CN114740120B - 同时定量测定阿比特龙及其五种代谢物的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种同时定量测定阿比特龙及其五种代谢物的方法及应用，属于阿比特龙药物定量检测技术领域。本方法通过LC‑MS/MS对血浆中的阿比特龙及其五种代谢物进行测定分析；以ABI‑d4的甲醇水溶液作为内标，采用ACE‑C18柱梯度洗脱，ESI串联质谱检测，使每种目标分析物在预先指定的验证浓度范围内均观察到良好的线性。所有分析物的批内和批间准确度均在87.6‑113.8％内，且批内和批间准确度低于14.0％，分析物无明显的基质效应，回收率高。在室温4h，湿冰8h，‑80℃下42天，经过三次冻融循环，在样品制备后的48h内，所有分析物在人血浆中均保持稳定。本发明的方法已应用于中国健康受试者口服醋酸阿比特龙片后的药代动力学研究。
Description
技术领域
本发明属于阿比特龙药物定量检测技术领域，特别是同时定量测定阿比特龙及其五种代谢物的方法及应用。
背景技术
尽管雄激素剥夺疗法(ADT)最初对前列腺癌患者有效，但不可避免的是，大多数患者会产生耐药性，并在1-3年内发展为转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)，而mCRPC目前仍然无法治愈。细胞色素P450(CYP450)-17，20-裂解酶和17α-羟化酶是合成雄激素和皮质醇的关键酶。醋酸阿比特龙(AA)在体内迅速水解为活性代谢物阿比特龙(ABI)，能够选择性且不可逆地抑制上述酶的活性，从而减少雄激素和皮质醇的产生，表现出抗mCRPC作用。
ABI在体内可被代谢成许多Ⅰ期和Ⅱ期代谢物。在3β-羟基类固醇脱氢酶(3βHSD)的作用下，ABI被转化为更具活性的代谢产物d4-阿比特龙(D4A)，它能够通过抑制CYP17A1癌症基因、3βHSD和类固醇-5a-还原酶(SRD5A)来减少5a-二氢睾酮(DHT)的合成。D4A具有相当强的雄激素受体拮抗活性和针对异种移植肿瘤的抗肿瘤活性。D4A的下游代谢物中，3-酮基-5α-阿比特龙(5αA)是另一种活性化合物，它能促进雄激素反应基因的表达并刺激雄激素受体标记基因。阿比特龙N-氧化物(A-NO)是ABI的另一种I期代谢物，其活性仍未知。硫酸阿比特龙(A-Sul)和硫酸阿比特龙N-氧化物(A-NO-Sul)是ABI的两种主要II期代谢产物，占人体40％以上。由于ABI在不同患者体内系统性暴露程度存在较大差异(41-141％)，可能导致不良毒性或副作用。因此在临床实践中有必要监测ABI及其主要代谢物的浓度。
在临床上，已经开发了用于同时测定ABI和其他针对雄激素受体的常用处方药物(例如比卡鲁胺和恩扎卢胺)的分析方法。目前，已经报道了几种液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法来定量人血浆中的ABI及其代谢物。D4A的定量下限(LLOQ)范围为0.075-0.5ng/mL，5αA、A-NO-Sul和A-Sul的浓度为0.1-0.5ng/mL、30ng/mL和100ng/mL，难以满足药代动力学研究的要求。此外，只有少数文献集中于同时测定ABI、I期和II期代谢物。例如，Alyamani等人(M.Alyamani,Z.Li,S.K.Upadhyay,D.J.Anderson,R.J.Auchus,N.Sharifi,Development and validation of a novel LC-MS/MS method for simultaneousdetermination of abiraterone and its seven steroidal metabolites in humanserum:Innovation in separation of diastereoisomers without use of a chiralcolumn,Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 172(2017)231-239)开发并验证了一种LC-MS/MS方法，用于同时测量人血清中的ABI及其七种I期代谢物非对映异构体。P.Caron等人(P.Caron,V.Turcotte,E.Levesque,C.Guillemette,An LC-MS/MS method for quantification of abiraterone,its active metabolites D(4)-abiraterone(D4A)and 5alpha-abiraterone,and their inactive glucuronidederivatives,Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in theBiomedical and Life Sciences 1104(2019)249-255)定量检测了ABI及其活性I期代谢物D4A和5αA以及它们相应的非活性葡萄糖醛酸代谢物。然而，上述这些方法并未针对II期硫酸化代谢物进行研究。更重要的是，上述现有的文献报道中，色谱和质谱方法的分析时间超过10min，影响分析通量与效率。最近，T.L.Dillenburg Weiss等人(T.L.DillenburgWeiss,G.M.Venzon Antunes,G.Schwartsmann,R.Linden,S.Gasparin Verza,Evaluation of dried blood spots as an alternative matrix for therapeutic drugmonitoring of abiraterone and delta(4)-abiraterone in prostate cancerpatients,Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 195(2021)113861)在对前列腺癌患者的ABI和D4A的治疗药物监测期间，采用一种干血斑的方法以克服ABI的稳定性问题。
中国专利申请CN112198244A提供了一种测定血浆中阿比特龙浓度的方法，该方法以阿比特龙-d4的甲醇水溶液为内标；液相色谱分析使用Waters XTERRA MS C18作为填充柱材料，流动相A为10mM乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液；质谱条件采用ESI源，离子化方式为电喷雾离子化正离子，MRM监测方式，极性为正离子，碎裂电压240V，碰撞能65V，阿比特龙母离子m/z为350.2，子离子m/z为155.9；阿比特龙-d4(IS)的母离子m/z为354.2，子离子的m/z为159.9。然而，该方法仅能用于阿比特龙单一化合物的分析检测，且该方法分析时间较长(6min)，不适用于高通量的阿比特龙及其多种代谢物的同时检测。
上述这些现有的方法都不能用于同时检测痕量水平的Ⅰ期代谢物和高浓度的Ⅱ期代谢物。目前，国内外均没有公开的采用液相色谱和质谱串联技术同时检测阿比特龙及其五种Ⅰ期、Ⅱ期代谢物的专利或文献报道。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种同时定量测定阿比特龙及五种代谢物的方法及其应用。本发明提供的方法能够同时检测人血浆中的阿比特龙(ABI)、d4-阿比特龙(D4A)、3-酮基-5α-阿比特龙(5αA)、阿比特龙N-氧化物(A-NO)、硫酸阿比特龙(A-Sul)和硫酸阿比特龙N-氧化物(A-NO-Sul)，利用这种方法可以应用于健康受试者临床药代动力学等研究与患者血药浓度监测，以及醋酸阿比特龙制剂研发及其相关前药开发，同时还能够用于研发同时定量测定阿比特龙及其五种代谢物的质谱检测试剂盒。具体通过以下技术实现。
同时定量测定阿比特龙及其五种代谢物的方法，包括以下步骤：
S1、分别制备阿比特龙及其五种代谢物的校正标样工作液和质控样品工作液，取校正标样工作液和质控样品工作液用空白血浆1:24稀释制成校正标样和质控样品；阿比特龙的五种代谢物分别为d4-阿比特龙、3-酮基-5α-阿比特龙、阿比特龙N-氧化物、硫酸阿比特龙和硫酸阿比特龙N-氧化物；
S2、取校正标样、质控样品或待测样品分别加入内标工作液；然后加入乙腈沉淀血浆蛋白，涡旋、离心，取上清，氮气吹干、复溶后备用；
S3、将步骤S2所得溶液分别进样LC-MS/MS系统得到色谱图；根据色谱图中分析物和内标色谱峰面积的比值，获得相应的标准曲线回归方程，计算待测样品的血浆中阿比特龙及其五种代谢物的浓度；
其中，步骤S1的阿比特龙及其五种代谢物的所述校正标样工作液是取阿比特龙及其五种代谢物的储备液，用体积比1:1的甲醇水溶液按梯度稀释配制而成；
所述质控样品工作液是取阿比特龙及其五种代谢物的储备液，用体积比1:1的甲醇水溶液按梯度稀释，分别配制成相应的LLOQ、LQC、MQC、MQC2、HQC质控样品工作液；
步骤S2的所述内标工作液是将ABI-d4(阿比特龙-d4)储备液用甲醇水溶液稀释制备而成；
所述阿比特龙及其五种代谢物的储备液和待测样品工作液在4℃保存；所述标准品工作液在检测时新制备。
优选地，步骤S1中，阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度梯度范围为12.5-5000ng/mL，d4-阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度梯度范围为0.25-100ng/mL，5α-阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度梯度范围为1.25-500ng/mL，阿比特龙N-氧化物的所述校正标样工作液的浓度梯度范围为2.5-125ng/mL，硫酸阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度梯度范围为250-100000ng/mL，硫酸阿比特龙N-氧化物的所述校正标样工作液的浓度梯度范围为625-125000ng/mL；
阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度梯度范围为12.5-3750ng/mL，d4-阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度梯度范围为0.25-75ng/mL，5α-阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度梯度范围为1.25-375ng/mL，阿比特龙N-氧化物的所述质控样品工作液的浓度梯度范围为2.5-93.75ng/mL，硫酸阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度梯度范围为250-75000ng/mL，硫酸阿比特龙N-氧化物的所述质控样品工作液的浓度梯度范围为625-93750ng/mL，即分别配制成相应的LLOQ、LQC、MQC、MQC2、HQC质控样品工作液。
优选地，步骤S1中，阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度分别为12.5、25、50、125、500、2500、4500、5000ng/mL，d4-阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度分别为0.25、0.5、1、2.5、10、5、90、100ng/mL，5α-阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度分别为1.25、2.5、5、12.5、50、250、450、500ng/mL，阿比特龙N-氧化物的所述校正标样工作液的浓度分别为2.5、5、12.5、25、50、100、120、125ng/mL，硫酸阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度分别为250、500、1000、2500、10000、50000、90000、100000ng/mL，硫酸阿比特龙N-氧化物的所述校正标样工作液的浓度分别为625、1250、5000、12500、25000、50000、120000、125000ng/mL；
阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度分别为12.5、37.5、250、1500、3750ng/mL，d4-阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度分别为0.25、0.75、5、30、75ng/mL，5α-阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度分别为1.25、3.75、25、150、375ng/mL，阿比特龙N-氧化物的所述质控样品工作液的浓度分别为2.5、3.75、12.5、37.5、93.75ng/mL，硫酸阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度分别为250、750、5000、30000、75000ng/mL，硫酸阿比特龙N-氧化物的所述质控样品工作液的浓度分别为625、1875、7500、37500、93750ng/mL，即分别配制成相应的LLOQ、LQC、MQC、MQC2、HQC质控样品工作液。
优选地，步骤S2具体为：取校正标样、质控样品或待测样品100μL，分别加入25μL内标工作液；然后分别加入400μL乙腈沉淀蛋白质，涡旋5min后，4℃、1700g离心15min；分别取250μL上清液室温氮气吹干，用125μL体积比2:8的乙腈水溶液复溶，4℃保存备用。
优选地，步骤S2的所述内标工作液是将ABI-d4储备液用体积比1:1的甲醇水溶液稀释至浓度为5ng/mL后制备而成。
优选地，步骤S3的色谱条件为：ACE-C18柱，2.1mm×50mm，5μm；流动相A为体积比0.1％甲酸的水溶液，流动相B为体积比0.1％甲酸的乙腈溶液；柱温35℃，自动进样器温度4℃；进样量20μL，流速1.0mL/min；
梯度洗脱的方式为：0-1.9min，流动相A的比例从75％变为45％，流动相B的比例从25％变为55％；1.9-2.0min，流动相A的比例从45％变为5％，流动相B的比例从55％变为95％；2.0-2.6min，流动相A的比例保持5％，流动相B的比例保持95％；2.60-2.70分钟，流动相A的比例从5％变为75％，流动相B的比例从95％变为25％；2.70-3.50分钟，流动相A的比例保持75％，流动相B的比例保持25％。
更优选地，步骤S3的质谱条件为：采用ESI源，电喷雾离子化正离子；监测方式：MRM；阿比特龙及其五种代谢物和内标ABI-d4的质谱分析条件如下表1所示。
表1阿比特龙及其五种代谢物和A-d4的质谱分析条件
| 分析物 | 母离子，m/z | 子离子，m/z | DP，V | EP，V | CE，eV | CXP，V |
| 阿比特龙 | 350.2 | 156.1 | 270 | 10 | 100 | 15 |
| d4-阿比特龙 | 348.2 | 156.2 | 163 | 10 | 58 | 15 |
| 5α-阿比特龙 | 350.2 | 156.1 | 150 | 10 | 75 | 15 |
| 阿比特龙N-氧化物 | 366.0 | 156.0 | 145 | 10 | 65 | 15 |
| 硫酸阿比特龙 | 430.2 | 332.1 | 190 | 10 | 80 | 15 |
| 硫酸阿比特龙N-氧化物 | 446.1 | 366.0 | 220 | 10 | 90 | 15 |
| 阿比特龙-d4(内标，IS) | 354.2 | 160.1 | 165 | 10 | 67 | 15 |
本发明提供的上述针对阿比特龙及其五种代谢物(d4-阿比特龙、3-酮基-5α-阿比特龙、阿比特龙N-氧化物、硫酸阿比特龙和硫酸阿比特龙N-氧化物)的检测方法，进行了选择性、线性、准确度、精密度、定量下限(LLOQ)、基质效应、回收率、稀释完整性、残留、重新再进样重现性和稳定性等方面的验证。为了获得低浓度分析物D4A的最高响应，本发明评估了在不同的流动相A(含0.1％(v/v)甲酸、5mM甲酸铵、5mM乙酸铵的水溶液)，以及不同的流动相B(乙腈、甲醇、含0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液、含0.1％(v/v)甲酸的甲醇溶液)中D4A的响应，以最大程度提升对D4A的检测灵敏度。最后发现采用0.1％(v/v)甲酸水溶液和0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液作为流动相体系，与上述色谱条件联用时，D4A的MS响应最高。
本发明的检测方法中，针对ABI、A-Sul和A-NO-Sul进行了质谱条件的优化，以避免MS信号饱和。通过将ABI的CE和DP从60V和172V更改为100V和270V，将A-Sul的CE和DP从37V和174V更改为80V和190V，将A-NO-Sul的CE和DP从35V和180V更改为90V和220V，获得了较低的MS响应。与更改前的MS条件相比，本发明对ABI、A-Sul和A-NO-Sul的响应分别降低了约80％、96％和87％。
本发明的申请人在研究时首次观察到定量上限(ULOQ)D4A样品(母离子→子离子：348.2→156.2)中存在ABI的同位素峰(母离子→子离子：350.2→156.1)干扰，该ULOQ D4A样品中ABI同位素峰干扰达38％(以ABI LLOQ分析物响应计算)，这是因为它们具有相似的质谱裂解规律和色谱行为。此外，由于ABI及其五种代谢物的化学结构的相似性，来自标准品的杂质也会对目标分析物产生显著干扰。从A-Sul ULOQ样品中ABI和D4A的干扰分别达488％与2220％(以ABI和D4A LLOQ分析物响应计算)。同样，A-NO-Sul ULOQ样品中A-NO的干扰达360％。为了将这些干扰影响降至最低，常采用每种分析物单独制备校正标样和质控样品。然而，该方法复杂、耗时，在我们当前的研究中，为A-Sul和A-NO-Sul单独配制了校正标样，并使用包含所有分析物的质控样品质控样品工作液配制时，使用基于干扰计算得出的校正因子校正配制体积。
本发明还考察了在室温下4h或24h或置于湿冰上8h或24h环境中，ABI在LLOQ和ULOQ水平下的稳定性。研究发现，在室温下24h后，超过30％的ABI被降解，而置于湿冰上8h或24h后，仅有14％的ABI被降解。本发明也考察了在相同的条件下的上述ABI的五种代谢物的稳定性。研究发现，D4A、A-NO、A-Sul和A-NO-Sul在所有测试条件下都是稳定的；在室温下24h超过29％的5αA降解，在置于湿冰上8h后，LLOQ质控样品中低于20％的5αA降解，这满足中国药典生物分析方法指南要求。本发明的所有试验结果表明，降低温度和缩短处理时间显著增加了ABI和5αA的稳定性。
最终，本发明针对阿比特龙及其上述五种代谢物，对其色谱、质谱条件、流动相A/B等的选择进行研究优化，所提供的检测方法能够同时完成上述六种成分的同时检测，并且还能保证这六种目标分析物在预先指定的验证浓度范围内均观察到良好的线性，具有较低的基质效应与较高的回收率；六种目标分析物的批内和批间准确度在87.6-113.8％范围内，而批内和批间准确度低于14.0％。
本发明还提供了一种上述的同时定量测定阿比特龙及其五种代谢物的方法的应用，用于研发同时定量测定阿比特龙及其五种代谢物的质谱检测试剂盒，或者用于阿比特龙及其五种代谢物的临床前研究(例如健康受试者临床药代动力学等研究与患者血药浓度监测)，或者用于醋酸阿比特龙制剂研发及其相关前药开发。
本发明提供的上述方法，不仅能将所用到的试剂制作成检测试剂盒，用于快速高效定量检测阿比特龙及其五种代谢物，还能用于这些化合物的临床前研究，例如针对中国人的特殊遗传特性，进行健康受试者的药代动力学研究或者患者体内血药浓度检测，或者对阿比特龙相关药物制剂的技术研发等。
以健康受试者的药代动力学研究为例，通过对45名健康的中国受试者在禁食至少10h后服用醋酸阿比特龙片剂(AA片剂)250mg。在给药前1h内以及给药后0.33、0.67、1、1.33、1.67、2、2.5、3、4、5、6、8、12、24、36、48、60、72h在EDTA-K2试管中收集血样。所有血样采集后置于冰浴中不超过2h，然后在4℃、1700g离心15min；血浆样本保存于-80℃。选用90个试验样本进行再分析(ISR)。对于至少67％的测试样本，初始浓度和再分析浓度之间的差异应小于20％。血药浓度数据采用非房室模型估算药代动力学参数。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明提供了一种同时快速高效定量检测阿比特龙及其五种代谢物的方法，这种方法具有分析时间短、测定结果准确可靠的效果。
附图说明
图1为实施例1的不同条件下ABI及其五种代谢物在人血浆中的稳定性；
图2为实施例1的空白血浆样品、LLOQ和给药后3h收集的血浆样品的代表性液相色谱-质谱图；
图3为实施例2的ABI及其代谢物的平均血浆浓度-时间曲线。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实验例：
1、本实施例提供的检测方法所使用的化学品和试剂
阿比特龙(ABI，纯度≥99.8％)、d4-阿比特龙(D4A，纯度≥99.2％)和3-酮基-5α-阿比特龙(5αA，纯度≥95.9％)购自Cato Research Chemicals公司。
阿比特龙N-氧化物(A-NO，纯度≥99.6％)、硫酸阿比特龙(A-Sul，纯度≥99.7％)、硫酸阿比特龙N-氧化物(A-NO-Sul，纯度≥92.4％)和阿比特龙-d4(ABI-d4，纯度≥99.7％)购自TLC Pharmaceutical Standards公司。
色谱级乙腈、甲醇和甲酸购自Fisher Scientific公司；二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis,MO,USA)；去离子水由ELGA净化系统制备；抗凝剂为二水合乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)，人空白血浆购自潍坊高新区人民医院。
2、本实施例提供的检测方法所使用的试验仪器
Shimadzu Prominence UFLC system购自日本岛津公司；
ACE-C18柱(2.1mm×50mm，5μm)；
Triple Quad 6500+质谱仪购自AB Sciex公司。
3、具体检测方法
S1、分别制备阿比特龙及其五种代谢物的校正标样工作液和质控样品工作液，取校正标样工作液和质控样品工作液用空白血浆1:24稀释制成校正标样和质控样品；阿比特龙的五种代谢物分别为d4-阿比特龙(D4A)、3-酮基-5α-阿比特龙(5αA)、阿比特龙N-氧化物(A-NO)、硫酸阿比特龙(A-Sul)和硫酸阿比特龙N-氧化物(A-NO-Sul)；
阿比特龙及其五种代谢物的所述校正标样工作液是取阿比特龙及其五种代谢物的储备液，A-Sul和A-NO-Sul的储备液浓度为1mg/mL，阿比特龙和其他代谢物的储备液浓度为0.5mg/mL，用体积比1:1的甲醇水溶液将阿比特龙稀释为12.5、25、50、125、500、2500、4500、5000ng/mL，将d4-阿比特龙稀释为0.25、0.5、1、2.5、10、5、90、100ng/mL，将5α-阿比特龙稀释为1.25、2.5、5、12.5、50、250、450、500ng/mL，将阿比特龙N-氧化物稀释为2.5、5、12.5、25、50、100、120、125ng/mL，将硫酸阿比特龙稀释为250、500、1000、2500、10000、50000、90000、100000ng/mL，将硫酸阿比特龙N-氧化物稀释为625、1250、5000、12500、25000、50000、120000、125000ng/mL配制而成；
所述质控样品工作液是取阿比特龙及其五种代谢物的储备液，用体积比1:1的甲醇水溶液将阿比特龙稀释为12.5、37.5、250、1500、3750ng/mL，将d4-阿比特龙稀释为0.25、0.75、5、30、75ng/mL，将5α-阿比特龙稀释为1.25、3.75、25、150、375ng/mL，将阿比特龙N-氧化物稀释为2.5、3.75、12.5、37.5、93.75ng/mL，将硫酸阿比特龙稀释为250、750、5000、30000、75000ng/mL，将硫酸阿比特龙N-氧化物稀释为625、1875、7500、37500、93750ng/mL，即分别配制成相应的LLOQ、LQC、MQC、MQC2、HQC质控样品工作液；
所述阿比特龙及其五种代谢物的储备液和待测样品工作液在4℃保存；所述标准品工作液在检测时新制备；
S2、分别取校正标样、质控样品和待测样品100μL，分别加入25μL内标工作液；然后分别加入400μL乙腈沉淀蛋白质，涡旋5min后，4℃、1700g离心15min；分别取250μL上清液室温氮气吹干，用125μL体积比2:8的乙腈水溶液复溶，4℃保存备用；
所述内标工作液是将ABI-d4储备液用体积比1:1的甲醇水溶液稀释至浓度为5ng/mL后制备而成；
S3、将步骤S2所得溶液分别进样LC-MS/MS系统得到色谱图；根据色谱图中分析物和内标的色谱峰面积的比值，获得相应的标准曲线回归方程，计算待测样品的血浆中阿比特龙及其五种代谢物的浓度；
色谱条件为：ACE-C18柱，2.1mm×50mm，5μm；流动相A为体积比0.1％甲酸的水溶液，流动相B为体积比0.1％甲酸的乙腈溶液；柱温35℃，自动进样器温度4℃；进样量20μL，流速1.0mL/min；
梯度洗脱的方式为：0-1.9min，流动相A的比例从75％变为45％，流动相B的比例从25％变为55％；1.9-2.0min，流动相A的比例从45％变为5％，流动相B的比例从55％变为95％；2.0-2.6min，流动相A的比例保持5％，流动相B的比例保持95％；2.60-2.70分钟，流动相A的比例从5％变为75％，流动相B的比例从95％变为25％；2.70-3.50分钟，流动相A的比例保持75％，流动相B的比例保持25％；
质谱条件为：采用ESI源，电喷雾离子化正离子；监测方式：MRM；阿比特龙及其五种代谢物和ABI-d4的质谱分析条件如上述表1所示。
4、本实施例的检测方法的验证
本实施例提供的阿比特龙及其五种代谢物的LC-MS/MS方法验证包括选择性、线性、准确度、精密度、定量下限(LLOQ)、基质效应、回收率、稀释可靠性、残留、重新再进样重现性和稳定性，符合中国药典生物分析方法指南要求。
(1)选择性
通过分析6种不同来源的空白血浆和LLOQ样品来评估选择性，以确定每种分析物和内标在保留时间的干扰峰面积是否低于LLOQ的20％(分析物)和5％(内标)峰面积。
此外，对不含内标的每种分析物的定量上限(ULOQ)样品分别进行处理，并与仅含IS的空白血浆样品一起分析，以检测ABI及其各代谢物与IS之间的干扰。每种分析物的干扰应≤20％，IS的干扰应≤5％。
(2)线性和LLOQ
制备并分析了8个浓度水平的校正标样，以获得标准曲线。ABI的分析物浓度范围为0.5-200ng/mL，D4A为0.01-4ng/mL，5αA为0.05-20ng/mL，A-NO为0.1-5ng/mL，A-Sul为10-4000ng/mL，A-NO-Sul为25-5000ng/mL。至少75％的校正标样计算浓度的准确度偏差应在±15％(LLOQ为±20％)，表明分析物的线性是可接受的。
LLOQ的批内(n＝6)和批间(n＝18)准确度和精密度均按照准确度在±20％以内，精密度在20％以内的接受标准进行评估。
(3)准确度和精密度
为了确定准确度和精密度，在三个单独的批次中测量了四种浓度的QC样品，包括低浓度质控样品(LQC)、中浓度质控样品(MQC)、中浓度质控样品2(MQC2)和高浓度质控样品(HQC)。批内(n＝6)和批间(n＝18)的相对误差(RE)应为±15％，相对标准偏差(RSD)应为±15％。
(4)基质效应和回收率
使用来自6个不同来源的空白血浆，通过比较LQC和HQC浓度水平的含/不含血浆，样品的响应来评估基质效应。内标校正基质因子(MF)从每种分析物与内标的MF比值中获得，应在0.85-1.15的范围内。RSD应不超过15％。此外，通过比较提取前后加质控样品工作溶液分析物峰面积计算回收率。
(5)稀释可靠性
对于每种分析物，稀释质控(DQC)样品的浓度是定量上限(ULOQ)样品浓度的4倍。用空白血浆按照体积比1:5稀释DQC血浆样品，然后进行LC-MS/MS分析。RE和RSD应分别为±15％和小于15％。
(6)残留
在ULOQ样本后测量空白血浆样本，以评估残留。对于LLOQ样品中的分析物和IS，每种分析物和IS保留时间的干扰峰面积应分别≤20％和≤5％。
(7)重新进样重现性
首次测定后，所有校正标样和质控样品(n＝6)在自动进样器(4℃)中储存91h，然后重新分析以测试重新进样的重现性。LLOQ的RE为±20％，RSD不超过20％，其他校正标样和质控样品的RE为±15％，RSD不超过15％。
(8)稳定性
在5种条件下进行了LQC和HQC浓度水平的血浆样品稳定性研究：①短期稳定性，室温条件下放置4h，②短期稳定性，湿冰条件下放置8h，③长期稳定性，-80℃条件下放置42d，④三次冻融循环(-80℃与室温放置)，⑤自动进样器，4℃条件下放置48h。
在同一个分析批次(n＝6)中分析测试样品和对照样品。如果RE为±15％，则认为人血浆中的ABI及其代谢物是稳定的。
对于短期稳定性，储备液和工作溶液均在室温下放置24h。对于长期稳定性，储备液和工作溶液分别在4℃下储存34d和44d。稀释并分析6份纯溶液，RE和RSD分别为±10％和不超过15％。
5、方法的验证结果
本发明提供的上述针对阿比特龙及其五种代谢物(d4-阿比特龙、3-酮基-5α-阿比特龙、阿比特龙N-氧化物、硫酸阿比特龙和硫酸阿比特龙N-氧化物)的检测方法，进行了选择性、线性、准确度、精密度、定量下限(LLOQ)、基质效应、回收率、稀释完整性、残留、重新再进样重现性和稳定性等方面的验证。
本发明针对阿比特龙及其上述五种代谢物，对其色谱、质谱条件、流动相A/B等的选择进行研究优化，所提供的检测方法能够同时完成上述六种成分的同时检测，并且还能保证这六种目标分析物在预先指定的验证浓度范围内均观察到良好的线性，最大程度降低了基质效应影响，提高了目标物的回收率；六种目标分析物的批内和批间准确度在87.6-113.8％范围内，而批内和批间准确度低于14.0％。
(1)选择性
空白血浆样品、LLOQ和给药后3h收集的血浆样品的代表性液相色谱-质谱图如图2所示。在空白血浆样品中，在每种分析物和内标的保留时间均未观察到干扰。对于每种分析物，仅含IS的样品中分析物的峰面积不超过LLOQ的1.0％，而不含IS的ULOQ样品中IS的峰面积不超过从LLOQ样品获得的IS响应的0.3％。
(2)线性和LLOQ
阿比特龙及其五种代谢物的标准曲线方程分别为：
ABI：y＝0.108x+0.00955，r＝0.9986；
D4A：y＝1.10x+-0.000260，r＝0.9978；
5αA：y＝0.648x+-0.00487，r＝0.9968；
A-NO：y＝0.290x+0.00384，r＝0.9990；
A-Sul：y＝0.000665x+0.00139，r＝0.9981；
A-NO-Sul：y＝0.000768x+0.00359，r＝0.9994。
每种校正标样回算浓度的准确度在理论浓度的±15％以内，而LLOQ样品的准确度允许在±20％以内。如下表2所示，所有分析物的LLOQ准确度为87.6％至107.7％，精密度低于13.8％。
表2人体血浆中ABI及其5种代谢物的批内(n＝6)和批间(n＝18)准确度和精密度
(3)准确度和精密度
上表2中列出了每个QC样品的准确度和精密度结果。ABI的批内和批间准确度为89.0-113.8％，D4A为96.3-106.9％，5αA为94.4-107.3％，A-NO为91.4-106.8％，A-Sul为96.8-109.3％，A-NO-Sul为87.6-108.9％。
ABI、D4A、5αA、A-NO、A-Sul和A-NO-Sul的批内和批间精密度分别低于6.8％、14.0％、9.5％、12.2％、11.2％和12.2％。
(4)基质效应和回收率
如下表3所示，在LQC和HQC浓度水平下考察了基质效应和回收率。内标校正的MF介于96.0％-113.7％之间，表明人血浆中ABI及其代谢物在人血浆的基质效应可忽略。此外，分析物和IS的回收率较高，满足分析检测要求。
表3ABI及其代谢物在人血浆中的回收率与基质效应(n＝6)
(5)稀释可靠性
稀释可靠性结果表明，DQC样品中ABI、D4A、5αA、A-NO、A-Sul和A-NO-Sul的RE值分别为94.2％、98.4％、106.1％、102.1％、93.5％和88.8％，RSD值分别为3.3％、5.2％、6.1％、3.6％、5.3％和4.1％，说明采用本实施例的方法的稀释可靠性是可接受的，高于ULOQ的血浆样品应该用空白血浆稀释5倍进行准确定量。
(6)残留
ULOQ样品分析后，立即测定空白血浆样品。在所有分析批次中，6种分析物和IS的保留时间处均未观察到干扰峰。因此，该方法中的残留被认为是可接受的。
(7)重新进样重现性
如表4所示，所有分析物的RE值在86.2-114.3％之间，而RSD低于13.0％。这说明，处理后的样品可在91h内重新分析。
表4人血浆中ABI及其代谢物的重新进样重现性(n＝6)
(8)稳定性
如表5所示，ABI及其代谢物在人血浆中被证实可在室温4h内保持稳定；在湿冰8h内保持稳定；在-80℃，42天保持稳定，并在三次冻融循环(-80℃)后保持稳定。
处理后的样品在自动进样器温度(4℃)下48h保持稳定。此外，储备溶液和工作溶液在室温4h内保持稳定，在4℃条件下分别稳定34天和44天。
表5不同条件下ABI及其代谢物在人血浆中的稳定性(n＝6)
实施例2：实施例1的方法在药代动力学领域的应用
在单次口服250mg AA片剂(250mg，Janssen-Cilag International N.V.)后，收集了45名中国健康志愿者的血浆样品，并首次通过我们验证的LC-MS/MS方法同时测定了ABI及其五种I相和II相代谢物的药代动力学特征。
ABI及其代谢物的平均血浆浓度-时间曲线如图3所示。ISR结果表明，初始数据和重新分析数据之间的差异至少有92.3％在±20％范围内。如表6所示，ABI的AUC0-t、AUC0-∞、t1/2、Cmax、Tmax和CL/F分别为239.52±137.96ng·h/mL、249.69±140.00ng·h/mL、2.22±1.54h、52.54±28.62ng/mL、8.60±3.99h和1.49±1.55mL/h。
D4A和5αA的Tmax分别为3.21h和3.36h，t1/2分别为13.58h和23.60h。5αA的t1/2的个体间变异高达71.6％，可能是与3β-羟类固醇脱氢酶1(3βHSD1)的遗传多态性有关。A-Sul和A-NO-SulTmax在中国人和白种人间无明显差异。A-Sul和A-NO-Sul的中国人体内t1/2分别为7.29h和9.65h，而白种人t1/2分别为2.47h和21.6h。
表6中国健康受试者单剂量口服250mg醋酸阿比特龙后ABI及其代谢物的药代动力学参数。
以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.同时定量测定阿比特龙及其五种代谢物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、分别制备阿比特龙及其五种代谢物的校正标样工作液和质控样品工作液，取校正标样工作液和质控样品工作液用空白血浆1:24稀释制成校正标样和质控样品；阿比特龙的五种代谢物分别为d4-阿比特龙、3-酮基-5α-阿比特龙、阿比特龙N-氧化物、硫酸阿比特龙和硫酸阿比特龙N-氧化物；
阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度梯度范围为12.5-5000ng/mL，d4-阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度梯度范围为0.25-100ng/mL，5α-阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度梯度范围为1.25-500ng/mL，阿比特龙N-氧化物的所述校正标样工作液的浓度梯度范围为2.5-125ng/mL，硫酸阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度梯度范围为250-100000ng/mL，硫酸阿比特龙N-氧化物的所述校正标样工作液的浓度梯度范围为625-125000ng/mL；
阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度梯度范围为12.5-3750ng/mL，d4-阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度梯度范围为0.25-75ng/mL，5α-阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度梯度范围为1.25-375ng/mL，阿比特龙N-氧化物的所述质控样品工作液的浓度梯度范围为2.5-93.75ng/mL，硫酸阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度梯度范围为250-75000ng/mL，硫酸阿比特龙N-氧化物的所述质控样品工作液的浓度梯度范围为625-93750ng/mL，即分别配制成相应的LLOQ、LQC、MQC、MQC2、HQC质控样品工作液；
S2、取校正标样、质控样品或待测样品分别加入内标工作液；然后加入乙腈沉淀血浆蛋白，涡旋、离心，取上清，氮气吹干、复溶后备用；
S3、将步骤S2所得溶液分别进样LC-MS/MS系统得到色谱图；根据色谱图中分析物和内标色谱峰面积的比值，获得相应的标准曲线回归方程，计算待测样品的血浆中阿比特龙及其五种代谢物的浓度；
其中，步骤S1的阿比特龙及其五种代谢物的所述校正标样工作液是取阿比特龙及其五种代谢物的储备液，用体积比1:1的甲醇水溶液按梯度稀释配制而成；
所述质控样品工作液是取阿比特龙及其五种代谢物的储备液，用体积比1:1的甲醇水溶液按梯度稀释，分别配制成相应的LLOQ、LQC、MQC、MQC2、HQC质控样品工作液；
步骤S2的所述内标工作液是将ABI-d4(阿比特龙-d4)储备液用甲醇水溶液稀释制备而成；
所述阿比特龙及其五种代谢物的储备液和待测样品工作液在4℃保存；标准品工作液在检测时新制备；
步骤S3的色谱条件为：ACE-C18柱，2.1mm×50mm，5μm；流动相A为体积比0.1％甲酸的水溶液，流动相B为体积比0.1％甲酸的乙腈溶液；柱温35℃，自动进样器温度4℃；进样量20μL，流速1.0mL/min；
梯度洗脱的方式为：0-1.9min，流动相A的比例从75％变为45％，流动相B的比例从25％变为55％；1.9-2.0min，流动相A的比例从45％变为5％，流动相B的比例从55％变为95％；2.0-2.6min，流动相A的比例保持5％，流动相B的比例保持95％；2.60-2.70分钟，流动相A的比例从5％变为75％，流动相B的比例从95％变为25％；2.70-3.50分钟，流动相A的比例保持75％，流动相B的比例保持25％；
步骤S3的质谱条件为：采用ESI源，电喷雾离子化正离子；监测方式：MRM；阿比特龙及其五种代谢物和内标ABI-d4的质谱分析条件如下表
所示。
2.根据权利要求1所述的同时定量测定阿比特龙及其五种代谢物的方法，其特征在于，步骤S1中，阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度分别为12.5、25、50、125、500、2500、4500、5000ng/mL，d4-阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度分别为0.25、0.5、1、2.5、10、5、90、100ng/mL，5α-阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度分别为1.25、2.5、5、12.5、50、250、450、500ng/mL，阿比特龙N-氧化物的所述校正标样工作液的浓度分别为2.5、5、12.5、25、50、100、120、125ng/mL，硫酸阿比特龙的所述校正标样工作液的浓度分别为250、500、1000、2500、10000、50000、90000、100000ng/mL，硫酸阿比特龙N-氧化物的所述校正标样工作液的浓度分别为625、1250、5000、12500、25000、50000、120000、125000ng/mL；
阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度分别为12.5、37.5、250、1500、3750ng/mL，d4-阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度分别为0.25、0.75、5、30、75ng/mL，5α-阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度分别为1.25、3.75、25、150、375ng/mL，阿比特龙N-氧化物的所述质控样品工作液的浓度分别为2.5、3.75、12.5、37.5、93.75ng/mL，硫酸阿比特龙的所述质控样品工作液的浓度分别为250、750、5000、30000、75000ng/mL，硫酸阿比特龙N-氧化物的所述质控样品工作液的浓度分别为625、1875、7500、37500、93750ng/mL，即分别配制成相应的LLOQ、LQC、MQC、MQC2、HQC质控样品工作液。
3.根据权利要求1所述的同时定量测定阿比特龙及其五种代谢物的方法，其特征在于，步骤S2具体为：取校正标样、待测样品或质控样品100μL，分别加入25μL内标工作液；然后分别加入400μL乙腈沉淀蛋白质，涡旋5min后，4℃、1700g离心15min；分别取250μL上清液室温氮气吹干，用125μL体积比2:8的乙腈水溶液复溶，4℃保存备用。
4.根据权利要求1所述的同时定量测定阿比特龙及其五种代谢物的方法，其特征在于，步骤S2的所述内标工作液是将ABI-d4储备液用体积比1:1的甲醇水溶液稀释至浓度为5ng/mL后制备而成。
5.一种如权利要求1所述的同时定量测定阿比特龙及其五种代谢物的方法的应用，其特征在于，用于制备同时定量测定阿比特龙及其五种代谢物的质谱检测试剂盒，或者用于阿比特龙及其五种代谢物的临床前研究，或者用于醋酸阿比特龙制剂研发及其相关前药开发。
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