CN105651893A - 一种饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法，所述方法先采用液相色谱法对梯度浓度的纽甜标准溶液进行检测，采用C₁₈液相色谱柱、检测波长为210nm，得到纽甜出峰的峰面积，以纽甜标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；采用水溶并结合超声处理饲料添加剂得到样品处理液，将样品处理液在与纽甜标准溶液相同的检测色谱条件下进行检测，得到样品处理液中纽甜峰面积，计算出样品处理液中纽甜含量，换算得所述饲料添加剂中纽甜的含量。本发明方法能够对饲料添加剂中纽甜含量进行精准定量，且具有无需进行复杂的前处理、检测灵敏、高效、准确和稳定的特点且具有检测结果。

Description

一种饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法

技术领域

本发明属于饲料添加剂中成分分析检测技术领域，具体涉及一种饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法。

背景技术

高效液相色谱法是一项高压、高效、高灵敏度的分离技术，可用于分离分析高沸点、相对分子量大、难挥发的有机化合物，广泛应用于化学、化工、高分子、生物、食品、医药等领域。

纽甜，化学名称是N-[N-(3,3—二甲基丁基)-L-α-天冬氨酰]-L-苯丙氨酸-1-甲酯，白色结晶粉末，含约4.5％的结晶水，是一种功能性甜味剂，其具有纯正的甜味，甜味协和，十分接近阿斯巴甜，没有其他强力甜味剂常带的苦味和金属味，甜度比蔗糖甜7000～13000倍，比阿斯巴甜甜30～60倍，纽甜在常温(25℃)下水中的溶解度为12.6g/L，此溶解度能完全满足正常的生产需要。

在饲料添加剂领域，纽甜纯净的甜味，没有苦、涩、金属的异味，可有效地遮蔽糖精的后苦等特征，因而纽甜可用于配制饲料甜味剂，通常将纽甜以及其他有效成分加入到二氧化硅和/或蛭石等载体中混合均匀制备成所需产品。然而，目前饲料添加剂中纽甜含量的检测没有国家标准，也没有现成的方法。《GB/T29944-2013食品安全国家标准食品添加剂纽甜》规定了食品中纽甜含量的检测方法，但其不适用于混合型饲料添加剂中纽甜含量的检测，该标准适用于以阿斯巴甜和3,3-二甲基丁醛为主要原料，在氢气存在下甲醇溶液中进行反应而制得的纽甜，采用高效液相色谱法外标单点进行定量，适用于大浓度下纽甜含量的检测，而饲料添加剂中纽甜含量低，采用该标准检测产生的误差大，故不能用于饲料添加剂中甲酸的定量测定。《GB/T23378-2009食品中纽甜的测定方法高效液相色谱法》，该标准提供了一种定量检测纽甜的方法，但该方法在样品处理过程中采用固相萃取柱，过程复杂，工作量大，不适用于大批量检测；流动相采用走梯度方式，液相采用二元泵，而对于液相只有单泵的企业，并不适用。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：怎样提供一种饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法，使其能够对饲料添加剂中纽甜含量进行精准定量，且具有无需进行复杂的前处理、检测灵敏、高效、准确和稳定的特点。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法，包括如下步骤：

1)配制梯度浓度的纽甜标准溶液；所述纽甜标准溶液以水作为溶剂；

2)采用液相色谱法对步骤1)配制的纽甜标准溶液进行检测，计算得到纽甜出峰的峰面积，以纽甜标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；其中，色谱条件为采用C₁₈液相色谱柱，检测波长210nm，流动相为pH3.5～4.0的庚烷磺酸钠、三乙胺和乙腈的混合水溶液，庚烷磺酸钠、三乙胺、乙腈和水的质量体积比为2.6～3.4g：3～4.5mL：300～450mL：500-650mL；

3)将饲料添加剂加入水中，并进行超声处理，得到样品处理液；

4)将步骤3)得到的样品处理液在与步骤2)相同的液相色谱条件下进行检测，计算得到纽甜出峰的峰面积，根据步骤2)建立的标准曲线计算出样品处理液中纽甜的浓度，并结合所述样品处理液的体积和样品重量，计算出所述饲料添加剂中纽甜的含量。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、饲料添加剂中纽甜含量较少，针对现有的国家标准仅适用于大浓度下纽甜含量的检测，而并不适用于饲料添加剂中纽甜含量的检测，且前处理方法过于繁琐等不足之处，本发明考虑到纽甜的特性，并根据饲料添加剂样品中各成分组成的性质，选择C₁₈柱作为固定相，并通过创造性的研究得出适用于本发明饲料添加剂分离的色谱条件，使得各成分在该色谱条件下能充分分离开，在检测波长210nm条件下纽甜能够稳定出峰，相较于现有技术更短时间内即可出峰，出峰不会拖尾、重叠，不会有干扰峰出现，进而使本发明检测结果精确，可靠性高。

2、本发明先对不同浓度的纽甜标准溶液进行检测，避免了单点计算带来的误差，进而使检测结果更加准确、可靠，制得的标准曲线相关系数更高，为后续样品的检测奠定了可靠的定量基础。

3、本发明无需进行复杂的样品前处理，只需采用纯水并结合超声处理对饲料添加剂中纽甜进行提取即可，前处理过程更加简单，本发明还研究出提取过程中最佳料液比和超声时间，在此条件下纽甜提取最完全，能够保证良好的提取效果，进而使检测结果更加准确。

4、本发明检测方法使用的设备和试剂均为通用设备，适用于饲料厂、饲料添加剂厂进行大批量自检，具有良好的应用推广前景。

附图说明

图1为本发明检测方法纽甜标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程，来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

本实施例主要设备有分析天平、高效液相色谱和一些常见实验室玻璃仪器；所用的试剂有色谱纯级乙腈、色谱纯级庚烷磺酸钠、色谱纯级三乙胺、磷酸和纽甜标准品，所用水为纯水。

一、一种饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法，包括如下步骤：

1)以水作为溶剂，配制梯度浓度的纽甜标准溶液；

2)采用液相色谱法对步骤1)配制的纽甜标准溶液进行检测，计算得到纽甜出峰的峰面积，以纽甜标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；其中，色谱条件为采用C₁₈液相色谱柱，检测波长210nm，流动相为pH3.5～4.0的庚烷磺酸钠、三乙胺和乙腈的混合水溶液，庚烷磺酸钠、三乙胺、乙腈和水的质量体积比为2.6～3.4g：3～4.5mL：300～450mL：500-650mL；

3)将饲料添加剂加入水中，并进行超声处理，得到样品处理液；

4)将步骤3)得到的样品处理液在与步骤2)相同的液相色谱条件下进行检测，计算得到纽甜出峰的峰面积，根据步骤2)建立的标准曲线计算出样品处理液中纽甜的浓度，并结合所述样品处理液的体积和样品重量，计算出所述饲料添加剂中纽甜的含量。

上述步骤1)中为配制浓度依次为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL的纽甜标准溶液。这样，得到的标准曲线线性相关性更好，使得后续检测样品的计算结果更加准确。

上述C₁₈液相色谱柱规格为250mm长×4.6mm内径，填料粒度为5μm。

上述步骤2)所述流动相配制过程中先将庚烷磺酸钠溶于水中，再加入三乙胺混合均匀，用磷酸调节溶液的pH为3.0～3.5后，加入乙腈并用磷酸调节溶液pH至3.5～4.0，过滤后备用。采用这种方法配制的流动相，溶液的均一性更好，性质更加稳定。

上述液相色谱检测过程中控制柱温为室温，流动相流速为0.8～1.5mL/min，进样量为20～30μL。

上述步骤3)将饲料添加剂与水按照3～5g：100mL的质量体积比混合，并进行超声处理20～60min，得到样品处理液。这样的提取条件下，待测样品中的纽甜提取的更加完全，检测结果更加真实可靠。

上述混合型饲料添加剂为以二氧化硅和/或蛭石为载体的混合型饲料添加剂，特别是指甜味剂。

上述得到的样品处理液如果经过本发明液相色谱方法检测，检测的210nm处吸光度值最大大于0.8，则对样品处理液进行一定的浓度稀释后再重新进行检测，这样检测结果更加准确可靠。

本发明检测原理：配制梯度浓度的纽甜标准溶液，用液相色谱仪在本发明设定的色谱条件下对各浓度的标准溶液中纽甜含量进行测定，得带纽甜出峰的峰面积，建立浓度-峰面积标准曲线；采用水溶并结合超声处理对饲料添加剂中的纽甜进行提取，得到样品处理液，采用与标准溶液测定相同的液相色谱条件对样品处理液进行洗脱，使样品处理液中的各成分能够相互分离开来，在线检测分离液210nm左右处的吸光度值，得到纽甜出峰的峰面积，并根据上述标准曲线进行计算可以得到样品处理液中纽甜的浓度，进一步可结合样品处理液的体积和样品质量计算出样品中纽甜含量，进行精准定量分析。

二、具体测定实施例：

1、试剂：

乙腈：色谱纯；庚烷磺酸钠：色谱纯；三乙胺：色谱纯；水：GB/T6682-2008中一级水；磷酸：分析纯；纽甜标准品。

2、主要仪器设备：

高效液相色谱仪：配紫外检测器；分析天平：感量为0.0001g。

3、色谱条件：

3.1色谱柱：C₁₈色谱柱，250mm(长)×4.6mm(内径)，粒度5μm。

3.2流动相：将3.0g庚烷磺酸钠溶于600mL水中，加入3.8mL三乙胺，用磷酸调pH至3.5，再加入400mL乙腈，用磷酸调整溶液pH至3.7，过滤后备用。

3.3柱温：室温。

3.4流动相流速：1.0mL/min。

3.5进样量：20μL。

3.6检测波长：210nm。

4、分析步骤：

4.1标准储备液配制：

准确称取0.1000g纽甜标准品于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，此溶液纽甜浓度为1.0mg/mL。

4.2标准工作液配制：

分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL储备液至10mL容量瓶中，用水定容至刻度，该系列纽甜浓度依次分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。

4.3标准曲线的绘制：

用液相色谱仪在上述“3、色谱条件”下进行检测，计算出峰的峰面积，以标准溶液的浓度为横坐标，相应峰面积为纵坐标做标准曲线，绘制的标准曲线方程为y＝18503097.0000x+393772.3000，R²＝0.9993，标准曲线图如图1所示。

4.4试样溶液制备：

称取饲料添加剂甜味剂约3.0-5.0g(精密称取)于烧杯中，加入纯水，超声20min，再转移到100mL容量瓶中，加纯水定容至刻度；其中，所述甜味剂与纯水的质量体积比为3～5g：100mL。

4.5试样的检测：

在与4.3相同的液相色谱条件下，对4.4试样溶液中纽甜含量进行检测，得到纽甜出峰的峰面积，并根据上述得到的标准曲线方程计算出试样溶液中的纽甜浓度，根据下述式1计算得到样品中纽甜质量百分含量(X)，单位以％计，每份样品至少重复两次平行试验：

$X=\frac{C\×V\×K}{m\×1000}\×100...\left(1\right)$

式中：

C——试样溶液中纽甜的浓度，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

V——试样溶液体积，单位为毫升(mL)；

K——试样溶液的稀释倍数；

m——称取试样的质量，单位为克(g)。

计算结果表示到小数点后两位；在重复性条件下获得的两次独立平行测定结果取平均值，得到最终检测结果，两次独立平行测定结果的相对标准偏差(RSD)不大于5％。

经计算，本实施例甜味剂中纽甜含量的两次独立平行测定结果分别为0.923％和0.938％，两次独立平行测定结果的相对标准偏差(RSD)不大于5％，平行性好，检测结果稳定；计算两次独立平行测定结果的平均值0.923％+0.938/2＝0.931％，得到本实施例甜味剂中纽甜的质量含量为0.931％。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）配制梯度浓度的纽甜标准溶液；

2）采用液相色谱法对步骤1）配制的纽甜标准溶液进行检测，计算得到纽甜出峰的峰面积，以纽甜标准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；其中，色谱条件为采用C₁₈液相色谱柱，检测波长210nm，流动相为pH3.5~4.0的庚烷磺酸钠、三乙胺和乙腈的混合水溶液，庚烷磺酸钠、三乙胺、乙腈和水的质量体积比为2.6~3.4g：3~4.5mL：300~450mL：500~650mL；

3）将饲料添加剂加入水中，并进行超声处理，得到样品处理液；

4）将步骤3）得到的样品处理液在与步骤2）相同的液相色谱条件下进行检测，计算得到纽甜出峰的峰面积，根据步骤2）建立的标准曲线计算出样品处理液中纽甜的浓度，并结合所述样品处理液的体积和样品重量，计算出所述饲料添加剂中纽甜的含量。

2.根据权利要求1所述饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法，其特征在于，步骤1）中为配制浓度依次为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL的纽甜标准溶液。

3.根据权利要求1所述饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法，其特征在于，所述C₁₈液相色谱柱规格为250mm长×4.6mm内径，填料粒度为5μm。

4.根据权利要求1所述饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法，其特征在于，步骤2）所述流动相配制过程中先将庚烷磺酸钠溶于水中，再加入三乙胺混合均匀，用磷酸调节溶液的pH为3.0~3.5后，加入乙腈并用磷酸调节溶液pH至3.5~4.0，过滤后备用。

5.根据权利要求1所述饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法，其特征在于，液相色谱检测过程中控制柱温为室温，流动相流速为0.8~1.5mL/min，进样量为20~30μL。

6.根据权利要求1所述饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法，其特征在于，步骤3）将饲料添加剂与水按照3~5g：100mL的质量体积比混合，并进行超声处理20~60min，得到样品处理液。

7.根据权利要求1所述饲料添加剂中纽甜含量的高效液相色谱测定方法，其特征在于，所述饲料添加剂为甜味剂。