CN117288856A - 一种测定lh-1801有关物质含量的方法 - Google Patents

一种测定lh-1801有关物质含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定LH‑1801有关物质含量的方法，属于医药分析技术领域。本发明采用高效液相法测定LH‑1801原料中降解及工艺杂质的含量，采用反相色谱柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，有机溶剂为流动相B进行梯度洗脱，测定LH‑1801有关物质。各杂质及主成分之间能很好分离；其他杂质、辅料峰及溶剂峰不干扰检测；在各破坏条件下辅料及供试品产生的降解产物不干扰各杂质的测定，有关物质检测专属性良好；同时对色谱条件参数发生微小变化时对杂质的分离与检查结果无显著影响，耐用性良好。本发明能够快速、有效、准确和可靠的分离检测出LH‑1801杂质含量，有利于提高LH‑1801的产品质量，提高患者用药安全性。

Description

一种测定LH-1801有关物质含量的方法
技术领域
本发明属于医药分析技术领域，具体涉及一种测定LH-1801有关物质含量的方法。
背景技术
为了满足广大糖尿病患者的临床用药需求，中国科学院上海药物研究所通过对SGLT2抑制剂糖片段进行结构设计和修饰，结合构效关系研究，设计合成了一类结构新颖的SGLT2小分子抑制剂(LH-1801)，目前已获得了中国、美国、日本、澳大利亚的专利授权。LH-1801具有优良的SGLT2抑制活性，可改善自发性2型糖尿病模型小鼠及STZ诱导1型糖尿病模型小鼠的高血糖症，具有起效剂量低、降糖作用显著的特点。LH-1801在多个动物模型中的药效均优于上市药物达格列净，在大鼠和犬体内具有良好的药代动力学特性和安全性，是一个安全、有效、质量可控的抗糖尿病临床候选药物，具有良好的成药前景。本品的临床试验获批为2型糖尿病患者及1型糖尿病患者提供了安全有效的潜在治疗选择。
LH-1801及其制剂在国内外均未上市，该原料药及其制剂的分析方法尚无文献报道。为了保证LH-1801后续的研发和生产质量，需要对原料药及其制剂的质量进行控制。因此，研究建立一种快速、有效的检测LH-1801有关物质含量的方法，这对医药生产企业来说显得尤为迫切。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种可行性高、操作过程简单方便、适用性好，可以广泛应用于测定LH-1801有关物质含量的高效液相色谱分析法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种测定LH-1801有关物质含量的方法，采用反相色谱柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，有机溶剂为流动相B进行梯度洗脱，测定LH-1801有关物质。
进一步地，所述反相色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长250mm，内径4.6mm，柱温为30～40℃。
进一步地，所述流动相B为乙腈，流速为0.98～1.02mL/min；检测波长为210～240nm。
进一步地，所述色谱柱柱温为35℃。
进一步地，所述的流动相流速为1.0mL/min。
进一步地，检测波长为220nm。
进一步地，梯度洗脱程序如下：
时间(min) A％(v/v) B％(v/v)
0 80～100 0～20
15 30～50 70～50
45 30～50 70～50
50 20～10 80～90
60 5～10 95～90
更进一步地，梯度洗脱程序如下：
时间(min) A％(v/v) B％(v/v)
0 80 20
15 45 55
45 40 60
50 40 60
60 10 90
70 10 90
进一步地，上述的分析方法，包括以下步骤：
(1)取LH-1801原料，用溶剂溶解并配制成适量浓度的样品溶液，同时稀释成浓度为0.1％的自身对照溶液，其中所述溶剂为乙腈和水的混合溶液；
(2)分别取供试品溶液和自身对照溶液注入液相色谱仪；
(3)采用反相色谱柱，以磷酸盐缓冲液和有机溶剂为流动相进行梯度洗脱。
LH-1801为未见文献报道的新化合物，且又作为1类候选药，为保证药品质量、保障患者的用药安全，本发明为LH-1801有关物质的分析方法，解决LH-1801及其片的质量研究工作。
相比于现有技术，本发明的优点：
(1)本发明采用高效液相法测定LH-1801有关物质的含量，可以同时分析LH-1801及其杂质含量，解决未知杂质对主成分及已知杂质的干扰。
(2)本发明LH-1801和杂质之间能很好分离；其他杂质、辅料峰及溶剂峰不干扰检测；有关物质检测专属性良好；同时色谱条件参数发生微小变化时主成分与杂质的分离与检查结果没有影响，耐用性良好。
(3)本发明能够快速、有效、准确和可靠的分离检测出LH-1801的杂质情况，有利于提高LH-1801的产品质量，提高患者用药安全性。
附图说明
图1为实施例1中本发明色谱条件下供试品溶液测试色谱图；
图2为实施例1中本发明色谱条件下系统适用性色谱图；
图3为实施例1中本发明色谱条件下稀释剂色谱图；
图4为杂质2(C20H23ClO6S)的标准曲线图；
图5为杂质3(C20H21ClO6S)的标准曲线图；
图6为杂质4(C21H25ClO6S)的标准曲线图；
图7为杂质5(C20H23BrO5S)的标准曲线图；
图8为杂质6(C20H21ClO6S)的标准曲线图；
图9为杂质8(C14H15ClOS)的标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
下列实施例中涉及的LH-1801有关杂质为：杂质2(化学式：C20H23ClO6S，降解杂质)、杂质3(化学式：C20H21ClO6S，降解杂质)、杂质4(化学式：C21H25ClO6S，降解杂质)、杂质5(化学式：C20H23BrO5S，降解杂质)、杂质6(化学式：C20H21ClO6S，降解杂质)、杂质8(化学式：C14H15ClOS，起始原料引入杂质)。
采用高效液相法测定LH-1801有关物质的含量，实验条件如下：
色谱柱：Waters C18，5μm，4.6mm×250mm
流速：1.0mL/min；
柱温：35℃；
流动相A：10mmol磷酸二氢钠溶液；
流动相B：乙腈
检测波长：220nm
梯度洗脱：
时间(min) A％(v/v) B％(v/v)
0 80 20
15 45 55
45 40 60
50 40 60
60 10 90
70 10 90
实施例1
采用高效液相法测定LH-1801有关物质的含量，具体包括以下步骤：
(1)分别称取LH-1801对照品、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质8的对照品各适量，加稀释剂(乙腈：水＝50：50)溶解并稀释制成每1ml中含LH-1801约1.0mg，含杂质对照品各5.0μg的溶液，作为系统适用性溶液。
(2)取本品适量，精密称定，加稀释剂(乙腈：水＝50：50)溶解并定量稀释制成每1ml中约含1.0mg的溶液，作为供试品溶液。
(3)精密量取1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂(乙腈：水＝50：50)稀释到刻度，作为对照溶液。
(4)设置高效液相检测条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(根据主成分及已知杂质结构特征，在十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱上有较好的保留)，以磷酸盐缓冲液为流动相，流速为1.0mL/min进行梯度洗脱(为增强缓冲效果，更好的分离主峰和杂质)，柱温为35℃；检测波长为220nm(LH-1801和各杂质在220nm下吸收均较强，为了兼顾各杂质的灵敏度，因此采用220nm作为检测波长，该波长可满足各杂质的灵敏度测定要求)；
(5)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图1。由图1可知，此色谱条件下主成分在220nm检测波长下，主峰与各杂质之间能很好分离，分离度见表1，且溶剂峰不干扰测定，符合标准。
实施例2
对实施例1的检测方法进行方法验证，分别从系统适用性、破坏性试验、定量限、检测限、线性关系、滤膜吸附、精密度、准确度、溶液稳定性等几个方面进行验证，下面进行详细的说明。
(1)系统适用性
分别称取LH-1801对照品、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6、杂质8的对照品各适量，加稀释剂(乙腈：水＝50：50)溶解并稀释制成每1ml中含LH-1801约1.0mg、含杂质对照品各5.0μg的溶液。
表1：杂质定位及分离度表
名称 保留时间 分离度 理论塔板数 拖尾因子
杂质2 12.770 5.3 203142 1.01
杂质3 13.377 24.0 213709 1.00
杂质4 16.302 22.8 256843 0.99
LH-1801 19.042 3.3 463641 0.82
杂质5 19.517 3.8 192662 0.96
杂质6 20.233 30.0 171216 0.98
杂质8 29.327 n.a. 81076 0.97
(2)破坏性试验
取LH-1801原料进行破坏性试验溶液制备，破坏考察结果见表2：
未破坏溶液：称取本品，用溶剂溶解并稀释至刻度。
酸降解试液1：称取本品，加1ml溶剂溶解，经强酸室温放置，中和后，用溶剂稀释至刻度，制成酸降解溶液1。
酸降解试液2：称取本品，加1ml溶剂溶解，经强酸60℃加热，中和后，用溶剂稀释至刻度，制成酸降解溶液2。
碱降解试液1：称取本品，加1ml溶剂溶解，经强碱室温放置，中和后，用溶剂稀释至刻度，制成碱降解试液1。
碱降解试液2：称取本品，加1ml溶剂溶解，经强碱60℃加热，中和后，用溶剂稀释至刻度，制成碱降解试液2。
氧化降解试液1：称取本品，加1ml溶剂溶解，经3％过氧化氢溶液室温放置，用溶剂稀释至刻度，制成碱降解试液1。
氧化降解试液2：称取本品，加1ml溶剂溶解，经3％过氧化氢溶液60℃加热，用溶剂稀释至刻度，制成氧化降解试液2。
光降解试液1：称取本品，于强光条件下照射，用溶剂溶解并定容至刻度，制成光降解试液1。
光降解试验2：称取本品，加1ml溶剂溶解，于强光条件下照射，用溶剂稀释至刻度，制成光降解试验2。
热降解试液：称取本，于高温条件(80℃)下放置，用溶剂溶解并定容至刻度，制成热降解试液。
表2：破坏考察结果表
各降解试验条件下物料平衡(均在90％～108％之间)，在液体状态下，高温破坏生成三个未知杂质在220nm波长下吸收较弱，所以物料守恒低于90％，主峰纯度符合规定。酸空白、碱空白及氧化空白溶剂均不干扰检测，专属性良好。
(3)定量限和检测限试验
用逐级稀释法测其定量限(S/N≥10)、检测限(S/N≥3)，结果见表3。
表3：检测限和定量限表
(4)进样精密度
在本色谱条件下，连续进样6次，进样精密度结果见表4。
表4：进样精密度结果表
(5)溶液稳定性
在本色谱条件下，分别于0h、12h、24h、36h、48h进样，考察其日内稳定性，稳定性结果见表5。
表5：溶液稳定性结果表
(6)线性和范围
在本色谱条件下，按40％，50％，100％，200％，500％限度，配制溶液，绘制标准曲线，结果如图4-9所示。
有关物质-相对校正因子计算结果
结论：LH-1801及6个杂质在限度浓度40％～500％范围内，均呈线性，r均大于0.999。各杂质的响应因子比值均在0.2～5范围内，符合加校正因子的定量要求。
(7)重复性
精密称取LH-1801(批号：SH190801-1-4)约10mg，共6份，置于6只10mL量瓶中，分别精密加入各杂质储备液适量，用溶剂溶解至10mL，使加入的各待测杂质浓度分别为限度的100％，作为重复性供试品溶液。另取LH-1801(批号：SH190801-1-4)约10mg，配制成浓度为1mg/mL的空白供试品溶液，用于扣除样品中杂质的本底量，并稀释成0.1％的对照溶液。取上述溶液分别进样，考察6份样品中杂质加样回收率测定的RSD值，作为重复性考察指标，结果见表6。
表6：重复性试验表
试验结果表明：样品中各杂质的加样回收率的RSD均<10％，重复性较好。
(8)中间精密度
按重复性项下操作，在不同日期、不同仪器上同法操作，计算两次实验所测得各杂质含量的精密度。结果见表7，测定结果显示，两次试验结果所测得杂质加样回收率的RSD值均<10％，中间精密度较好。
表7：中间精密度试验表
(9)回收率
取LH-1801(批号：SH190801-1-4)约10mg，精密称定，共9份，置9支10mL量瓶中，分别精密加入杂质储备液适量，用溶剂溶解至10mL，使各待测杂质的浓度分别为限度浓度的80％、100％、120％，每个浓度各三份，作为回收率供试品溶液。另取本品约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液，用于扣除样品中杂质的本底量，并稀释0.1％对照溶液。取以上供试品溶液、0.1％对照溶液和杂质对照品溶液各10μl，分别进样，记录色谱附图。量取峰面积，以加校正因子的主成分自身对照法计算杂质1～杂质13的测得量，计算回收率。加样回收率测定结果分别见表8-表13。
表8：杂质2加样回收率测定结果表
表9：杂质3加样回收率测定结果表
表10：杂质4加样回收率测定结果表
表11：杂质5加样回收率测定结果表
表12：杂质6加样回收率测定结果表
表13：杂质8加样回收率测定结果表
(10)有关物质HPLC方法的耐用性
参照《中国药典》通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则，对LH-1801有关物质方法进行耐用性试验。取系统适用性溶液进样，分别改变柱温(±2℃)、流速(±0.02mL/min)、波长(±2nm)、水相起始比例(±2％)，考察LH-1801峰理论塔板数、拖尾因子、主峰与相邻杂质的分离度以及杂质间分离度，针对本色谱条件主要进行的耐用性研究项目，具体结果见下表。
表14：有关物质HPLC方法的耐用性表
研究结果表明：改变柱温(±2℃)、流速(±0.02mL/min)、波长(±2nm)、水相起始比例(±2％)，DC892081及各有关物质的拖尾因子均小于2.0，相邻杂质峰与DC892081峰的分离度均大于1.5，各杂质均能得到有效分离，说明本方法耐用性良好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种测定LH-1801有关物质含量的方法，其特征在于，采用反相色谱柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，有机溶剂为流动相B进行梯度洗脱，测定LH-1801中有关物质。
2.根据权利要求1所述测定LH-1801有关物质含量的方法，其特征在于，所述反相色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长250mm，内径4.6mm，柱温为30～40℃。
3.根据权利要求1所述测定LH-1801有关物质含量的方法，其特征在于，所述流动相B为乙腈，流速为0.98～1.02mL/min；检测波长为210～240nm。
4.根据权利要求2所述测定LH-1801有关物质含量的方法，其特征在于，所述色谱柱柱温为35℃。
5.根据权利要求3所述测定LH-1801有关物质含量的方法，其特征在于，所述的流动相流速为1.0mL/min。
6.根据权利要求3所述测定LH-1801有关物质含量的方法，其特征在于，检测波长为220nm。
7.根据权利要求1所述测定LH-1801有关物质含量的方法，其特征在于，梯度洗脱程序中体积百分比随时间变化如下：0min，A为80％-100％，B为0％-20％；15min，A为30％-50％，B为50％-70％；45min，A为30％-50％，B为50％-70％；50min，A为10％-20％，B为80％-90％；60min，A为5％-10％，B为90％-95％。
8.根据权利要求7所述测定LH-1801有关物质含量的方法，其特征在于，梯度洗脱程序中体积百分比随时间变化如下：0min，A为80％，B为20％；15min，A为45％，B为55％；45min，A为40％，B为60％；50min，A为40％，B为60％；60min，A为10％，B为90％。
9.根据权利要求1所述测定LH-1801有关物质含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取LH-1801原料，用溶剂溶解并配制成适量浓度的样品溶液，同时稀释成浓度为0.1％的自身对照溶液，其中所述溶剂为乙腈和水的混合溶液；
(2)采用反相色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸盐缓冲液和有机溶剂为流动相进行梯度洗脱；
(3)设置高效液相色谱仪检测器检测波长为220nm；
(4)分别取供试品溶液和自身对照溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
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