JP2003259861A - プリンヌクレオシドおよびヌクレオチドの製造方法 - Google Patents
プリンヌクレオシドおよびヌクレオチドの製造方法Info
- Publication number
- JP2003259861A JP2003259861A JP2003029752A JP2003029752A JP2003259861A JP 2003259861 A JP2003259861 A JP 2003259861A JP 2003029752 A JP2003029752 A JP 2003029752A JP 2003029752 A JP2003029752 A JP 2003029752A JP 2003259861 A JP2003259861 A JP 2003259861A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- purine
- nucleoside
- medium
- bacterium
- accumulated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 バチルス属のヌクレオシド生産株のヌクレオ
シド生産性を高めること。 【解決手段】 ポリミキシンＢおよび／またはコリスチ
ンによる生育阻害に対する耐性を有し、かつプリンヌク
レオシド生産能を有するバチルス属細菌を培地で培養
し、生成、蓄積したプリンヌクレオシドを該培地から採
取することにより、プリンヌクレオシドを製造する。
シド生産性を高めること。 【解決手段】 ポリミキシンＢおよび／またはコリスチ
ンによる生育阻害に対する耐性を有し、かつプリンヌク
レオシド生産能を有するバチルス属細菌を培地で培養
し、生成、蓄積したプリンヌクレオシドを該培地から採
取することにより、プリンヌクレオシドを製造する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、イノシン、キサン
トシン、グアノシンのようなプリンヌクレオシドを製造
するための発酵方法、ならびに同方法に使用する新規微
生物に関する。プリンヌクレオシドは、５’−イノシン
酸、５’−キサンチル酸および５’−グアニル酸のよう
な相当するヌクレオチドの合成のための原料として使用
される。
トシン、グアノシンのようなプリンヌクレオシドを製造
するための発酵方法、ならびに同方法に使用する新規微
生物に関する。プリンヌクレオシドは、５’−イノシン
酸、５’−キサンチル酸および５’−グアニル酸のよう
な相当するヌクレオチドの合成のための原料として使用
される。
【０００２】
【従来の技術】従来、ヌクレオシドは、アデニン栄養要
求株、またはこれらの株にプリンアナログ、サルファ
剤、メチオニンアナログおよび抗葉酸剤のような種々の
薬剤に対する耐性が付与した株を用いた発酵法により工
業的に生産されてきた。ヌクレオシド生産株として、バ
チルス属に属する菌株（特許文献１〜９）、またはブレ
ビバクテリア属に属する菌株（特許文献１０〜１２、非
特許文献１）、またはエシェリヒア属に属する菌株（特
許文献１３）等が利用され得る。
求株、またはこれらの株にプリンアナログ、サルファ
剤、メチオニンアナログおよび抗葉酸剤のような種々の
薬剤に対する耐性が付与した株を用いた発酵法により工
業的に生産されてきた。ヌクレオシド生産株として、バ
チルス属に属する菌株（特許文献１〜９）、またはブレ
ビバクテリア属に属する菌株（特許文献１０〜１２、非
特許文献１）、またはエシェリヒア属に属する菌株（特
許文献１３）等が利用され得る。
【０００３】従来、これらの変異株の取得は、微生物
を、変異を誘発する線量の電離放射線（紫外線、Ｘ線、
γ線）の照射、または化学薬剤（硝酸ナトリウム、硫酸
ジエチル、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン）に曝し、その後、適切な選択培地を用いるこ
とで所望の菌株を選択することによってなされてきた。
を、変異を誘発する線量の電離放射線（紫外線、Ｘ線、
γ線）の照射、または化学薬剤（硝酸ナトリウム、硫酸
ジエチル、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン）に曝し、その後、適切な選択培地を用いるこ
とで所望の菌株を選択することによってなされてきた。
【０００４】ストレス（温度、放射線照射、飢餓、阻害
剤および抗生物質）の下に微生物細胞を曝すような種々
の処理、あるいは定常期への移行により、ＲＮＡおよび
ＤＮＡの崩壊を誘発し、その後核酸誘導体が排出され得
ることはよく知られている（非特許文献２〜４）。今日
では、細胞膜を介した代謝産物の透過は、通常は、多か
れ少なかれ特定の排出輸送タンパク質により媒介される
ことが一般に知られている（非特許文献５〜７）。ＵＶ
またはＸ線照射したエシェリヒア・コリ細胞は、遊離塩
基、リボース配糖体、モノヌクレオシドおよびＡＴＰを
排出することがかなり以前に示されていた（非特許文献
８）。これらの排出は、ＤＮＡ断片またはペプチドは検
出されなかったことから、細胞溶解の結果として生じた
ものではない。
剤および抗生物質）の下に微生物細胞を曝すような種々
の処理、あるいは定常期への移行により、ＲＮＡおよび
ＤＮＡの崩壊を誘発し、その後核酸誘導体が排出され得
ることはよく知られている（非特許文献２〜４）。今日
では、細胞膜を介した代謝産物の透過は、通常は、多か
れ少なかれ特定の排出輸送タンパク質により媒介される
ことが一般に知られている（非特許文献５〜７）。ＵＶ
またはＸ線照射したエシェリヒア・コリ細胞は、遊離塩
基、リボース配糖体、モノヌクレオシドおよびＡＴＰを
排出することがかなり以前に示されていた（非特許文献
８）。これらの排出は、ＤＮＡ断片またはペプチドは検
出されなかったことから、細胞溶解の結果として生じた
ものではない。
【０００５】
【特許文献１】特公昭３８−２３０３９号公報
【特許文献２】特公昭５４−１７０３３号公報
【特許文献３】特公昭５５−２９５６号公報
【特許文献４】特公昭５５−４５１９９号公報
【特許文献５】特開昭５６−１６２９９８号公報
【特許文献６】特公昭５７−１４１６０号公報
【特許文献７】特公昭５７−４１９１５
【特許文献８】特開昭５９−４２８９５号公報
【特許文献９】特開平０６−１１３８７６号（１９９２
年）
年）
【特許文献１０】特公昭５１−５０７５号公報
【特許文献１１】特公昭５８−１７５９２号公報
【特許文献１２】特公昭０２−１７４６８９号
【特許文献１３】国際公開第９９０３９８８号パンフレ
ット
ット
【非特許文献１】Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)
【非特許文献２】A. Demain (1968)、Production of pu
rine nucleotides by fermentation. In:Progress in I
ndustrial Microbiology, Vol. 18. Ed. D.J.D. Hocken
hull. J.&A. Churchill Ltd. London
rine nucleotides by fermentation. In:Progress in I
ndustrial Microbiology, Vol. 18. Ed. D.J.D. Hocken
hull. J.&A. Churchill Ltd. London
【非特許文献３】Cohen and Kaplan. J. Bacteriol., 1
29, 651-657, (1977)
29, 651-657, (1977)
【非特許文献４】Rinas et al., Appl. Environ. Micro
biol., 61, 4147-4151, (1995)
biol., 61, 4147-4151, (1995)
【非特許文献５】Pao et al., 1988. Microbiol. Mol.
Biol. Rev., 62, 1-34
Biol. Rev., 62, 1-34
【非特許文献６】Paulsen et al., 1988. J. Mol. Bio
l., 277, 573-592
l., 277, 573-592
【非特許文献７】Saier et al., 1999. J. Mol. Microb
iol. Biotechnol. (1999) 1, 257-279
iol. Biotechnol. (1999) 1, 257-279
【非特許文献８】Billen, D. (1957), Arch. Biochem.
Biophys., 67, 333-340
Biophys., 67, 333-340
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヌクレオシ
ド生産株によるヌクレオシド生産能を高めること、及び
その株を用いたイノシン、キサントシンおよびグアノシ
ン等のプリンヌクレオシドの製造方法、ならびに５’−
イノシン酸、５’−キサンチル酸および５’−グアニル
酸等のプリンヌクレオチドの製造方法を提供することを
課題とする。
ド生産株によるヌクレオシド生産能を高めること、及び
その株を用いたイノシン、キサントシンおよびグアノシ
ン等のプリンヌクレオシドの製造方法、ならびに５’−
イノシン酸、５’−キサンチル酸および５’−グアニル
酸等のプリンヌクレオチドの製造方法を提供することを
課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、細胞膜の構
造および／または機能に影響を及ぼす幾つかの変異が、
ストレス状態を模倣して、特定の輸送体の活性増大を誘
導し、その結果、培地中のプリンヌクレオシド、好まし
くはイノシンおよびキサントシンのような核酸誘導体の
蓄積を増大させ得ると推測した。そのために、本発明者
は、バチルス属に属し、ポリミキシンＢおよびコリスチ
ン等のペプチド抗生物質に対する耐性を付与する新規な
変異を有する微生物が、かなり多い量のプリンヌクレオ
シドを生成し、培地中に蓄積し得ることを見出した。こ
れまで、プリンヌクレオシドの生産能が、プリンヌクレ
オシド生産菌にこのような性質を付与することで向上す
るということは知られていなかった。そして、この知見
に基づいて研究を続け、本発明を達成するに至った。
造および／または機能に影響を及ぼす幾つかの変異が、
ストレス状態を模倣して、特定の輸送体の活性増大を誘
導し、その結果、培地中のプリンヌクレオシド、好まし
くはイノシンおよびキサントシンのような核酸誘導体の
蓄積を増大させ得ると推測した。そのために、本発明者
は、バチルス属に属し、ポリミキシンＢおよびコリスチ
ン等のペプチド抗生物質に対する耐性を付与する新規な
変異を有する微生物が、かなり多い量のプリンヌクレオ
シドを生成し、培地中に蓄積し得ることを見出した。こ
れまで、プリンヌクレオシドの生産能が、プリンヌクレ
オシド生産菌にこのような性質を付与することで向上す
るということは知られていなかった。そして、この知見
に基づいて研究を続け、本発明を達成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は、バチルス属に属し、
プリンヌクレオシド生産能を有する細菌を提供する。特
に、本発明は、ポリミキシンＢおよびコリスチン等のペ
プチド抗生物質に対する耐性を付与する変異によりプリ
ンヌクレオシド生産能が向上した細菌を提供する。
プリンヌクレオシド生産能を有する細菌を提供する。特
に、本発明は、ポリミキシンＢおよびコリスチン等のペ
プチド抗生物質に対する耐性を付与する変異によりプリ
ンヌクレオシド生産能が向上した細菌を提供する。
【０００９】本発明はさらに、前記細菌を培地で培養
し、プリンヌクレオシドを生成して培地に蓄積させ、同
培地からプリンヌクレオシドを採取することとを特徴と
する発酵によりプリンヌクレオシドを製造する方法を提
供する。
し、プリンヌクレオシドを生成して培地に蓄積させ、同
培地からプリンヌクレオシドを採取することとを特徴と
する発酵によりプリンヌクレオシドを製造する方法を提
供する。
【００１０】本発明はさらに、本発明の細菌を培地で培
養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生
成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取ことを特徴とす
る５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸および５’−
グアニル酸等のプリンヌクレオチドの製造方法を提供す
る。
養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生
成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取ことを特徴とす
る５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸および５’−
グアニル酸等のプリンヌクレオチドの製造方法を提供す
る。
【００１１】本発明はさらに、前記細菌を培地で培養
し、生成蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄
積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、生成、蓄積し
た５’−グアニル酸を採取することを特徴とする５’−
グアニル酸の製造方法を提供する。
し、生成蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄
積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、生成、蓄積し
た５’−グアニル酸を採取することを特徴とする５’−
グアニル酸の製造方法を提供する。
【００１２】本発明は、以下のとおりである。
（１）ポリミキシンＢおよび／またはコリスチンによる
生育阻害に対する耐性を有し、かつプリンヌクレオシド
生産能を有するバチルス属細菌。 （２）バチルス・ズブチリスに属する（１）に記載の細
菌。 （３）バチルス・アミロリケファシエンスに属する
（１）に記載の細菌。 （４）前記プリンヌクレオシドはイノシンである（１）
〜（３）のいずれかに記載の細菌。 （５）前記プリンヌクレオシドはキサントシンである
（１）〜（３）のいずれかに記載の細菌。 （６）前記プリンヌクレオシドはグアノシンである
（１）〜（３）のいずれかに記載の細菌。 （７）（１）〜（６）のいずれかに記載の細菌を培地で
培養し、プリンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積さ
せ、同培地からプリンヌクレオシドを採取することを特
徴とするプリンヌクレオシドの製造方法。 （８）前記プリンヌクレオシドはイノシンである（７）
に記載の方法。 （９）前記プリンヌクレオシドはキサントシンである
（７）に記載の方法。 （１０）前記プリンヌクレオシドはグアノシンである
（７）に記載の方法。 （１１）（１）〜（６）のいずれかに記載の細菌を培地
で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、
生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取することを特
徴とするプリンヌクレオチドの製造方法。 （１２）前記プリンヌクレオチドは５’−イノシン酸で
ある（１１）に記載の方法。 （１３）前記プリンヌクレオチドは５’−キサンチル酸
である（１１）に記載の方法。 （１４）前記プリンヌクレオチドは５’−グアニル酸で
ある請求項（１１）に記載の方法。 （１５）（５）に記載の細菌を培地で培養し、生成蓄積
したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−
キサンチル酸をアミノ化し、そして生成蓄積した５’−
グアニル酸を採取することを特徴とする５’−グアニル
酸の製造方法。
生育阻害に対する耐性を有し、かつプリンヌクレオシド
生産能を有するバチルス属細菌。 （２）バチルス・ズブチリスに属する（１）に記載の細
菌。 （３）バチルス・アミロリケファシエンスに属する
（１）に記載の細菌。 （４）前記プリンヌクレオシドはイノシンである（１）
〜（３）のいずれかに記載の細菌。 （５）前記プリンヌクレオシドはキサントシンである
（１）〜（３）のいずれかに記載の細菌。 （６）前記プリンヌクレオシドはグアノシンである
（１）〜（３）のいずれかに記載の細菌。 （７）（１）〜（６）のいずれかに記載の細菌を培地で
培養し、プリンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積さ
せ、同培地からプリンヌクレオシドを採取することを特
徴とするプリンヌクレオシドの製造方法。 （８）前記プリンヌクレオシドはイノシンである（７）
に記載の方法。 （９）前記プリンヌクレオシドはキサントシンである
（７）に記載の方法。 （１０）前記プリンヌクレオシドはグアノシンである
（７）に記載の方法。 （１１）（１）〜（６）のいずれかに記載の細菌を培地
で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、
生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取することを特
徴とするプリンヌクレオチドの製造方法。 （１２）前記プリンヌクレオチドは５’−イノシン酸で
ある（１１）に記載の方法。 （１３）前記プリンヌクレオチドは５’−キサンチル酸
である（１１）に記載の方法。 （１４）前記プリンヌクレオチドは５’−グアニル酸で
ある請求項（１１）に記載の方法。 （１５）（５）に記載の細菌を培地で培養し、生成蓄積
したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した５’−
キサンチル酸をアミノ化し、そして生成蓄積した５’−
グアニル酸を採取することを特徴とする５’−グアニル
酸の製造方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、プリンヌクレオシド生産能を元々有す
る細菌に、特定の耐性を付与することにより得ることが
できる。あるいは、本発明の細菌は、特定の耐性を有す
る細菌に、プリンヌクレオシド生産能を付与することに
よっても得ることができる。
る細菌に、特定の耐性を付与することにより得ることが
できる。あるいは、本発明の細菌は、特定の耐性を有す
る細菌に、プリンヌクレオシド生産能を付与することに
よっても得ることができる。
【００１４】「ポリミキシンＢおよび／またはコリスチ
ンによる生育阻害に対する耐性を有する微生物」という
用語は、親株としての細菌株に由来し、ポリミキシンＢ
および／またはコリスチン等のペプチド抗生物質を含有
する培地中で生育できるように、遺伝的に改変された微
生物を意味する。
ンによる生育阻害に対する耐性を有する微生物」という
用語は、親株としての細菌株に由来し、ポリミキシンＢ
および／またはコリスチン等のペプチド抗生物質を含有
する培地中で生育できるように、遺伝的に改変された微
生物を意味する。
【００１５】例えば、５ｍｇ／ｌ以上、好ましくは１０
ｍｇ／ｌ以上の濃度のポリミキシンＢ、または、５ｍｇ
／ｌ以上、好ましくは１０ｍｇ／ｌ以上のコリスチンを
含有する寒天培地上で、３４℃で培養したときに、３〜
５日以内にコロニーを形成することができる細菌は、こ
れらのペプチド抗生物質に耐性である。前記寒天培地と
しては、Ｌブロス寒天培地が挙げられる。すでに述べた
性質に加えて、本発明の細菌は、本発明の範囲を逸脱す
ることなく、種々の栄養要求性、薬剤耐性、薬剤感受
性、および薬剤依存性のような他の特定の性質を有して
もよい。
ｍｇ／ｌ以上の濃度のポリミキシンＢ、または、５ｍｇ
／ｌ以上、好ましくは１０ｍｇ／ｌ以上のコリスチンを
含有する寒天培地上で、３４℃で培養したときに、３〜
５日以内にコロニーを形成することができる細菌は、こ
れらのペプチド抗生物質に耐性である。前記寒天培地と
しては、Ｌブロス寒天培地が挙げられる。すでに述べた
性質に加えて、本発明の細菌は、本発明の範囲を逸脱す
ることなく、種々の栄養要求性、薬剤耐性、薬剤感受
性、および薬剤依存性のような他の特定の性質を有して
もよい。
【００１６】グラミシジン、ナイジェリシン等と合わせ
てポリミキシンＢおよびコリスチン（ポリミキシンＦ）
は、いわゆる「ペプチド抗生物質」と呼ばれる化合物の
部類に属する。それらは、細胞膜の構造および機能に影
響を及ぼし、ストレス状態を模倣する。ペプチド抗生物
質は、グラム陰性菌に対して有効な化合物である（Vaar
a, Microbiol. Rev., 56, 395-411, 1992）。本発明者
は、ポリミキシンは、バチルス属に属するグラム陽性菌
の生育をも阻害し得ることを見出した。バチルス属細菌
で見出された、ポリミキシン耐性を付与するような変異
は、細胞膜に影響を及ぼしてストレス状態を模倣するこ
とにより、プリンヌクレオシド排出輸送体を誘導する可
能性がある。
てポリミキシンＢおよびコリスチン（ポリミキシンＦ）
は、いわゆる「ペプチド抗生物質」と呼ばれる化合物の
部類に属する。それらは、細胞膜の構造および機能に影
響を及ぼし、ストレス状態を模倣する。ペプチド抗生物
質は、グラム陰性菌に対して有効な化合物である（Vaar
a, Microbiol. Rev., 56, 395-411, 1992）。本発明者
は、ポリミキシンは、バチルス属に属するグラム陽性菌
の生育をも阻害し得ることを見出した。バチルス属細菌
で見出された、ポリミキシン耐性を付与するような変異
は、細胞膜に影響を及ぼしてストレス状態を模倣するこ
とにより、プリンヌクレオシド排出輸送体を誘導する可
能性がある。
【００１７】本発明の細菌は、ペプチド抗生物質に対し
ていわゆる「交差耐性」を有してもよい。これは、ペプ
チド抗生物質の１つに対して耐性を有する細菌が、別の
ペプチド抗生物質に対しても耐性を示し得ることを意味
する（実施例参照）。複数のペプチド抗生物質は、同一
の作用メカニズムを持つことが示唆されている。例え
ば、ポリミキシンＢおよびグラミシジンＳは、いずれも
これらの抗生物質により高分子合成が阻害される条件下
で、緊縮応答を調節するヌクレオチドであるグアノシン
四リン酸（ppGpp）の蓄積を誘導することが示されてい
る（Cortay J.C. and Cozzone A.J., Biochim. Biophy
s. Acta, 1983, 755(3), 467-473）。
ていわゆる「交差耐性」を有してもよい。これは、ペプ
チド抗生物質の１つに対して耐性を有する細菌が、別の
ペプチド抗生物質に対しても耐性を示し得ることを意味
する（実施例参照）。複数のペプチド抗生物質は、同一
の作用メカニズムを持つことが示唆されている。例え
ば、ポリミキシンＢおよびグラミシジンＳは、いずれも
これらの抗生物質により高分子合成が阻害される条件下
で、緊縮応答を調節するヌクレオチドであるグアノシン
四リン酸（ppGpp）の蓄積を誘導することが示されてい
る（Cortay J.C. and Cozzone A.J., Biochim. Biophy
s. Acta, 1983, 755(3), 467-473）。
【００１８】本明細書で使用する「プリンヌクレオシド
生産能」という用語は、プリンヌクレオシドを生成して
培地中に蓄積する能力を意味する。「細菌がプリンヌク
レオシド生産能を有する」という用語は、液体培地で培
養中に、有意な量のプリンヌクレオシドを生成して培地
中に蓄積させる能力を細菌が有することを意味する。通
常、これは、実施例に記載する条件下で、５０ｍｇ／ｌ
以上のプリンヌクレオシドを、より好ましくは０．５ｇ
／ｌ以上のプリンヌクレオシドを蓄積する能力を意味す
る（以下参照）。
生産能」という用語は、プリンヌクレオシドを生成して
培地中に蓄積する能力を意味する。「細菌がプリンヌク
レオシド生産能を有する」という用語は、液体培地で培
養中に、有意な量のプリンヌクレオシドを生成して培地
中に蓄積させる能力を細菌が有することを意味する。通
常、これは、実施例に記載する条件下で、５０ｍｇ／ｌ
以上のプリンヌクレオシドを、より好ましくは０．５ｇ
／ｌ以上のプリンヌクレオシドを蓄積する能力を意味す
る（以下参照）。
【００１９】本明細書中で使用する「プリンヌクレオシ
ド」という用語は、イノシン、キサントシン、グアノシ
ン及びこれらの混合物を含む。
ド」という用語は、イノシン、キサントシン、グアノシ
ン及びこれらの混合物を含む。
【００２０】本発明の実施に用いられる変異細菌は、紫
外線照射、Ｘ線照射、放射線照射、および変異誘発化学
物質による処理のような従来の変異誘発法により変異誘
発を行い、続いてレプリカ法のような従来法による選択
をすることによって得ることができる。好ましい変異誘
発物質は、Ｎ−ニトロ−Ｎ’−メチル−Ｎ−ニトロソグ
アニジン（以下、ＮＴＧと称する）である。
外線照射、Ｘ線照射、放射線照射、および変異誘発化学
物質による処理のような従来の変異誘発法により変異誘
発を行い、続いてレプリカ法のような従来法による選択
をすることによって得ることができる。好ましい変異誘
発物質は、Ｎ−ニトロ−Ｎ’−メチル−Ｎ−ニトロソグ
アニジン（以下、ＮＴＧと称する）である。
【００２１】例えば、プリンヌクレオシド生産能を元々
有するバチルス属に属する既知の菌株を、変異株を得る
ために上記のいずれかの処理をし、続いて、その変異が
ペプチド抗生物質に対する耐性に関して本発明の要件を
満たし、そして本発明に適切に使用できるかどうかにつ
いて、試験を行う。さらに、得られた菌株を栄養培地中
で培養し、親株よりも高い収率でプリンヌクレオシドを
生産する能力を有する株を選択して、本発明に使用す
る。
有するバチルス属に属する既知の菌株を、変異株を得る
ために上記のいずれかの処理をし、続いて、その変異が
ペプチド抗生物質に対する耐性に関して本発明の要件を
満たし、そして本発明に適切に使用できるかどうかにつ
いて、試験を行う。さらに、得られた菌株を栄養培地中
で培養し、親株よりも高い収率でプリンヌクレオシドを
生産する能力を有する株を選択して、本発明に使用す
る。
【００２２】本発明の要件を満たす菌株は、当業者によ
く知られている遺伝子組換え技術によっても得ることが
できる。
く知られている遺伝子組換え技術によっても得ることが
できる。
【００２３】上記のような耐性に関する性質は、連続的
な選択または遺伝子組換え技術により、１つの菌株中で
組み合わせてもよい。
な選択または遺伝子組換え技術により、１つの菌株中で
組み合わせてもよい。
【００２４】本発明で使用されるバチルス属細菌の例と
して、バチルス・ズブチリス（B. subtilis）、バチル
ス・アミロリケファシエンス（B. amiloliquefaciens）
等が挙げられる。本発明の実施に使用される菌株の代表
例として、バチルス・ズブチリスＫMBS16polR1-1（VKPM
B-8245）、バチルス・アミロリケファシエンスColR7-1
05（VKPM B-8246）がある。本発明によりプリンヌクレ
オシドを生産する際に使用される細菌は、ペプチド抗生
物質に対する耐性、および高収率でプリンヌクレオシド
を生産する能力以外は、親株と同じ細菌学的性質を有し
ていてもよい。バチルス・ズブチリスKMBS16polR1-1お
よびバチルス・アミロリケファシエンスColR7-105
は、、２００２年１月２９日に、the Russian National
Collection ofIndustrial Microorganisms（VKPM）(Ru
ssia, 113545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)に、そ
れぞれ受託番号VKPM B-8245、VKPM B-8246のもとで寄託
され、２００３年１月６日に原寄託からブダペスト条約
に基づく国際寄託に移管されている。
して、バチルス・ズブチリス（B. subtilis）、バチル
ス・アミロリケファシエンス（B. amiloliquefaciens）
等が挙げられる。本発明の実施に使用される菌株の代表
例として、バチルス・ズブチリスＫMBS16polR1-1（VKPM
B-8245）、バチルス・アミロリケファシエンスColR7-1
05（VKPM B-8246）がある。本発明によりプリンヌクレ
オシドを生産する際に使用される細菌は、ペプチド抗生
物質に対する耐性、および高収率でプリンヌクレオシド
を生産する能力以外は、親株と同じ細菌学的性質を有し
ていてもよい。バチルス・ズブチリスKMBS16polR1-1お
よびバチルス・アミロリケファシエンスColR7-105
は、、２００２年１月２９日に、the Russian National
Collection ofIndustrial Microorganisms（VKPM）(Ru
ssia, 113545 Moscow, 1st Dorozhny proezd, 1)に、そ
れぞれ受託番号VKPM B-8245、VKPM B-8246のもとで寄託
され、２００３年１月６日に原寄託からブダペスト条約
に基づく国際寄託に移管されている。
【００２５】本発明の細菌を得るために改良されるべき
親株として、バチルス・ズブチリスAJ12707（FERM P-12
951）（特開昭61-13876号）、バチルス・ズブチリスAJ3
772（FERM P-2555）（特開昭62-014794号）、バチルス
・プミルス(Bacillus pumilus）NA-1102（FERM BP-28
9）、バチルス・ズブチリスNA-6011（FERM BP-291）お
よびバチルス・ズブチリスNA-6012（FERM BP-292）（米
国特許第４，７０１，４１３号）、バチルス・プミルス
Gottheil No.3218（ATCC No.21005）（米国特許第3,61
6,206号）、バチルス・アミロリケファシエンスAS115-7
（VKPM B-6134）（ロシア特許第2003678号）等のバチル
ス属に属するイノシン生産株が使用できる。また、バチ
ルス・ズブチリスKMBS16株を使用してもよい。この株
は、プリンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子
（purR::spc）、スクシニルＡＭＰシンターゼをコード
するｐｕｒＡ遺伝子（purA::erm）、およびプリンヌク
レオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子
（deoD::kan）に変異が導入された、既知のバチルス・
ズブチリス168trpC2株の誘導体である。
親株として、バチルス・ズブチリスAJ12707（FERM P-12
951）（特開昭61-13876号）、バチルス・ズブチリスAJ3
772（FERM P-2555）（特開昭62-014794号）、バチルス
・プミルス(Bacillus pumilus）NA-1102（FERM BP-28
9）、バチルス・ズブチリスNA-6011（FERM BP-291）お
よびバチルス・ズブチリスNA-6012（FERM BP-292）（米
国特許第４，７０１，４１３号）、バチルス・プミルス
Gottheil No.3218（ATCC No.21005）（米国特許第3,61
6,206号）、バチルス・アミロリケファシエンスAS115-7
（VKPM B-6134）（ロシア特許第2003678号）等のバチル
ス属に属するイノシン生産株が使用できる。また、バチ
ルス・ズブチリスKMBS16株を使用してもよい。この株
は、プリンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子
（purR::spc）、スクシニルＡＭＰシンターゼをコード
するｐｕｒＡ遺伝子（purA::erm）、およびプリンヌク
レオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子
（deoD::kan）に変異が導入された、既知のバチルス・
ズブチリス168trpC2株の誘導体である。
【００２６】＜２＞プリンヌクレオシドの製造方法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地中で培養し、プリ
ンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積させ、該プリン
ヌクレオシドを培地から採取する、プリンヌクレオシド
の製造方法を包含する。
ンヌクレオシドを生成して培地中に蓄積させ、該プリン
ヌクレオシドを培地から採取する、プリンヌクレオシド
の製造方法を包含する。
【００２７】本発明の方法においては、バチルス細菌の
培養、液体培地からのプリンヌクレオシドの採取および
精製は、細菌を用いた発酵によりプリンヌクレオシドを
製造する従来法と同様にして行うことができる。
培養、液体培地からのプリンヌクレオシドの採取および
精製は、細菌を用いた発酵によりプリンヌクレオシドを
製造する従来法と同様にして行うことができる。
【００２８】プリンヌクレオシド生産用培地は、炭素
源、窒素源、無機イオン、および必要に応じて他の有機
成分を含有する限り、合成培地であっても天然培地であ
ってもよい。炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マル
トース、キシロース、トレハロース、リボース、および
デンプンの加水分解産物等の糖類、グリセロール、マン
ニトールおよびソルビトール等のアルコール、グルコン
酸、フマル酸、クエン酸およびコハク酸等の有機酸等を
使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウムおよびリン酸アンモニウム等の
無機アンモニウム塩、ダイズ加水分解産物等の有機窒
素、アンモニアガス、アンモニア水溶液等を使用するこ
とができる。また、ビタミンＢ1等のビタミン、アデニ
ンおよびＲＮＡ等の核酸、または酵母抽出物等の必須物
質を、極微量有機栄養分として適切な量で含有すること
が望ましい。これら以外に、必要であれば、少量のリン
酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガン
イオン等を添加してもよい。
源、窒素源、無機イオン、および必要に応じて他の有機
成分を含有する限り、合成培地であっても天然培地であ
ってもよい。炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フルクトース、アラビノース、マル
トース、キシロース、トレハロース、リボース、および
デンプンの加水分解産物等の糖類、グリセロール、マン
ニトールおよびソルビトール等のアルコール、グルコン
酸、フマル酸、クエン酸およびコハク酸等の有機酸等を
使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウムおよびリン酸アンモニウム等の
無機アンモニウム塩、ダイズ加水分解産物等の有機窒
素、アンモニアガス、アンモニア水溶液等を使用するこ
とができる。また、ビタミンＢ1等のビタミン、アデニ
ンおよびＲＮＡ等の核酸、または酵母抽出物等の必須物
質を、極微量有機栄養分として適切な量で含有すること
が望ましい。これら以外に、必要であれば、少量のリン
酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガン
イオン等を添加してもよい。
【００２９】培養は、好ましくは、好気性条件下にて１
６〜７２時間実施され、培養温度は、３０〜４５℃の範
囲に、ｐＨは、５〜８の範囲に制御される。ｐＨは、無
機もしくは有機の酸性またはアルカリ性物質、及びアン
モニアガスにより調節され得る。
６〜７２時間実施され、培養温度は、３０〜４５℃の範
囲に、ｐＨは、５〜８の範囲に制御される。ｐＨは、無
機もしくは有機の酸性またはアルカリ性物質、及びアン
モニアガスにより調節され得る。
【００３０】プリンヌクレオシドの発酵液からの採取
は、イオン交換樹脂法および沈殿法のような従来の技法
のいずれか、またはそれらの任意の組合せにより、行う
ことができる。
は、イオン交換樹脂法および沈殿法のような従来の技法
のいずれか、またはそれらの任意の組合せにより、行う
ことができる。
【００３１】＜３＞プリンヌクレオチドの製造方法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、生成、
蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生成、蓄積したプ
リンヌクレオチドを採取する、プリンヌクレオチドの製
造方法を包含する。具体的には、本発明の方法は、本発
明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したイノシンをリ
ン酸化し、生成、蓄積した５’−イノシン酸を採取す
る、５’−イノシン酸の製造方法を包含する。さらに、
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、生成、
蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した
５’−キサンチル酸を採取する、５’−キサンチル酸の
製造方法を包含する。
蓄積したヌクレオシドをリン酸化し、生成、蓄積したプ
リンヌクレオチドを採取する、プリンヌクレオチドの製
造方法を包含する。具体的には、本発明の方法は、本発
明の細菌を培地で培養し、生成、蓄積したイノシンをリ
ン酸化し、生成、蓄積した５’−イノシン酸を採取す
る、５’−イノシン酸の製造方法を包含する。さらに、
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、生成、
蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄積した
５’−キサンチル酸を採取する、５’−キサンチル酸の
製造方法を包含する。
【００３２】本発明においては、培養、培地からのプリ
ンヌクレオシドの採取および精製等は、プリンヌクレオ
シドを微生物を用いて生産する従来の発酵法と同様にし
て行うことができる。さらに、本発明においては、生
成、蓄積したプリンヌクレオシドのリン酸化、および生
成、蓄積したプリンヌクレオチドの採取は、プリンヌク
レオシドからプリンヌクレオチドを生産する従来の発酵
法に類似した様式で実施されてもよい。
ンヌクレオシドの採取および精製等は、プリンヌクレオ
シドを微生物を用いて生産する従来の発酵法と同様にし
て行うことができる。さらに、本発明においては、生
成、蓄積したプリンヌクレオシドのリン酸化、および生
成、蓄積したプリンヌクレオチドの採取は、プリンヌク
レオシドからプリンヌクレオチドを生産する従来の発酵
法に類似した様式で実施されてもよい。
【００３３】プリンヌクレオシドのリン酸化は、種々の
ホスファターゼ、ヌクレオシドキナーゼまたはヌクレオ
シドホスホトランスフェラーゼを用いて酵素的に、ある
いはＰＯＣｌ3等のようなリン酸化剤を用いて化学的に
行うことができる。ヌクレオシドへのピロリン酸塩のリ
ン酸基のＣ−５’位選択的転移を触媒することが可能な
ホスファターゼ（Mihara et al, Phosphorylation of n
ucleosides by the mutated acid phosphatase from Mo
rganella morganii, Appl. Environ. Microbiol. 2000,
66:2811-2816)、またはポリリン酸（塩）、フェニルリ
ン酸（塩）もしくはカルバミルリン酸（塩）をリン酸ド
ナーとして利用する酸性ホスファターゼ（WO 96/37603A
1）等を使用してもよい。また、ホスファターゼの一例
として、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸塩（Mits
ugi, K., et al, Agric. Biol. Chem. 1964, 28, 586-6
00）、無機リン酸塩（特開昭４２−１１８６号）または
アセルリン酸塩（特開昭６１−４１５５５号）を利用し
てヌクレオシドのＣ−２’、３’または５’位へのリン
酸基の転移を触媒することが可能なホスファターゼ等を
使用してもよい。ヌクレオチドキナーゼの例としては、
エシェリヒア・コリ由来のグアノシン／イノシンキナー
ゼ(Mori et al., Cloning of a guanosine-inosine kin
ase gene of Escherichia coli and characterization
of the purified gene product. J. Bacteriol. 1995.
177:4921-4926；WO 91/08286）等を使用してもよい。ヌ
クレオシドホスホトランスフェラーゼの例として、Hamm
er-Jespersen, K. (Nucleoside catabolism, p203-258.
In A Munch-Petesen (ed.),Metabolism of nucleotid
es, nucleosides, and nucleobases in microorganism.
1980, Academic Press, New York）により記載されて
いるヌクレオシドホスホトランスフェラーゼ等を使用し
てもよい。ヌクレオシドの化学的リン酸化は、ＰＯＣｌ
3のようなリン酸化剤（Yoshikawa et al, Studies of p
hosphorylation.III. Selective phosphorylation of u
nprotected nucleosides, Bull. Chem. Soc. Jpn. 196
9, 42:3505-3508)等を用いて行うことができる。
ホスファターゼ、ヌクレオシドキナーゼまたはヌクレオ
シドホスホトランスフェラーゼを用いて酵素的に、ある
いはＰＯＣｌ3等のようなリン酸化剤を用いて化学的に
行うことができる。ヌクレオシドへのピロリン酸塩のリ
ン酸基のＣ−５’位選択的転移を触媒することが可能な
ホスファターゼ（Mihara et al, Phosphorylation of n
ucleosides by the mutated acid phosphatase from Mo
rganella morganii, Appl. Environ. Microbiol. 2000,
66:2811-2816)、またはポリリン酸（塩）、フェニルリ
ン酸（塩）もしくはカルバミルリン酸（塩）をリン酸ド
ナーとして利用する酸性ホスファターゼ（WO 96/37603A
1）等を使用してもよい。また、ホスファターゼの一例
として、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸塩（Mits
ugi, K., et al, Agric. Biol. Chem. 1964, 28, 586-6
00）、無機リン酸塩（特開昭４２−１１８６号）または
アセルリン酸塩（特開昭６１−４１５５５号）を利用し
てヌクレオシドのＣ−２’、３’または５’位へのリン
酸基の転移を触媒することが可能なホスファターゼ等を
使用してもよい。ヌクレオチドキナーゼの例としては、
エシェリヒア・コリ由来のグアノシン／イノシンキナー
ゼ(Mori et al., Cloning of a guanosine-inosine kin
ase gene of Escherichia coli and characterization
of the purified gene product. J. Bacteriol. 1995.
177:4921-4926；WO 91/08286）等を使用してもよい。ヌ
クレオシドホスホトランスフェラーゼの例として、Hamm
er-Jespersen, K. (Nucleoside catabolism, p203-258.
In A Munch-Petesen (ed.),Metabolism of nucleotid
es, nucleosides, and nucleobases in microorganism.
1980, Academic Press, New York）により記載されて
いるヌクレオシドホスホトランスフェラーゼ等を使用し
てもよい。ヌクレオシドの化学的リン酸化は、ＰＯＣｌ
3のようなリン酸化剤（Yoshikawa et al, Studies of p
hosphorylation.III. Selective phosphorylation of u
nprotected nucleosides, Bull. Chem. Soc. Jpn. 196
9, 42:3505-3508)等を用いて行うことができる。
【００３４】本発明の方法は、前記細菌のような細菌を
培地で培養し、生成、蓄積したキサントシンをリン酸化
し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、
そして生成、蓄積した５’−グアニル酸を採取する、
５’−グアニル酸の製造方法を包含する。本発明におい
ては、前記細菌のような細菌の培地での培養、生成、蓄
積したキサントシンのリン酸化、生成、蓄積した５’−
キサンチル酸のアミノ化、および生成、蓄積した５’−
グアニル酸の採取は、５’−キサンチル酸から５’−グ
アニル酸を生産する従来の発酵法と同様にして行うこと
ができる。
培地で培養し、生成、蓄積したキサントシンをリン酸化
し、生成、蓄積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、
そして生成、蓄積した５’−グアニル酸を採取する、
５’−グアニル酸の製造方法を包含する。本発明におい
ては、前記細菌のような細菌の培地での培養、生成、蓄
積したキサントシンのリン酸化、生成、蓄積した５’−
キサンチル酸のアミノ化、および生成、蓄積した５’−
グアニル酸の採取は、５’−キサンチル酸から５’−グ
アニル酸を生産する従来の発酵法と同様にして行うこと
ができる。
【００３５】５’−キサンチル酸のアミノ化は、例え
ば、エシェリヒア・コリ由来のＧＭＰシンテターゼを用
いて酵素的に行うことができる（Fujio et al. High le
vel ofexpression of XMP aminase in Escherichia col
i and its application for the industrial productio
n of 5'-guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem.19
97, 61:840-845、欧州特許第０２５１４８９Ｂ１号）。
ば、エシェリヒア・コリ由来のＧＭＰシンテターゼを用
いて酵素的に行うことができる（Fujio et al. High le
vel ofexpression of XMP aminase in Escherichia col
i and its application for the industrial productio
n of 5'-guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem.19
97, 61:840-845、欧州特許第０２５１４８９Ｂ１号）。
【００３６】本発明の方法においては、本発明の細菌
は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子発現が高
められるように改変してもよい。
は、プリンヌクレオチド生合成のための遺伝子発現が高
められるように改変してもよい。
【００３７】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【参考例１】バチルス・ズブチリスのイノシン生産菌Ｋ
ＭＢＳ１６株の構築ｐｕｒＲ、ｐｕｒＡ、およびｄｅｏ
Ｄ遺伝子中に挿入−欠失変異を有する変異株であるバチ
ルス・ズブチリスのイノシン生産菌ＫＭＢＳ１６株を、
バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇ株から得
た。
ＭＢＳ１６株の構築ｐｕｒＲ、ｐｕｒＡ、およびｄｅｏ
Ｄ遺伝子中に挿入−欠失変異を有する変異株であるバチ
ルス・ズブチリスのイノシン生産菌ＫＭＢＳ１６株を、
バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇ株から得
た。
【００３８】１）バチルス・ズブチリスのｐｕｒＲ欠損
変異株の構築 バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇの染色体
ＤＮＡを鋳型として、また遺伝子データバンクのＤＮＡ
配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマ
ーＮｏ．１（配列番号１）およびＮｏ．２（配列番号
２）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃
で１分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR
System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮ
ｏ．１（２８mer）は、バチルス・ズブチリスｐｕｒＲ
遺伝子（M. Weng, P.L. Nagy, and H.Zalkin. Identifi
cation of the Bacillus subtilis pur operon repress
or. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, 92:7455-745
9）の開始コドン上流の２４６番目〜２２８番目のヌク
レオチド由来の配列、および、５’末端に付加したＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位を含む９mer配列から構成される。プラ
イマーＮｏ．２（２８mer）は、ＰｓｔＩ部位を含む９m
er配列を５’末端に融合したｐｕｒＲ遺伝子の終止コド
ンの下流の５７〜７５のヌクレオチド由来の配列であ
る。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化したＰＣＲ増
幅断片（０．９ｋｂ）を、ｐＨＳＧ３８９(TaKaRa, Jap
an)の両方の制限酵素部位の間に挿入して、ｐＨＳＧ３
９８ＢＳＰＲを創製した。増幅されたｐｕｒＲ遺伝子の
内部配列であるＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｃＩＩ断片０．３ｋ
ｂをｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲから除去し、続いて、ｐＤ
Ｇ１７２６（Bacillus Genetic Stock Center, Ohio）
から切り出したエンテロコッカス・フェカリス（Entero
coccus faecalis）のスペクチノマイシン耐性遺伝子
（１．２ｋｂ）で置き換えた。
変異株の構築 バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇの染色体
ＤＮＡを鋳型として、また遺伝子データバンクのＤＮＡ
配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマ
ーＮｏ．１（配列番号１）およびＮｏ．２（配列番号
２）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃
で１分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR
System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮ
ｏ．１（２８mer）は、バチルス・ズブチリスｐｕｒＲ
遺伝子（M. Weng, P.L. Nagy, and H.Zalkin. Identifi
cation of the Bacillus subtilis pur operon repress
or. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, 92:7455-745
9）の開始コドン上流の２４６番目〜２２８番目のヌク
レオチド由来の配列、および、５’末端に付加したＨｉ
ｎｄＩＩＩ部位を含む９mer配列から構成される。プラ
イマーＮｏ．２（２８mer）は、ＰｓｔＩ部位を含む９m
er配列を５’末端に融合したｐｕｒＲ遺伝子の終止コド
ンの下流の５７〜７５のヌクレオチド由来の配列であ
る。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化したＰＣＲ増
幅断片（０．９ｋｂ）を、ｐＨＳＧ３８９(TaKaRa, Jap
an)の両方の制限酵素部位の間に挿入して、ｐＨＳＧ３
９８ＢＳＰＲを創製した。増幅されたｐｕｒＲ遺伝子の
内部配列であるＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｃＩＩ断片０．３ｋ
ｂをｐＨＳＧ３９８ＢＳＰＲから除去し、続いて、ｐＤ
Ｇ１７２６（Bacillus Genetic Stock Center, Ohio）
から切り出したエンテロコッカス・フェカリス（Entero
coccus faecalis）のスペクチノマイシン耐性遺伝子
（１．２ｋｂ）で置き換えた。
【００３９】得られたプラスミドｐＨＳＧ３９８ｐｕｒ
Ｒ：：ｓｐｃを、Dubunau and Davidoff-Abelsonの方法
（Dubnau, D., and R. Davidoff-Abelson. Fate of tra
nsforming DNA following uptake by competent Bacill
us subtilis. J. Mol. Biol.1971, 56:209-221）により
調製したバチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇ
のコンピテントセルの形質転換に使用した。スペクチノ
マイシン耐性コロニーから個々に染色体ＤＮＡを調製
し、続いて上述のＰＣＲにより、ダブルクロスオーバー
変異株をスクリーニングした。ｐｕｒＲ欠損変異株（ｐ
ｕｒＲ：：ｓｐｃ）であると確認されたコロニーの１つ
をＫＭＢＳ４と命名した。 ２）バチルス・ズブチリスのｐｕｒＡ欠損変異株の構築 バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇの染色体
ＤＮＡを鋳型として、また遺伝子データバンクのＤＮＡ
配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマ
ーＮｏ．３（配列番号３）およびＮｏ．４（配列番号
４）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃
で２分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR
System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮ
ｏ．３（２９mer）は、バチルス・ズブチリスｐｕｒＡ
遺伝子の開始コドンの上流の１３７番目〜１１８番目の
ヌクレオチド由来の配列（P. Mantsala and H, Zaliki
n. Cloning and sequence of Bacillus subtilis purA
and gua A, involved in the conversion of IMP to AM
P and GMP. J, Bacteriol. 1992, 174: 1883-1890）、
および５’末端に付加したＳａｌＩ部位を含む追加の９
mer配列から構成される。プライマーＮｏ．４（２９me
r）は、５’末端でＳｐｈＩ部位を含む追加の９mer配列
を融合したｐｕｒＡ遺伝子の終止コドンの下流の５１〜
７０のヌクレオチド由来の配列である。ＳａｌＩおよび
ＳｐｈＩで消化したＰＣＲ増幅断片（１．５ｋｂ）を、
ｐＳＴＶ２８(TaKaRa Japan)の両制限酵素部位の間に挿
入した。得られたプラスミドｐＳＴＶ２８ＢＳＰＡをＭ
ｌｕＩおよびＢｇｌIIで消化し、増幅ｐｕｒＡ遺伝子の
内部配列０．４ｋｂを除去して、クレノウ酵素で平滑末
端化し、続いて、ｐＤＧ６４６（Bacillus Genetic Sto
ck Center, Ohio）から切り出したスタフィロコッカス
・アウレウス（Staphylococcus aureus）のエリスロマ
イシン耐性遺伝子（１．６ｋｂ）の平滑末端化した断片
に連結した。
Ｒ：：ｓｐｃを、Dubunau and Davidoff-Abelsonの方法
（Dubnau, D., and R. Davidoff-Abelson. Fate of tra
nsforming DNA following uptake by competent Bacill
us subtilis. J. Mol. Biol.1971, 56:209-221）により
調製したバチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇ
のコンピテントセルの形質転換に使用した。スペクチノ
マイシン耐性コロニーから個々に染色体ＤＮＡを調製
し、続いて上述のＰＣＲにより、ダブルクロスオーバー
変異株をスクリーニングした。ｐｕｒＲ欠損変異株（ｐ
ｕｒＲ：：ｓｐｃ）であると確認されたコロニーの１つ
をＫＭＢＳ４と命名した。 ２）バチルス・ズブチリスのｐｕｒＡ欠損変異株の構築 バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇの染色体
ＤＮＡを鋳型として、また遺伝子データバンクのＤＮＡ
配列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマ
ーＮｏ．３（配列番号３）およびＮｏ．４（配列番号
４）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃
で２分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR
System Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮ
ｏ．３（２９mer）は、バチルス・ズブチリスｐｕｒＡ
遺伝子の開始コドンの上流の１３７番目〜１１８番目の
ヌクレオチド由来の配列（P. Mantsala and H, Zaliki
n. Cloning and sequence of Bacillus subtilis purA
and gua A, involved in the conversion of IMP to AM
P and GMP. J, Bacteriol. 1992, 174: 1883-1890）、
および５’末端に付加したＳａｌＩ部位を含む追加の９
mer配列から構成される。プライマーＮｏ．４（２９me
r）は、５’末端でＳｐｈＩ部位を含む追加の９mer配列
を融合したｐｕｒＡ遺伝子の終止コドンの下流の５１〜
７０のヌクレオチド由来の配列である。ＳａｌＩおよび
ＳｐｈＩで消化したＰＣＲ増幅断片（１．５ｋｂ）を、
ｐＳＴＶ２８(TaKaRa Japan)の両制限酵素部位の間に挿
入した。得られたプラスミドｐＳＴＶ２８ＢＳＰＡをＭ
ｌｕＩおよびＢｇｌIIで消化し、増幅ｐｕｒＡ遺伝子の
内部配列０．４ｋｂを除去して、クレノウ酵素で平滑末
端化し、続いて、ｐＤＧ６４６（Bacillus Genetic Sto
ck Center, Ohio）から切り出したスタフィロコッカス
・アウレウス（Staphylococcus aureus）のエリスロマ
イシン耐性遺伝子（１．６ｋｂ）の平滑末端化した断片
に連結した。
【００４０】得られたプラスミドｐＨＳＧ３９８ｐｕｒ
Ａ：：ｅｒｍを、上述のようにDubunau and Davidoff-A
belsonの方法により調製された、ＫＭＢＳ４のコンピテ
ントセルの形質転換に使用した。エリスロマイシン耐性
コロニーから個々に染色体ＤＮＡを調製し、続いて上述
のＰＣＲにより、ダブルクロスオーバー変異株をスクリ
ーニングした。ｐｕｒＡ欠損変異株（ｐｕｒＲ：：ｓｐ
ｃ ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ）であると確認されたコロニー
の１つをＫＭＢＳ１３と命名した。予想通り、ＫＭＢＳ
１３の細胞は、アデニン栄養要求株であった。
Ａ：：ｅｒｍを、上述のようにDubunau and Davidoff-A
belsonの方法により調製された、ＫＭＢＳ４のコンピテ
ントセルの形質転換に使用した。エリスロマイシン耐性
コロニーから個々に染色体ＤＮＡを調製し、続いて上述
のＰＣＲにより、ダブルクロスオーバー変異株をスクリ
ーニングした。ｐｕｒＡ欠損変異株（ｐｕｒＲ：：ｓｐ
ｃ ｐｕｒＡ：：ｅｒｍ）であると確認されたコロニー
の１つをＫＭＢＳ１３と命名した。予想通り、ＫＭＢＳ
１３の細胞は、アデニン栄養要求株であった。
【００４１】３）バチルス・ズブチリスのｄｅｏＤ欠損
変異株の構築 バチルス・ズブチリス由来のｄｅｏＤ遺伝子の５’末端
およびその上流領域を増幅するために、遺伝子データバ
ンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオ
チドプライマーＮｏ．５（配列番号５）およびＮｏ．６
（配列番号６）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１
分、７２℃で１分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Ge
ne Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プラ
イマーＮｏ．５（２９mer）は、ｄｅｏＤ遺伝子の開始
コドンの上流の３１０番目〜２９１番目のヌクレオチド
由来の配列、および５’末端に付加したＥｃｏＲＩ部位
を含む追加の９mer配列から構成される。プライマーＮ
ｏ．６（２９mer）は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含
む追加の９mer配列を融合したｄｅｏＤ遺伝子の開始コ
ドンの下流の３９〜５７のヌクレオチド由来の配列であ
る。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ増幅
断片（０．４ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８(TaKaRaJapan)の
両制限酵素部位の間に挿入して、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮを
創製した。
変異株の構築 バチルス・ズブチリス由来のｄｅｏＤ遺伝子の５’末端
およびその上流領域を増幅するために、遺伝子データバ
ンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオリゴヌクレオ
チドプライマーＮｏ．５（配列番号５）およびＮｏ．６
（配列番号６）を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１
分、７２℃で１分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Ge
ne Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer）。プラ
イマーＮｏ．５（２９mer）は、ｄｅｏＤ遺伝子の開始
コドンの上流の３１０番目〜２９１番目のヌクレオチド
由来の配列、および５’末端に付加したＥｃｏＲＩ部位
を含む追加の９mer配列から構成される。プライマーＮ
ｏ．６（２９mer）は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含
む追加の９mer配列を融合したｄｅｏＤ遺伝子の開始コ
ドンの下流の３９〜５７のヌクレオチド由来の配列であ
る。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ増幅
断片（０．４ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８(TaKaRaJapan)の
両制限酵素部位の間に挿入して、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮを
創製した。
【００４２】ｄｅｏＤ遺伝子の３’末端およびその下流
領域を増幅するために、遺伝子データバンクのＤＮＡ配
列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマー
Ｎｏ．７（配列番号７）およびＮｏ．８（配列番号８）
を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１
分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR Sys
tem Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．７
（２９mer）は、ｄｅｏＤ遺伝子の終止コドンの下流の
３２１番目〜３０２番目のヌクレオチド由来の配列、お
よび５’末端に付加したＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む９me
r配列から構成される。プライマーＮｏ．８（２９mer）
は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列
を融合したｄｅｏＤ遺伝子の終止コドンの上流の２４番
目〜４２番目のヌクレオチド由来の配列である。Ｈｉｎ
ｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ増幅断片
（０．４ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮの両制限酵素部
位の間に挿入して、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮＣを創出した。
領域を増幅するために、遺伝子データバンクのＤＮＡ配
列情報に従って合成したオリゴヌクレオチドプライマー
Ｎｏ．７（配列番号７）およびＮｏ．８（配列番号８）
を用いて、９４℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で１
分の３０サイクルでＰＣＲを行った（Gene Amp PCR Sys
tem Model 9600, Perkin Elmer）。プライマーＮｏ．７
（２９mer）は、ｄｅｏＤ遺伝子の終止コドンの下流の
３２１番目〜３０２番目のヌクレオチド由来の配列、お
よび５’末端に付加したＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む９me
r配列から構成される。プライマーＮｏ．８（２９mer）
は、５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列
を融合したｄｅｏＤ遺伝子の終止コドンの上流の２４番
目〜４２番目のヌクレオチド由来の配列である。Ｈｉｎ
ｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化したＰＣＲ増幅断片
（０．４ｋｂ）を、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮの両制限酵素部
位の間に挿入して、ｐＳＴＶ２８ＤＯＮＣを創出した。
【００４３】ストレプトコッカス・フェカーリス（Stre
ptococcus faecalis）のカナマイシン耐性遺伝子を増幅
するために、鋳型としてｐＤＧ７８３のプラスミドＤＮ
Ａ(Bacillus Genetic Stock Center, Ohio)を、また遺
伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオ
リゴヌクレオチドプライマーＮｏ．９（配列番号９）お
よびＮｏ．１０（配列番号１０）を用いて、９４℃で３
０秒、５５℃で１分、７２℃で２分の３０サイクルでＰ
ＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perk
in Elmer）。プライマーＮｏ．９（３３mer）は、カナ
マイシン耐性遺伝子の開始コドンの上流の５１３番目〜
４９０番目のヌクレオチド由来の配列、および５’末端
に付加したＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列から
構成される。プライマーＮｏ．１０（３３mer）は、
５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列を融
合したカナマイシン耐性遺伝子の終止コドンの下流の１
１７〜１４０のヌクレオチド由来の配列である。Ｂａｍ
ＨＩで消化したＰＣＲ増幅断片（１．５ｋｂ）を、ｐＳ
ＴＶ２８ＤＯＮＣの唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入した。
得られたプラスミドｐＳＴＶ２８ｄｅｏＤ：：ｋａｎ
を、上述のようにDubunau and Davidoff-Abelsonの方法
により調製した、ＫＭＢＳ１３のコンピテントセルの形
質転換に使用した。カナマイシン耐性コロニーから個々
に染色体ＤＮＡを調製し、続いてプライマーＮｏ．５お
よびＮｏ．７を用いた上述のＰＣＲにより、ダブルクロ
スオーバー変異株をスクリーニングした。ｄｅｏＤ欠損
変異株（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ：：ｅｒｍ ｄｅｏＤ：：
ｋａｎ）であると確認されたコロニーの１つをＫＭＢＳ
１６と命名した。
ptococcus faecalis）のカナマイシン耐性遺伝子を増幅
するために、鋳型としてｐＤＧ７８３のプラスミドＤＮ
Ａ(Bacillus Genetic Stock Center, Ohio)を、また遺
伝子データバンクのＤＮＡ配列情報に従って合成したオ
リゴヌクレオチドプライマーＮｏ．９（配列番号９）お
よびＮｏ．１０（配列番号１０）を用いて、９４℃で３
０秒、５５℃で１分、７２℃で２分の３０サイクルでＰ
ＣＲを行った（Gene Amp PCR System Model 9600, Perk
in Elmer）。プライマーＮｏ．９（３３mer）は、カナ
マイシン耐性遺伝子の開始コドンの上流の５１３番目〜
４９０番目のヌクレオチド由来の配列、および５’末端
に付加したＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列から
構成される。プライマーＮｏ．１０（３３mer）は、
５’末端にＢａｍＨＩ部位を含む追加の９mer配列を融
合したカナマイシン耐性遺伝子の終止コドンの下流の１
１７〜１４０のヌクレオチド由来の配列である。Ｂａｍ
ＨＩで消化したＰＣＲ増幅断片（１．５ｋｂ）を、ｐＳ
ＴＶ２８ＤＯＮＣの唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入した。
得られたプラスミドｐＳＴＶ２８ｄｅｏＤ：：ｋａｎ
を、上述のようにDubunau and Davidoff-Abelsonの方法
により調製した、ＫＭＢＳ１３のコンピテントセルの形
質転換に使用した。カナマイシン耐性コロニーから個々
に染色体ＤＮＡを調製し、続いてプライマーＮｏ．５お
よびＮｏ．７を用いた上述のＰＣＲにより、ダブルクロ
スオーバー変異株をスクリーニングした。ｄｅｏＤ欠損
変異株（ｐｕｒＲ：：ｓｐｃ：：ｅｒｍ ｄｅｏＤ：：
ｋａｎ）であると確認されたコロニーの１つをＫＭＢＳ
１６と命名した。
【００４４】
【実施例１】バチルス・ズブチリス イノシン生産株の
ポリミキシン耐性変異株の選択および評価 バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６株の細胞（〜１
０8）を、１５、２０、３０または４０ｍｇ／ｌのポリ
ミキシンＢ硫酸塩（Sigma, USA）を含有するＬブロス寒
天培地（トリプトン−１０ｇ／ｌ、酵母抽出物−５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌ−０．５ｇ／ｌ、グルコース−２ｇ／ｌ、
ｐＨ７、寒天２０ｇ／ｌ）に植菌した。これらのプレー
トを３４℃にて５日間インキュベートした。出現した自
然変異株のコロニーから、バチルス・ズブチリスＫＭＢ
Ｓ１６ｐｏｌR１−１株（ＶＫＰＭＢ−８２４５）を選
択した。
ポリミキシン耐性変異株の選択および評価 バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６株の細胞（〜１
０8）を、１５、２０、３０または４０ｍｇ／ｌのポリ
ミキシンＢ硫酸塩（Sigma, USA）を含有するＬブロス寒
天培地（トリプトン−１０ｇ／ｌ、酵母抽出物−５ｇ／
ｌ、ＮａＣｌ−０．５ｇ／ｌ、グルコース−２ｇ／ｌ、
ｐＨ７、寒天２０ｇ／ｌ）に植菌した。これらのプレー
トを３４℃にて５日間インキュベートした。出現した自
然変異株のコロニーから、バチルス・ズブチリスＫＭＢ
Ｓ１６ｐｏｌR１−１株（ＶＫＰＭＢ−８２４５）を選
択した。
【００４５】変異株および親株のポリミキシンおよびコ
リスチンに対する耐性（相対生育度）を、以下の手法に
より評価した。段階的な濃度のポリミキシンまたはコリ
スチンを添加することにより調製したＬブロス５ｍｌを
入れた試験管に、あらかじめＬブロス中で１８時間振と
うしながら生育させた試験株を約１０6細胞／ｍｌとな
るように接種し、３７℃で２４時間振とう培養を行っ
た。得られた培地を水で適当に希釈して、希釈物の５４
０ｎｍでの吸光度を測定して、生育度（ポリミキシンの
場合にはＰＯＤ540、またコリスチンの場合にはＣＯＤ
540）を調べた。抗生物質を含まないＬブロスでの同一
株の生育度（ＯＤ540）を１００とした。ポリミキシン
含有培地またはコリスチン含有培地における相対生育度
は、それぞれ（ＰＯＤ540）／（ＯＤ540）×１００、ま
たは（ＣＯＤ540）／（ＯＤ540）×１００として算出す
ることができる。結果を表１に示す。
リスチンに対する耐性（相対生育度）を、以下の手法に
より評価した。段階的な濃度のポリミキシンまたはコリ
スチンを添加することにより調製したＬブロス５ｍｌを
入れた試験管に、あらかじめＬブロス中で１８時間振と
うしながら生育させた試験株を約１０6細胞／ｍｌとな
るように接種し、３７℃で２４時間振とう培養を行っ
た。得られた培地を水で適当に希釈して、希釈物の５４
０ｎｍでの吸光度を測定して、生育度（ポリミキシンの
場合にはＰＯＤ540、またコリスチンの場合にはＣＯＤ
540）を調べた。抗生物質を含まないＬブロスでの同一
株の生育度（ＯＤ540）を１００とした。ポリミキシン
含有培地またはコリスチン含有培地における相対生育度
は、それぞれ（ＰＯＤ540）／（ＯＤ540）×１００、ま
たは（ＣＯＤ540）／（ＯＤ540）×１００として算出す
ることができる。結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】表１から、ポリミキシンＢ耐性として取得
されたバチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６ｐｏｌR１−
１株は、コリスチンにも耐性であることがわかる。
されたバチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６ｐｏｌR１−
１株は、コリスチンにも耐性であることがわかる。
【００４８】バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６ｐｏｌ
R１−１株および親株であるバチルス・ズブチリスＫＭ
ＢＳ１６株を、それぞれＬブロス中で３４℃で１８時
間、通気しながら培養した。次に、得られた培養物０．
３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の発酵培地３ｍｌ
に接種し、ロータリーシェーカーを用いて３４℃で７２
時間培養した。
R１−１株および親株であるバチルス・ズブチリスＫＭ
ＢＳ１６株を、それぞれＬブロス中で３４℃で１８時
間、通気しながら培養した。次に、得られた培養物０．
３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管中の発酵培地３ｍｌ
に接種し、ロータリーシェーカーを用いて３４℃で７２
時間培養した。
【００４９】発酵培地の組成：（ｇ／ｌ）
グルコース ８０．０
ＫＨ2ＰＯ4 １．０
ＭｇＳＯ4 ０．４
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０１
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ０．０１
Ｍａｍｅｎｏ−ＴＮ １．３５
ＤＬ−メチオニン ０．３
ＮＨ4Ｃｌ ３２．０
アデニン ０．１
トリプトファン ０．０２
ＣａＣＯ3 ５０．０
グルコースおよび硫酸マグネシウムは、別個に滅菌す
る。ＣａＣＯ3は、１８０度で２時間、乾熱滅菌する。
ｐＨを７．０に調整する。
る。ＣａＣＯ3は、１８０度で２時間、乾熱滅菌する。
ｐＨを７．０に調整する。
【００５０】培養後、培地中に蓄積したイノシン量をＨ
ＰＬＣにより測定した。培地試料（５００μｌ）を、１
５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＨ2Ｏで
１００倍希釈して、ＨＰＬＣにより分析した。
ＰＬＣにより測定した。培地試料（５００μｌ）を、１
５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をＨ2Ｏで
１００倍希釈して、ＨＰＬＣにより分析した。
【００５１】分析条件：
カラム：Ｌｕｎａ Ｃ１８（２） ２５０×３ｍｍ、５
ｕ(Phenomenex, USA)。 緩衝液：２％ Ｃ2Ｈ5ＯＨ；０．８％（ｖ／ｖ）トリエ
チルアミン；０．５５％（ｖ／ｖ）酢酸（氷酢酸）；ｐ
Ｈ４．５。 温度：３０℃。 流速：０．３ｍｌ／分。 検出：ＵＶ２５０ｎｍ。 保持時間（分）： キサントシン １３．７ イノシン ９．６ ヒポキサンチン ５．２ グアノシン １１．４ アデノシン ２８．２
ｕ(Phenomenex, USA)。 緩衝液：２％ Ｃ2Ｈ5ＯＨ；０．８％（ｖ／ｖ）トリエ
チルアミン；０．５５％（ｖ／ｖ）酢酸（氷酢酸）；ｐ
Ｈ４．５。 温度：３０℃。 流速：０．３ｍｌ／分。 検出：ＵＶ２５０ｎｍ。 保持時間（分）： キサントシン １３．７ イノシン ９．６ ヒポキサンチン ５．２ グアノシン １１．４ アデノシン ２８．２
【００５２】結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
表２
─────────────────────────────────
バチルス・ズブチリス菌株 ＯＤ540 イノシン、ｇ／ｌ
─────────────────────────────────
ＫＭＢＳ１６ ８．１ １．４
ＫＭＢＳ１６ｐｏｌR１−１ ７．８ １．９
─────────────────────────────────
【００５４】表２に示すように、バチルス・ズブチリス
ＫＭＢＳ１６ｐｏｌR１−１株は、親株よりも多くイノ
シンを蓄積した。
ＫＭＢＳ１６ｐｏｌR１−１株は、親株よりも多くイノ
シンを蓄積した。
【００５５】
【実施例２】バチルス・アミロリケファシエンス イノ
シン生産株のコリスチン耐性変異株の選択および評価 バチルス・アミロリケファシエンスＡＳ１１５−７株の
細胞（〜１０8）を、１０、１５、２０、３０または４
０ｍｇ／ｌのコリスチン硫酸塩（Sigma, USA）を含有す
る実施例１と同様のＬブロス寒天培地に植菌した。これ
らのプレートを、３４℃で５日間インキュベートした。
出現した自然変異株のコロニーから、バチルス・アミロ
リケファシエンスＣｏｌR７−１０５株（ＶＫＰＭ Ｂ
−８２４６）を選択した。
シン生産株のコリスチン耐性変異株の選択および評価 バチルス・アミロリケファシエンスＡＳ１１５−７株の
細胞（〜１０8）を、１０、１５、２０、３０または４
０ｍｇ／ｌのコリスチン硫酸塩（Sigma, USA）を含有す
る実施例１と同様のＬブロス寒天培地に植菌した。これ
らのプレートを、３４℃で５日間インキュベートした。
出現した自然変異株のコロニーから、バチルス・アミロ
リケファシエンスＣｏｌR７−１０５株（ＶＫＰＭ Ｂ
−８２４６）を選択した。
【００５６】この株及び親株のポリミキシンに対する耐
性（相対生育度）を、実施例１に記載の方法により評価
した。結果を表３に示す。
性（相対生育度）を、実施例１に記載の方法により評価
した。結果を表３に示す。
【００５７】
【表３】
【００５８】表３からわかるように、コリスチン耐性株
として得られたバチルス・アミロリケファシエンスＣｏ
ｌR７−１０５株は、ポリミキシンＢに対してより耐性
である。
として得られたバチルス・アミロリケファシエンスＣｏ
ｌR７−１０５株は、ポリミキシンＢに対してより耐性
である。
【００５９】バチルス・アミロリケファシエンスＣｏｌ
Ｒ７−１０５株および親株であるバチルス・アミロリケ
ファシエンスＡＳ１１５−７株を、それぞれＬブロス中
で、３４℃で１８時間培養した。次に、得られた培養物
０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管に入れた、Ｌ−
トリプトファンの代わりに４０μｇ／ｍｌのＬ−ヒスチ
ジンおよび４０μｇ／ｍｌのＬ−チロシンを含有する実
施例１の発酵培地３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカ
ーを用いて３４℃で７２時間培養した。培養後、培地中
に蓄積したイノシン量を、上記のようにしてＨＰＬＣに
より測定した。結果を表４に示す。
Ｒ７−１０５株および親株であるバチルス・アミロリケ
ファシエンスＡＳ１１５−７株を、それぞれＬブロス中
で、３４℃で１８時間培養した。次に、得られた培養物
０．３ｍｌを、２０×２００ｍｍ試験管に入れた、Ｌ−
トリプトファンの代わりに４０μｇ／ｍｌのＬ−ヒスチ
ジンおよび４０μｇ／ｍｌのＬ−チロシンを含有する実
施例１の発酵培地３ｍｌに接種し、ロータリーシェーカ
ーを用いて３４℃で７２時間培養した。培養後、培地中
に蓄積したイノシン量を、上記のようにしてＨＰＬＣに
より測定した。結果を表４に示す。
【００６０】
【表４】
表４
─────────────────────────────────
バチルス・ズブチリス菌株 ＯＤ540 イノシン、ｇ／ｌ
─────────────────────────────────
ＡＳ１１５−７ ４．２ ８．８
ＣｏｌR７−１０５ ５．０ ９．５
─────────────────────────────────
【００６１】表４に示すように、コリスチンに耐性の
Ｂ．アミロリケファシエンスＣｏｌR７−１０５株は、
親株よりも多くイノシンを蓄積した。
Ｂ．アミロリケファシエンスＣｏｌR７−１０５株は、
親株よりも多くイノシンを蓄積した。
【００６２】
【発明の効果】本発明により、バチルス属に属する細菌
によるイノシンおよびキサントシン等のプリンヌクレオ
シドの生産性を向上させることができる。また、本発明
によれば、５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸およ
び５’−グアニル酸等のプリンヌクレオチドを効率よく
製造することができる。
によるイノシンおよびキサントシン等のプリンヌクレオ
シドの生産性を向上させることができる。また、本発明
によれば、５’−イノシン酸、５’−キサンチル酸およ
び５’−グアニル酸等のプリンヌクレオチドを効率よく
製造することができる。
【００６３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> Method for Producing Purine Nuclesides and Nucleotides
<130> P-B0606F
<140>
<141> 2003-02-06
<150> RU 2002103333
<151> 2002-02-11
<160> 10
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 1
ctcaagcttg aagttgcgat gatcaaaa 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 2
ctcctgcaga catattgttg acgataat 28
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 3
ctcgtcgaca aaacgaatgg aagcgaacg 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 4
ctcgcatgca gaccaactta tatgcggct 29
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 5
ctcgaattcc agcggaatat tctttcccg 29
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 6
ctcggatccc ggcaaaagca cagtatcc 28
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 7
ctcaagctta tggtttccag accatcgact 30
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 8
ctcggatccc atgatatgat agaagtgg 28
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 9
ctcggatccg aggtgatagg taagattata ccg 33
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: primer
<400> 10
ctcggatccg gcgctcggga cccctatcta gcg 33
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:125）
(Ｃ１２Ｐ 19/40
Ｃ１２Ｒ 1:125）
(72)発明者 リュドミラ アナトリエヴナ カザリノヴ
ァ
ロシア連邦、117321、モスクワ市、オスト
ロヴィチャノヴァ通り16番地、４号棟、88
号室
(72)発明者 ニコライ ゲオルギエヴィッチ マトロソ
フ
ロシア連邦、113535、モスクワ市、ダロジ
ュナヤ通り28番地、２号棟、１号室
(72)発明者 エカチェリナ イゴレヴナ ムハノヴァ
ロシア連邦、113208、モスクワ市、チェル
タノフスカヤ通り11番地、２号棟、179号
室
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA02 DA07 HA03
4B064 AF24 AF34 CA02 CA19 CC24
CE11 DA01
4B065 AA19 AB01 AC14 BB02 BB15
BB27 CA16 CA44
Claims (15)
- 【請求項１】 ポリミキシンＢおよび／またはコリスチ
ンによる生育阻害に対する耐性を有し、かつプリンヌク
レオシド生産能を有するバチルス属細菌。 - 【請求項２】 バチルス・ズブチリスに属する請求項１
に記載の細菌。 - 【請求項３】 バチルス・アミロリケファシエンスに属
する請求項１に記載の細菌。 - 【請求項４】 前記プリンヌクレオシドはイノシンであ
る請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。 - 【請求項５】 前記プリンヌクレオシドはキサントシン
である請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。 - 【請求項６】 前記プリンヌクレオシドはグアノシンで
ある請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか一項に記載の細
菌を培地で培養し、プリンヌクレオシドを生成して培地
中に蓄積させ、同培地からプリンヌクレオシドを採取す
ることを特徴とするプリンヌクレオシドの製造方法。 - 【請求項８】 前記プリンヌクレオシドはイノシンであ
る請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 前記プリンヌクレオシドはキサントシン
である請求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記プリンヌクレオシドはグアノシン
である請求項７に記載の方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜６のいずれか一項に記載の
細菌を培地で培養し、生成、蓄積したヌクレオシドをリ
ン酸化し、生成、蓄積したプリンヌクレオチドを採取す
ることを特徴とするプリンヌクレオチドの製造方法。 - 【請求項１２】 前記プリンヌクレオチドは５’−イノ
シン酸である請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記プリンヌクレオチドは５’−キサ
ンチル酸である請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記プリンヌクレオチドは５’−グア
ニル酸である請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項５に記載の細菌を培地で培養
し、生成蓄積したキサントシンをリン酸化し、生成、蓄
積した５’−キサンチル酸をアミノ化し、そして生成蓄
積した５’−グアニル酸を採取することを特徴とする
５’−グアニル酸の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002103333 | 2002-02-11 | ||
| RU2002103333/13A RU2260040C2 (ru) | 2002-02-11 | 2002-02-11 | Способ получения инозина и инозин 5'-монофосфата, штамм бактерии, принадлежащей к роду bacillus - продуцент инозина (варианты) |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003259861A true JP2003259861A (ja) | 2003-09-16 |
| JP2003259861A5 JP2003259861A5 (ja) | 2006-03-02 |
| JP4385611B2 JP4385611B2 (ja) | 2009-12-16 |
Family
ID=28673168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003029752A Expired - Lifetime JP4385611B2 (ja) | 2002-02-11 | 2003-02-06 | プリンヌクレオシドおよびヌクレオチドの製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4385611B2 (ja) |
| RU (1) | RU2260040C2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007075109A (ja) * | 2005-09-14 | 2007-03-29 | Ajinomoto Co Inc | プリンヌクレオシド生産菌及びプリンヌクレオシド製造法 |
| JP2007075108A (ja) * | 2005-09-14 | 2007-03-29 | Ajinomoto Co Inc | プリンヌクレオシド生産菌及びプリンヌクレオシド製造法 |
| WO2009088074A1 (ja) | 2008-01-11 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co., Inc. | 植物用病害耐性増強剤およびそれを用いた植物病害防除法 |
| US7951913B2 (en) | 2006-06-02 | 2011-05-31 | Biotika A.S. | Method of polymyxin B recovery from fermentation broth |
| US8119371B2 (en) | 2006-06-15 | 2012-02-21 | Biotika A.S. | Process for the preparation of polymyxin B employing (PAENI) Bacillus polymyxa |
| US9012182B2 (en) * | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
| CN111830153A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-10-27 | 南京品生医学检验实验室有限公司 | 一种检测血清中多粘菌素b1和多粘菌素b2浓度的方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101916611B1 (ko) * | 2017-12-15 | 2018-11-07 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 imp 생산방법 |
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| CN111665307A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-09-15 | 南京品生医疗科技有限公司 | 一种检测血清中多粘菌素b1和多粘菌素b2浓度的试剂盒 |
-
2002
- 2002-02-11 RU RU2002103333/13A patent/RU2260040C2/ru active
-
2003
- 2003-02-06 JP JP2003029752A patent/JP4385611B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9012182B2 (en) * | 2004-03-31 | 2015-04-21 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacterium belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
| JP2007075109A (ja) * | 2005-09-14 | 2007-03-29 | Ajinomoto Co Inc | プリンヌクレオシド生産菌及びプリンヌクレオシド製造法 |
| JP2007075108A (ja) * | 2005-09-14 | 2007-03-29 | Ajinomoto Co Inc | プリンヌクレオシド生産菌及びプリンヌクレオシド製造法 |
| US7951913B2 (en) | 2006-06-02 | 2011-05-31 | Biotika A.S. | Method of polymyxin B recovery from fermentation broth |
| US8119371B2 (en) | 2006-06-15 | 2012-02-21 | Biotika A.S. | Process for the preparation of polymyxin B employing (PAENI) Bacillus polymyxa |
| WO2009088074A1 (ja) | 2008-01-11 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co., Inc. | 植物用病害耐性増強剤およびそれを用いた植物病害防除法 |
| CN111830153A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-10-27 | 南京品生医学检验实验室有限公司 | 一种检测血清中多粘菌素b1和多粘菌素b2浓度的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4385611B2 (ja) | 2009-12-16 |
| RU2260040C2 (ru) | 2005-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7326546B2 (en) | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance | |
| JP3944916B2 (ja) | 発酵法によるプリンヌクレオシドの製造法 | |
| JP4760711B2 (ja) | バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を使用した発酵によるプリンヌクレオシド及びヌクレオチドの製造方法 | |
| RU2365622C2 (ru) | СПОСОБ ПРОДУКЦИИ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К РОДУ Escherichia ИЛИ Bacillus | |
| CN101432417A (zh) | 能够产生嘌呤物质的细菌和用于产生嘌呤物质的方法 | |
| KR20060136477A (ko) | 바실러스 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균을 사용하여발효에 의해 퓨린 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를제조하는 방법 | |
| JP5488594B2 (ja) | プリンリボヌクレオシド及びリボヌクレオチドの製造方法 | |
| JP4352716B2 (ja) | バチルス属に属するイノシン生産菌及びイノシンの製造法 | |
| JP4385611B2 (ja) | プリンヌクレオシドおよびヌクレオチドの製造方法 | |
| JP4363042B2 (ja) | プリンヌクレオシドおよびプリンヌクレオチドの製造方法 | |
| KR100779865B1 (ko) | 발효에 의한 뉴클레오타이드의 제조방법 | |
| RU2333949C2 (ru) | ШТАММЫ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis И Bacillus amyloliquefaciens-ПРОДУЦЕНТЫ ИНОЗИНА И СПОСОБ ПРОДУКЦИИ ИНОЗИНА С ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ | |
| JP2007075108A6 (ja) | プリンヌクレオシド生産菌及びプリンヌクレオシド製造法 | |
| RU2271391C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНОЗИНА И 5'-ИНОЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К РОДУ Escherichia | |
| RU2542387C1 (ru) | БАКТЕРИЯ Bacillus subtilis, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ 5`-АМИНОИМИДАЗОЛ-4-КАРБОКСАМИДРИБОЗИД (АИКАР), И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА АИКАР ПУТЕМ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ТАКОЙ БАКТЕРИИ | |
| RU2244004C2 (ru) | Способ получения инозина и 5'-инозиновой кислоты, штамм escherichia coli - продуцент инозина | |
| JP4696404B2 (ja) | 発酵法によるヌクレオチドの製造法 | |
| JP2000135078A (ja) | 発酵法によるキサントシンの製造法 | |
| RU2320717C2 (ru) | Способ продукции пуриновых нуклеозидов методом ферментации с использованием бактерий, принадлежащих к роду bacillus | |
| RU2294962C2 (ru) | БЕЛОК YdhL ИЗ Bacillus amyloliquefaciens, ФРАГМЕНТ ДНК, БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ Escherichia ИЛИ Bacillus, - ПРОДУЦЕНТ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОЗИДОВ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПУРИНОВЫХ НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ | |
| JP2007075109A6 (ja) | プリンヌクレオシド生産菌及びプリンヌクレオシド製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060118 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060118 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081007 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081208 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090317 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090414 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20090521 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090804 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090817 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090908 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090921 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4385611 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121009 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121009 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121009 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131009 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |