CN106093238A - 一种同时测定丁苯酞及其有关物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种同时测定丁苯酞及其有关物质的分析检测方法，通过高效液相色谱仪，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.2％的磷酸盐缓冲液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，检测波长为226～230nm。本发明提供的分析方法专属性好，灵敏度高，各吸收峰的分离度≥7，准确度和耐用性好。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，特别是涉及一种用高效液相色谱法分离测定丁苯酞及其有关物质的方法。
背景技术
丁苯酞是最早由中科院开发的脑血管领域药物，用于治疗轻、中度急性缺血性脑卒中，其结构式为:
有关物质主要是在生产过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物，以及贮藏过程中的降解产物等。基于安全性和生产实际情况的考虑，可允许含有一定限量的无害或低毒性的有关物质，但对毒性较大，危害人体健康、无效或影响药物稳定性的有关物质必须严格控制。因此，有关物质的检测是控制药物质量的关键指标。
丁苯酞有关物质检测的难点在于合成和保存过程中产生多种杂质与主成分难于分离。经研究发现丁苯酞原料药中主要含有如下6种已知杂质：
WS1-(X-124)-2005Z国家标准公布了丁苯酞的检测方法，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇:水(65:35)为流动相，检测波长280nm，分离度测试溶液为含有丁苯酞和丙苯酞的甲醇溶液。但是将此方法应用于检测含有上述6种杂质的样品时，分离比较困难。
发明内容
为克服现有技术缺陷，本发明提供了一种新的检测方法，该方法可以同时检测丁苯酞及其6种有关物质，专属性好，灵敏度高，采用梯度洗脱条件实现杂质的有效分离，各吸收峰的分离度≥7。
本发明目的在于提供一种同时测定丁苯酞及其有关物质的方法：
检测仪器：高效液相色谱仪；
色谱柱：Welch Ultimate XB C18、Waters XBridge C18或Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：0.2％磷酸盐缓冲溶液和乙腈；
按下列梯度洗脱：
| 时间(min) | 0.2％磷酸盐缓冲溶液(v/v) | 乙腈(v/v) |
| 0 | 70 | 30 |
| 5 | 70 | 30 |
| 20 | 40 | 60 |
| 40 | 40 | 60 |
| 50 | 70 | 30 |
| 55 | 70 | 30 |
检测器：UV检测器，检测波长226～230nm；
流速：0.8mL/min～1.2mL/min；
柱温：20～35℃；
进样量：10μL～100μL。
本发明优选方案，磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或磷酸铵，优选磷酸氢二钠。
本发明所述的检测方法，其流动相流速常见的范围一般为0.5mL/min～2mL/min，本发明优选0.8～1.2mL/min，更优选1.0mL/min。
本发明优选方案，所述的检测波长为228nm。
本发明优选方案，所述的进样量为10μL或20μL，优选20μL。
在一些实施例中，本发明有关物质选自以下杂质：
在一些实施例中，丁苯酞的检测限为15.76ng//mL，邻苯二甲酸的检测限为12.85ng/mL，中间体II的检测限为22.39ng/mL，中间体I的检测限为18.33ng/mL，丙苯酞的检测限为30.67ng/mL，丁烯基苯酞的检测限为29.89ng/mL，双丁基苯酞的检测限为30.52ng/mL。
在一些实施例中，本发明系统适用性实验中对照品溶液是用稀释剂分别配制成邻苯二甲酸浓度为0.1μg/mL、中间体I浓度为0.1μg/mL、中间体II浓度为0.1μg/mL、丙苯酞浓度为0.1μg/mL、丁烯基苯酞浓度为0.1μg/mL、双丁基苯酞浓度为0.1μg/mL和丁苯酞对照品浓度为0.5mg/mL的溶液；其中所述的稀释剂为乙腈和水的混合溶剂。
本发明优选方案，稀释剂乙腈和水的体积比为2：3。
本发明的方法与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明的方法能在同一个高效液相色谱条件下同时分离丁苯酞及其6种杂质，避免了在检测中频繁更换液相条件，提高工作效率，适合工业大生产的要求；
(2)本发明的方法所用仪器设备及试剂均是常规用品，实验参数无苛刻条件，成本低；
(3)本发明的检测方法专属性好，各杂质和丁苯酞峰之间均达到有效分离，各吸收峰的分离度≥7，理论板数均超过5000，本发明的检测方法重复性良好，RSD≤1.25％；
(4)本发明检测方法灵敏度高，丁苯酞的检测限为15.76ng/mL，其有关物质邻苯二甲酸的检测限为12.85ng/mL，中间体II的检测限为22.39ng/mL，中间体I的检测限为18.33ng/mL，丙苯酞的检测限为30.67ng/mL，丁烯基苯酞的检测限为29.89ng/mL，双丁基苯酞的检测限为30.52ng/mL；各杂质在0.02～3μg/mL范围内峰面积与浓度线性关系良好；
(5)本发明方法的平均回收率在99.4％～101.7％范围内，回收率RSD值在0.95％以内，本方法的准确度良好；
(6)本发明方法耐用性好，微调流速、柱温、色谱柱、检测波长，对丁苯酞及其杂质的检测无明显变化。
“v/v”指体积比；
“约”在本发明中是指在所述数值的±10％以内；
“0.2％的磷酸盐缓冲溶液”是指磷酸盐溶液的质量百分比，即100g溶液中含有0.2g磷酸盐。
附图说明
附图1邻苯二甲酸紫外扫描图
附图2中间体I紫外扫描图
附图3中间体II紫外扫描图
附图4丙苯酞紫外扫描图
附图5丁烯基苯酞紫外扫描图
附图6双丁基苯酞紫外扫描图
附图7丁苯酞紫外扫描图
附图8空白溶液在228nm检测波长下的色谱图
附图9邻苯二甲酸对照品在228nm检测波长下的色谱图
附图10中间体I对照品在228nm检测波长下的色谱图
附图11中间体II对照品在228nm检测波长下的色谱图
附图12丙苯酞对照品在228nm检测波长下的色谱图
附图13丁烯基苯酞对照品在228nm检测波长下的色谱图
附图14双丁基苯酞对照品在228nm检测波长下的色谱图
附图15混合溶液在228nm检测波长下的色谱图
附图16按WS1-(X-124)-2005Z方法丁苯酞粗品在280nm检测波长下的色谱图
附图17按实施例2方法丁苯酞粗品在228nm检测波长下的色谱图
附图18邻苯二甲酸峰面积对实际浓度线性回归曲线图谱
附图19中间体II峰面积对实际浓度线性回归曲线图谱
附图20中间体I峰面积对实际浓度线性回归曲线图谱
附图21丙苯酞峰面积对实际浓度线性回归曲线图谱
附图22丁苯酞峰面积对实际浓度线性回归曲线图谱
附图23丁烯基苯酞峰面积对实际浓度线性回归曲线图谱
附图24双丁基苯酞峰面积对实际浓度线性回归曲线图谱
具体实施方式
下面通过实施例来进一步解释和说明本发明。本发明的实施例仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，因此在本发明的方法的基础上对本发明的简单改进或替换均属本发明要求保护的范围。
以下实施例中检测用丁苯酞及其有关物质均由实验室合成，其对应批号如下：
对照品
丁苯酞对照品批号DBT-20140301
邻苯二甲酸批号DBT-ZZ1-20140201
中间体I批号DBT-I-20140301
中间体II批号DBT-II-20140301
丙苯酞批号BBT-20140302
丁烯基苯酞批号DXBT-20140302
双丁基苯酞批号DBT-ZZ2-20140202
丁苯酞原料药批号20140501
丁苯酞粗品批号20140401
HPLC：岛津LC-20A高效液相色谱仪或戴安U3000高效液相色谱仪；
色谱柱：Welch Ultimate XB C18、Waters XBridge C18或Waters Symmetry C18(250mm×4.6mm，5μm)；乙腈：色谱纯；水：超纯水；
实施例1检测波长的确定
稀释剂的配制：量取乙腈400mL和水600mL，搅拌混匀，得到的溶液亦为空白溶液，使用紫外分光光度计分别测定各杂质和丁苯酞对照品的最大吸收波长，结果见图1～7。
由全波长扫描图谱图1～7，丁苯酞及其各杂质在约226～230nm波长处均有较大吸收，优选波长为228nm，因此确定检测波长为228nm。
实施例2系统适用性实验
色谱条件：岛津LC-20A或戴安U3000型高效液相色谱系统及工作站；自动进样；以Welch Ultimate XB C18(4.6mm×250mm，5μm)为分离柱；紫外检测波长：228nm；流动相：0.2％磷酸氢二钠溶液和乙腈(梯度洗脱)；柱温25℃，进样体积20μL，流速1.0mL/min；
梯度程序
定位溶液的配制：
称取邻苯二甲酸约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，称取200μL溶液，置于20mL容量瓶中，得到浓度为5μg/mL的邻苯二甲酸定位溶液；
称取中间体I约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，称取100μL溶液，置于20mL容量瓶中，得到浓度为2.5μg/mL的中间体I定位溶液；
称取中间体II约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，称取500μL溶液，置于20mL容量瓶中，得到浓度为12.5μg/mL的中间体II定位溶液；
称取丙苯酞约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，称取300μL溶液，置于20mL容量瓶中，得到浓度为7.5μg/mL的丙苯酞定位溶液；
称取丁烯基苯酞约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，称取30μL溶液，置于20mL容量瓶中，得到浓度为0.75μg/mL的丁烯基苯酞定位溶液；
称取双丁基苯酞约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，称取300μL溶液，置于20mL容量瓶中，得到浓度为7.5μg/mL的双丁基苯酞定位溶液；
系统适用性溶液的配制：
分别取邻苯二甲酸、中间体II、中间体I、丙苯酞、丁烯基苯酞、双丁基苯酞的定位溶液，加稀释剂溶解，分别配制邻苯二甲酸浓度为0.1μg/mL、中间体I浓度为0.1μg/mL、中间体II浓度为0.1μg/mL、丙苯酞浓度为0.1μg/mL、丁烯基苯酞浓度为0.1μg/mL和双丁基苯酞浓度为0.1μg/mL溶液；
称取丁苯酞对照品50mg，精密称定，置100mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀即得，浓度为0.5mg/mL；
混合溶液的配制：
取定位溶液各1mL，置20mL容量瓶，稀释至刻度，摇匀得杂质溶液；
称取丁苯酞原料药25mg，精密称定，加入杂质溶液1mL，置50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀即得混合溶液。
取空白溶液、系统适用性溶液和混合溶液各20μL，分别注入液相色谱仪中，记录色谱图。其中，空白溶液为图8、杂质对照品溶液为图9～14，混合溶液为图15，本方法对丁苯酞的有关物质分离情况见表1。
表1 丁苯酞与各杂质的分离情况
| 名称 | 保留时间/min | 峰面积 | 理论板数 | 分离度 |
| 邻苯二甲酸 | 1.84 | 29476 | 6719 | 13.34 |
| 中间体II | 3.627 | 11345 | 6588 | 7.19 |
| 中间体I | 7.683 | 24399 | 10781 | 29.88 |
| 丙苯酞 | 15.77 | 37695 | 65379 | 7 |
| 丁苯酞 | 19.197 | 29555029 | 83178 | 11.01 |
| 丁烯基苯酞 | 22.037 | 47708 | 123378 | 15.41 |
| 双丁基苯酞 | 30.63 | 28617 | 54554 | / |
结论：各杂质和丁苯酞峰之间均达到有效分离，分离度≥7，理论板数均超过5000，空白溶剂无干扰，说明本方法适用于测定丁苯酞及其有关物质。
对比例1
取丁苯酞粗品约25mg，置50mL量瓶中，加稀释剂(取乙腈400mL，加水600mL，搅拌混匀)溶解并稀释，作为供试品溶液。
按照丁苯酞质量标准WS1-(X-124)-2005Z检测方法，以甲醇-水(体积比65:35)为流动相，检测波长280nm，取20μL供试品溶液进行检测，记录色谱图，具体见附图16。
按照实施例2的检测方法，以0.2％磷酸氢二钠溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，检测波长228nm，取20μL供试品溶液进行检测，记录色谱图，具体见附图17。
结果分析：从图16和17可以看出WS1-(X-124)-2005Z检测方法主峰出峰太早，杂质分离差，且波长下杂质检出量少，该方法不能有效地分离检测丁苯酞及其6种相关杂质；而实施例2方法主峰和杂质的保留时间均适宜，峰形较好，理论板数高，杂质和主峰可以达到有效分离。
实施例3专属性试验
考察丁苯酞原料药的降解研究，强制降解条件包括酸、碱、氧化、高温和光照，具体降解试验如下：
未破坏样品：取丁苯酞原料药约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
酸破坏：取丁苯酞原料药约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加入1mol/L盐酸溶液2mL破坏6小时后；加入等量的1mol/L氢氧化钠溶液中和，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
碱破坏：取丁苯酞原料药约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加入1mol/L氢氧化钠溶液2mL破坏6小时后；加入等量的1mol/L盐酸溶液中和，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
氧化破坏：取丁苯酞原料药约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，加30％双氧水0.2mL破坏6小时后，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
光照破坏：取丁苯酞原料药约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，置照度4500Lx下照射6小时，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
高温破坏：取丁苯酞原料药约25mg，精密称定，置50mL量瓶中，在105℃烘箱中加热6小时，放冷；加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。精密量取上述溶液20μL分别注入液相色谱仪，结果见表2和表3。
表2 苛刻破坏降解杂质谱分析
表3 破坏试验物料平衡结果
结论：丁苯酞原料药在酸、碱、氧化、光照条件下无明显降解，在高温破坏条件下主要降解杂质为丙苯酞，降解约0.39％。本品破坏试验物料基本平衡，本品产生的杂质在该色谱条件下均能被检出、分离度好，该方法专属性良好。
实施例4检测限
取丁苯酞对照品和各已知杂质，用稀释剂溶解并分别逐级稀释，再精密量取各溶液，照实施例1色谱条件依次进样20μl，记录色谱图，按信噪比10:1、3:1分别计算丁苯酞和各已知杂质的定量限与检测限，结果见表4。
表4 丁苯酞及其杂质的定量限、检测限结果
由表4可以看出，本发明的检测方法灵敏度高，丁苯酞的检测限为15.76ng/mL，邻苯二甲酸的检测限为12.85ng/mL，中间体II的检测限为22.39ng/mL，中间体I的检测限为18.33ng/mL，丙苯酞的检测限为30.67ng/mL，丁烯基苯酞的检测限为29.89ng/mL，双丁基苯酞的检测限为30.52ng/mL。
实施例5线性范围考察
分别取邻苯二甲酸、中间体II、中间体I、丙苯酞、丁烯基苯酞、双丁基苯酞和丁苯酞对照品各25mg，用稀释剂溶解并配成约0.5mg/mL的对照母液，分别精密量取各对照母液，加稀释剂稀释成不同浓度的线性溶液。精密量取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算线性回归方程，并绘制标准曲线，结果见附图18～24和表5～11。
表5 邻苯二甲酸线性试验结果
表6 中间体II线性试验结果
表7 中间体I线性试验结果
表8 丙苯酞线性试验结果
表9 丁苯酞对照品线性试验结果
表10 丁烯基苯酞线性试验结果
表11 双丁基苯酞线性试验结果
结论：本发明提供的分析方法检测丁苯酞及其有关物质时，检测浓度在约0.02～3μg/mL范围内具有良好线性关系，特别是邻苯二甲酸在0.02～3μg/mL范围内线性良好，中间体II在0.04～3μg/mL范围内线性良好，中间体I在0.03～3μg/mL范围内线性良好，丙苯酞在0.06～3μg/mL范围内线性良好，丁苯酞对照品在0.03～3μg/mL范围内线性良好，丁烯基苯酞在0.06～3μg/mL范围内线性良好，双丁基苯酞在0.06～3μg/mL范围内线性良好。
实施例6重复性实验
重复性是通过配制6份含各杂质限度浓度的供试品溶液，在相同的条件下进行测试，计算6份供试品溶液中各杂质含量的相对标准偏差。
混合杂质储备液：分别称取邻苯二甲酸25mg、中间体II、中间体I、丙苯酞、丁烯基苯酞和双丁基苯酞，分别置于50mL量瓶中，加稀释剂溶解至刻度，摇匀。各取1mL邻苯二甲酸溶液、中间体II溶液、中间体I溶液、丁烯基苯酞溶液、双丁基苯酞溶液和5mL丙苯酞溶液，混合，置20mL量瓶稀释至刻度，得到混合杂质储备液。
取1mL混合杂质储备液加入50mL量瓶中，加稀释剂溶解至刻度，摇匀，得到混合杂质对照溶液。
取丁苯酞原料药25mg，精密称定，置50mL量瓶中，精密量取混合杂质储备液1mL，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取20μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图，另取混合杂质对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，结果见表12。
表12 重复性试验结果
| 含量 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 | RSD |
| 邻苯二甲酸 | 0.101％ | 0.101％ | 0.101％ | 0.101％ | 0.102％ | 0.103％ | 0.101％ | 0.77％ |
| 中间体II | 0.101％ | 0.101％ | 0.102％ | 0.102％ | 0.099％ | 0.100％ | 0.101％ | 0.95％ |
| 中间体I | 0.100％ | 0.098％ | 0.100％ | 0.098％ | 0.101％ | 0.100％ | 0.099％ | 1.23％ |
| 丙苯酞 | 0.510％ | 0.509％ | 0.510％ | 0.514％ | 0.512％ | 0.511％ | 0.511％ | 0.34％ |
| 丁烯基苯酞 | 0.099％ | 0.101％ | 0.100％ | 0.102％ | 0.102％ | 0.102％ | 0.101％ | 1.25％ |
| 双丁基苯酞 | 0.100％ | 0.101％ | 0.100％ | 0.102％ | 0.100％ | 0.100％ | 0.100％ | 0.67％ |
结论：丁苯酞各杂质重复性良好，RSD≤1.25％。
实施例7回收率
准确度是通过在供试品中加入标准限度的50％(低)、100％(中)和150％(高)三个不同浓度各杂质测得的回收率所得。
取邻苯二甲酸、中间体II、中间体I、丙苯酞、丁烯基苯酞、双丁基苯酞对照品，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1mL约含邻苯二甲酸25μg、中间体II 25μg、中间体I 25μg、丁烯基苯酞25μg、双丁基苯酞25μg，丙苯酞125μg的溶液，作为混合杂质储备液；精密移取混合杂质储备液1mL，置50mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；
取丁苯酞原料药9份，每份25mg，精密称定，置50mL量瓶中，分成3组，分别加混合杂质储备液0.5mL、1mL、1.5mL，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
分别吸取对照品溶液和供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，记录图谱，按外标法以峰面积计算各已知杂质的测得量，扣除样品中原有量，计算回收率。
表13 回收率试验结果
结论：结果表明，低、中、高水平的平均回收率在99.4％～101.7％范围内，回收率RSD值在0.95％以内，表明本方法的准确度良好。
实施例8耐用性实验
取邻苯二甲酸、中间体II、中间体I、丙苯酞、丁烯基苯酞、双丁基苯酞对照品，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1mL约含邻苯二甲酸、中间体II、中间体I、丙苯酞、丁烯基苯酞、双丁基苯酞各0.025mg/mL的溶液，作为混合杂质储备液；取丁苯酞对照品25mg，精密称定，置50mL量瓶中，精密量取混合杂质储备液1mL，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。我们将丁苯酞有关物质检测色谱条件分别作适当变动流速(1.0mL/min、0.8mL/min、1.2ml/min)、柱温(15℃、25℃、35℃)、色谱柱(Welch Ultimate XB C18、WatersX Bridge C18、Waters Symmetry C18)、波长(228nm、226nm、230nm)，考察在不同条件下系统适用性溶液中主峰的保留时间及与杂质分离情况，结果见表14～17。
表14 不同流速的测试结果
表15 不同柱温的测试结果
表16 不同色谱柱的测试结果
表17 不同检测波长的测试结果
结论：由表14～17可以看出，流速在0.8mL/min～1.2ml/min、柱温15℃～35℃、不同型号的C18色谱柱、波长226nm～230nm条件下对测试结果没有显著影响，较小改变流速、柱温、色谱柱、检测波长，对丁苯酞及其杂质的检测无明显变化，本发明方法耐用性好。
Claims (9)
1.一种同时测定丁苯酞及其有关物质的方法，特征在于：
仪器：高效液相色谱仪；
色谱柱：Welch Ultimate XB C18、Waters XBridge C18或Waters Symmetry C18，4.6mm×250mm，5μm；
流动相：0.2％磷酸盐缓冲溶液和乙腈；
按下列梯度洗脱：
检测器：UV检测器，检测波长226～230nm；
流速：0.8mL/min～1.2mL/min；
柱温：20～35℃；
进样量：10μL～100μL。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或磷酸铵。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的磷酸盐为磷酸氢二钠。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的检测波长为228nm。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的流速为1.0mL/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的进样量为10μL或20μL。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的有关物质选自以下杂质：
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，丁苯酞的检测限为15.76ng/mL，邻苯二甲酸的检测限为12.85ng/mL，中间体II的检测限为22.39ng/mL，中间体I的检测限为18.33ng/mL，丙苯酞的检测限为30.67ng/mL，丁烯基苯酞的检测限为29.89ng/mL，双丁基苯酞的检测限为30.52ng/mL。
9.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其特征在于，配制对照品或供试品溶液所用的稀释剂为体积比为2:3的乙腈/水的混合溶液。
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