CN109374781A - 一种注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，属于化学药物分析方法技术领域。本发明采用梯度洗脱过程可以分离舒巴坦和美洛西林的杂质，同时可以对两种成分的杂质进行归属，有效区分美洛西林和舒巴坦的杂质，专属性高，灵敏度高，回收率高，检测出的杂质多，能快速、有效、准确监控注射用美洛西林钠舒巴坦钠中的有关物质。

Description

一种注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法
技术领域
本发明属于化学药物分析方法技术领域，具体涉及一种注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法。
背景技术
注射用美洛西林钠舒巴坦钠(Mezlocillin Sodium and Sulbactam Sodium forInjection)，注射用美洛西林钠舒巴坦钠规格为每瓶含有美洛西林1.0g和舒巴坦0.25g与每瓶含有美洛西林2.0g和舒巴坦0.5g。
注射用美洛西林钠舒巴坦钠含β-内酰胺酶抑制剂-舒巴坦，适用于产β-内酰胺酶耐药菌引起的中、重度下列感染性疾病，包括：1.呼吸系统感染：如中耳炎、鼻窦炎、扁桃体炎、咽炎、肺炎、急性支气管炎和慢性支气管炎急性发作、支气管扩张、脓胸、肺脓肿等；2.泌尿生殖系统感染：如肾盂肾炎、膀胱炎和尿道炎等；3.腹腔感染：如胆道感染等；4.皮肤及软组织感染：如蜂窝组织炎、伤口感染、疖病、脓性皮炎和脓疱病；5.性病：淋病等；6.盆腔感染：妇科感染、产后感染等；7.严重系统感染：如脑膜炎、细菌性心内膜炎、腹膜炎、败血症、脓毒症等。对于致命的全身性细菌感染、未知微生物或不敏感微生物所致感染、重度感染及混合感染等，如使用注射用美洛西林钠舒巴坦钠，建议与其他杀菌剂联合用药治疗。
注射用美洛西林钠由法国拜耳公司研制，商品名：1980.07.15上市。注射用舒巴坦钠由法国PFIZER公司研制，商品名：1990.7.30上市。注射用美洛西林钠舒巴坦钠在国外没有上市，是我国自行研制的新药。
为了保证药物的安全有效，需要对药物中的有关物质进行研究、检测和监控。有关物质主要为工艺副产物及降解产物，药品在放置过程中，杂质谱在发生变化，因此需要根据不同的合成路线和生产工艺、贮藏条件建立合适的分析方法，达到对注射用美洛西林钠舒巴坦钠有关物质准确、有效的检测和监控。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法。
本发明的技术方案如下：
一种注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：以流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，流动相A为磷酸盐缓冲溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱过程包括以下步骤：(1)在0分钟，流动相A和流动相B的体积为98:2；(2)在0-11分钟内，流动相A和流动相B的体积比从98:2匀速渐变至81:19；(3)在11-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持81:19不变；(4)在50-80分钟内，流动相A和流动相B的体积比从81:19匀速渐变至30:70；(5)80-85分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变；(6)85-87分钟内，流动相A和流动相B的体积比从30:70匀速渐变至98:2；(7)87-94分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持98:2不变。具体的梯度洗脱过程如下：
在一种优选方案中，流动相A为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合溶液。在不影响本发明效果的情况下，流动相A优选为：每1000ml混合溶液中含有磷酸二氢钾4.9g和磷酸氢二钾0.45g。
在一种更优选方案中，流动相A的制备方法包括以下步骤：取磷酸二氢钾4.9g和磷酸氢二钾0.45g，加水溶解并稀释至1000ml，即得。
本发明的色谱条件还包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶柱；色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm。在不影响本发明效果的情况下，本发明采用的色谱柱可以为岛津Inertsustain C18柱(250mm×4.6mm,5μm)或YMC-Pack ODS-AQ柱(250mm×4.6mm,5μm)。
进一步的，检测波长为200～230nm，优选210nm。
进一步的，柱温为20℃～35℃，优选为25℃。
进一步的，进样量为10～50μl，优选为20μl。
进一步的，流速为1.0ml/min。
本发明采用梯度洗脱过程可以分离舒巴坦和美洛西林的杂质，同时可以对两种成分的杂质进行归属，有效区分美洛西林和舒巴坦的杂质，专属性高，灵敏度高，回收率高，检测出的杂质多，能快速、有效、准确监控注射用美洛西林钠舒巴坦钠中的有关物质。在前11分钟内用含低乙腈流动相分离舒巴坦的2个已知杂质和未知杂质，在11分钟之后逐步提高乙腈浓度分离美洛西林的4个已知杂质和未知杂质。
本发明提供的一种注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，其中有关物质包括以下物质：
本发明提供检测方法的具体步骤为：分别配制对照溶液、对照品溶液、美洛西林钠原料样品溶液、舒巴坦钠原料样品溶液、供试品溶液并进样，通过外标法进行已知杂质含量检测，通过主成分1％自身对照法进行未知杂质含量检测。其中，对照溶液：1％供试品溶液。
一种对照品溶液：分别取美洛西林杂质1、2、3、4，舒巴坦杂质A、B、C、D、E、F适量，加溶剂(流动相A：流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含舒巴坦杂质A为2.5μg，舒巴坦杂质B为0.5μg，舒巴坦杂质C为0.5μg，舒巴坦杂质D为0.5μg，舒巴坦杂质E为0.5μg，舒巴坦杂质F为0.5μg，美洛西林1为20μg，美洛西林2为10μg，美洛西林3为10μg，美洛西林4为10μg的混合溶液。
另一种对照品溶液：分别取舒巴坦及舒巴坦杂质A、B，美洛西林及美洛西林杂质1、2、3、4适量，加溶剂(流动相A:流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含舒巴坦杂质A为2.5μg，舒巴坦杂质B为0.5μg，舒巴坦为5μg，美洛西林1为20μg，美洛西林2为1μg，美洛西林3为10μg，美洛西林4为10μg，美洛西林为20μg的混合溶液。
美洛西林钠原料样品溶液：取美洛西林钠原料适量，加溶剂(流动相A：流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含美洛西林2.0mg的溶液。
舒巴坦钠原料样品溶液：取舒巴坦钠原料适量，加溶剂(流动相A：流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含舒巴坦0.5mg的溶液。
供试品溶液：取注射用美洛西林钠舒巴坦钠适量，加溶剂(流动相A：流动相B＝98:2)溶解并定量稀释制成每1ml约含美洛西林2.0mg的溶液。
供试品加杂质混合溶液：取各杂质及注射用美洛西林钠舒巴坦钠各适量，加溶剂(流动相A：流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含舒巴坦杂质A为2.5μg，舒巴坦杂质B为0.5μg，舒巴坦杂质C为0.5μg，舒巴坦杂质D为0.5μg，舒巴坦杂质E为0.5μg，舒巴坦杂质F为0.5μg，舒巴坦为0.5mg，美洛西林1为20μg，美洛西林2为10μg，美洛西林3为10μg，美洛西林4为10μg，美洛西林为2mg的混合溶液。
本发明通过筛选合适流动相并优化流动相中各组分比例，筛选合适的其他色谱条件，对注射用美洛西林钠舒巴坦钠以及上述10个杂质进行色谱分析，确定了本发明分析方法，同时进行了专属性、检测限定量限、进样精密度、线性范围、溶液稳定性、重复性、准确度、校正因子验证，确证该方法的可行性(美洛西林杂质2为混合物，定量研究不准确，舒巴坦杂质C～G为舒巴坦钠原料工艺杂质，只进行定性研究)。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供的注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，对各研究杂质均能有效分离，有效区分美洛西林和舒巴坦的杂质，检测出的杂质多，专属性高，灵敏度高，回收率高，能快速、有效、准确监控注射用美洛西林钠舒巴坦钠中的有关物质。
附图说明
图1是本发明实施例1的美洛西林原料溶液高效液相色谱图；
图2是本发明实施例1的注射用美洛西林钠舒巴坦钠溶液高效液相色谱图；
图3是本发明实施例1的舒巴坦原料溶液高效液相色谱图；
图4是本发明实施例1的供试品加杂质溶液高效液相色谱图；
图5是对比例1的对照品溶液高效液相色谱图；
图6是对比例1的美洛西林钠原料溶液高效液相色谱图；
图7是对比例1的舒巴坦钠原料溶液高效液相色谱图；
图8是对比例1的供试品溶液高效液相色谱图；
图9是对比例2的美洛西林钠原料溶液高效液相色谱图；
图10是对比例3的对照品溶液高效液相色谱图；
图11是对比例3的舒巴坦钠原料加杂质溶液高效液相色谱图；
图12是对比例4的舒巴坦对照品溶液高效液相色谱图；
图13是对比例4的美洛西林钠原料溶液高效液相色谱图；
图14是本发明实施例2的对照品溶液高效液相色谱图；
图15是本发明实施例2的供试品溶液高效液相色谱图；
图16是本发明实施例3的对照品溶液高效液相色谱图；
图17是本发明实施例3的供试品溶液高效液相色谱图。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
实施例1：
高效液相色谱条件：
色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶柱，岛津Inertsustain C18柱(250mm×4.6mm,5μm)，S/N：7JR98491，以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾4.9g和磷酸氢二钾0.45g，加水溶解并稀释至1000ml)为流动相A；以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。检测波长：210nm，流速：1.0ml/min，进样量：20μl，柱温：25℃。
梯度洗脱过程为：(1)在0分钟，流动相A和流动相B的体积为98:2；(2)在0-11分钟内，流动相A和流动相B的体积比从98:2匀速渐变至81:19；(3)在11-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持81:19不变；(4)在50-80分钟内，流动相A和流动相B的体积比从81:19匀速渐变至30:70；(5)80-85分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变；(6)85-87分钟内，流动相A和流动相B的体积比从30:70匀速渐变至98:2；(7)87-94分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持98:2不变。
样品配制：
美洛西林钠原料样品溶液：取美洛西林钠原料适量，加溶剂(流动相A：流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含美洛西林2.0mg的溶液。
舒巴坦钠原料样品溶液：取舒巴坦钠原料适量，加溶剂(流动相A：流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含舒巴坦0.5mg的溶液。
供试品溶液：取注射用美洛西林钠舒巴坦钠适量，加溶剂(流动相A：流动相B＝98:2)溶解并定量稀释制成每1ml约含美洛西林2.0mg的溶液。
供试品加杂质混合溶液：取各杂质及注射用美洛西林钠舒巴坦钠各适量，加溶剂(流动相A：流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含舒巴坦杂质A为2.5μg，舒巴坦杂质B为0.5μg，舒巴坦杂质C为0.5μg，舒巴坦杂质D为0.5μg，舒巴坦杂质E为0.5μg，舒巴坦杂质F为0.5μg，舒巴坦为0.5mg，美洛西林1为20μg，美洛西林2为10μg，美洛西林3为10μg，美洛西林4为10μg，美洛西林为2mg的混合溶液。
试验操作：
取上述溶液各20μl进样，记录色谱图，具体如图1、图2、图3和图4所示。
(1)本发明对专属性考察：
取美洛西林杂质1、2、3、4，舒巴坦杂质A、B、C、D、E、F各适量，分别置不同的量瓶中，加溶剂(流动相A:流动相B＝98:2)溶解，作为各杂质定位溶液；取各杂质及注射用美洛西林钠舒巴坦钠溶液各适量，加溶剂(流动相A:流动相B＝98:2)稀释制成每1ml约含舒巴坦杂质A为2.5μg，舒巴坦杂质B为0.5μg，舒巴坦杂质C为0.5μg，舒巴坦杂质D为0.5μg，舒巴坦杂质E为0.5μg，舒巴坦杂质F为0.5μg，舒巴坦为0.5mg，美洛西林1为20μg，美洛西林2为10μg，美洛西林3为10μg，美洛西林4为10μg，美洛西林为2mg的混合溶液，作为供试品加杂质混合溶液。考察杂质与主峰保留时间分离度及各峰理论板数相关数据，见表1。
表1专属性考察结果总汇
由表1和图4可以看出，舒巴坦主峰、美洛西林主峰、各杂质峰之间的分离度均大于1.5，本发明专属性结果最优。
(2)本发明对美洛西林、舒巴坦和各杂质的检测限、定量限进行考察：
分别取美洛西林及美洛西林杂质1、2、3、4，舒巴坦及舒巴坦杂质A、B、C、D、E、F适量，加溶剂(流动相A:流动相B＝98:2)逐步稀释后进样20μL，检测限评价标准以信噪比(S/N)≈3、定量限评价标准以信噪比(S/N)≈10分别作为检测限和定量限。结果测得美洛西林、舒巴坦及各杂质的检测限和定量限见表2。
表2各成分检测限、定量限
由表2统计数值可以看出，本发明美洛西林、舒巴坦及各杂质检测灵敏度均较高，其检测限和定量限较小,充分验证了本方法的检测灵敏度高。
(3)本发明对美洛西林、舒巴坦和各杂质的进样精密度进行了考察，结论如下：
美洛西林及美洛西林杂质1、2、3、4、舒巴坦及舒巴坦杂质A、B、C、D、E、F连续进样6次，峰面积RSD值均在5％以内，进样精密度良好。
(4)本发明对美洛西林及美洛西林杂质1、3、4，舒巴坦及舒巴坦杂质A、B的线性范围进行考察：
取舒巴坦杂质A、舒巴坦杂质B、舒巴坦、美洛西林杂质1、美洛西林、美洛西林杂质3、美洛西林杂质4、美洛西林对照品及舒巴坦对照品各适量，分别加溶剂(流动相A:流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含舒巴坦杂质A为25μg、舒巴坦杂质B为5μg、舒巴坦为50μg、美洛西林杂质1为200μg、美洛西林为200μg、美洛西林杂质3为100μg、美洛西林杂质4为100μg的溶液，作为对照品储备液，分别精密吸取对照品储备液适量置10ml量瓶中，用溶剂(流动相A：流动相B＝98:2)定容，摇匀，得到一系列浓度的溶液。精密吸取上述系列梯度浓度溶液各20μl从定量限到高浓度依次进样分析，记录色谱图，以杂质对照品溶液浓度C(μg/ml)为横坐标，杂质对照品峰面积为纵坐标，进行线性回归并求出回归方程。试验结果见表3。
表3线性关系考察结果(n＝6)
由表4可见，本发明美洛西林、舒巴坦和各杂质线性范围与各杂质在较低浓度范围内线性关系良好。
(5)本发明对注射用美洛西林钠舒巴坦钠，美洛西林及美洛西林杂质1、3、4，舒巴坦及舒巴坦杂质A、B的溶液稳定进行了考察，结论如下：
在室温下，对照品溶液放置3小时有明显降解，稳定性较差；供试品溶液放置3小时出现未知杂质且有杂质明显增加，溶液稳定性差，需临用现配。
在5℃下，对照品溶液放置15小时各杂质峰面积无明显变化，溶液稳定性较好。
(6)本发明对注射用美洛西林钠舒巴坦钠的重复性进行了考察，结论如下：
6份供试品溶液中各杂质RSD值均在5％以内，重复性良好。
(7)本发明对美洛西林杂质1、3、4和舒巴坦杂质A、B的准确度进行了验证，在限度的80％，100％和120％三个水平的平均回收率(n＝9)：
取注射用美洛西林钠舒巴坦钠九份，分3组，每组加入杂质限量的80％、100％、120％的杂质对照，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含美洛西林2.0mg的溶液。分别精密量取20μl，注入液相色谱仪，进行回收率测定，结果见表4。
表4各杂质回收率结果
试验 回收率 RSD(％)
舒巴坦杂质A 92.2％-104.3％ 4.85
舒巴坦杂质B 93.5％-100.1％ 2.74
美洛西林杂质1 95.4％-105.6％ 3.00
美洛西林杂质3 96.0％-99.0％ 1.07
美洛西林杂质4 93.8％-104.5％ 4.60
由表4可以看出，本发明的各个杂质回收率均在90％-106％之间，RSD≤5.0％，符合回收率试验要求；所用HPLC方法适用于注射用美洛西林钠舒巴坦钠有关物质测定。
(6)本发明对美洛西林及美洛西林杂质1、3、4，舒巴坦及舒巴坦杂质A、B的校正因子进行考察：
取美洛西林及美洛西林杂质1、3、4，舒巴坦及舒巴坦杂质A、B对照品，在限量浓度的50％～200％内共制备5份样品，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归并求出美洛西林及美洛西林杂质1、3、4，舒巴坦及舒巴坦杂质A、B的标准曲线；美洛西林的标准曲线K值与美洛西林杂质的标准曲线K值之比，舒巴坦的标准曲线K值与舒巴坦杂质的标准曲线K值之比，即为校正因子。采用不同人员、不同色谱柱和不同仪器进行测定。测定结果见表5。
表5校正因子(f)测定结果
本发明的校正因子检测运用两台不同高效液相色谱仪，三根色谱柱，对杂质含量加校正因子自身对照计算结果提供了科学、有效地依据。
(7)注射用美洛西林钠舒巴坦钠杂质含量测定，结果见表6。
表6注射用美洛西林钠舒巴坦钠杂质检测结果
本发明对样品进行了检测，通过加校正因子计算，检测结果注射用美洛西林钠舒巴坦钠供试品中舒巴坦杂质A、B，美洛西林杂质1、3、4均有检出，其余已知杂质未检出，归属舒巴坦的未知总杂为0.07％，归属美洛西林的未知总杂为0.46％。
对比例1：国家标准有关物质方法
高效液相色谱条件：
色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6mm*25cm，5μm，C18)，以0.0050mol/L氢氧化四丁基铵溶液(取10％的氢氧化四丁基铵26.4ml，用水稀释至1000ml，用0.1mol/L磷酸溶液调节pH值至5.0±0.1，再用水稀释至2000ml，摇匀)-乙腈(68:32)等度，检测波长为230nm，流速：1.5ml/min，进样量：20μl。图谱保留至2.5倍保留时间。
样品配制：
对照品溶液：分别取舒巴坦杂质A、B各适量，加流动相(0.0050mol/L氢氧化四丁基铵溶液:乙腈＝68:32)溶解并稀释制成约含舒巴坦杂质A、B各3μg/ml的溶液。
美洛西林钠原料溶液：取美洛西林钠原料适量，加流动相(0.0050mol/L氢氧化四丁基铵溶液:乙腈＝68:32)溶解并稀释制成每1ml约含1.2mg的溶液。
舒巴坦钠原料溶液：取舒巴坦钠原料适量，加流动相(0.0050mol/L氢氧化四丁基铵溶液:乙腈＝68:32)溶解并稀释制成每1ml约含0.3mg的溶液。
供试品溶液：取注射用美洛西林钠舒巴坦钠适量，加流动相(0.0050mol/L氢氧化四丁基铵溶液:乙腈＝68:32)溶解并稀释制成每1ml约含美洛西林1.2mg的溶液。
试验操作：
取上述溶液各20μl进样，记录色谱图，具体谱图如图5、图6、图7和图8。
本对比例1为国家标准收载注射用美洛西林钠舒巴坦钠有关物质检测方法，供试品检出6个杂峰，2个归属于舒巴坦，4个归属于美洛西林，各杂质峰、主峰之间均能达到基线分离，但是检出杂峰个数较少，不适用于注射用美洛西林钠舒巴坦钠有关物质检测。
对比例2：
高效液相色谱条件：
色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6mm*15cm，5μm，C18)，以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾4.9g和磷酸氢二钾0.45g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调pH至5.7)为流动相A；以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。检测波长：215nm，流速：1.0ml/min，进样量：20μl，柱温31℃。
梯度洗脱过程为：(2)在0-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持80:20不变；(4)在50-81分钟内，流动相A和流动相B的体积比从80:20匀速渐变至30:70；(5)81-84分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变；(6)84-86分钟内，流动相A和流动相B的体积比从30:70匀速渐变至80:20；(7)86-93分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持80:20不变。
样品配制：
美洛西林钠原料溶液：取美洛西林钠原料适量，加水溶解并稀释制成每1ml约含美洛西林2mg的溶液。
试验操作：
取美洛西林钠原料溶液20μl进样，记录色谱图，如图9所示。
由本对比例2的谱图可知，美洛西林主峰后检出杂质增多，但是55min处杂质明显没有分离，而且未考虑舒巴坦及其杂质的分离。
对比例3：欧洲药典
高效液相色谱条件：
色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6mm*15cm，5μm，C18)，以5.44g/L磷酸二氢钾溶液(用lmol/L磷酸溶液调节pH值至4.0)为流动相A；以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。检测波长：215nm，流速：1.0ml/min，进样量：20μl，柱温：25℃。
梯度洗脱过程为：(1)在0分钟，流动相A和流动相B的体积为98:2；(2)在0-7.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比从98:2匀速渐变至50:50；(3)在7.5-8.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持50:50不变；(4)在8.5-9分钟内，流动相A和流动相B的体积比从50:50匀速渐变至98:2；(5)9-13分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持98:2不变。
样品配制：
对照品溶液：分别取舒巴坦杂质A、B、C、D、E、F各适量，加溶剂(流动相A：流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含舒巴坦杂质A、B、C、D、E、F各2.5μg的溶液。
舒巴坦钠原料加杂质溶液：取舒巴坦钠原料适量，加舒巴坦钠杂质A、B、C、D、E、F溶液适量，加溶剂溶剂(流动相A:流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含舒巴坦2.5mg和舒巴坦杂质A、B、C、D、E、F各2.5μg的溶液。
试验操作：
取舒巴坦钠原料加杂质混合溶液20μl进样，记录色谱图，具体如图10和图11所示。
由本对比例3的谱图可知，在此梯度洗脱过程中，各已知杂质、未知杂质与舒巴坦主峰间分离度良好。但是，该方法只适于舒巴坦杂质的检出，未考虑美洛西林及其杂质的分离。
对比例4：
高效液相色谱条件：
色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶柱(4.6mm*15cm，5μm，C18)，以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾4.9g和磷酸氢二钾0.45g，加水溶解并稀释至1000ml)为流动相A；以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。检测波长：210nm，流速：1.0ml/min，进样量：20μl。
梯度洗脱过程为：(1)在0分钟，流动相A和流动相B的体积为98:2；(2)在0-11分钟内，流动相A和流动相B的体积比从98:2匀速渐变至81:19；(3)在11-40分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持81:19不变；(4)在40-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比从81:19匀速渐变至35:65；(5)70-75分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持35:65不变；(6)75-77分钟内，流动相A和流动相B的体积比从35:65匀速渐变至98:2；(7)77-84分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持98:2不变。
样品配制：
舒巴坦对照品溶液：分别取舒巴坦和舒巴坦杂质A、B、C、D、E、F各适量，加溶剂(流动相A:流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含舒巴坦和舒巴坦杂质A、B、C、D、E、F各2μg的溶液。
美洛西林钠原料溶液：取美洛西林钠原料适量，加溶剂(流动相A:流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含美洛西林2mg的溶液。
试验操作：
取美洛西林钠原料溶液20μl进样，记录色谱图，具体如图12和图13所示。
本对比例4的谱图可知，在此梯度洗脱过程中，舒巴坦及已知杂质完全分离，美洛西林钠未知杂质未达到有效分离。
实施例2：
高效液相色谱条件：
色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶柱，岛津Inertsustain C18柱(250mm×4.6mm,5μm)，S/N:6HR98145，以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾4.9g和磷酸氢二钾0.45g，加水溶解并稀释至1000ml)为流动相A；以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。检测波长：210nm，流速：1.0ml/min，进样量：20μl，柱温：25℃。
梯度洗脱过程为：(1)在0分钟，流动相A和流动相B的体积为98:2；(2)在0-11分钟内，流动相A和流动相B的体积比从98:2匀速渐变至81:19；(3)在11-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持81:19不变；(4)在50-80分钟内，流动相A和流动相B的体积比从81:19匀速渐变至30:70；(5)80-85分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变；(6)85-87分钟内，流动相A和流动相B的体积比从30:70匀速渐变至98:2；(7)87-94分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持98:2不变。
样品配制：
对照品溶液：分别取舒巴坦及舒巴坦杂质A、B，美洛西林及美洛西林杂质1、2、3、4适量，加溶剂(流动相A:流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含舒巴坦杂质A为2.5μg，舒巴坦杂质B为0.5μg，舒巴坦为5μg，美洛西林1为20μg，美洛西林2为1μg，美洛西林3为10μg，美洛西林4为10μg，美洛西林为20μg的混合溶液。
供试品溶液：取注射用美洛西林钠舒巴坦钠适量，加溶剂(流动相A：流动相B＝98:2)溶解并定量稀释制成每1ml约含美洛西林2.0mg的溶液。
试验操作：
取上述溶液各20μl进样，记录色谱图,具体如图14和图15所示。
本实施例2更换相同型号不同批号的色谱柱，具体为“岛津Inertsustain C18柱(250mm×4.6mm,5μm)，S/N：6HR98145”，考察美洛西林、舒巴坦及杂质的分离及响应。结果发现，舒巴坦主峰、美洛西林主峰、各杂质峰之间的分离度良好，检测效果同实施例1。
实施例3：
高效液相色谱条件：
色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶柱，YMC-Pack ODS-AQ柱(250mm×4.6mm,5μm)，No:0425086919，以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾4.9g和磷酸氢二钾0.45g，加水溶解并稀释至1000ml)为流动相A；以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。检测波长：210nm，流速：1.0ml/min，进样量：20μl，柱温：25℃。
梯度洗脱过程为：(1)在0分钟，流动相A和流动相B的体积为98:2；(2)在0-11分钟内，流动相A和流动相B的体积比从98:2匀速渐变至81:19；(3)在11-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持81:19不变；(4)在50-80分钟内，流动相A和流动相B的体积比从81:19匀速渐变至30:70；(5)80-85分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变；(6)85-87分钟内，流动相A和流动相B的体积比从30:70匀速渐变至98:2；(7)87-94分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持98:2不变。
样品配制：
对照品溶液：分别取舒巴坦及舒巴坦杂质A、B，美洛西林及美洛西林杂质1、2、3、4适量，加溶剂(流动相A:流动相B＝98:2)溶解并稀释制成每1ml约含舒巴坦杂质A为2.5μg，舒巴坦杂质B为0.5μg，舒巴坦为5μg，美洛西林1为20μg，美洛西林2为1μg，美洛西林3为10μg，美洛西林4为10μg，美洛西林为20μg的混合溶液。
供试品溶液：取注射用美洛西林钠舒巴坦钠适量，加溶剂(流动相A：流动相B＝98:2)溶解并定量稀释制成每1ml约含美洛西林2.0mg的溶液。
试验操作：
取上述溶液各20μl进样，记录色谱图，具体如图16和图17所示。。
本实施例3更换不同型号的色谱柱，具体为“YMC Pack ODS-AQ柱(250mm×4.6mm,5μm)，NO:0425086919”，考察美洛西林、舒巴坦及杂质的分离及响应。结果发现，舒巴坦主峰、美洛西林主峰、各杂质峰之间的分离度良好，检测效果同实施例1。
综上所述，采用本发明的检测方法检测注射用美洛西林钠舒巴坦钠有关物质，杂质分离度、响应良好，检测该剂型专一性能好。本发明通过对专属性、检测限、定量限、进样精密度、溶液稳定性、重复性、线性范围、准确度、校正因子的验证，确定了本发明的检测方法，充分证明该方法的可行性。
本发明检测出的杂质多，能快速、有效、准确监控注射用美洛西林钠舒巴坦钠中的有关物质；本发明具有良好的专属性、舒巴坦、美洛西林及各杂质之间的分离度均大于1.5，杂质和主峰可以有效分离；本发明针对极性较小的杂质，采用梯度洗脱过程，提高了检测限、定量限，本发明的灵敏度高，回收率高，可以准确测量注射用美洛西林钠舒巴坦钠中的有关物质，通过严谨的校正因子计算，为计算结果提供支持依据；本发明可以准确累积数据考察各杂质的转换趋势。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明保护范围之内。

Claims (10)

1.一种注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，其特征在于，该检测方法采用高效液相色谱法，其高效液相色谱条件包括：以流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为磷酸盐缓冲溶液，所述流动相B为乙腈；所述梯度洗脱过程包括以下步骤：(1)在0分钟，流动相A和流动相B的体积为98:2；(2)在0-11分钟内，流动相A和流动相B的体积比从98:2匀速渐变至81:19；(3)在11-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持81:19不变；(4)在50-80分钟内，流动相A和流动相B的体积比从81:19匀速渐变至30:70；(5)80-85分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变；(6)85-87分钟内，流动相A和流动相B的体积比从30:70匀速渐变至98:2；(7)87-94分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持98:2不变。
2.根据权利要求1所述的注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合溶液。
3.根据权利要求2所述的注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，其特征在于，流动相A为：每1000ml混合溶液中含有磷酸二氢钾4.9g和磷酸氢二钾0.45g。
4.根据权利要求1所述的注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶柱；优选，色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm；更优选为岛津Inertsustain C18柱或YMC-Pack ODS-AQ柱。
5.根据权利要求1所述的注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件包括：检测波长为200～230nm。
6.根据权利要求1或5所述的注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件包括：检测波长为210nm。
7.根据权利要求1所述的注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件包括：柱温为20℃～35℃。
8.根据权利要求1或7所述的注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件包括：柱温为25℃。
9.根据权利要求1所述的注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件包括：进样量为10～50μl。
10.根据权利要求1或9所述的注射用美洛西林钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件包括：进样量为20μl。
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