CN112611822A - 一种头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质的检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种头孢哌酮钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法及应用，该检测方法可实现头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的有效分离，峰形和分离度情况良好，可以满足头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的检出，获得分离度良好、稳定性可控的检测方法，更能控制和提高头孢哌酮钠舒巴坦钠药品的质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质的检测方法及应用。
背景技术
头孢哌酮钠舒巴坦钠制剂成品注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠，其有关物质的检测方法仅在日本药典17版和中国药典2015版有收载。
经过原药典方法重现，采用日本药典17版收载的方法进行注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质检测时，在5～10min洗脱程序中，基线处对出峰存在较大干扰，舒巴坦保留时间5.058min，头孢哌酮的出峰异常，且样品溶液中，两个主成分无法有效分离。也即头孢哌酮出峰处存在较大的基线干扰，舒巴坦和头孢哌酮的出峰时间相近，实际检测中不能实现二者的完全分离，因此该方法不可用于本品的有关物质检测。
采用中国药典2015版中收载的注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质检测方法进行检测时，头孢哌酮杂质C与舒巴坦、头孢哌酮三者的分离度均大于1.5，基本符合检测要求；但在进行强降解试验中，105℃高温条件下破坏10分钟，头孢哌酮未知杂质含量增加，且与头孢哌酮主峰分离度不能满足药典要求。依照现行法规要求，药典方法不足以进行头孢哌酮钠舒巴坦钠原料及制剂中潜在杂质的检出。
因此，急需对头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质的检测方法进行改进，以开发出一种适合的新的检测方法，以实现对目标杂质的定量检测，满足头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的检出。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在的头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质的检测方法不足的缺陷；而提供了一种头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质的检测方法及应用。该头孢哌酮钠舒巴坦钠的检测方法可实现头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的有效分离，峰形和分离度情况良好，可以满足头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的检出，获得分离度良好、稳定性可控的检测方法。
本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的。
本发明提供了一种头孢哌酮钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，所述的检测方法为外标法以峰面积计算有关物质的含量。其包含以下步骤：采用色谱法对头孢哌酮钠舒巴坦钠原料药或制剂中有关物质进行分离检测，即可；其中，所述的有关物质为头孢哌酮杂质A、头孢哌酮杂质B、头孢哌酮杂质C、舒巴坦杂质A、舒巴坦杂质B、舒巴坦杂质C、舒巴坦杂质D、舒巴坦杂质E、舒巴坦杂质F中的一种或多种；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶型色谱柱；
检测波长：220nm；
流动相：以0.005mol/L氢氧化四丁基铵溶液(pH4.0)-乙腈(77:23)为流动相A，以0.005mol/L氢氧化四丁基铵溶液(pH4.0)-乙腈(70:30)为流动相B，按以下流量梯度进样检测：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
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| 65 | 100 | 0 |
本发明中，所述的检测可为使用检测器进行检测，所述检测器例如DAD和/或UV检测器，再例如DAD和UV检测器。
在本发明的某一方案中，所述的流动相的流速可参考领域色谱法检测分析时的常规流速，例如0.8-1.2mL/min，例如1.0mL/min。
在本发明的某一方案中，柱温为25-35℃；优选28-32℃，例如30℃。
本发明中，所述色谱柱的填料颗粒度可为2.5μm～7.5μm，例如5μm；所述色谱柱的长度可为150mm～350mm，优选250mm；所述的色谱柱的内径可为3mm～5mm，例如4.6mm。
在本发明的某一方案中，所述的色谱柱可为Thermo HYPERSIL C18(250×4.6mm，5μm)或柱效相当的色谱柱。
在本发明的某一方案中，供试品溶液为取头孢哌酮舒巴坦钠供试品80mg，精密称定，置20ml量瓶中，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含头孢哌酮约2.5mg的溶液。
本发明中，所述高效液相色谱法的进样量可参考本领域色谱法检测分析的常规进样量，例如5μL～20μL，再例如10-20μL，再例如10μL。
在本发明的某一方案中，头孢哌酮杂质A对照品、头孢哌酮杂质B对照品、头孢哌酮杂质C对照品、舒巴坦杂质A对照品、舒巴坦杂质B对照品、舒巴坦杂质C对照品、舒巴坦杂质D对照品、舒巴坦杂质E对照品、舒巴坦杂质F对照品的对照溶液为：分别取头孢哌酮对照品、头孢哌酮杂质A对照品、头孢哌酮杂质C对照品、舒巴坦对照品、舒巴坦杂质A对照品、舒巴坦杂质B对照品、舒巴坦杂质C对照品、舒巴坦杂质E对照品、舒巴坦杂质F对照品各约0.1mg，置同一液相进样小瓶中，加入流动相2ml，溶解并稀释制成每1ml中含各组分各约0.05mg的混合溶液。
本发明还提供了一种所述头孢哌酮钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法在头孢哌酮钠舒巴坦钠的原料药或制剂中头孢哌酮钠舒巴坦钠及其有关物质含量检测中的应用；所述的有关物质为头孢哌酮杂质A、头孢哌酮杂质B、头孢哌酮杂质C、舒巴坦杂质A、舒巴坦杂质B、舒巴坦杂质C、舒巴坦杂质D、舒巴坦杂质E、舒巴坦杂质F中的一种或多种。
术语“原料药”表示由主要药物活性成分，以及含量可控的杂质组成。
术语“制剂”表示由主要药物活性成分，以及含量可控的杂质和/或辅料组成的，根据药典或药品监督部门批准的标准，为满足临床治疗或预防的需要而制备的药物应用形式(剂型)的具体品种。
术语“有关物质”或“杂质”表示任何影响药物纯度的物质。所述杂质按其理化性质一般分为三类：有机杂质、无机杂质及残留溶剂。按照其来源，杂质可以分为工艺杂质(包括合成中未反应完全的反应物及试剂、中间体、副产物等)、降解产物、从反应物及试剂中混入的杂质等。
本发明中，术语“外标法”是指用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明所提供的头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质的检测方法，其是对原有检测方法进行的重新优化，主要包括对色谱条件的优化和对溶液稳定性方面的考察，对流动相中水相pH值、洗脱梯度等进行调整，并考察低温和常温下杂质的变化趋势，获得分离度良好、稳定性可控的检测方法；
(2)本发明提供的头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质的检测方法可实现头孢哌酮钠舒巴坦钠中各杂质的有效分离，峰形和分离度情况良好，可以满足头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的检出。
(3)本发明所提供的检测方法中，使得舒巴坦杂质E和后面未知杂质分离度满足基本分离的要求，同时保证头孢哌酮和舒巴坦杂质C之间的分离度也基本满足分离的要求；
(4)相比较于CN111060621A中的方法，本发明所提供的检测方法能更有效地分离头孢哌酮附近的杂质，此外，还能够一并洗脱舒巴坦杂质F，因此本发明所述的提供的头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质的检测方法较CN111060621A中提到的方法更具有专属性，以便使得本发明所述的有关物质检测方法更能控制和提高头孢哌酮钠舒巴坦钠药品的质量。
(5)本发明所提供的检测方法，通过对本方法专属性、准确度、线性和耐用性等方面的考察和验证，结果均符合《中国药典》2015版相关要求。
附图说明
图1为实施例1中分离度溶液色谱图；
图2为对比实施例1中分离度溶液色谱图；
图3为对比实施例1中强制降解原料药供试品溶液色谱图叠加图谱；
图4为对比实施例1中原料药高温105℃降解10min溶液色谱图；
图5为对比实施例1中原料药高温105℃降解1h溶液色谱图；
图6为对比实施例2中调整流动相pH值后分离度溶液色谱图；
图7为对比实施例2中调整流动相pH值后分离度溶液色谱图在0～12min的局部放大图；
图8为对比实施例3中改变流动相洗脱梯度后分离度溶液色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
样品名称：头孢哌酮钠舒巴坦钠(来源：珠海联邦制药股份有限公司；批号：3191909001；含量：以头孢哌酮钠舒巴坦钠无水物计，含量99.2％)。
化合物名称：头孢哌酮对照品(来源：中国食品药品检定研究院；批号：130420-201105；含量：93.8％)
结构：
化合物名称：头孢哌酮杂质A对照品(来源：中国食品药品检定研究院；批号：130428-201605；含量：98.1％)
结构：
化合物名称：头孢哌酮杂质B对照品(来源：SINCO PHARMACHEM；批号：19-03-1070；含量：95.98％)
结构：
化合物名称：头孢哌酮杂质C对照品(来源：中国食品药品检定研究院；批号：130617-201702；含量：97.2％)
结构：
化合物名称：舒巴坦杂质A(来源：中国食品药品检定研究院；批号：130430-201408；含量：90.5％)
结构：
化合物名称：舒巴坦杂质A(来源：USP；批号：F0M494；含量：100.0％)
结构：
化合物名称：舒巴坦杂质B(来源：EP；批号：1.1；含量：100.0％)
结构：
化合物名称：舒巴坦杂质C(来源：TLC；批号：3112-018A2；含量：99.3％)
结构：
化合物名称：舒巴坦杂质D(来源：USP；批号：F0M495；含量：100.0％)
结构：
化合物名称：舒巴坦杂质E(来源：USP；批号：F00720；含量：100.0％)
结构：
化合物名称：舒巴坦杂质F(来源：USP；批号：F00730；含量：100.0％)
结构：
实施例1
各溶液的配制步骤如下：
供试品溶液：取头孢哌酮舒巴坦钠供试品约80mg，精密称定，置20ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释制成每1ml中约含头孢哌酮2.5mg、舒巴坦1.3mg的溶液。
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀即得。
系统适用性溶液：取头孢哌酮舒巴坦钠供试品约80mg，置20ml量瓶中，分别加入头孢哌酮杂质A对照品、头孢哌酮杂质B对照品、头孢哌酮杂质C对照品、舒巴坦杂质A对照品、舒巴坦杂质B对照品、舒巴坦杂质C对照品、舒巴坦杂质D对照品、舒巴坦杂质E对照品、舒巴坦杂质F对照品各适量，用流动相A溶解并稀释制成每1ml中约含头孢哌酮杂质A 3.6μg、头孢哌酮杂质B 1.2μg、头孢哌酮杂质C 10μg、舒巴坦杂质A 3.6μg、舒巴坦杂质B 1.2μg、舒巴坦杂质C 3.6μg、舒巴坦杂质D 3.6μg、舒巴坦杂质E 3.6μg、舒巴坦杂质F 3.6μg、头孢哌酮2.5mg和舒巴坦1.2mg的混合溶液。
使用Thermo HYPERSIL C18(250×4.6mm，5μm)，柱温30℃，检测波长220nm，DAD检测器检测。
以0.005mol/L氢氧化四丁基铵溶液(pH4.0)-乙腈(77:23)为流动相A，以0.005mol/L氢氧化四丁基铵溶液(pH4.0)-乙腈(70:30)为流动相B，按以下流量梯度进样检测，流速：1.0mL/min，进样量10μL。
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 15 | 70 | 30 |
| 16 | 0 | 100 |
| 50 | 0 | 100 |
| 51 | 100 | 0 |
| 65 | 100 | 0 |
取分离度溶液进样，获得杂质分离情况如下：
头孢哌酮钠舒巴坦钠的分离度溶液色谱图如附图1所示。
结果表明：本发明提供的头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质的检测方法可实现头孢哌酮钠舒巴坦钠中各杂质的有效分离，峰形和分离度情况良好，可以满足头孢哌酮钠舒巴坦钠中杂质的检出。而且，舒巴坦杂质E和后面未知杂质分离度满足基本分离的要求，同时保证头孢哌酮和舒巴坦杂质C之间的分离度也基本满足分离的要求。
另外，相比较于CN111060621A中的方法，本发明所提供的检测方法能更有效地分离头孢哌酮附近的杂质，此外，还能够一并洗脱舒巴坦杂质F，因此本发明所述的提供的头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质的检测方法较CN111060621A中提到的方法更具有专属性。
取本品适量，用流动相A制成每ml约含头孢哌酮2.5mg和舒巴坦1.3mg的溶液，作为供试品溶液。精密移取供试品溶液，用流动相A稀释100倍，作为对照溶液。取头孢哌酮杂质A、头孢哌酮杂质B、头孢哌酮杂质C、舒巴坦杂质A、舒巴坦杂质B、舒巴坦杂质C、舒巴坦杂质D、舒巴坦杂质E、舒巴坦杂质F、对照品和头孢哌酮舒巴坦适量，用流动相A溶解稀释制成每1ml中约含含头孢哌酮杂质A 3.6μg、头孢哌酮杂质B 1.2μg、头孢哌酮杂质C 10μg、舒巴坦杂质A 3.6μg、舒巴坦杂质B 1.2μg、舒巴坦杂质C 3.6μg、舒巴坦杂质D 3.6μg、舒巴坦杂质E3.6μg、舒巴坦杂质F 3.6μg、头孢哌酮2.5mg和舒巴坦1.2mg的溶液，作为系统适用性溶液。
系统适用性溶液220nm波长下色谱图中，各峰之间分离度应不小于1.5。供试品溶液220nm波长下色谱图中若检出杂质峰，头孢哌酮杂质A和头孢哌酮杂质C按照外标法以峰面积计算，其他已知杂质按加校正因子的自身对照法计算，未知杂质按照自身对照法计算，各已知杂质的校正因子及杂质限度如下表。
实施例2：方法学验证及结果
本发明所述的头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质的检测方法，先确定其专属性、回收率均符合要求。
1、专属性及系统适用性
1)溶液配制
杂质混合对照品溶液#1：称取头孢哌酮杂质A对照品和头孢哌酮杂质C对照品各7.549mg，7.670mg至50ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，再移取1ml至10ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为杂质混合对照品溶液，标记为STD#1，平行配制STD#2溶液，头孢哌酮杂质A对照品和头孢哌酮杂质C对照品的称样量分别为7.587mg，7.608mg。
供试品溶液：临用新制。取本品约79.95mg，精密称定，至20ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。
对照溶液：取1ml供试品溶液，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为对照溶液。
头孢哌酮杂质A对照品储备液#1：称取头孢哌酮杂质A对照品12.627mg至50ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，即得头孢哌酮杂质A对照品储备液#1。
头孢哌酮杂质B对照品储备液#1：称取头孢哌酮杂质B对照品6.298mg至25ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，即得头孢哌酮杂质B对照品储备液#1。
头孢哌酮杂质C对照品储备液#1：称取头孢哌酮杂质C对照品5.042mg至20ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，即得头孢哌酮杂质C对照品储备液#1。
舒巴坦杂质A对照品储备液#1：称取舒巴坦杂质A对照品3.007mg至25ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，即得舒巴坦杂质A对照品储备液#1。
舒巴坦杂质B对照品储备液#1：称取舒巴坦杂质B对照品3.083mg至25ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，即得舒巴坦杂质B对照品储备液#1。
舒巴坦杂质C对照品储备液#1：称取舒巴坦杂质C对照品3.001mg至25ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，即得舒巴坦杂质C对照品储备液#1。
舒巴坦杂质D对照品储备液#1：称取舒巴坦杂质D对照品3.023mg至25ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，即得舒巴坦杂质D对照品储备液#1。
舒巴坦杂质E对照品储备液#1：称取舒巴坦杂质E对照品3.066mg至25ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，即得舒巴坦杂质E对照品储备液#1。
舒巴坦杂质F对照品储备液#1：称取舒巴坦杂质F对照品3.057mg至25ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，即得舒巴坦杂质F对照品储备液#1。
头孢哌酮对照品储备液：称取头孢哌酮对照品约6.445mg，置50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，即得头孢哌酮对照品储备液。
舒巴坦对照品储备液：称取舒巴坦对照品约6.055mg，置50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，即得舒巴坦对照品储备液。
分别精密量取“头孢哌酮杂质A对照品储备溶液#1”1ml，“头孢哌酮杂质B对照品储备溶液#1”0.5ml，“头孢哌酮杂质C对照品储备溶液#1”0.4ml，“舒巴坦杂质A对照品储备溶液#1，舒巴坦杂质C对照品储备溶液#1，舒巴坦杂质D对照品储备溶液#1，舒巴坦杂质E对照品储备溶液#1，舒巴坦杂质F对照品储备溶液#1”各0.3ml，“舒巴坦杂质B对照品储备溶液#1”0.1ml至不同10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，混合均匀，即得各单个杂质定位溶液。
头孢哌酮定位溶液：即头孢哌酮对照品储备液。
舒巴坦定位溶液：即舒巴坦对照品储备液。
分离度溶液：取本品约80.29mg，精密称定，置20ml量瓶中，分别加入取“头孢哌酮杂质A对照品储备溶液#1”2ml，“头孢哌酮杂质B对照品储备溶液”1ml，“头孢哌酮杂质C对照品储备溶液#1”0.8ml，“舒巴坦杂质A对照品储备溶液#1，舒巴坦杂质C对照品储备溶液#1，舒巴坦杂质D对照品储备溶液#1，舒巴坦杂质E对照品储备溶液#1，舒巴坦杂质F对照品储备溶液#1”各0.6ml、“舒巴坦杂质B对照品储备溶液#1”0.2ml至同一20ml量瓶中，加稀释液定容至刻度，作为分离度溶液。
2)试验结果
专属性(空白干扰)结果表
3)专属性结论：(A)空白溶液对各定位溶液及供试品溶液色谱图中头孢哌酮主峰、舒巴坦主峰以及主要杂质保留时间位置均无明显干扰；
(B)分离度溶液中，主峰与相邻杂质之间、各杂质之间最小分离度为1.5，均不小于1.5；
(C)供试品溶液色谱图中头孢哌酮主峰峰纯度角2.329小于纯度阈值2.467；舒巴坦主峰峰纯度角0.136小于纯度阈值0.262；
(D)对照溶液中头孢哌酮峰和舒巴坦峰拖尾因子分别为1.0、1.3，小于2.0；理论塔板数分别为21556、20565，大于3000。
系统适用性结果表
系统适用性结论：(A)对照品溶液#1连续进样5针的头孢哌酮杂质A峰面积RSD为0.2％，小于5.0％；保留时间RSD为0.1％，小于2.0％，头孢哌酮杂质C峰面积RSD为0.1％，小于5.0％；保留时间RSD为0.1％，小于2.0％。
(B)对照品溶液#2中头孢哌酮杂质A、头孢哌酮杂质C相对于对照品溶液#1的回收率都为98％，在95％～105％之间。
2、准确度实验
1)溶液配制
空白溶液：稀释剂(流动相A)
杂质对照品储备液#1：杂质对照品储备液。
头孢哌酮杂质A对照品储备液#2：称取头孢哌酮杂质A对照品12.622mg至50ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为头孢哌酮杂质A对照品储备液#2。
头孢哌酮杂质B对照品储备液#2：称取头孢哌酮杂质B对照品6.250mg至25ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为头孢哌酮杂质B对照品储备液#2。
头孢哌酮杂质C对照品储备液#2：称取头孢哌酮杂质C对照品5.088mg至20ml容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为头孢哌酮杂质C对照品储备液#2。
杂质混合对照品溶液#1：称取头孢哌酮杂质A对照品和头孢哌酮杂质C对照品各7.506mg，7.460mg至50ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，再移取1ml至10ml容量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为杂质混合对照品溶液，标记为STD#1，平行配制STD#2，称取头孢哌酮杂质A对照品和头孢哌酮杂质C对照品各7.451mg，7.493mg。
混合杂质对照品溶液：分别移取“头孢哌酮杂质A对照品储备溶液”2ml，“头孢哌酮杂质B对照品储备溶液”1ml，“头孢哌酮杂质C对照品储备溶液”0.8ml至同一20ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，作为杂质混合对照品溶液。平行配制两份，标记为MIX-STD#1，MIX-STD#2。(MIX-STD#1配制采用杂质对照品储备液#2，MIX-STD#2配制采用杂质对照品储备液#1)。
头孢哌酮杂质A、B混合对照品溶液#1：移取头孢哌酮杂质A储备液#1 0.2ml，头孢哌酮杂质B储备液#1 0.6ml至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
头孢哌酮杂质A、B混合对照品溶液#2：移取头孢哌酮杂质A储备液#2 0.2ml，头孢哌酮杂质B储备液#2 0.6ml至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
头孢哌酮杂质C对照品溶液#1：移取头孢哌酮杂质C储备液#1 0.8ml至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，再移取上述溶液1ml至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
头孢哌酮杂质C对照品溶液#2：移取头孢哌酮杂质C储备液#2 0.8ml至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，再移取上述溶液1ml至10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。
本底溶液：临用新制。取本品约80.67mg，精密称定，至20ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为本底溶液。
回收率溶液配制：具体配制见下表
头孢哌酮杂质A、B、C回收率溶液配置表
AC1-LOQ浓度水平准确度溶液：精密称取供试品77.75mg，78.33mg，77.94mg至3个不同20ml量瓶中，分别加入头孢哌酮杂质A、B混合对照品溶液0.4ml，头孢哌酮杂质C对照品溶液0.4ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。标记为AC1-LOQ-1，AC1-LOQ-2，AC1-LOQ-3。(AC1-LOQ-1，AC1-LOQ-2配制采用头孢哌酮杂质A、B混合对照品溶液#2和头孢哌酮杂质C对照品溶液#2，AC1-LOQ-3配制采用头孢哌酮杂质A、B混合对照品溶液#1和头孢哌酮杂质C对照品溶液#1)。
AC1-LOQ浓度水平对照溶液：取1ml AC1-LOQ-1溶液，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为对照溶液。标记为AC1-LOQ-1-1％。
AC1-0.2％浓度水平准确度溶液：精密称取供试品80.28mg，80.07mg，80.06mg至3个不同20ml量瓶中，分别加入头孢哌酮杂质B对照品储备液0.1ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。标记为AC1-0.2％-1，AC1-0.2％-2，AC1-0.2％-3。(AC1-2.6％-1，AC1-0.2％-2，配制采用杂质对照品储备液#2，AC1-0.2％-3配制采用杂质对照品储备液#1)。
AC1-0.2％浓度水平对照溶液：取1ml AC1-0.2％-1溶液，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为对照溶液。标记为AC1-0.2％-1-1％。
AC1-0.4％(0.5％)浓度水平准确度溶液：精密称取供试品80.82mg，80.54mg，80.33mg至3个不同20ml量瓶中，分别加入头孢哌酮杂质A对照品储备液0.8ml，头孢哌酮杂质B对照品储备液1.0ml，头孢哌酮杂质C对照品储备液0.8ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。标记为AC1-0.4％(0.5％)-1，AC1-0.4％(0.5％)-2，AC1-0.4％(0.5％)-3。(AC1-0.4％(0.5％)-1，AC1-0.4％(0.5％)-2配制采用杂质对照品储备液#2，AC1-0.4％(0.5％)-3配制采用杂质对照品储备液#1)。
AC1-0.4％(0.5％)浓度水平对照溶液：取1ml AC1-0.4％(0.5％)-1溶液，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为对照溶液。标记为AC1-0.4％(0.5％)-1％。
AC1-0.6％浓度水平准确度溶液：精密称取供试品80.26mg，80.25mg，80.22mg至3个不同20ml量瓶中，分别加入头孢哌酮杂质C对照品储备液1.2ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。标记为AC1-0.6％-1，AC1-0.6％-2，AC1-0.6％-3。(AC1-0.6％-1，AC1-0.6％-2，配制采用杂质对照品储备液#2，AC1-0.6％-3配制采用杂质对照品储备液#1)。
AC1-0.6％浓度水平对照溶液：取1ml AC1-0.6％-1溶液，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为对照溶液。标记为AC1-0.6％-1％。
AC1-1.0％浓度水平准确度溶液：精密称取供试品80.35mg，80.37mg，80.31mg至3个不同20ml量瓶中，分别加入头孢哌酮杂质A对照品储备液2.0ml，头孢哌酮杂质B对照品储备液2.0ml，头孢哌酮杂质C对照品储备液2.0ml，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。标记为AC1-1.0％-1，AC1-1.0％-1，AC1-1.0％-3。(AC1-1.0％-1，AC1-1.0％-2配制采用杂质对照品储备液#2，AC1-1.0％-3配制采用杂质对照品储备液#1)。
AC1-1.0％浓度水平对照溶液：取1ml AC1-1.0％-1溶液，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为对照溶液。标记为AC1-1.0％-1％。
AC1-2.0％浓度水平准确度溶液：精密称取供试品80.19mg，80.12mg，80.23mg至3个不同20ml量瓶中，分别加入头孢哌酮杂质A对照品储备液4.0ml加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。标记为AC1-2.0％-1，AC1-2.0％-1，AC1-2.0％-3。(AC1-2.0％-1，AC1-2.0％-2配制采用杂质对照品储备液#2，AC1-2.0％-3配制采用杂质对照品储备液#1)。
AC1-2.0％浓度水平对照溶液：取1ml AC1-2.0％-1溶液，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为对照溶液。标记为AC1-2.0％-1％。
AC1-3.0％浓度水平准确度溶液：精密称取供试品80.19mg，80.12mg，80.23mg至3个不同20ml量瓶中，分别加入头孢哌酮杂质A对照品储备液6.0ml加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。标记为AC1-3.0％-1，AC1-3.0％-1，AC1-3.0％-3。(AC1-3.0％-1，AC1-3.0％-2配制采用杂质对照品储备液#2，AC1-3.0％-3配制采用杂质对照品储备液#1)。
AC1-3.0％浓度水平对照溶液：取1ml AC1-2.0％-1溶液，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，作为对照溶液。标记为AC1-3.0％-1％。
2)试验结果：
头孢哌酮及其杂质准确度结果的结论：
(A)LOQ浓度水平头孢哌酮杂质A回收率在87％～95％范围内，RSD为4.6％；头孢哌酮杂质B回收率在108％～110％范围内，RSD为1.0％；头孢哌酮杂质C回收率在100％～114％范围内，RSD为7.0％；回收率均在80％～115％范围内，RSD均不大于8.0％。
(B)其他浓度水平头孢哌酮杂质A回收率在99％～101％范围内，RSD在0.0％～1.0％范围内；头孢哌酮杂质B回收率在96％～100％范围内，RSD在0.0％～0.7％范围内；头孢哌酮杂质C回收率在97％～101％范围内，RSD在0.6％～2.2％范围内；回收率均在90％～108％范围内，RSD均不大于4.0％。
(C)采用外标法和加校正因子自身对照法计算各浓度水平的检测结果，头孢哌酮杂质B比值在103％～104％范围内；比值均在80％～120％范围内，该方法对检测头孢哌酮各杂质的准确度良好。
舒巴坦及其杂质准确度结果的结论：
(A)LOQ浓度水平头孢哌酮杂质A回收率在87％～95％范围内，RSD为4.6％；头孢哌酮杂质B回收率在108％～110％范围内，RSD为1.0％；头孢哌酮杂质C回收率在100％～114％范围内，RSD为7.0％；回收率均在80％～115％范围内，RSD均不大于8.0％。
(B)其他浓度水平头孢哌酮杂质A回收率在99％～101％范围内，RSD在0.0％～1.0％范围内；头孢哌酮杂质B回收率在96％～100％范围内，RSD在0.0％～0.7％范围内；头孢哌酮杂质C回收率在97％～101％范围内，RSD在0.6％～2.2％范围内；回收率均在90％～108％范围内，RSD均不大于4.0％。
(C)采用外标法和加校正因子自身对照法计算各浓度水平的检测结果，头孢哌酮杂质B比值在103％～104％范围内；比值均在80％～120％范围内，该方法对检测头孢哌酮各杂质的准确度良好。
本发明所述的头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质的检测方法，在确定其专属性、回收率均符合要求之后，对其进行了完整系统的方法学验证，具体方法学验证总结见下表。
方法验证总结表
结论：本发明所述的检测方法，其专属性、准确性和耐用性均良好，符合本品的检测要求。
对比实施例1：中国药典2015版收载注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠有关物质检测方法
(1)色谱条件(HPLC)
检测器：DAD/UV；
色谱柱：Thermo HYPERSIL C18(250×4.6mm，5μm)或柱效相当色谱柱；
柱温：30℃；
检测波长：220nm；
流速：1.0ml/min；
流动相：0.005mol/L氢氧化四丁基铵溶液(取10％氢氧化四丁基铵溶液26.4ml，加水1.8L后，用1mol/L磷酸溶液调节pH值至4.0，再用水稀释至2.0L)-乙腈(750:250)；
稀释剂：流动相；
洗脱程序：等度洗脱80min。
(2)溶液配制
分离度溶液：分别取头孢哌酮杂质A、头孢哌酮杂质B、头孢哌酮杂质C、头孢哌酮对照品，舒巴坦杂质A、舒巴坦杂质B、舒巴坦杂质C、舒巴坦杂质D、舒巴坦杂质E、舒巴坦杂质F、舒巴坦对照品各约0.1ml置同一样品瓶中，加入2ml流动相溶解，并混合均匀即得。
(3)试验方法
取分离度溶液各10μl进样，记录色谱图。
(4)对本方法的杂质定位以及分离情况进行相应的考察，其结果分析如下：
从结果上看，如采用该方法进行检测，舒巴坦杂质B、头孢哌酮杂质B之间的分离度通过正常积分无法获得，此外舒巴坦杂质C和头孢哌酮之间分离度0.9，不能完全分离。
虽然该方法对于头孢哌酮钠舒巴坦钠的大部分的杂质是可以进行有效分离的，但是对其进行的强制降解研究结果显示，通过强制降解原料药供试品溶液色谱图叠加图谱可以看到，相关杂质分离情况并不能完全满足本发明的检测需求，见图3。当样品在105℃中放置10分钟时，头孢哌酮未知杂质增长明显，且不能与头孢哌酮完全分离，见图4。
头孢哌酮钠舒巴坦钠的降解杂质主要为头孢哌酮杂质A(5.77min)和头孢哌酮C(8.19min)，从目前的研究来看，二者均可以被有效检出。但在高温降解1小时的情况下，头孢哌酮(19.13min)和头孢哌酮未知杂质(20.59min)之间随着降解时间的延长，分离度逐渐变差，头孢哌酮未知杂质应增加其分离度，保证其在后续的研究中能够被有效检测，具体见图5。
对比实施例2：调整流动相pH值
原方法中水相pH值为4.0，将其调节至3.5，其他调节均不变，测试分离度溶液。结果显示：舒巴坦杂质C应在头孢哌酮保留时间之前，当调节pH值更低时，舒巴坦杂质C与头孢哌酮重合，舒巴坦杂质B、头孢哌酮杂质A和舒巴坦杂质A之间峰分离度均变差，具体见图6-图7。
结果如下：
对比实施例3改变流动相洗脱梯度
使用色谱柱：Thermo HYPERSIL C18(250×4.6mm，5μm)；将流动相以A、B区分开，A相为0.005mol/L氢氧化四丁基铵溶液，B相为乙腈，通过以下梯度进行洗脱：
流速：1mL/min，柱温：30℃，220nm波长检测。
结果如下：
将色谱洗脱系统的等度洗脱调整为梯度后，舒巴坦杂质C和头孢哌酮之间的分离度可达到1.5以上，且杂质均在40分钟即可全部被洗脱检测，表明洗脱方式从等度改变为梯度时，杂质之间的分离度发生了显著的变化，但舒巴坦杂质B和相邻杂质之间峰分离度仍然无法通过自动积分体现，具体见图8。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种头孢哌酮钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法，其特征在于，其包含以下步骤：采用色谱法对头孢哌酮钠舒巴坦钠原料药或制剂中有关物质进行分离检测，即可；其中，所述的有关物质为头孢哌酮杂质A、头孢哌酮杂质B、头孢哌酮杂质C、舒巴坦杂质A、舒巴坦杂质B、舒巴坦杂质C、舒巴坦杂质D、舒巴坦杂质E、舒巴坦杂质F中的一种或多种；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶型色谱柱；
检测波长：220nm；
流动相：以0.005mol/L氢氧化四丁基铵溶液(pH4.0)-乙腈(77:23)为流动相A，以0.005mol/L氢氧化四丁基铵溶液(pH4.0)-乙腈(70:30)为流动相B，按以下流量梯度进样检测：
。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测器例如DAD和/或UV检测器；
和/或，所述的流动相的流速为0.8-1.2mL/min。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测器例如DAD和UV检测器；
和/或，所述的流动相的流速为1.0mL/min。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，柱温为25-35℃；
和/或，所述色谱柱的填料颗粒度为2.5μm～7.5μm；
和/或，所述色谱柱的长度为150mm～350mm；
和/或，所述的色谱柱的内径为3mm～5mm。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，柱温为28-32℃；
和/或，所述色谱柱的填料颗粒度为5μm；
和/或，所述色谱柱的长度为250mm；
和/或，所述的色谱柱的内径为4.6mm。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，柱温为30℃。
7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的色谱柱为Thermo HYPERSIL C18，250×4.6mm，5μm，或柱效相当的色谱柱。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，供试品溶液为将头孢哌酮舒巴坦钠供试品，用流动相A制成每ml约含头孢哌酮2.5mg和舒巴坦1.3mg的溶液得到；
和/或，所述高效液相色谱法的进样量为5μL～20μL；
和/或，所述的检测方法为外标法以及加校正因子的自身对照法；
和/或，头孢哌酮对照品、头孢哌酮杂质A对照品、头孢哌酮杂质B对照品、头孢哌酮杂质C对照品、舒巴坦对照品、舒巴坦杂质A对照品、舒巴坦杂质B对照品、舒巴坦杂质C对照品、舒巴坦杂质D对照品、舒巴坦杂质E对照品、舒巴坦杂质F对照品，用流动相A溶解稀释制成每1ml中约含头孢哌酮杂质A3.6μg、头孢哌酮杂质B1.2μg、头孢哌酮杂质C10μg、舒巴坦杂质A3.6μg、舒巴坦杂质B1.2μg、舒巴坦杂质C 3.6μg、舒巴坦杂质D 3.6μg、舒巴坦杂质E 3.6μg、舒巴坦杂质F 3.6μg、头孢哌酮2.5mg和舒巴坦1.2mg的混合溶液。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的进样量为10μL；
和/或，所述的检测方法为外标法及加校正因子的自身对照法以峰面积计算有关物质的含量。
10.一种如权利要求1-9中任一项所述的头孢哌酮钠舒巴坦钠中有关物质的检测方法在头孢哌酮钠舒巴坦钠的原料药或制剂中头孢哌酮钠舒巴坦钠及其有关物质含量检测中的应用；所述的有关物质为头孢哌酮杂质A、头孢哌酮杂质B、头孢哌酮杂质C、舒巴坦杂质A、舒巴坦杂质B、舒巴坦杂质C、舒巴坦杂质D、舒巴坦杂质E、舒巴坦杂质F的一种或多种。
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