利要求所述的化合物来实现。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述OEA、PEA、SEA或花生四烯乙醇胺对于所述哺乳动物而言是内源性的。
28.如权利要求26所述的方法，其中在将所述化合物给药之前、之后或同时向所述哺乳动物给予所述OEA、PEA、SEA或花生四烯乙醇胺。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述OEA、PEA、SEA或花生四烯乙醇胺的给药与所述化合物的给药同时进行。
30.如权利要求26至29中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物需要疼痛、炎症或免疫性病症的治疗。
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