CN115266956A - 自胶束化固体分散体中人参皂苷ck的血药浓度定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了自胶束化固体分散体中人参皂苷CK的血药浓度的定量分析方法，采用UPLC‑MS/MS分析方法，能够同时测定人参皂苷CK和PPD的血浆暴露量，该方法对流动相进行了优化，在流动相中添加NH4HCO3和氨水。经验证，本发明的方法在选择性、样品残留、线性范围和定量下限、方法的精密度与准确度、基质效应、稳定性等方面均能满足样品分析要求，为自胶束化固体分散体中人参皂苷CK的血药浓度的定量分析提供了可靠的依据。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及一种药物成分的血药浓度定量分析方法，具体来说，涉及自胶束化固体分散体中人参皂苷CK的血药浓度定量分析方法。
背景技术
人参皂苷化合物K（Ginsenoside compound K，人参皂苷CK，CK）于1972年在人参皂苷的土壤细菌水解产物中被发现，并进行结构鉴定，其结构式为：
分子式为C36H62O8，分子量为622.87Da。人参皂苷CK是原人参二醇如人参皂苷Rb1、Rb2、Rc等在肠道菌群中主要的代谢产物，它能进一步代谢成20（S）PPD。有报道称人参皂苷的抗癌活性和糖基的数目成反比，而CK只有一个葡萄糖基，被认为是人参中最重要的活性物质。人参皂苷CK是人参皂苷的主要代谢产物之一，具有多种药理活性，研究表明人参皂苷CK具有很好的抗细胞突变、抑制肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤细胞耐药性和抗肿瘤诱导的血管生成等活性，还可以增强放疗和化疗的效果。除此之外，人参皂苷CK还有具有抗过敏和抗炎活性，并且可以起到神经保护作用，抗糖尿病作用和抗皮肤衰老作用。人参皂苷CK药理作用显著，但几乎不溶于水，pH在5.0-8.0范围内LogP在1-3之间，提示CK是偏脂溶性药物，其水中溶解度仅为35.2μg/mL，大鼠口服生物利用度只有4.3%，严重限制了其临床应用。因此，提高人参皂苷CK的水中溶解性，增加口服吸收，进而提高其生物利用度，是人参皂苷CK临床应用中亟待解决的问题。
自胶束化固体分散体属于第五代固体分散体，是药物高度分散于固体载体中形成的一种以固体形式存在的分散系统，遇水相可以自组装形成胶束，能够提高难溶性药物的溶出速率和溶解度，延缓或控制药物释放，提高药物的稳定性，提高药物的生物利用度。
血药浓度是指药物吸收后在血浆内的总浓度，包括与血浆蛋白结合的或在血浆游离的药物，有时也可泛指药物在全血中的浓度。药物作用的强度与药物在血浆中的浓度成正比， 因此血药浓度可以反应药物的药效。
石家庄以岭药业股份有限公司于2020年7月17日申请了名称为“一种含有人参皂苷CK的制剂组合物及其制备方法”的发明专利，专利中公开了人参皂苷CK的自胶束化固体分散体制剂，但未提供自胶束化固体分散体中人参皂苷CK的血药浓度的定量分析方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种自胶束化固体分散体中人参皂苷CK的血药浓度的定量分析方法，为人参皂苷CK的自胶束化固体分散体的血药浓度研究提供方法依据。
为了实现上述目的，发明人提供了以下技术方案。
自胶束化固体分散体中人参皂苷CK的血药浓度定量分析方法，采用UPLC-MS/MS，包括以下操作步骤：
a. 人参皂苷CK系列标准溶液的配制：精密称量人参皂苷CK标准品，置于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到人参皂苷CK储备液，取八个不同体积的储备液，加50%乙腈稀释，获得人参皂苷CK系列标准溶液，备用；
b. 原人参二醇系列标准溶液的配制：精密称量原人参二醇标准品，置于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到原人参二醇储备液，取八个不同体积的储备液，加50%乙腈稀释，获得原人参二醇系列标准溶液，备用；
c. 内标工作液的配制：精密称量地高辛标准品适量，置于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制备得到浓度为1mg/mL的地高辛储备液；精密量取地高辛储备液适量，置于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制备得到浓度为30ng/mL的内标工作液，备用；
d. 供试样品的制备：取血浆样本，加入步骤c制备得到的内标工作液，涡流振荡，离心，得到上清液，即供试样品，备用；
e. 色谱条件：C18 色谱柱；流动相A为水，水中添加NH4HCO3和氨水，流动相B为乙腈；梯度洗脱；柱温30℃，流速0.3 mL/min，进样量2μL；
f. 质谱条件：采用电喷雾离子源，负离子模式检测，采集选用的母离子和定量子离子分别为人参皂苷CK（621.4→161.0）、原人参二醇（779.395→649.500）；离子源喷射电压为-4500V，离子源温度为500℃，扫描模式为多反应检测模式，雾化气的压强为40 psi，加热气的压强为40 psi，气帘气的压强为35.0psi，均为氮气，碰撞能为-28V，去簇电压为-130V，累积时间为80ms；
g. 测定：取人参皂苷CK系列标准溶液、原人参二醇系列标准溶液、内标工作液、供试样品进行测定，得到含量谱图。
上述血药浓度的定量分析方法，步骤a所述人参皂苷CK系列标准溶液的浓度分别为3.125 ng/mL、6.25 ng/mL、12.5 ng/mL、31.25 ng/mL、62.5 ng/mL、125 ng/mL、312.5ng/mL、625ng/mL。
上述血药浓度的定量分析方法，步骤b所述原人参二醇系列标准溶液的浓度分别为3.125 ng/mL、6.25 ng/mL、12.5 ng/mL、31.25 ng/mL、62.5 ng/mL、125 ng/mL、312.5ng/mL、625ng/mL。
上述血药浓度的定量分析方法，步骤d所述涡旋振荡的时间为10min。
上述血药浓度的定量分析方法，步骤d所述离心的转速为12000r/min，时间为10min。
上述血药浓度的定量分析方法，步骤e所述色谱柱的规格为50×2.1 mm，1.7μm。
上述血药浓度的定量分析方法，步骤e所述氨水的添加量为0.04%。
上述血药浓度的定量分析方法，步骤e所述梯度洗脱的条件如下表所示：
本发明中所述自胶束化固体分散体是指石家庄以岭药业股份有限公司于2020年7月17日申请的名称为“一种含有人参皂苷CK的制剂组合物及其制备方法”的发明专利中公开的人参皂苷CK的自胶束化固体分散体制剂。
本发明成功建立了一种UPLC-MS/MS分析方法，能够同时测定人参皂苷CK和PPD的血浆暴露量，方法对流动相进行了优化，在流动相中添加NH4HCO3，发现峰面积RSD符合要求。在优化流动相的过程中发现添加0.04%和0.02%的NH3，A响应值基本不变，考虑到NH3易挥发，最终流动相中添加NH3为0.04%，最终使得本发明方法的精密度更好。因此，本发明采用ESI源，负离子检测模式，Acquity UPLC BEH C18（50×2.1 mm, 1.7μm, Waters）柱，有机相为乙腈。MRM检测模式，人参皂苷CK的碎片离子为621.4→161.0。
经验证，本发明的方法在选择性、样品残留、线性范围和定量下限、方法的精密度与准确度、基质效应、稳定性等方面均能满足样品分析要求。
附图说明
图1为实施例1中人参皂苷CK的Q1扫描图谱。
图2为实施例1中人参皂苷CK的离子全扫描质谱图。
图3为实施例1中原人参二醇的Q1扫描图谱。
图4为实施例1中原人参二醇的离子全扫描质谱图。
图5为实施例1中地高辛的Q1扫描图谱。
图6为实施例1中地高辛的离子全扫描质谱图。
图7为实施例2中方法的选择性项下得到的MRM色谱图，A为人参皂苷CK组空白样品的谱图，B为人参皂苷CK质控样品的的谱图，C为PPD组空白样品的谱图，D为PPD质控样品的谱图，E为内标工作液的谱图。
图8为实施例2中线性范围项下人参皂苷CK的标准曲线。
图9为实施例2中线性范围项下PPD的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述内容做进一步详细的说明。
实施例1 人参皂苷CK血药浓度的测定
（一）仪器与试剂
| 液质联用仪AB5500 | AB公司 |
| Genespeed1580R高速冷冻离心机 | 基因有限公司 |
| AS20500A超声波清洗器 | 南京昕航科学仪器有限公司 |
| SI-T256涡旋混合器 | Scientific Industries公司 |
| Milli-Q超纯水仪 | 默克密理博公司 |
| Secura 225D-1CN赛多利斯精密分析天平 | 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司 |
| Heraeus Pico 21微量高速台式离心机 | 美国赛默飞世尔公司 |
| 乙腈、甲醇（色谱纯） | 德国默克MERKE公司 |
| 色谱甲酸 | 阿拉丁公司 |
| 氨水 | Sigma 公司 |
| 碳酸氢铵 | 国药集团化学试剂有限公司 |
| 地高辛 | 河南省标物生物科技有限公司 |
| CK | 上海源叶生物科技有限公司 |
| PPD | 中检院 |
（二）实验动物：
SD大鼠雄性，180-220g，雄性，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号SCXK（京）2016-0006，5只/笼，饲养于河北省中西医结合医药研究院新药评价中心动物屏障环境，进食大小鼠维持饲料，光照12h/天，温度20-23℃，相对湿度40-60%。所有动物实验按照国家和研究院实验动物相关管理条例执行。
（三）人参皂苷CK自胶束化固体分散体的制备
精密称取人参皂苷CK100.7mg、soluplus300.1mg置于圆底烧瓶中，加入10mL二氯甲烷使溶解后，采用30℃水浴旋转蒸发除去二氯甲烷；随后将圆底烧瓶置于真空干燥箱25-30℃干燥过夜；将圆底烧瓶中的固体取出，研磨后过180目筛，即得到人参皂苷CK的自胶束化固体分散体。
（四）溶液的配制
标准溶液的配制：分别精密称量CK及原人参二醇（PPD）标准品10.0mg，分别置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，获得浓度为 1.0 mg/mL 的储备液。分别取储备液适量，加50%乙腈稀释，获得CK及PPD 浓度分别为 3.125、6.25、12.5、31.25、62.5、125、312.5、625ng/mL标准系列溶液。
内标工作液的配制：精密称量内标地高辛（IS）适量，溶解定容得到1mg/mL的IS储备液，再用乙腈适当稀释得到30ng/mL的内标工作液。
（五）色谱条件
ACQUITY UPLC BEH C18 (50×2.1 mm, 1.7μm, Waters) 色谱柱，流动相A为含有5mM NH4HCO3-0.04%NH3的水， B为乙腈，柱温30℃，流速0.3 mL/min，进样量2μL，梯度洗脱过程如表1所示。
（六） 质谱条件
采用电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测，采集选用的母离子和定量子离子分别为CK（621.4→161.0）和PPD（779.395→649.500）。离子源喷射电压-4500V，离子源温度500℃，扫描模式为多反应检测模式（MRM），雾化气（GS1）40 psi，加热气（GS2）40 psi，气帘气35.0psi，均为氮气，碰撞能-28V，去簇电压-130V，累积时间80ms。
（七）血浆的获得
SD大鼠单次灌胃给与CK原料药和人参皂苷CK自胶束化分散体CK-SSD（35mg/Kg，按CK计算），分别于给药后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48h眼内眦静脉丛取血，离心得到血浆。
（八）血浆样品的处理
采用沉淀蛋白法，取50μL血浆加入150μL内标工作液，涡流10min，12000r/min离心10min，留取上清液。
（九）检测
进行超高液相色谱-串联质谱UPLC-MS/MS分析，得到谱图，详见附图1、附图2、附图3、附图4、附图5、附图6。
实施例2 方法学验证
发明人对本发明提供的分析方法进行了方法学考察，包括方法的选择性、样品残留、线性范围和定量下限、方法的精密度与准确度、提取回收率、基质效应考察、稳定性考察、稀释可靠性等，具体如下：
（一）方法的选择性
取大鼠空白血浆按照实施例1中血浆样品的处理项中血浆预处理方法制备成空白血浆样品、零浓度样品、含有人参皂苷CK和PPD的质控样品，证明该生物分析方法应能区分目标分析物、IS与基质的内源性物质，干扰组分的响应低于待测物定量下限（LLOQ）响应值的20%，并低于IS响应值的5%时。
测定5份不同供体的SD大鼠血浆样品，得附图7，结果显示CK、PPD和IS的保留时间分别为1.63min、2.54min和0.46min，空白样品在待测化合物和IS的保留时间处无干扰峰，该方法选择性良好。
（二）残留
残留通过定量上限血浆样品后运行空白样品来验证。高浓度样品之后在空白样品中的残留应不超过定量下限的20%，并且不超过内标的5%。
运行定量上限（ULOQ）血浆样品后，运行空白样品，CK的残留为定量下限的1.88±0.89%，IS的峰面积为1.12E+05 ±6202.86，CK残留为内标的0.06±0.03%。PPD的残留为其定量下限的2.73±0.95%，残留为内标的0.37±0.14%，说明两种待测物均无残留，结果如表2所示。
（三）线性范围
取人参皂苷CK和PPD标准系列样品，按血浆样品处理方法，加入3倍量乙腈沉淀蛋白后，涡旋10min，12000r/min离心10min，取上清进样2μL。分别以人参皂苷CK和PPD浓度为横坐标，以人参皂苷CK、PPD的内标校正后的峰面积作为纵坐标，使用加权（W=1/
χ2）最小二乘法进行一元线性回归，建立标准曲线，样品重复三批。
以待测物峰面积与内标的峰面积比为纵坐标，以浓度为横坐标，拟合成标准曲线，CK和PPD的线性范围均为3.13-625 ng/mL，回归方程参数如表3、表4和附图8、附图9所示，所有标准曲线的相关系数r>0.99，RSD<5%。表3为人参皂苷CK标准曲线参数，表4为PPD标准曲线参数。
（四）方法的精密度与准确度
批内精密度：取空白血浆按实施例1中血浆样品的处理方法对样品进行处理，每个分析批中包括4个浓度水平（LLOQ、低、中、高，），每浓度水平5个质控样本，要求分析批内低、中、高浓度水平的RSD（%）不大于15%，LLOQ的RSD（%）不大于20%。
批间精密度：在2天内考察3个分析批，所有分析批间低、中、高浓度批间RSD（%）不大于15%，LLOQ批间RSD（%）不大于20%。
准确度：每批低、中、高浓度质控样本的平均准确度（实测值的平均值/理论值×100%）介于85~115%之间。LLOQ的准确度（实测值的平均值/理论值×100%）应介于80~120%之间。至少取一个分析批进行批内准确度考察，对于批间准确度至少考察3个分析批，且至少两天进行考察。
CK的LLOQ样本批内精密度介于3.43-10.34%之间；批间精密度为5.57%；平均准确度介于92.83-103.41%。CK的质控样本批内精密度介于3.77-11.54%之间；批间精密度介于1.73-1.81%之间；平均准确度介于94.82-111.29%。结果见表5和表6，说明本发明的方法精密度和准确度良好。
PPD的LLOQ样本批内精密度介于6.7-10.34%之间；批间精密度为8.47%；平均准确度介于93.67-107.79%。CK的质控样本批内精密度介于3.85-11.04%之间；批间精密度介于1.86-4.13%之间；平均准确度介于96.95-111.54%。结果见表7和表8，说明本发明的方法精密度和准确度良好。
（五）提取回收率和基质效应考察
本研究采用低和高两种浓度计算提取回收率和基质效应，取空白血浆加入标准溶液经样品预处理后，得到样品谱峰面积（A）。取不同供体的空白基质代替空白血浆经上述步骤得到色谱峰面积（B）。
同时以蒸馏水代替血浆另取标准溶液、内标工作液等，经过涡旋离心后，取上清液进行分析，得到色谱峰面积（C）。所有样品平行操作六份。用以下公式计算提取回收率和基质效应：
提取回收率= A与内标峰面积比值/B分析物峰面积与内标峰面积比值×100%。
基质效应= B与内标峰面积比值/C分析物峰面积与内标峰面积比值×100%。
本研究采用低和高两种浓度计算提取回收率和基质效应，人参皂苷CK及PPD的提取回收率见表9，其值在68.91-85.36%范围内，基质效应在91.47-108.22%范围内，PPD的提取回收率其值在68.33-83.46%范围内，基质效值在88.43-109.42%范围内。结果表明，血浆中内源性化合物对CK和PPD的离子化无显著影响。
（六）血浆稳定性考察
新鲜配制的稳定性样本（即刻浓度C0），常温放置约6小时、反复冻融3次和-80℃放置60天，每个浓度，每个条件平行五个样本。
同一浓度稳定性样本的精密度应不大于15%；平均准确度（实测值的平均值/理论值×100%）应介于85~115%之间。
本实验考察了人参皂苷CK血浆低浓度和高浓度在不同条件下的稳定性，结果见表10。人参皂苷CK常温放置约6小时、反复冻融3次和-80℃放置60天，样本平均准确度（%）介于89.76-112.43%之间，LQ的RSD介于2.76-10.18%之间，HQ的RSD介于1.93到9.53之间。
考察PPD血浆低浓度和高浓度在不同条件下的稳定性，结果见表11。PPD常温放置约6小时、反复冻融3次和-80℃放置60天，样本平均准确度（%）介于99.2到108%之间，LQ的RSD介于4.16和9.37之间，HQ的RSD介于3.99%和8.4%之间。
（七）大鼠口服生物利用度研究
取健康SD大鼠雄性12只，体重200g左右，随机分为两组，每组6只，实验前禁食12h，不禁水。第一组口服人参皂苷CK原料药35mg/kg（0.5%CMC-Na混悬液），第二组口服CK-SSD（按CK35mg/kg给药）。大鼠给药后，分别于5min、15min、30 min、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h、48h眼内眦静脉丛取血0.20mL，放入含抗凝剂的EP管中，4000r/min离心10分钟，得到血浆样品，-80℃冰箱保存备用。
样品按照预处理方法处理后UPLC-MS/MS测定血浆中CK和PPD的药物含量，每个分析批包括空白样品、零值样品（含内标的基质样品）、适量QC样品（低、中、高浓度）和被分析的试验样品。
大鼠口服人参皂苷CK原料药、CK-SSD后，其主要药动参数见表12CK和CK-SSD的Cmax分别为253.6±143.3和518.05±185.0μg/L，CK-SSD的最大血药浓度是CK的2.04倍。CK的AUC(0-24)为1203.1±636.6μg/mL•h，CK-SSD的AUC(0-24)为2434.2± 2008.3μg/mL• h，是CK的2.02倍。CK-SSD的AUC(0-24)和Cmax与CK的有显著差异（P<0.05）。CK和CK-SSD的t1/2分别为5.4±0.8和4.8±2.5 h。CK-SSD的Tmax为0.4±0.1 h，CK的Tmax为3.0±0h。CK和 CK-SSD的MRT(0-24)分别为6.7±0.8 h 和6.8±1.6 h。CK-SSD的相对生物利用度（BA）为202%。
（八）数据采集及统计处理
使用AB公司的Analyst 1.6.2输出原始数据和色谱图，计算测定样本浓度。实验数据用DAS软件进行数据处理，计算药代动力学参数，包括：Cmax、t1/2、MRT(0-t)、Tmax、AUC(0-t)、AUC(0-∞)等，并使用SPSS19等对血浆中药物暴露水平（AUC、Cmax等）进行显著性分析。
Claims (8)
1.自胶束化固体分散体中人参皂苷CK的血药浓度定量分析方法，其特征在于，采用UPLC-MS/MS，包括以下操作步骤：
a. 人参皂苷CK系列标准溶液的配制：精密称量人参皂苷CK标准品，置于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到人参皂苷CK储备液，取八个不同体积的储备液，加50%乙腈稀释，获得人参皂苷CK系列标准溶液，备用；
b. 原人参二醇系列标准溶液的配制：精密称量原人参二醇标准品，置于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到原人参二醇储备液，取八个不同体积的储备液，加50%乙腈稀释，获得原人参二醇系列标准溶液，备用；
c. 内标工作液的配制：精密称量地高辛标准品适量，置于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制备得到浓度为1mg/mL的地高辛储备液；精密量取地高辛储备液适量，置于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制备得到浓度为30ng/mL的内标工作液，备用；
d. 供试样品的制备：取血浆样本，加入步骤c制备得到的内标工作液，涡流振荡，离心，得到上清液，即供试样品，备用；
e. 色谱条件：C18 色谱柱；流动相A为水，水中添加NH4HCO3和氨水，流动相B为乙腈；梯度洗脱；柱温30℃，流速0.3 mL/min，进样量2μL；
f. 质谱条件：采用电喷雾离子源，负离子模式检测，采集选用的母离子和定量子离子分别为人参皂苷CK（621.4→161.0）、原人参二醇（779.395→649.500）；离子源喷射电压为-4500V，离子源温度为500℃，扫描模式为多反应检测模式，雾化气的压强为40 psi，加热气的压强为40 psi，气帘气的压强为35.0psi，均为氮气，碰撞能为-28V，去簇电压为-130V，累积时间为80ms；
g. 测定：取人参皂苷CK系列标准溶液、原人参二醇系列标准溶液、内标工作液、供试样品进行测定，得到含量谱图。
2.根据权利要求1所述的血药浓度的定量分析方法，其特征在于，步骤a所述人参皂苷CK系列标准溶液的浓度分别为3.125 ng/mL、6.25 ng/mL、12.5 ng/mL、31.25 ng/mL、62.5ng/mL、125 ng/mL、312.5 ng/mL、625ng/mL。
3.根据权利要求1所述的血药浓度的定量分析方法，其特征在于，步骤b所述原人参二醇系列标准溶液的浓度分别为3.125 ng/mL、6.25 ng/mL、12.5 ng/mL、31.25 ng/mL、62.5ng/mL、125 ng/mL、312.5 ng/mL、625ng/mL。
4.根据权利要求1所述的血药浓度的定量分析方法，其特征在于，步骤d所述涡旋振荡的时间为10min。
5.根据权利要求1所述的血药浓度的定量分析方法，其特征在于，步骤d所述离心的转速为12000r/min，时间为10min。
6.根据权利要求1所述的血药浓度的定量分析方法，其特征在于，步骤e所述色谱柱的规格为50×2.1 mm，1.7μm。
7.根据权利要求1所述的血药浓度的定量分析方法，其特征在于，步骤e所述氨水的添加量为0.04%。
8.根据权利要求1所述的血药浓度的定量分析方法，其特征在于，步骤e所述梯度洗脱的条件如下表所示：
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