CN110361491B - 同时准确定量分析人血浆维卡格雷及其主要代谢产物的检测方法及其试剂盒 - Google Patents
同时准确定量分析人血浆维卡格雷及其主要代谢产物的检测方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了同时准确定量分析人血浆维卡格雷原药及其主要代谢产物的检测方法及其试剂盒。一种同时准确定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的试剂盒,其特征在于该试剂盒包含柠檬酸、氟化钠和2‑溴‑3’‑甲氧基苯乙酮;或者包含柠檬酸、氟化钠、2‑溴‑3’‑甲氧基苯乙酮和K2EDTA抗凝真空采血管。本发明提供了一种维持人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的稳定性的优化方案,并提供了一种可同时准确定量分析人血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的检测方法。该检测方法的最低定量限、专属性、回收率和基质效应、精密度和准确度、稳定性和残留效应均符合生物样品检测的规范要求,表明该方法具有良好的准确性和重复性。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域,涉及同时准确定量分析人血浆维卡格雷原药及其主要代谢产物的检测方法及其试剂盒。
背景技术
氯吡格雷(clopidogrel)是一种广泛用于急性冠状动脉综合征(acute coronarysyndrome,ACS)或经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention,PCI)植入支架后预防冠脉血栓事件的抗血小板药物。然而,大量临床研究发现,在服用常规剂量的氯吡格雷后,仍有一部分患者不能获得预期的抗血小板效应,表现为对氯吡格雷的低反应或无反应,严重的可致血栓、缺血等不良事件,这一现象被称为“氯吡格雷抵抗(clopidogrelresistance,CR)”。
维卡格雷(vicagrel)作为氯吡格雷醋酸酯类似物,是一种旨在克服CR的新型抗血小板药物。如图1所示,维卡格雷主要通过肠道羧酸酯酶(carboxylesterase,CES)2和芳基乙酰胺脱乙酰酶(arylacetamide deacetylase,AADAC)快速水解转化为其中间代谢产物2-oxo-clopidogrel,后者经细胞色素P450(cytochrome P450,CYP或P450)催化生成活性硫醇代谢物(active thiol metabolite)而发挥其抗血小板作用。该代谢途径避开了氯吡格雷依赖于P450催化的第一步氧化代谢,可显著地减少因CYP2C19基因多态性所致CR。同时,临床研究表明,维卡格雷的抗血小板作用显著高于氯吡格雷,一定程度上可克服CR。
活性硫醇代谢物含四种异构体即H1、H2、H3、H4,其中H4是维卡格雷发挥其抗血小板作用的独特硫醇活性代谢物异构体。由于H4化学结构中含有巯基,在血浆中高度不稳定,以往有文献报道,在血液收集过程中使用烷基化试剂2-溴-3’-甲氧基苯乙酮(2-bromo-3’-methoxyacetophenone,MPB)将H4衍生化为MP-H4(已知化学结构,市售商品)可延缓其降解。2-oxo-clopidogrel作为活性硫醇代谢物H4的前体,其准确定量分析有助于估计维卡格雷的口服吸收率。已有文献报道在收集的血浆中加入乙酸可稳定2-oxo-clopidogrel,但未能避免血液收集过程中待测物的降解;另有文献报道使用还原剂1,4-二硫代-DL-苏糖醇(1,4-dithio-DL-threitol,DTT)可维持人血中2-oxo-clopidogrel的稳定性,但考虑到DTT与MPB可能发生相互作用,显然该方法不能同时定量2-oxo-clopidogrel和H4。
维卡格雷作为一种含酯前药,可被血液中广泛存在的各种酯酶(esterases)或水解酶(hydrolases)迅速水解,这不仅导致无法准确定量分析维卡格雷,还可能导致2-oxo-clopidogrel和H4的实测值高于理论值。为了准确分析维卡格雷在人体内的代谢活化过程以指导临床精准用药,在血液样品收集、储存和处理过程中保证维卡格雷、2-oxo-clopidogrel和H4的稳定性,同时准确定量分析它们的血浓度显得尤为重要(图2)。然而,稳定全血或血浆中维卡格雷的优化方法以及可同时检测人血浆中上述三种化合物的方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有相关技术的上述不足,提供一种可通过维持维卡格雷及其主要代谢产物的稳定性而同时准确定量分析人血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的检测方法。
本发明的主要目的可通过以下技术方案来实现:
柠檬酸(CA)、氟化钠(NaF)、2-溴-3’-甲氧基苯乙酮(MPB)和K2EDTA(或市售K2EDTA抗凝真空采血管)在保持人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物稳定性中的应用,其中所述的维卡格雷主要代谢产物是指其中间代谢产物2-oxo-clopidogrel和硫醇活性代谢产物(H4)。
一种稳定人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的方法,所述的维卡格雷主要代谢产物为2-oxo-clopidogrel和H4,该方法包括向人全血或血浆中加入柠檬酸、氟化钠、2-溴-3’-甲氧基苯乙酮和K2EDTA。
柠檬酸、氟化钠、2-溴-3’-甲氧基苯乙酮和K2EDTA在制备同时定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的试剂盒中的应用,其中所述的维卡格雷主要代谢产物为2-oxo-clopidogrel和H4。
一种同时定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的试剂盒,该试剂盒包含柠檬酸、氟化钠和2-溴-3’-甲氧基苯乙酮;或者包含柠檬酸、氟化钠、2-溴-3’-甲氧基苯乙酮和K2EDTA抗凝真空采血管。
所述的试剂盒优选包含:
对照品溶液A:维卡格雷:8μg/mL
对照品溶液B:2-oxo-clopidogrel:8μg/mL
对照品溶液C:MP-H4:30μg/mL
内标IS溶液:氯吡格雷:300ng/mL
稳定剂A:柠檬酸溶液:5M
稳定剂B:氟化钠溶液:1M
稳定剂C:MPB溶液:500mM
校准品稀释液:稳定化人空白血浆,通过以下方法制备:将稳定剂A、稳定剂B和稳定剂C加入到K2EDTA抗凝的、新鲜的人空白全血中,充分混合后,4000rpm离心10min分离所得血浆,即为稳定化人空白血浆。其中所述的稳定剂A与所述的人空白全血的体积比为1:100;所述的稳定剂B与所述的人空白全血的体积比为1:100;所述的稳定剂C与所述的人空白全血的体积比为1:50;
流动相添加剂:甲酸
K2EDTA抗凝真空采血管;
或者包含:
对照品溶液A:维卡格雷:8μg/mL
对照品溶液B:2-oxo-clopidogrel:8μg/mL
对照品溶液C:MP-H4:30μg/mL
内标IS溶液:氯吡格雷:300ng/mL
稳定剂A:柠檬酸溶液:5M
稳定剂B:氟化钠溶液:1M
稳定剂C:MPB溶液:500mM
校准品稀释液:稳定化人空白血浆,通过以下方法制备:将稳定剂A、稳定剂B和稳定剂C加入到K2EDTA抗凝的、新鲜的人空白全血中,充分混合后,4000rpm离心10min分离所得血浆,即为稳定化人空白血浆。其中所述的稳定剂A与所述的人空白全血的体积比为1:100;所述的稳定剂B与所述的人空白全血的体积比为1:100;所述的稳定剂C与所述的人空白全血的体积比为1:50;
流动相添加剂:甲酸。
本发明所述的试剂盒在同时定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的试剂盒中的应用,其中所述的维卡格雷主要代谢产物为2-oxo-clopidogrel和H4。
一种同时定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的方法,包含以下步骤:
A.全血收集与血浆制备:
1)依次将稳定剂A(1:100;v/v)、稳定剂B(1:100;v/v)、稳定剂C(1:50;v/v)注入K2EDTA抗凝真空采血管内,注意不要破坏其真空;
2)收集全血至采血管刻度线,立即颠倒混匀,4℃,4000rpm离心10min,分离血浆于-80℃保存待测;
稳定剂A与收集的全血的体积比为1:100;稳定剂B与收集的全血的体积比为1:100;稳定剂C与收集的全血的体积比为1:50;
B.内标工作液与流动相配制:
1)内标工作液的制备:按测试量移取所需量的内标溶液,按照内标溶液:乙腈=1:99混匀,配制成内标工作液,备用。
2)流动相的配制:量取500mL超纯水至试剂瓶中,再加入500μL流动相添加剂甲酸,制备成流动相A;量取500mL乙腈至试剂瓶中,再加入500μL流动相添加剂甲酸,制备成流动相B;分别涡旋混合1min后超声10min脱气;
C.标准曲线和质控样品的制备:
1)将对照品溶液A用校准品稀释液依次梯度稀释至维卡格雷浓度为80.0、60.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05ng/mL浓度校准品用于建立标准曲线,并制备维卡格雷浓度为60、10、0.1ng/mL高、中、低三个浓度质控样品;
2)将对照品溶液B用校准品稀释液依次梯度稀释至2-oxo-clopidogrel浓度为80.0、60.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2ng/mL浓度校准品用于建立标准曲线,并制备2-oxo-clopidogrel浓度为2-oxo-clopidogrel 60、20、0.5ng/mL高、中、低三个浓度质控样品;
3)将对照品溶液C用校准品稀释液依次梯度稀释至MP-H4浓度为300.0、200.0、100.0、50.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2ng/mL浓度校准品用于建立标准曲线,并制备MP-H4浓度为200、50、0.5ng/mL高、中、低三个浓度质控样品;
D.样品处理:
1)将待测血浆样本至冰上融化并混匀;
2)取50μL血浆样品,包括定量校准品、质控品、待测样本于2mL离心管中,加入200μL内标工作液,涡旋3min,4℃,12,000rpm离心20min,取50μL上清至进样瓶中;
E.上机检测:
1)上机检测选用Shimadzu LC-30A超高效液相色谱-Sciex Triple QuadTM 4500三重四极杆质谱仪和Agilent Poroshell 120EC-C18(50×2.1mm,1.9μm)色谱柱及配套保护柱;
2)设置流动相流速为0.3mL/min,洗脱梯度如下表:
3)柱温设置为40℃,自动进样器温度设置为4℃,进样量设置为2μL;
4)质谱检测选用电喷雾离子化正离子扫描方式,离子喷雾电压为5500V,离子源温度为550℃,气帘气为35Psi,碰撞气为8Psi,喷雾气为40Psi,辅助加热气为45Psi;
5)离子检测方式选择多反应监测,各化合物检测离子对及其检测条件如下表:
6)取处理好的定量校准品、质控品和待测样本溶液注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测,并记录色谱图与待测样本各目标化合物峰面积和内标峰面积;
7)根据标准曲线和各待测样品目标化合物峰面积与内标峰面积比值计算质控品和待测样本的目标化合物浓度。
有益效果
本发明提供了一种维持人全血和血浆中维卡格雷及其主要代谢产物稳定性的优化方案,并提供了一种可同时准确定量分析人血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的检测方法。该检测方法的最低定量限、专属性、回收率和基质效应、精密度和准确度、稳定性和残留效应均符合生物样品检测要求,表明该方法具有良好的准确性和重复性。
附图说明
图1.维卡格雷和氯吡格雷在人体内的代谢流程图。
图2.专利发明内容示意图。
图3.维卡格雷及其主要代谢产物在稳定化血浆(A)和稳定化全血(B)中的剩余百分比(或残留量)(n=3)。
图4.维卡格雷及其主要代谢产物的人血浆样品的代表性色谱图。(A)稳定化空白血浆样品;(B)最低定量限样品;(C)中浓度质控样品(从左至右依次为维卡格雷、2-oxo-clopidogrel、MP-H4、内标)。
具体实施方式
同时检测人血浆维卡格雷原药及其主要代谢产物的方法及其验证
实施例1同时检测人血浆维卡格雷原药及其主要代谢产物的试剂盒,包括如下成分:
对照品溶液A:维卡格雷(vicagrel):8μg/mL
对照品溶液B:2-oxo-clopidogrel:8μg/mL
对照品溶液C:MP-H4(H4的MPB衍生物;市售品):30μg/mL
内标(IS)溶液:即氯吡格雷(clopidogrel):300ng/mL
稳定剂A:柠檬酸(CA)溶液:5M
稳定剂B:氟化钠(NaF)溶液:1M
稳定剂C:MPB(2-bromo-3’-methoxyacetophenone)溶液:500mM
校准品稀释液(即稳定化人空白血浆):稳定化人空白血浆,通过以下方法制备:将稳定剂A、稳定剂B和稳定剂C加入到K2EDTA抗凝的、新鲜的人空白全血中,充分混合后,4000rpm离心10min分离所得血浆,即为稳定化人空白血浆。其中所述的稳定剂A与所述的人空白全血的体积比为1:100;所述的稳定剂B与所述的人空白全血的体积比为1:100;所述的稳定剂C与所述的人空白全血的体积比为1:50;
流动相添加剂:甲酸
K2EDTA抗凝真空采血管
实施例2试剂盒使用方法
LC-MS/MS法测定,具体操作如下。
1、全血收集与血浆制备
1)依次将稳定剂A(1:100;v/v)、稳定剂B(1:100;v/v)、稳定剂C(1:50;v/v)注入K2EDTA抗凝真空采血管内,注意不要破坏其真空。稳定剂A与收集的全血的体积比为1:100;稳定剂B与收集的全血的体积比为1:100;稳定剂C与收集的全血的体积比为1:50;
2)收集全血至采血管刻度线,立即颠倒混匀,4℃,4000rpm离心10min,分离血浆于-80℃保存待测。
2、内标工作液与流动相配制
1)内标工作液的制备:按测试量移取所需量的内标溶液,按照内标溶液:乙腈=1:99混匀,配制成内标工作液,备用。
2)流动相的配制:量取500mL超纯水至试剂瓶中,再加入500μL流动相添加剂(甲酸),制备成流动相A;量取500mL乙腈至试剂瓶中,再加入500μL流动相添加剂(甲酸),制备成流动相B;分别涡旋混合1min后超声10min脱气。
3、标准曲线和质控样品的制备:
1)将对照品溶液A用校准品稀释液依次梯度稀释至维卡格雷浓度为80.0、60.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05ng/mL浓度校准品用于建立标准曲线,并制备维卡格雷浓度为60、10、0.1ng/mL高、中、低三个浓度质控(quality control,QC)样品。
2)将对照品溶液B用校准品稀释液依次梯度稀释至2-oxo-clopidogrel浓度为80.0、60.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2ng/mL浓度校准品用于建立标准曲线,并制备2-oxo-clopidogrel浓度为60、20、0.5ng/mL高、中、低三个浓度QC样品。
3)将对照品溶液C用校准品稀释液依次梯度稀释至MP-H4浓度为300.0、200.0、100.0、50.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2ng/mL浓度校准品用于建立标准曲线,并制备MP-H4浓度为200、50、0.5ng/mL高、中、低三个浓度QC样品。
4、样品处理
3)将待测血浆样本至冰上融化并混匀。
4)取50μL血浆样品(定量校准品、质控品、待测样本)于2mL离心管中,加入200μL内标工作液(含3ng/mL氯吡格雷),涡旋3min,4℃,12,000rpm离心20min,取50μL上清至进样瓶中。
5、上机检测
1)上机检测选用Shimadzu LC-30A超高效液相色谱-Sciex Triple QuadTM 4500三重四极杆质谱仪和Agilent Poroshell 120EC-C18(50×2.1mm,1.9μm)色谱柱及配套保护柱。
2)设置流动相流速为0.3mL/min。洗脱梯度如下表。
3)柱温设置为40℃,自动进样器温度设置为4℃,进样量设置为2μL。
4)质谱检测选用电喷雾离子化正离子扫描方式,离子喷雾电压为5500V,离子源温度为550℃,气帘气为35Psi,碰撞气为8Psi,喷雾气为40Psi,辅助加热气为45Psi。
5)离子检测方式选择多反应监测,各化合物检测离子对及其检测条件如下表。
6)取处理好的定量校准品、质控品和待测样本溶液注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测,并记录色谱图与待测样本各目标化合物峰面积和内标峰面积。
7)根据标准曲线和各待测样品目标化合物峰面积与内标峰面积比值计算质控品和待测样本的目标化合物浓度。
一、方法学验证
1、标准曲线和线性范围
维卡格雷、2-oxo-clopidogrel、MP-H4在人稳定化血浆中的标准曲线回归方程、线性范围、r2、最低定量限分别见表1。结果显示,三种分析物在考察的线性范围内均具有良好的线性关系(r2>0.99)和灵敏度。
表1.维卡格雷及其主要代谢产物在人稳定化血浆中的标准曲线(n=6)。
2、专属性
人稳定化空白血浆样品、稳定化空白血浆加入最低定量限样品、稳定化空白血浆加入中浓度质控样品的特征性色谱图分别见图4。如图所示,维卡格雷、2-oxo-clopidogrel、MP-H4和内标的保留时间分别是5.17、4.74/4.90、5.55、4.57min。三种分析物在人稳定化血浆样品中的色谱峰形和分离效果较好,无内源性物质干扰,表明该方法具有较高的专属性和选择性。
3、提取回收率和基质效应
维卡格雷、2-oxo-clopidogrel、MP-H4在低、中、高三个浓度下的提取回收率和基质效应分别见表2。结果显示,所有分析物在人稳定化血浆中的提取回收率和基质效应均符合生物样本检测要求。
表2.维卡格雷及其主要代谢产物在人稳定化血浆中的提取回收率(n=5)和基质效应(n=6)
4、精密度和准确度
维卡格雷、2-oxo-clopidogrel、MP-H4在最低定量限、低、中、高四个浓度下的精密度和准确度见表3。结果显示,所有分析物在人稳定化血浆中的日内精密度、日间精密度和准确度均符合生物样本检测要求。
表3.维卡格雷及其主要代谢产物在人稳定化血浆中的精密度(n=5)和准确度(n=5)
5、稳定性
低、中、高三个浓度的维卡格雷、2-oxo-clopidogrel、MP-H4在长期(-80℃保存30天)、短期(4℃放置4小时)、三次反复冻融、进样架(4℃放置24小时)条件下的稳定性分别见表4。如表所示,各分析物在人稳定化血浆中具有良好的稳定性。
表4.维卡格雷及其主要代谢产物在人稳定化血浆中的稳定性(n=3)
6、残留效应
最高定量限样品和稳定化空白血浆样品依次交替进样,记录色谱图,结果显示人稳定化空白血浆样品在维卡格雷、2-oxo-clopidogrel、MP-H4和内标的出峰位置未检测到干扰峰,说明该方法的残留效应在可接受范围内。
Claims (7)
1.柠檬酸、氟化钠、2-溴-3’-甲氧基苯乙酮和市售K2EDTA抗凝真空采血管在保持人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物稳定性中的应用,其中所述的维卡格雷主要代谢产物是指其中间代谢产物2-oxo-clopidogrel和硫醇活性代谢产物H4。
2.一种稳定人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的方法,所述的维卡格雷主要代谢产物为2-oxo-clopidogrel和H4,其特征在于该方法包括向人全血或血浆中加入柠檬酸、氟化钠、2-溴-3’-甲氧基苯乙酮和K2EDTA。
3.柠檬酸、氟化钠、2-溴-3’-甲氧基苯乙酮和K2EDTA在制备同时定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的试剂盒中的应用,其中所述的维卡格雷主要代谢产物为2-oxo-clopidogrel和H4。
4.一种同时定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的试剂盒,其特征在于该试剂盒包含柠檬酸、氟化钠和2-溴-3’-甲氧基苯乙酮;或者包含柠檬酸、氟化钠、2-溴-3’-甲氧基苯乙酮和K2EDTA抗凝真空采血管。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于所述的试剂盒包含:
对照品溶液A:维卡格雷:8μg/mL
对照品溶液B:2-oxo-clopidogrel:8μg/mL
对照品溶液C:MP-H4:30μg/mL
内标IS溶液:氯吡格雷:300ng/mL
稳定剂A:柠檬酸溶液:5M
稳定剂B:氟化钠溶液:1M
稳定剂C:2-溴-3’-甲氧基苯乙酮溶液:500mM
校准品稀释液:稳定化人空白血浆,通过以下方法制备:将稳定剂A、稳定剂B和稳定剂C加入到K2EDTA抗凝的、新鲜的人空白全血中,充分混合后,4000rpm离心10min分离所得血浆,即为稳定化人空白血浆;其中所述的稳定剂A与所述的人空白全血的体积比为1:100;所述的稳定剂B与所述的人空白全血的体积比为1:100;所述的稳定剂C与所述的人空白全血的体积比为1:50;
流动相添加剂:甲酸
K2EDTA抗凝真空采血管;
或者包含:
对照品溶液A:维卡格雷:8μg/mL
对照品溶液B:2-oxo-clopidogrel:8μg/mL
对照品溶液C:MP-H4:30μg/mL
内标IS溶液:氯吡格雷:300ng/mL
稳定剂A:柠檬酸溶液:5M
稳定剂B:氟化钠溶液:1M
稳定剂C:2-溴-3’-甲氧基苯乙酮溶液:500mM
校准品稀释液:稳定化人空白血浆,通过以下方法制备:将稳定剂A、稳定剂B和稳定剂C加入到K2EDTA抗凝的、新鲜的人空白全血中,充分混合后,4000rpm离心10min分离所得血浆,即为稳定化人空白血浆;其中所述的稳定剂A与所述的人空白全血的体积比为1:100;所述的稳定剂B与所述的人空白全血的体积比为1:100;所述的稳定剂C与所述的人空白全血的体积比为1:50;
流动相添加剂:甲酸。
6.权利要求4-5中任一项所述的试剂盒在同时定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物中的应用,其中所述的维卡格雷主要代谢产物为2-oxo-clopidogrel和H4。
7.一种同时定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的方法,其特征在于包含以下步骤:
A.全血收集与血浆制备:
1)依次将权利要求5中所述的稳定剂A、稳定剂B、稳定剂C注入K2EDTA抗凝真空采血管内,注意不要破坏其真空;其中所述的稳定剂A与所述的人空白全血的体积比为1:100;所述的稳定剂B与所述的人空白全血的体积比为1:100;所述的稳定剂C与所述的人空白全血的体积比为1:50;
2)收集全血至采血管刻度线,立即颠倒混匀,4℃,4000rpm离心10min,分离血浆于-80℃保存待测;
B.内标工作液与流动相配制:
1)内标工作液的制备:按测试量移取所需量的内标溶液,按照内标溶液:乙腈=1:99混匀,配制成内标工作液,备用;
2)流动相的配制:量取500mL超纯水至试剂瓶中,再加入500μL流动相添加剂甲酸,制备成流动相A;量取500mL乙腈至试剂瓶中,再加入500μL流动相添加剂甲酸,制备成流动相B;分别涡旋混合1min后超声10min脱气;
C.标准曲线和质控样品的制备:
1)将对照品溶液A用校准品稀释液依次梯度稀释至维卡格雷浓度为80.0、60.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05ng/mL浓度校准品用于建立标准曲线,并制备维卡格雷浓度为60、10、0.1ng/mL高、中、低三个浓度质控样品;
2)将对照品溶液B用校准品稀释液依次梯度稀释至2-oxo-clopidogrel浓度为80.0、60.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2ng/mL浓度校准品用于建立标准曲线,并制备2-oxo-clopidogrel浓度为2-oxo-clopidogrel 60、20、0.5ng/mL高、中、低三个浓度质控样品;
3)将对照品溶液C用校准品稀释液依次梯度稀释至H4衍生物MP-H4浓度为300.0、200.0、100.0、50.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2ng/mL浓度校准品用于建立标准曲线,并制备MP-H4浓度为200、50、0.5ng/mL高、中、低三个浓度质控样品;
D.样品处理:
1)将待测血浆样本至冰上融化并混匀;
2)取50μL血浆样品,包括定量校准品、质控品、待测样本于2mL离心管中,加入200μL内标工作液,涡旋3min,4℃,12,000rpm离心20min,取50μL上清至进样瓶中;
E.上机检测:
1)上机检测选用Shimadzu LC-30A超高效液相色谱-Sciex Triple QuadTM4500三重四极杆质谱仪和Agilent Poroshell 120EC-C18,规格:50×2.1mm,1.9μm色谱柱及配套保护柱;
2)设置流动相流速为0.3mL/min,洗脱梯度如下表:
3)柱温设置为40℃,自动进样器温度设置为4℃,进样量设置为2μL;
4)质谱检测选用电喷雾离子化正离子扫描方式,离子喷雾电压为5500V,离子源温度为550℃,气帘气为35Psi,碰撞气为8Psi,喷雾气为40Psi,辅助加热气为45Psi;
5)离子检测方式选择多反应监测,各化合物检测离子对及其检测条件如下表:
6)取处理好的定量校准品、质控品和待测样本溶液注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测,并记录色谱图与待测样本各目标化合物峰面积和内标峰面积;
7)根据标准曲线和各待测样品目标化合物峰面积与内标峰面积比值计算质控品和待测样本的目标化合物浓度。
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