CN117761206A - 一种左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及化学检测的技术领域，具体公开了一种左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法。本申请公开的一种左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法，包括以下步骤：利用高效液相色谱法对待测样品进行检测；色谱条件具体为：采用聚丙烯酰胺键合硅胶为填充剂的色谱柱；以体积比为（28‑33）：（67‑72）的25‑35mmol/L碳酸氢铵溶液‑乙腈为流动相；流速为：0.8‑1.5ml/min；检测波长为200‑230nm；柱温为23‑27℃。本申请提供的检测方法操作简单，检测速度快，且具有高灵敏度、高精密度、高重复性、高准确度的优点。
Description
技术领域
本申请涉及化学检测的技术领域，具体涉及一种左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法。
背景技术
左卡尼汀是哺乳动物能量代谢中必需的体内天然物质，其主要功能是促进脂类代谢。它既能将长链脂肪酸带进线粒体基质，并促进其氧化分解，为细胞提供能量，又能将线粒体内产生的短链脂酰基输出。左卡尼汀原料药的补充可缓解其因体内缺乏引起的脂肪代谢紊乱、骨骼肌和心肌等组织的功能障碍。
许多药品、保健食品、食品及添加剂等都含有左卡尼汀，左卡尼汀含有的有关杂质会对左卡尼汀原料药的安全性和有效性造成不利影响。现有标准中对左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法难以达到分离度要求，例如基线分离困难、各峰之间的分离度差、部分杂质未洗脱出来等。因此，为保证左卡尼汀原料药的使用安全性与有效性，急需提供一种专属性强、灵敏度高、分离度好的左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法显得至关重要。
发明内容
为了能够检测左卡尼汀原料药中的有关杂质，同时提高检测方法的精密度和准确度，本申请提供一种左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法。
本申请提供了一种左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法，包括以下步骤：
利用高效液相色谱法对待测样品进行检测；
所述有关杂质包括2-呋喃酮、杂质A、杂质C、杂质D；所述杂质A为4-(三甲基铵)丁-2-烯酸内盐，所述杂质C为(2R)-4-氨基-2-羟基-N,N,N-三甲基-4-氧代丁烷-1-胺，所述杂质D为4-氨基-N,N,N-三甲基-4-氧代丁基-2-烯-1-胺；
色谱条件具体为：采用聚丙烯酰胺键合硅胶为填充剂的色谱柱；以体积比为(28-33)：(67-72)的20-30mmol/L碳酸氢铵溶液-乙腈为流动相；流速为：0.8-1.5ml/min；柱温为23-27℃。
本申请中，2-呋喃酮(C4H4O2，分子量84.07)、杂质A(C7H13NO2，分子量143.18)、杂质C(C7H17N2O2Cl，分子量161.23)、杂质D(C7H15N2O，分子量143.21)的化学结构式分别如式(1)、式(2)、式(3)、式(4)所示；
其中，所述杂质A可以为(E)-4-(三甲基铵)丁-2-烯酸内盐或其异构体(Z)-4-(三甲基铵)丁-2-烯酸内盐；所述杂质D为(E)-4-氨基-N,N,N-三甲基-4-氧代丁基-2-烯-1-胺或其异构体(Z)-4-氨基-N,N,N-三甲基-4-氧代丁基-2-烯-1-胺。
式(1)
式(2)
式(3)
式(4)
本申请中，为了实现左卡尼汀原料药中2-呋喃酮、杂质A、杂质C、杂质D多种杂质的同时检测，通过大量实验探究，重新提供了左卡尼汀原料药中上述有关物质检测方法中的具体检测条件。利用特定的色谱柱和流动相、流速，并将分离检测过程的柱温控制23-27℃，能够快速、准确地同时检测左卡尼汀原料药中2-呋喃酮、杂质A、杂质C、杂质D，并且检测的专属性强、灵敏度高、分离度好；将上述检测方法用于左卡尼汀原料药的生产制备工艺中，能够实现制剂质量的有效把控。
优选地，所述流动相为体积比为(29-31)：(69-71)的碳酸氢铵溶液-乙腈混合溶液。
在一些实施方案中，所述碳酸氢铵溶液和乙腈的体积比可以为28-30：70-72、30-33：67-70。
在一个具体的实施方案中，所述碳酸氢铵溶液和乙腈的体积比可以为28：72、30：70、33：67。
优选地，所述流动相中，所述碳酸氢铵溶液的浓度为23-28mmol/L。
在一些实施方案中，所述碳酸氢铵溶液的浓度可以为20-23mmol/L、20-25mmol/L、20-28mmol/L、23-25mmol/L、23-30mmol/L、25-28mmol/L、25-30mmol/L、28-30mmol/L。
在一个具体的实施方案中，所述碳酸氢铵溶液可以为20mmol/L、23mmol/L、25mmol/L、28mmol/L、30mmol/L。
优选地，所述流动相中，所述碳酸氢铵溶液的pH为5.8-6.3。
在一些实施方案中，所述流动相中，所述碳酸氢铵溶液的pH为5.8-6.0、6.0-6.3。
在一个具体的实施方案中，所述流动相中，所述碳酸氢铵溶液的pH为5.8、6.0、6.3。
优选地，所述柱温为24-26℃。
在一些实施方案中，所述柱温为23-24℃、23-25℃、23-26℃、24-25℃、24-27℃、25-26℃、25-27℃、26-27℃。
在一个具体的实施方案中，所述柱温为23℃、24℃、25℃、26℃、27℃。
优选地，所述色谱柱为Ultimate HILIC Amide 250×4.6mm，3μm。
优选地，所述色谱条件中，进样体积为15-25μl。
优选地，所述色谱条件中，检测波长为200-230nm。
在一些实施方案中，所述检测波长为205nm。
优选地，所述检测方法包括以下步骤：
供试品溶液的配制：取左卡尼汀原料药，加流动相溶解并定量稀释制成4mg/ml的溶液；
混合对照品溶液的配制：取左卡尼汀对照品、杂质A对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、2-呋喃酮对照品，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含左卡尼汀及各杂质各4μg的混合溶液；
系统适用性溶液的配制：取左卡尼汀原料药与杂质A对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、2-呋喃酮对照品，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含左卡尼汀4mg及杂质A、杂质C对照品、杂质D对照品、2-呋喃酮对照品各4μg的混合溶液；
测定法：取空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液与混合对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图
综上所述，本申请的技术方案具有以下效果：
本申请通过高效液相色谱法技术对左卡尼汀原料药中的有关杂质进行检测，提供了一种检测速度快、操作方法简单的检测方法。利用特定的色谱柱和流动相、流速，并将分离检测过程的柱温控制23-27℃，能够快速、准确地同时检测左卡尼汀原料药中2-呋喃酮、杂质A、杂质C、杂质D，并且检测的专属性强、灵敏度高、分离度好；将上述检测方法用于左卡尼汀原料药的生产制备工艺中，能够实现制剂质量的有效把控。
本申请通过对相关测试条件进行筛选与优化，2-呋喃酮、杂质A、杂质C、杂质D有关物质的检测方法获得的检测谱图的各峰的对称性好、峰高适宜、出峰位置居中、各物质的出峰位置相差较远，分离效果明显；提供的左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法具有检出限低、精密度高、重复性高、准确度高的优点。
本申请提供的左卡尼汀原料药中的有关杂质的检测方法解决了相关技术中存在的基线分离困难、各峰之间的分离度差、部分杂质未洗脱出来等问题，利用上述检测方法检测左卡尼汀原料药中的有关杂质，能够实现左卡尼汀原料药质量的有效把控。
附图说明
图1为本申请实施例1中左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的检测谱图。
图2为本申请实施例2中2-呋喃酮的线性关系图。
图3为本申请实施例2中左卡尼汀的线性关系图。
图4为本申请实施例2中杂质A的线性关系图。
图5为本申请实施例2中杂质D的线性关系图。
图6为本申请实施例2中杂质C的线性关系图。
图7为本申请对比例1中左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的检测谱图。
图8为本申请对比例2中左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的检测谱图。
具体实施方式
本申请提供一种左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法，具体包括以下步骤：
本申请中，所用左卡尼汀原料药原料、有关杂质标准溶液及其来源如表1所示；其余原料、试剂、溶剂等均可通过商购获得。
表1实施例所用的原料及其来源
参考左卡尼汀ChP2020、USP43、BP2020、欧洲药典论坛32.4及原料药供应商标准限度对比，通过比较，拟定杂质A不得过0.2％、杂质C、D、2-呋喃酮、其它单个杂质均不得过0.05％、总杂不得过0.5％，为最严标准。
表2左卡尼汀原料药中有关杂质的标准限度对比
以下结合实施例以及性能检测试验对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例
实施例1
实施例1提供了一种左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法。
本例中左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法具体包括以下步骤：
供试品溶液：取本品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含4mg的溶液。
混合对照品溶液：取左卡尼汀对照品、杂质A对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、2-呋喃酮对照品各适量，分别精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含左卡尼汀及各杂质各4μg的混合溶液。
系统适用性溶液：取本品与杂质A对照品各适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含左卡尼汀4mg及杂质A4μg的混合溶液。
系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，左卡尼汀峰与杂质A峰分离度应大于1.5，左卡尼汀峰理论板数应不低于2000。混合对照品溶液色谱图中，出峰顺序依次为2-呋喃酮、左卡尼汀、杂质A、杂质D、杂质C；杂质A为4-(三甲基铵)丁-2-烯酸内盐，所述杂质C为(2R)-4-氨基-2-羟基-N,N,N-三甲基-4-氧代丁烷-1-胺，所述杂质D为4-氨基-N,N,N-三甲基-4-氧代丁基-2-烯-1-胺。
限度：供试品溶液色谱图中如有保留时间与混合对照品溶液色谱图中杂质A、杂质C、杂质D、2-呋喃酮保留时间一致的杂质峰，按外标法以峰面积计算，杂质A不得过0.10％，杂质C、杂质D与2-呋喃酮均不得过0.05％；其他单个杂质峰，按主成分外标法以峰面积计算，不得过0.05％；总杂不得过0.50％；小于左卡尼汀对照品峰面积0.1倍(0.01％)的峰忽略不计。
色谱条件：用聚丙烯酰胺键合硅胶为填充剂(Ultimate HILIC Amide 250×4.6mm，3μm)；以25mmol/L碳酸氢铵溶液(取碳酸氢铵1.97g，加水1000ml溶解，用磷酸调节pH值至6.0)-乙腈(30∶70)为流动相；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：205nm；进样量20μl；供试品溶液5mg/ml。
测定法：精密量取空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液与混合对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍。
检测结果：如图1和表3所示。
表3实施例1中左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的分离度
结果及结论：更换色谱柱，调节柱温后，杂质C峰与杂质D峰间的分离度为2.08，在此色谱条件下，可达到检测要求，此方法可用于有关物质检测方法。
实施例2
本实施例参考《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》及中国药典2020年版四部通则9101，对实施例1中1.3拟定的本品有关物质的检测方法进行方法学验证，内容包括专属性、仪器精密度、定量限与检测限、线性与范围、重复性、准确度、耐用性，综合结果如表4所示。
表4左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证汇总表
2.1专属性
考察左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的专属性情况，要求空白溶液应不干扰左卡尼汀原料药中有关杂质的检测，系统适用性溶液色谱图中，左卡尼汀峰与杂质A峰间的分离度应不低于1.5，左卡尼汀峰理论板数应不低于2000；混合对照品溶液色谱图中，主成分峰与相邻峰间的分离度应符合要求。
检测结果：如表5所示。
表5左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-专属性
结论：空白溶液不干扰本品(左卡尼汀原料药)有关物质检测；系统适用性溶液色谱图中，左卡尼汀峰与杂质A峰分离度为3.00，大于1.5，左卡尼汀峰理论板数为2718，大于2000；混合对照品溶液色谱图中，主成分峰与相邻峰间的分离度为3.64，大于1.5，符合要求，因此，本品有关物质方法专属性良好。
2.2仪器精密度
考察检测方法中的仪器精密度是否符合要求，要求保留时间RSD≤1.0％，峰面积RSD≤2.0％。精密量取混合对照品溶液，连续进样6次，计算保留时间和峰面积的RSD。
检测结果：如表6所示。
表6左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-仪器精密度
结论：混合对照品溶液连续进样6次，各杂质及主成分的保留时间RSD均小于1.0％(最大值为0.24％)，峰面积RSD均小于2.0％(最大值为1.38％)，因此，本品有关物质方法仪器精密度良好。
2.3溶液稳定性
考察在室温条件下，混合对照品溶液、供试品溶液的稳定性，分别于0h及不同时间点进样，要求混合对照品溶液中杂质及主成分的峰面积RSD≤10％，供试品溶液中杂质峰面积RSD≤10％，主成分峰面积RSD≤2％，且无新增杂质，判定为溶液稳定性良好。
检测结果：如表7和表8所示。
表7左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-溶液稳定性-混合对照品溶液
表8左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-溶液稳定性-供试品溶液
结论：混合对照品溶液室温放置34h，各杂质及主成分峰面积的RSD均小于10％(最大值为2.05％)，因此，混合对照品溶液室温放置至少34h稳定；
供试品溶液室温放置28h，2-呋喃酮、杂质A、C、D均未检出，且无新增杂质，因此，供试品溶液室温放置至少28h稳定。
2.4定量限与检测限
考察该方法检测灵敏度，采用信噪比作为评价指标。要求信噪比不低于10，作为定量限；信噪比不低于3，作为检测限；定量限重复性峰面积RSD(n＝6)≤10％。
检测结果：如表9和表10所示。
表9左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-定量限与检测限
表10左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-定量限重复性
结论：2-呋喃酮、杂质A、C、D、左卡尼汀的定量限与检测限、定量限重复性均符合规定，因此，本品有关物质检测方法灵敏度良好。
2.5线性与范围
考察杂质A含量在LOQ～200％限度范围内的线性、杂质C、D、2-呋喃酮含量在LOQ～400％限度范围内的线性，要求以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，相关系数r≥0.998，Y轴截距应在100％限度响应值的25％以内。
检测结果：如表11、表12、表13、表14、表15所示。
表11左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-线性(2-呋喃酮)
表12左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-线性(左卡尼汀)
表13左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-线性(杂质A)
表14左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-线性(杂质D)
表15左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-线性(杂质C)
结论：本品有关物质杂质A、C、D、2-呋喃酮、左卡尼汀在LOQ～400％限度浓度范围内，线性均良好。
2.6重复性
测定6份供试品加标溶液中各杂质检出量的RSD(n＝6)≤10％。
检测结果：如表16所示。
表16左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-重复性
结论：6份供试品加标溶液中各杂质检出量RSD均小于10％(最大值为1.85％)，因此，本品有关物质重复性良好。
2.7耐用性
考察色谱条件中柱温、pH值以及不同色谱柱发生微小变动后，对本品各杂质检测结果的影响。要求各色谱条件下，空白溶液应不干扰本品有关物质检测；系统适用性溶液色谱图中，左卡尼汀峰与杂质A峰间的分离度应大于1.5，左卡尼汀峰理论板数应不低于2000；加标供试品溶液中各杂质检出量应无明显变化。
试验方案如表17所示。
表17左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-耐用性试验方案
| 研究项目 | 标准条件 | 考察范围 |
| 柱温(℃) | 25 | 23～27 |
| pH值 | 6.0 | 5.8～6.3 |
| 流动相比例 | 30∶70 | (28∶72)～(33∶67) |
| 色谱柱 | Ultimate HILIC Amide 250×4.6mm，3μm | 同品牌不同批次 |
检测结果：如表18、表19、表20、表21、表22所示。
表18左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-耐用性-系统适用性
表19左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-耐用性-柱温
表20左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-耐用性-pH值
表21左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-耐用性-流动相比例
表22左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的方法学验证-耐用性-更换色谱柱
结论：该方法在柱温(23℃～27℃)、pH值(5.8～6.3)、流动相比例(28∶72)～(33∶67)以及使用同品牌不同批号色谱柱时，空白溶液不干扰左卡尼汀与各杂质峰的检测；系统适用性溶液色谱图中，左卡尼汀峰与杂质A峰间的分离度大于1.5(最小值为2.52)，理论板数按左卡尼汀峰计算大于2000(最小值为2718)，加标供试品溶液中各杂质检出量基本一致，无明显变化，因此，本品有关物质方法耐用性良好。
综上所述，本申请提供的左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法检测速度快、操作方法简单，且该检测方法具有检出限低、定量限重复性好、精密度高、重复性高、准确度高的优点。
对比例
对比例1
本对比例提供了一种左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法。
本例中左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法具体包括以下步骤：
色谱条件：色谱柱：HILIC 250mm×4.6mm，5μm；流动相：25mmol/L碳酸氢铵溶液(用磷酸调节pH值至6.0)-乙腈(体积比为35∶65)；流速：0.7ml/min，柱温：22℃，检测波长：205nm，进样量：20μl，供试品溶液5mg/ml。
检测结果：如图7所示。
结果及结论：供试品溶液色谱图中，主成分峰前有倒峰。因此，该方法不适用于本申请中左卡尼汀原料药中有关杂质的检测。
对比例2
本对比例提供了一种左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法。
本例中左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法具体包括以下步骤：
色谱条件：色谱柱：HILIC 250mm×4.6mm，5μm；流动相：45mmol/L碳酸氢铵溶液(用磷酸调节pH值至6.0)-乙腈(体积比为25∶75)；流速：1.7ml/min，柱温：30℃，检测波长：205nm，进样量：20μl，供试品溶液5mg/ml。
测定法：精密量取空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液与混合对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍。
检测结果：如图8和表23所示。
表23对比例2中左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法的分离度
结果及结论：杂质C与杂质D的分离度为1.50。因此，该方法不适用于本申请中左卡尼汀原料药中有关杂质的检测。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用高效液相色谱法对待测样品进行检测；
所述有关杂质包括2-呋喃酮、杂质A、杂质C、杂质D；所述杂质A为4-（三甲基铵）丁-2-烯酸内盐，所述杂质C为（2R）-4-氨基-2-羟基-N,N,N-三甲基-4-氧代丁烷-1-胺，所述杂质D为4-氨基-N,N,N-三甲基-4-氧代丁基-2-烯-1-胺；
色谱条件具体为：采用聚丙烯酰胺键合硅胶为填充剂的色谱柱；以体积比为（28-33）：（67-72）的20-30mmol/L碳酸氢铵溶液-乙腈为流动相；流速为：0.8-1.5ml/min；柱温为23-27℃。
2.根据权利要求1所述的左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法，其特征在于，所述流动相为体积比为（29-31）：（69-71）的碳酸氢铵溶液-乙腈混合溶液。
3.根据权利要求1所述的左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法，其特征在于，所述流动相中，所述碳酸氢铵溶液的浓度为23-28mmol/L。
4.根据权利要求1所述的左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法，其特征在于，所述流动相中，所述碳酸氢铵溶液的pH为5.8-6.3。
5.根据权利要求1所述的左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法，其特征在于，所述柱温为24-26℃。
6.根据权利要求1所述的左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Ultimate HILIC Amide 250×4.6mm，3µm。
7.根据权利要求1所述的左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件中，进样体积为15-25µl。
8.根据权利要求1所述的左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件中，检测波长为200-230nm。
9.根据权利要求1所述的左卡尼汀原料药中有关杂质的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
供试品溶液的配制：取左卡尼汀原料药，加流动相溶解并定量稀释制成4mg/ml的溶液；
混合对照品溶液的配制：取左卡尼汀对照品、杂质A对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、2-呋喃酮对照品，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中含左卡尼汀及各杂质各4µg的混合溶液；
系统适用性溶液的配制：取左卡尼汀原料药与杂质A对照品、杂质C对照品、杂质D对照品、2-呋喃酮对照品，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含左卡尼汀4mg及杂质A、杂质C对照品、杂质D对照品、2-呋喃酮对照品各4µg的混合溶液；
测定法：取空白溶液、系统适用性溶液、供试品溶液与混合对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
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