CN104764825B - 依折麦布关键中间体的对映异构体的分离检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种柱前衍生化高效液相色谱法来分离检测依折麦布关键中间体A及其对映异构体的方法。该方法采用在有机醇溶液中，使用一定浓度的酸性溶液对依折麦布关键中间体A和其对映异构体进行脱去三甲基硅基保护基的反应，反应一定时间后，经简单后处理即得到脱去保护基的衍生化产物。衍生化后的依折麦布关键中间体A及其对映异构体可以采用以手性填料为固定相的高效液相色谱法进行分离检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种依折麦布关键中间体的对映异构体的分离检测方法，属于药物分析领域。
背景技术
依折麦布是由先灵葆雅公司(Schering-Plough Pharmaceuticals)研发上市的选择性肠道胆固醇吸收抑制剂，2002年在美国上市，商品名为Zetia。2011年7月，CFDA批准该品种在国内上市，商品名为益适纯(Ezetrol)。
依折麦布作为第一个上市的选择性肠道胆固醇吸收抑制剂，其作用机制是附着于小肠绒毛刷状缘，有效地抑制胆固醇和植物固醇的吸收，从而降低小肠中的胆固醇向肝脏中的转运，使得肝脏胆固醇贮量减少从而降低血浆胆固醇水平。它不增加胆汁分泌，也不抑制胆固醇在肝脏中的合成。与安慰剂比较，依折麦布可以抑制54％的胆固醇吸收，同时并不影响小肠对甘油三酯、脂肪酸、胆汁酸、孕酮、乙炔雌二醇及脂溶性维生素A、D的吸收。临床上，依折麦布常与他汀类药物联合使用，可以进一步改善血清中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B、总甘油三酯及高密度脂蛋白胆固醇水平，优于两种药物的单独应用。
依折麦布化学名为1-(4-氟苯基)-3(R)-[3-(4-氟苯基)-3(S)-羟丙基]-4(S)-(4-羟苯基)-2-吖丁啶(氮杂环丁烷)酮，是一个具有多手性中心的手性化合物，其化学结构式如下所示：
依折麦布的合成路线和方法已见报道的有很多，其中一条路线的关键合成步骤是采用Evans手性辅助试剂的衍生物和亚胺缩合，得到关键中间体A，再经过关环和脱保护得到依折麦布成品(中国医药工业杂志，2006,37,364～366.)，合成路线如下所示：
由以上合成路线可以看到，依折麦布分子中β内酰胺环上的二个手性中心，是在合成关键中间体A的缩合反应步骤中一次性构建的。因此，该步缩合反应的立体选择性将决定关键中间体A的手性异构体(包括对映异构体和非对映异构体)含量的高低，乃至决定最终产品依折麦布中的对映异构体和非对映异构体含量的高低。在手性药物的研究中，立体异构体的研究是其质量研究中的重点之一，详细请见《手性药物质量控制研究技术指导原则》(国食药监注[2006]639号)。理论上，非对映异构体之间可采用非立体专属性的方法进行分离检测，而对映异构体则需要立体专属性的方法来分离检测。因此，研究开发关键中间体A对映异构体的分离检测方法，对于优化合成工艺、控制关键中间体A中对映异构体的含量尤为重要，进而为控制最终产品依折麦布中对映异构体的含量奠定基础。
目前，在国内外相关文献中未见有关依折麦布关键中间体的分析检测方法的报道。本发明提供了一种准确、稳定可靠、灵敏度高的依折麦布关键中间体A对映异构体的分离检测方法，该方法对于依折麦布的质量研究和控制具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种柱前衍生化高效液相色谱法来分离依折麦布关键中间体A和其对映异构体。该方法准确、稳定可靠，灵敏度高，可很好地分离依折麦布关键中间体A和其对映异构体，可用于依折麦布原料药生产过程中的质量控制。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究，最终获得如下采用柱前衍生化高效液相色谱法的技术方案。
柱前衍生化的方法如下：在有机醇溶液中，使用一定浓度的酸性溶液对依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体进行脱去三甲基硅基(TMS)保护基的反应，反应一定时间后，经简单后处理即得到脱去保护基的衍生化产物。衍生化反应如下所示：
该衍生化方法可以保证依折麦布关键中间体A及其对映异构体得到完全衍生化。衍生化后的依折麦布关键中间体A及其对映异构体可以采用以手性填料为固定相的高效液相色谱法进行分离检测。
本发明所述的衍生化方法中，有机醇可以是甲醇、乙醇、异丙醇。
本发明所述的衍生化方法中，酸溶液可以是硫酸、硝酸、盐酸或醋酸溶液。
本发明所述的衍生化方法中，酸溶液的浓度可以是0.5～5mol/L；当酸溶液的浓度在1～2mol/L时最佳。
本发明所述的衍生化反应中，所使用的酸与依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体总量的摩尔比为2:1～5:1。
本发明所述的衍生化反应中，反应时间为30min～24h，当反应时间在1～5h时最佳。
本发明所述的依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体的柱前衍生化方法，可以按照以下步骤实现：
室温下，在一定量的有机醇溶剂中加入一定量的依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体，振荡，然后加入一定浓度和一定量的酸性溶液，放置在振荡器上振荡一定时间后，加入少量的有机醇溶剂稀释，过滤，再用少量的有机醇溶剂洗涤，取滤饼，在室温下挥发除去溶剂后，即得到依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体的衍生化产物。
衍生化后的依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体可用高效液相色谱法进行分离检测。高效液相色谱法的色谱条件包括采用硅胶表面共价键合有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性固定相为填料的色谱柱，以水-乙腈-四氢呋喃的混合溶剂为流动相。
本发明所述的衍生化后的依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体的分离检测方法，其中所述的色谱柱为采用硅胶表面共价键合有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性固定相为填料的手性色谱柱。
本发明所述的衍生化后的依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体的分离检测方法，其中所述的流动相为水-乙腈-四氢呋喃的混合溶剂，水-乙腈-四氢呋喃的体积比为60～70：27～36：3～4。
本发明所述的衍生化后的依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体的分离检测方法，其中所述的流动相为水-乙腈-四氢呋喃的混合溶剂，水-乙腈-四氢呋喃的体积比为65～68：28.8～31.6：3.2～3.4。
本发明所述的衍生化后的依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体的分离检测方法，其中色谱柱的柱温为25℃～45℃。
本发明所述的衍生化后的依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体的分离检测方法，其中色谱柱的柱温为30℃～35℃。
本发明所述的衍生化后的依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体的分离检测方法，其中流动相的流速为0.6～1.0ml/min。
本发明所述的衍生化后的依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体的分离检测方法，其中流动相的流速为1.0ml/min。
本发明所述的衍生化后的依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体的分离检测方法，其中检测器可以选择紫外吸收检测器、光电二极管阵列检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器或质谱检测器中的一种。
本发明所述的衍生化后的依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体的分离检测方法，其中检测器可以选择紫外吸收检测器或光电二极管阵列检测器，检测波长为230nm。
以上本发明所提供的依折麦布关键中间体A和(或)其对映异构体的衍生化方法和分离检测方法，可以有效地将依折麦布关键中间体A和其对映异构体进行分离和检测，二者的分离度可以达到《中国药典》的要求。该方法准确、稳定可靠、灵敏度高，有助于依折麦布关键中间体A的质量研究和质量控制，为其最终产品依折麦布的质量控制奠定基础，可保证依折麦布的安全性和有效性。
附图说明
图1、实施例3的高效液相色谱图；
图2、实施例4的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下典型实施例用来举例说明本发明，在本领域内的技术人员对本发明所做的简单替换或改进等均属于本发明所保护的技术方案之内。
实施例1：依折麦布关键中间体A衍生化产物的制备
室温下，在1.5ml的EP管中加入0.1mL的异丙醇和10mg的依折麦布关键中间体A，振荡，然后加入1mol/L的硫酸溶液35μl，放置在振荡器上振荡2h，然后加入0.5ml异丙醇稀释样品并转移至滤器内，过滤，用少量异丙醇洗涤EP管和滤器，取滤饼，在室温下挥发除去溶剂后，即得到依折麦布关键中间体A的衍生化产物。
实施例2：依折麦布关键中间体A的对映异构体衍生化产物的制备
室温下，在1.5ml的EP管中加入0.1mL的异丙醇和10mg的依折麦布关键中间体A的对映异构体，振荡，然后加入1mol/L的硫酸溶液35μl，放置在振荡器上振荡2h，然后加入0.5ml异丙醇稀释样品并转移至滤器内，过滤，用少量异丙醇洗涤EP管和滤器，取滤饼，在室温下挥发除去溶剂后，即得到依折麦布关键中间体A的对映异构体的衍生化产物。
实施例3：
仪器与条件：
高效液相色谱仪：安捷伦，1260Bin Pump泵，1260VWD检测器，1260TCC柱温箱，1260ALS自动进样器，ChemStation工作站；
色谱柱：
IC(150mm×4.6mm×5μm)；
流动相：水：乙腈：四氢呋喃＝65：31.6：3.4；
流速：1.0ml/min；
检测波长：230nm；
柱温：30℃；
进样体积：20μl。
实验步骤：取实施例2和3中的衍生化产物等量，混合，用乙腈-水的混合溶剂(乙腈：水＝40：60)溶解并稀释成浓度各约为1mg/ml，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。
图1中保留时间为22.152min的为依折麦布关键中间体A的衍生化产物，保留时间为20.080min的为依折麦布关键中间体A的对映异构体的衍生化产物。在上述条件下依折麦布关键中间体A的衍生化产物和依折麦布关键中间体A的对映异构体的衍生化产物的分离度为1.70，可以满足《中国药典》的相关要求。
实施例4：
仪器与条件：
高效液相色谱仪：安捷伦，1260Bin Pump泵，1260VWD检测器，1260TCC柱温箱，1260ALS自动进样器，ChemStation工作站；
色谱柱：
IC(150mm×4.6mm×5μm)；
流动相：水：乙腈：四氢呋喃＝68：28.8：3.2；
流速：1.0ml/min；
检测波长：230nm；
柱温：35℃；
进样体积：20μl。
实验步骤：取实施例2和3中的衍生化产物等量，混合，用乙腈-水的混合溶剂(乙腈：水＝40：60)溶解并稀释成浓度各约为1mg/ml，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图2。
图2中保留时间为40.197min的为依折麦布关键中间体A的衍生化产物，保留时间为35.820min的为依折麦布关键中间体A的对映异构体的衍生化产物。在上述条件下依折麦布关键中间体A的衍生化产物和依折麦布关键中间体A的对映异构体的衍生化产物的分离度为1.97，可以满足《中国药典》的相关要求。
Claims (9)
1.一种分离检测依折麦布关键中间体A及其对映异构体的方法，其特征在于，在有机醇溶液中，使用一定浓度的酸性溶液对依折麦布关键中间体A和其对映异构体进行脱去三甲基硅基保护基的反应，反应一定时间后，经简单后处理即得到脱去保护基的衍生化产物，衍生化后的依折麦布关键中间体A及其对映异构体采用以手性填料为固定相的高效液相色谱法进行分离检测；
按照以下步骤实现：室温下，在一定量的有机醇溶剂中加入一定量的依折麦布关键中间体A或其对映异构体或二者混合物，振荡，然后加入一定浓度和一定量的酸性溶液，放置在振荡器上振荡一定时间后，加入少量的有机醇溶剂稀释，过滤，再用少量的有机醇溶剂洗涤，取滤饼，在室温下挥发除去溶剂后，即得到依折麦布关键中间体A和其对映异构体的衍生化产物；所使用的酸与依折麦布关键中间体A和其对映异构体总量的摩尔比为2:1～5:1；有机醇是甲醇、乙醇、异丙醇中的一种；酸溶液是硫酸、硝酸、盐酸或醋酸溶液中的一种；酸溶液的浓度为0.5～5mol/L；采用硅胶表面共价键合有纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)手性固定相为填料的手性色谱柱，以水-乙腈-四氢呋喃的混合溶剂为流动相；水-乙腈-四氢呋喃的体积比为60～70：27～36：3～4；检测器选择紫外吸收检测器或光电二极管阵列检测器，检测波长为230nm。
2.根据权利要求1所述的一种分离检测依折麦布关键中间体A及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的酸溶液的浓度为1～2mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种分离检测依折麦布关键中间体A及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的加入一定浓度和一定量的酸性溶液后的震荡时间为30min～24h。
4.根据权利要求1所述的一种分离检测依折麦布关键中间体A及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的加入一定浓度和一定量的酸性溶液后的震荡时间为1～5h。
5.根据权利要求1所述的一种分离检测依折麦布关键中间体A及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的流动相水-乙腈-四氢呋喃的体积比为65～68：28.8～31.6：3.2～3.4。
6.根据权利要求1所述的一种分离检测依折麦布关键中间体A及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱法的色谱条件中的色谱柱的柱温为25℃～45℃。
7.根据权利要求1所述的一种分离检测依折麦布关键中间体A及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱法的色谱条件中的色谱柱的柱温为30℃～35℃。
8.根据权利要求1所述的一种分离检测依折麦布关键中间体A及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱法的色谱条件中的流动相的流速为0.6～1.0ml/min。
9.根据权利要求1所述的一种分离检测依折麦布关键中间体A及其对映异构体的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱法的色谱条件中的流动相的流速为1.0ml/min。
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