CN115219605A - 一种阿托伐他汀钙中苯胺的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种阿托伐他汀钙中苯胺的分析方法，该方法采用反相高效液相色谱法，分离测定了阿托伐他汀钙中苯胺的含量。本方法专属性良好，检测简便﹑灵敏度高﹑重复性好﹑准确度高，可以有效检测阿托伐他汀钙原料药及其制剂中苯胺的含量。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种阿托伐他汀钙中苯胺的分析方法。
背景技术
阿托伐他汀钙是一种3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A(HMG-COA)还原酶抑制剂，临床用于治疗多种高胆固醇血症和混合性脂代谢紊乱症。阿托伐他汀钙的化学结构见式I，其在生产及贮藏过程中，可能发生酰胺键的断裂，降解生成苯胺。苯胺一种重要的有机化工原料，其具有基因毒性杂质警示结构，且被收录在世界卫生组织国际癌症研究机构三类致癌物清单中，为基因毒性杂质。
基因毒性杂质是指能引起DNA突变或重组、染色体变异的一类物质，这类物质还可能导致肿瘤的发生。人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)及各国药品监督管理机构均颁布了基因毒性杂质控制的指导文件，本研究参照ICH M7《基因毒性杂质指导原则》，以1.5μg/天的安全剂量计算，拟定阿托伐他汀钙中苯胺的限度为18ppm；同时，采用高效液相色谱法，以控制阿托伐他汀钙中苯胺潜在的致癌风险，可为阿托伐他汀钙的质量控制提供参考依据。
发明内容
本发明的目的在于提供高效液相色谱法测定阿托伐他汀钙中苯胺的方法。其中苯胺的结构如式II所示：
为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种阿托伐他汀钙中苯胺的分析方法，其特征在于：所述方法是高效液相色谱法，该方法采用反相色谱柱，以磷酸二氢钾缓冲液-乙腈的混合溶液作为洗脱液，按等度或梯度洗脱。
在一些更为典型的实施方案中，以磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱:
且在梯度洗脱过程中，流动相A比例与流动相B比例总和为100％；其中流动相A比例是指流动相A体积占洗脱液总体积的百分比，流动相B比例是指流动相B占洗脱液总体积的百分比。
在一些实施方案中，所述磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.005mol/L～0.2mol/L；在一些典型的实施方案中，所述磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.01mol/L～0.04mol/L；在一些更为典型的实施方案中，所述磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.02mol/L。
在一些典型的实施方案中，所述磷酸二氢钾缓冲液为磷酸二氢钾水溶液。
在一些实施方案中，所述洗脱液的流速为0.5～2mL/min；在一些典型的实施方案中，所述洗脱液的流速为0.5～1.5mL/min；在一些更为典型的实施方案中，所述洗脱液的流速为1mL/min。
在一些实施方案中，所述反相色谱柱采用非极性固定相作为填料；在一些典型的实施方案中，所述反相色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料；在一些更为典型的实施方案中，所述反相色谱柱为Kromasil100-5-C18，其规格为4.6mm×250mm，5μm。
在一些实施方案中，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用二极管阵列检测器、紫外检测器、示差折光检测器、电喷雾检测器或蒸发光散射检测器；在一些典型的实施方案中，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用二极管阵列检测器或紫外检测器；在一些更为典型的实施方案中，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用紫外检测器，且其检测波长为195nm～400nm；优选为200nm～322nm；更优选为231nm。
在一些实施方案中，所述反相色谱柱的柱温为20～55℃；在一些典型的实施方案中，所述反相色谱柱的柱温为30～45℃；在一些更为典型的实施方案中，所述反相色谱柱的柱温为40℃。
另一方面，本发明提供了一种阿托伐他汀钙中苯胺的分析方法，其特征在于：
所述分析方法是在高效液相色谱仪上进行的；其采用反相色谱柱，所述反相色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料；
所述分析方法采用紫外检测器，检测波长是231nm；
所述分析方法柱温为40℃；
所述分析方法以流动相A和/或流动相B作为洗脱液，其中流动相A为磷酸二氢钾缓冲液，流动相B是乙腈，所述磷酸二氢钾缓冲液为0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液；
按以下程序梯度洗脱：
且在梯度洗脱过程中，流动相A比例与流动相B比例总和为100％；其中流动相A比例是指流动相A体积占洗脱液总体积的百分比，流动相B比例是指流动相B占洗脱液总体积的百分比；
洗脱液流速为1mL/min；
分别注入供试品溶液、对照品溶液和加标供试品溶液；
通过外标法计算供试品中苯胺的含量。
在一些特定的实施方案中，本发明提供了一种阿托伐他汀钙中苯胺的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
任选地，包含步骤(1)供试品溶液配制：取供试品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释，定容，摇匀，即得；
(2)对照品溶液的配制：取苯胺对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成，定容，摇匀，即得；
(3)加标供试品溶液配制：精密量取供试品和苯胺对照品适量，用甲醇作溶剂定量稀释定容，摇匀，即得；
(4)供试品测定：采用Kromasil 100-5-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱液流速为每分钟1ml；柱温为40℃；采用紫外检测器作为检测器，检测波长为231nm；进样体积为10μl；分别量取供试品溶液、对照品溶液和加标供试品溶液，分别注入液相色谱仪，并按下表进行梯度洗脱；
且在梯度洗脱过程中，流动相A比例与流动相B比例总和为100％；其中流动相A比例是指流动相A体积占洗脱液总体积的百分比，流动相B比例是指流动相B占洗脱液总体积的百分比；记录各色谱图；
(5)含量计算：
其中：校正因子f＝Cs/As；
Cs—对照品溶液杂质的浓度，μg/mL；
As—对照品溶液杂质的峰面积；
At—供试品溶液杂质的峰面积；
N—供试品溶液的溶剂稀释倍数体积，mL；
Wt—供试品称样量，mg；
本领域技术人员容易理解，在实施本发明过程中，本领域技术人员可以根据实际需求适当调整上述步骤的顺序且不影响测定方法的实施，例如加标供试品溶液、对照品溶液和供试品溶液的配置顺序。
本发明中，除非另有说明，用以“供试品配制”的式I化合物包括但不限于新制备或经储存的式I化合物或包含式I化合物的药物组合物，优选新制备或经储存的式I化合物。
本发明中，适量是指在根据实验目的，各化合物的量均在其高效液相色谱仪的检测限或定量限范围内。
本发明中，“mL”是指毫升；“mg”是指毫克；“μg”是指微克；“min”是指分钟；“ppm”是指微克每毫升。
本发明要解决的技术问题是提供一种能准确测定阿托伐他汀钙中苯胺含量的高效液相色谱分析方法。
本发明的有益效果：采用本发明提供的方法可以准确测定式I化合物供试品中苯胺含量，且主峰与苯胺的分离度≥1.5，溶剂不干扰杂质检测，方法专属性良好，且该检测方法简便﹑快速﹑准确﹑灵敏度高﹑重复性好以及准确度好，可以快速准确地进行供试品中苯胺的定性及定量分析，保证本品质量的可控性。
附图说明
图1实施例2空白溶液的色谱图
图2实施例2苯胺对照品溶液的色谱图
图3实施例2供试品溶液的色谱图
图4实施例2加标供试品溶液色谱图
图5参考例空白溶液色谱图
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业的本领域技术人员更全面地理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
本发明所用试剂：苯胺对照品购自阿拉丁试剂公司；阿托伐他汀钙样品购自浙江华海药业股份有限公司。甲醇、乙腈均为色谱纯；其他试剂为分析纯；水为超纯水。
实施例1样品测定
供试品溶液取阿托伐他汀钙多批样品各适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含25mg的溶液，作为供试品溶液。
对照品溶液取苯胺适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.45μg的溶液，作为对照品溶液
色谱条件Kromasil 100-5-C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱；以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟1ml；柱温为40℃；检测波长为231nm；进样体积为10μl。
测定法分别取各溶液10μl，照上述色谱条件测定，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有苯胺峰，按外标法计算。
计算过程：
其中：校正因子f＝Cs/As；
Cs—对照品溶液杂质的浓度，μg/mL；
As—对照品溶液杂质的峰面积；
At—供试品溶液杂质的峰面积；
N—供试品溶液的溶剂体积，mL；
Wt—供试品称样量，mg；
检测结果见表1，由表可知，多批阿托伐他汀钙的基因毒性杂质(苯胺)均符合规定，且小于限度的30％(即5.4ppm)。
表1供试品中苯胺的含量
实施例2专属性试验
对照品溶液：取苯胺适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.45μg的溶液。
供试品溶液：取阿托伐他汀钙适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含25mg的溶液。
加标供试品溶液：取阿托伐他汀钙、苯胺各适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含阿托伐他汀钙25mg、苯胺0.45μg的溶液。
试验过程：取空白溶剂甲醇、苯胺对照品溶液、供试品溶液、加标供试品溶液分别进样，记录色谱图，结果见图1～图4。
结果表明：空白无干扰，杂质主峰分离度大于1.5，专属性良好。
实施例3检测限和定量限
溶液配制：取苯胺对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并逐级稀释成一系列溶液，在实施例1所述的色谱条件下进样分析，并将定量限溶液平行配制6份分别测试，考察保留时间的RSD和峰面积的RSD。采用信噪比(S/N)法分别确定本品的检测限(LOD)和定量限(LOQ)：以信噪比S/N≥3:1计算，对应供试品浓度为检测限；信噪比(S/N)法分别确定本品的检测限(LOD)和定量限(LOQ)，以信噪比S/N≥10:1计算，对应供试品浓度为定量限。
试验过程：取空白溶剂及上述溶液进样，记录色谱图。
表2定量限结果
表3检测限结果
结果表明：苯胺峰面积RSD≤10.0％，保留时间RSD≤1.0％，LOQ与LOD均小于供试品浓度的0.05％检测灵敏度满足要求，苯胺的定量限为0.015μg/ml，检测限为0.005μg/ml。
实施例4线性和范围
溶液配制：精密称取苯胺对照品适量，用甲醇溶解制备成浓度约为限度浓度20％、50％、80％、100％、150％和200％的溶液，即配样浓度依次为0.02、0.10、0.25、0.41、0.54、0.76、1.02μg/ml的溶液
试验方法：分别精密量取上述溶液，按实施例1的色谱条件测定。以浓度(X，μg/ml)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，回归方程为y＝47.1113x-0.1486(γ＝0.9999)。结果表明，苯胺检测质量浓度在0.02～1.02μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。
实施例5溶液稳定性
取实施例2中的供试品溶液、对照品溶液，于室温条件下放置，分别在0、2、4、6、8、12、16、24、32、48h进行检测。结果表明，对照品溶液于室温下放置48h，苯胺峰相对0h峰面积百分比在98.0％～102％之间，则对照品溶液于室温条件下放置48h稳定；供试品溶液于室温下放置48h，苯胺相对0h含量变化绝对值小于限度的2％(即0.36ppm)，则供试品溶液于室温条件下放置48h稳定。
实施例6精密度实验
6.1进样精密度
溶液配制：精密称取苯胺对照品适量，用甲醇溶解制备成浓度为0.54μg/ml的溶液。
试验方法：连续进样6针，记录色谱图，计算6针苯胺峰面积及保留时间的RSD。结果表明：苯胺平均峰面积的RSD≤2.0％，保留时间RSD≤1.0％，仪器进样精密度良好。
表4进样精密度实验结果
6.2重复性
加标供试品溶液：取阿托伐他汀钙、苯胺各适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含阿托伐他汀钙25mg、苯胺0.45μg的溶液，平行配制6份
对照品溶液配制：同实施例1中的方法配制对照品溶液。
试验方法：精密量取空白溶剂、对照品溶液及加标供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算苯胺的含量。
表5重复性实验结果
结果表明：6份供试品中苯胺含量的RSD不大于6.0％，本方法的重复性良好。
6.3中间精密度
溶液配制：取阿托伐他汀钙、苯胺各适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含阿托伐他汀钙25mg、苯胺0.45μg的溶液，平行配制6份。
试验方法：由不同的分析人员在不同天，进行中间精密度试验。
表6中间精密度实验结果
可以看出，不同仪器不同人员的12次检测结果，苯胺含量的RSD≤10％，本方法的中间精密度良好。
实施例7准确度实验
溶液配制：精密称取苯胺对照品适量，用甲醇溶解制备成浓度约为限度浓度50％、100％和150％的溶液，即配样浓度依次为0.25、0.54和0.76μg/ml的溶液。供试品溶液的配制同实施例2中的配制方法。
试验方法：取供试品溶液、各加标供试品溶液分别进样，注入液相色谱仪，记录色谱图，外标法计算其回收率。结果见表7。
表7苯胺回收率结果
结果表明：苯胺的回收率在80％～120％之间，RSD值≤10.0％，该方法的准确度良好。
参考例1
溶液配制：同实施例1中的加标供试品溶液、供试品溶液和对照品溶液配制。
色谱条件Phenomenex Luna C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱；以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，以甲醇为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟1ml；柱温为40℃；检测波长为231nm；进样体积为10μl。
测定法分别取各溶液10μl，照上述色谱条件测定，记录色谱图。
空白溶液的色谱图如图5所示，在保留时间7-8min之间有一个由于甲醇引起的峰，该峰可能会对苯胺检测造成干扰。
Claims (10)
1.一种阿托伐他汀钙中苯胺的分析方法，其特征在于：所述方法是高效液相色谱法，该方法采用反相色谱柱，以磷酸二氢钾缓冲液-乙腈的混合溶液作为洗脱液，按等度或梯度洗脱。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：以磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱:
且在梯度洗脱过程中，流动相A比例与流动相B比例总和为100％；其中流动相A比例是指流动相A体积占洗脱液总体积的百分比，流动相B比例是指流动相B占洗脱液总体积的百分比。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述磷酸二氢钾缓冲液的浓度为0.005mol/L～0.2mol/L；优选为0.01mol/L～0.04mol/L；进一步优选为0.02mol/L。
4.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述磷酸二氢钾缓冲液为磷酸二氢钾水溶液。
5.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述洗脱液的流速为0.5～2mL/min；优选为0.5～1.5mL/min；更优选为1mL/min。
6.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述反相色谱柱采用非极性固定相作为填料；优选采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料；更优选反相色谱柱为Kromasil 100-5-C18，其规格为4.6mm×250mm，5μm。
7.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用二极管阵列检测器、紫外检测器、示差折光检测器、电喷雾检测器或蒸发光散射检测器；优选采用二极管阵列检测器或紫外检测器；进一步优选采用紫外检测器，且其检测波长为195nm～400nm；优选为200nm～322nm；更优选为231nm。
8.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述反相色谱柱的柱温为20～55℃；优选为30～45℃；更优选为40℃。
9.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述分析方法是在高效液相色谱仪上进行的；其采用反相色谱柱，所述反相色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料；
所述分析方法采用紫外检测器，检测波长是231nm；
所述分析方法柱温为40℃；
所述分析方法以流动相A和/或流动相B作为洗脱液，其中流动相A为磷酸二氢钾缓冲液，流动相B是乙腈，所述磷酸二氢钾缓冲液为0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液；
按以下程序梯度洗脱：
且在梯度洗脱过程中，流动相A比例与流动相B比例总和为100％；其中流动相A比例是指流动相A体积占洗脱液总体积的百分比，流动相B比例是指流动相B占洗脱液总体积的百分比；
洗脱液流速为1mL/min。
10.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)供试品溶液配制：取供试品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释，定容，摇匀，即得；
(2)对照品溶液的配制：取苯胺对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成，定容，摇匀，即得；
(3)加标供试品溶液配制：精密量取供试品和苯胺对照品适量，用甲醇作溶剂定量稀释定容，摇匀，即得；
(4)供试品测定：采用Kromasil 100-5-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，洗脱液流速为每分钟1ml；柱温为40℃；采用紫外检测器作为检测器，检测波长为231nm；进样体积为10μl；分别量取供试品溶液、对照品溶液和加标供试品溶液，分别注入液相色谱仪，并按下表进行梯度洗脱；
且在梯度洗脱过程中，流动相A比例与流动相B比例总和为100％；其中流动相A比例是指流动相A体积占洗脱液总体积的百分比，流动相B比例是指流动相B占洗脱液总体积的百分比；记录各色谱图；
(5)通过外标法计算供试品中苯胺的含量。
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| CN110646550A (zh) * | 2018-06-26 | 2020-01-03 | 北京伟林恒昌医药科技有限公司 | 一种阿托伐他汀钙中有关物质的检测方法 |
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