JP5664667B2

JP5664667B2 - 質量分析データ解析方法、質量分析データ解析装置、及び質量分析データ解析用プログラム

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Publication number: JP5664667B2
Application number: JP2012552551A
Authority: JP
Inventors: 弘明小澤
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2011-01-11
Filing date: 2011-01-11
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2031-01-11
Also published as: WO2012095948A1; JPWO2012095948A1; US11094399B2; US20130282304A1

Description

本発明は、分析対象試料に由来するプリカーサイオンを1回又は複数回開裂させ、該開裂によって発生したフラグメントイオンを質量分析するMSⁿ分析によって得られたデータを解析するための質量分析データ解析方法に関し、特に或る構造既知の物質に類似した未知物質の構造を推定する方法に関する。

イオントラップ型質量分析装置などを用いた質量分析においてはMS/MS分析という手法が知られている。一般的なMS/MS分析では、まず分析対象物から目的とする特定の質量（厳密には質量電荷比）を有するイオンをプリカーサイオン（親イオン）として選別し、その選別したプリカーサイオンをCID（Collision Induced Dissociation：衝突誘起分解）によって開裂させ、開裂イオンを生成する。開裂様式は元の化合物の構造に依存するため、開裂によって生成したフラグメントイオンを質量分析することによって、目的とするイオンの質量や化学構造に関する情報を取得することができる。

近年、こうした装置で分析しようとする試料はますます分子量が大きくなり、構造（組成）も複雑になる傾向にある。そのため、試料の性質によっては、一段階の開裂操作だけでは十分に小さな質量までイオンが開裂しない場合がある。そうした場合には、開裂の操作を複数回（n-1回）繰り返し、生成したフラグメントイオンを質量分析するMSⁿ分析が行われることもある（例えば特許文献１、２など参照）。なお、上記のような1回の開裂操作によるフラグメントイオンの質量分析はMS²分析である。

このようなMSⁿ分析により得られたデータから未知物質の構造を推定するための解析処理としては、マススペクトルデータベースを用いたいわゆるパターンマッチングという処理が挙げられる。マススペクトルデータベースには、様々な既知物質（既知化合物）についての情報、すなわち、所定のイオン化法を用いて質量分析を行ったときに得られるMSⁿスペクトルのデータの他、化合物名、分子量、組成式、構造式等の情報が含まれている。このような既知物質のMSⁿスペクトルと未知物質のMSⁿスペクトルとを指定された検索条件の下でパターンマッチングすることにより、未知物質の構造を推定することができる。

しかしながら、データベースが厖大であったとしても分析対象の全ての化合物が登録されている訳ではない。特に、薬物や農薬、及びそれらの代謝物等では、化合物の基本骨格が同一であって一部の成分又は置換基を置き換えた（例えばメチル基をエチル基に、塩素を臭素に置換する）ものが多く、これらを全てライブラリに登録しておくことは実際上不可能である。そのため、目的とする未知物質がデータベースに登録されていない場合があり、このような場合には、該未知物質の分子構造を推定することは困難であった。

薬物や農薬、及びそれらの代謝物等では、上記のように、全体的な構造は類似しているが、部分構造が異なるだけのものが数多く存在する。この問題に対して、特許文献３では、既知物質に構造が類似した未知物質の構造推定を容易に行うことができる質量分析データ解析方法を示している。

特許文献３の方法は、未知物質に構造が類似した既知物質に既知の構造変化パターンを適用することで未知物質の構造を推定するものである。この方法では、まず、未知物質のプリカーサイオンの質量からその組成式を推定し、該未知物質に類似する既知物質の構造式と所定の構造変化パターンとを組み合わせることで、該組成式と同じ組成式が得られる構造候補を作成する。そして、作成した構造候補から発生するMSⁿスペクトルのデータを推定し、それを基に構造候補を蓋然性の高い順にランク付けする。次に、未知物質と既知物質のMSⁿスペクトルデータを比較し、両者に共通するフラグメントイオンピークを探索する。ここで、共通するピークが存在する場合には、該ピークに対応する既知物質の部分構造が未知物質にも含まれているものとして、作成した構造候補の中から該部分構造を含むものを絞り込む。

特開平１０−１４２１９６号公報特開２００１−２４９１１４号公報特開２００７−２８７５３１号公報

特許文献３の方法は、解析対象である未知物質がデータベースに登録されていないようなものであっても、データベースに登録された、未知物質に類似する既知物質の情報からその構造を推定することができる。しかしながら、この方法は、構造変化パターンとして登録されていない構造変化を起こした未知物質の構造を推定することができない、という問題がある。例えば薬物代謝物の構造は、代謝前の物質のいずれかの部分構造が脱離した後に別の部分構造が付加されたものと考えられるが、どの部分構造が脱離し、どの部分構造が付加されるかは代謝前の物質によって大きく異なるため、その全てを構造変化パターンとして登録しておくことは困難である。

本発明が解決しようとする課題は、未知物質のMSⁿ分析による結果と該未知物質に類似する既知物質の構造に関する情報とに基づいて未知物質の構造推定を行う質量分析データ解析方法において、該既知物質からの構造変化に対する対応の自由度が高い構造候補を作成することができる質量分析データ解析方法を提供することである。

上記課題を解決するために成された本発明は、
未知物質のMSⁿ分析（n≧2）による結果と該未知物質に類似する既知物質の構造情報とに基づいて該未知物質の構造を推定する質量分析データ解析方法であって、
a) 前記既知物質の構造式から一部の構造を脱離させることによって既知物質の部分構造の候補を作成するステップと、
b) 前記既知物質の部分構造の候補と予め与えられた既知の付加部分構造の候補との組み合わせの中から、組み合わせ後の質量の総和が前記未知物質の質量と一致するものを組み合わせの候補として作成するステップと、
c) 前記組み合わせの候補の各々が採り得る構造を前記未知物質の構造候補として作成するステップと、
を有することを特徴とする。

本発明に係る質量分析データ解析方法は、既知物質からの構造変化を所定の化学反応や代謝反応として捉えるのではなく、脱離と付加として捉えることで、未知の構造変化を引き起こすような反応に対しても対処することができるようにしたものである。

本発明の方法では、予め与えられている既知物質の構造から、それぞれ異なる一部の構造を脱離させることによって、該既知物質の部分構造の候補を網羅的に作成する一方、既知物質の部分構造に付加される部分構造（付加部分構造）の候補については予め与えておく。なお、このように離脱と付加で候補の与え方が異なるのは、離脱する構造は反応前の物質によって大きく異なる一方、付加される構造は限定が可能であるからである。

これにより、様々な脱離と付加の組み合わせを作成することができるため、特許文献３に示される構造変化パターンに囚われない、構造変化に対する対応の自由度がより高い構造候補を作成することができるようになる。そのため、薬物代謝物のような構造変化パターンの多い物質であっても、本発明では構造推定が可能となる。

なお、上記ステップa)はさらに、既知物質のMSⁿスペクトルと未知物質のMSⁿスペクトルに共通するフラグメントイオンピーク及び／又はニュートラルロスを検出するステップと、作成した既知物質の部分構造の候補を、該共通するフラグメントイオンピーク及び／又はニュートラルロスに対応する既知物質の部分構造を含むものに絞り込むステップと、を有していても良い。これにより、明らかに間違った候補を除外することができるため、構造推定に要する処理時間を削減することができるようになる。

また、ステップb)は、未知物質のMSⁿスペクトルから組成式を導出し、部分構造の候補と付加部分構造の候補との組み合わせの中から該組成式が一致するものを組み合わせの候補として作成するものであっても良い（組成式が一致すれば、質量も一致する）。さらに、ステップb)では、既知物質の部分構造の候補及び／又はそれに付加する付加部分構造の候補を、この分野に熟練した分析者が自ら指定することができるようにしても良い。

さらに、ステップc)で作成された構造候補に対して、各々の構造候補から生じるフラグメントイオンピークを推定し、未知物質のフラグメントイオンピークと比較することにより、構造候補を未知物質の構造として蓋然性の高い順にランク付けするステップを設けても良い。またこの際、蓋然性の高さを数値で評価することも望ましい。これにより、分析者はどのような候補が得られ、それらにどの程度の信頼性があるかを容易に把握することができる。

本発明に係る質量分析データ解析方法は、特許文献３に示される構造変化パターンよりも構造変化に対する対応の自由度が高い構造候補を作成することができ、薬物代謝物のような構造変化パターンの多い物質であっても構造推定が可能となる。

本発明に係る質量分析データ解析方法を実施するための装置の一例を示す概略構成図。本発明に係る質量分析データ解析方法の一実施例による未知物質の構造解析の手順を示すフローチャート。既知物質の部分構造の候補に付加部分構造の候補を付加する際の組み合わせの例を示す図。既知物質（代謝前物質）であるネファゾドンの構造式。既知物質（代謝前物質）であるネファゾドンのMS²スペクトル(a)、及び未知物質（代謝後物質）であるネファゾドン酸素代謝物のMS²スペクトル(b)。最終的に残ったネファゾドンの部分構造の候補の構造式。本実施例の質量分析データ解析方法により作成された未知物質の構造候補の構造式。

本発明に係る質量分析データ解析方法を実行する質量分析データ解析装置（以下、単に「データ解析装置」とする）の一実施例について、図面を参照しながら説明する。なお、ここでは、液体クロマトグラフ質量分析装置による分析結果を利用する場合を例にとるが、ガスクロマトグラフ質量分析装置等の他のクロマトグラフ質量分析装置や、試料の直接導入を行う質量分析装置を用いる場合も同様である。

図１は本実施例のデータ解析装置１０の構成を示す図である。データ解析装置１０は、液体クロマトグラフ質量分析装置（LC/MS）２０から送出される検出データを処理するものであり、中央制御部１１、スペクトルデータ作成部１２、解析処理部１３、測定データ記憶部１４、参照データ記憶部１５、及び付加部分構造記憶部１６を備えている。測定データ記憶部１４、参照データ記憶部１５、及び付加部分構造記憶部１６、は中央制御部１１に接続されている。また、中央制御部１１には入力部３０及び表示部４０が接続されている。なお中央制御部１１は、LC/MS２０の各部の動作を制御する機能も兼ね備えている。

上記において、中央制御部１１、スペクトルデータ作成部１２、及び解析処理部１３はコンピュータ・プログラムに従って動作するCPUにより構成することができる。測定データ記憶部１４にはハードディスク（HD）や光磁気ディスク（MO）等の読み出し／書き込み可能な記憶装置が利用できる。参照データ記憶部１５及び付加部分構造記憶部１６にもHD等が利用可能であるが、参照データ記憶部１５及び付加部分構造記憶部１６へのデータの書き込みを行わないような構成とする場合は、CD-ROMのような読出専用の装置を用いてもよい。参照データ記憶部１５には様々な化合物に関するデータ（構造式、組成式、MSⁿスペクトルデータ、及び該MSⁿスペクトルデータ中の各フラグメントイオンピークに対応する部分構造の情報など）が格納されている。また、付加部分構造記憶部１６には、既知物質の部分構造に付加される付加部分構造の候補に関する情報（構造式、組成式、質量、価数など）が格納されている。

なお、図１では、測定データ記憶部１４、参照データ記憶部１５、及び付加部分構造記憶部１６がそれぞれ独立に配置されているが、これらの記憶部は、単一の記憶装置（HD等）を論理的に分割して構成することも可能である。また、入力部３０にはキーボードやマウス等を利用することができ、表示部４０にはCRTやプリンタ等が利用できる。

このようなデータ解析装置１０は、LC/MS専用の制御・解析ユニットとして具現化しても良く、あるいはパーソナルコンピュータ等の汎用コンピュータに本発明の解析方法を実行するためのプログラムをインストールすることにより具現化しても良い。

LC/MS２０は、混合試料を時間的に分離するためのカラムを有する液体クロマトグラフ装置とMSⁿ分析（少なくともMS²分析）が可能な質量分析装置で構成される。このような質量分析装置としては、例えば、三連四重極型の質量分析装置やイオントラップ型の質量分析装置等を用いることができる。クロマトグラフ装置のカラムから溶出される試料成分は質量分析装置によって順次イオン化されてMSⁿ分析に供される。このとき、各試料成分由来のイオンから適当な質量を有するイオンがプリカーサイオンとして自動的に選択され、該プリカーサイオンを開裂させて発生したフラグメントイオンの質量分離・検出が行われる。また、必要に応じてこのようなイオンの選択・開裂・検出を複数回繰り返すこともできる。

試料の測定中は、LC/MS２０からデータ解析装置１０に対し、各質量毎に検出されたイオン数に応じた電流による検出データ（デジタル化された検出信号）が送られる。スペクトルデータ作成部１２は、所定のアルゴリズムに従って該検出データを処理することにより、質量と該質量におけるピーク強度（相対信号強度）とが対となったMSⁿスペクトルデータをMSⁿ分析の各段階において算出し、測定データ記憶部１４に格納する。

以上、LC/MS２０及びデータ解析装置１０の測定時の動作について説明したが、以下では、所定の質量の未知物質に対して得られたMSⁿスペクトルデータと、参照データ記憶部１５に格納された、該未知物質に構造が類似する既知物質のMSⁿスペクトルデータと、を用いた本実施例による構造解析の手順を、図２のフローチャートを参照しながら説明する。
なお、本実施例では、未知物質に構造が類似する既知物質が予め分かっているものとして構造解析を行うが、解析対象の未知物質が例えば薬物代謝物のような代謝や化学変化を起こした後の物質であり、反応前の物質が予め分かっている場合には、この反応前の物質を本実施例の既知物質として用いることができる。また、未知物質のMSⁿスペクトルデータと参照データ記憶部１５に格納された各化合物のMSⁿスペクトルデータとを用いて、多変量解析等により、MSⁿスペクトルデータ間の類似度が高い化合物を本実施例の既知物質として選出しても良い。

未知物質に構造が類似する既知物質に対して、解析処理部１３はまず、参照データ記憶部１５からその構造式を取得し、該構造式の一部を脱離させた部分構造の候補を網羅的に作成する（ステップＳ１）。次に、測定データ記憶部１４と参照データ記憶部１５に格納された未知物質と既知物質のMSⁿスペクトルデータをそれぞれ参照し、これらに共通するフラグメントイオンピーク及び／又はニュートラルロスを検出する（ステップＳ２）。そして、ステップＳ１で作成した既知物質の部分構造の候補を、ステップＳ２で検出されたフラグメントイオンピーク及び／又はニュートラルロスに対応する既知物質の部分構造を含むものに絞り込む（ステップＳ３）。

続いて、未知物質のMSⁿスペクトルデータからその組成式を推定する（ステップＳ４）。一方、ステップＳ３で絞り込んだ既知物質の部分構造の候補の各々に対して、付加部分構造記憶部１６内に格納された付加部分構造の候補を様々な組み合わせで付加し、ステップＳ４で推定した組成式と一致する組み合わせを、組み合わせの候補として作成する（ステップＳ５）。そして、各々の組み合わせの候補が採り得る構造式全てを未知物質の構造候補として作成する（ステップＳ６）。なお図３は、両端に単結合鎖を有する既知物質の部分構造の候補(a)に付加部分構造の候補である水酸基(b)を付加させる場合の例を示したものであるが、この例では、既知物質の部分構造の候補(a)が有する2つの単結合鎖のいずれにおいても水酸基が結合する可能性があるため、この組み合わせの候補が採り得る構造式は2通りになる。このように、ステップＳ６において1つの組み合わせの候補が採り得る構造式は、複数存在することがある。また、それとは逆に、価数が合わない等の理由で1つも存在しないこともある。

次に、ステップＳ６で作成した未知物質の構造候補の各々に対して、MSⁿ分析で検出されると予想されるフラグメントイオンピークを推定し、未知物質のMSⁿスペクトルに存在するフラグメントイオンピークとの一致度を蓋然性の高さとして数値化することで、蓋然性の高い順に構造候補をランク付けし（ステップＳ７）、結果を表示部４０に表示する（ステップＳ８)。

以上、実施例を用いて本発明の質量分析データ解析方法について説明を行ったが、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で種々の変更を行うことができる。

例えば、本発明に係る質量分析データ解析方法は、ステップＳ２、Ｓ３、Ｓ７の処理を省略しても行うことができる。また、ステップＳ４、Ｓ５における組成式による絞り込みは、未知物質の質量と組み合わせ後の質量の総和とが一致するものを絞り込むことによっても行うことができる。

また、図２のフローチャートでは、全てのステップをデータ解析装置１０が自動で行うものとしているが、例えば作成された既知物質の部分構造の候補と予め与えられている付加部分構造の候補の中から熟練者が構造推定に用いる候補を自らの経験により指定できるようにしても良い。このようにすることにより、どの部分構造が残り、どの部分構造が付加されるかが予めある程度分かっている場合には、構造推定に要する処理時間を短縮することができる。

図４〜７に、構造が前もって分かっているネファゾドン酸素代謝物を未知物質、代謝前物質であるネファゾドンを既知物質とし、上記のようにユーザによる候補の指定を行った上で該未知物質の構造を解析した際の実験結果を示す。

図４は既知物質（代謝前物質）であるネファゾドンの構造式、図５(a)は参照データ記憶部１５から参照したネファゾドンのMS²スペクトルのデータ、図５(b)は未知物質（代謝後物質）であるネファゾドン酸素代謝物に対してMS²分析を行うことにより得られたMS²スペクトルのデータ、図６は、図４に示すネファゾドンの構造式から作成した部分構造の候補を、図５の(a)及び(b)から検出された共有ニュートラルロスによって絞り込んだ上でユーザが指定することにより、最終的に残ったネファゾドンの部分構造の候補の構造式、図７は本実施例の質量分析データ解析方法により作成された未知物質の構造候補を評価値順にランク付けして並べたものである。なお、評価値は、部分構造が割り当てられたピークの強度の総和を全ピークの強度の総和で除することにより算出した。

図７に示すように、この実験において作成された未知物質の構造候補の数は10個である。そして、これらの中には確かに推定対象のネファゾドン酸素代謝物の構造式が含まれていた（図７の上段の左から2番目の構造式）。また、全ての処理に要した時間は10.7秒であった。このように、本実施例の質量分析データ解析方法では、薬物代謝物のような構造変化パターンが著しいものの構造解析においても、実用的な処理時間で正しい構造候補を得ることができる。

１０…データ解析装置
１１…中央制御部
１２…スペクトルデータ作成部
１３…解析処理部
１４…測定データ記憶部
１５…参照データ記憶部
１６…付加部分構造記憶部
２０…LC/MS
３０…入力部
４０…表示部

Claims

未知物質のMSⁿ分析（n≧2）による結果と該未知物質に類似する既知物質の構造情報とに基づいて該未知物質の構造を推定する質量分析データ解析方法であって、
a) 前記既知物質の構造式から一部の構造を脱離させることによって既知物質の部分構造の候補を作成するステップと、
b) 前記既知物質の部分構造の候補と予め与えられた既知の付加部分構造の候補との組み合わせの中から、組み合わせ後の質量の総和が前記未知物質の質量と一致するものを組み合わせの候補として作成するステップと、
c) 前記組み合わせの候補の各々が採り得る構造を前記未知物質の構造候補として作成するステップと、
を有することを特徴とする質量分析データ解析方法。
前記ステップa)がさらに、前記既知物質のMSⁿスペクトルと前記未知物質のMSⁿスペクトルに共通するフラグメントイオンピーク及び／又はニュートラルロスを検出するステップと、前記既知物質の部分構造の候補を、該共通するフラグメントイオンピーク及び／又はニュートラルロスに対応する該既知物質の部分構造を含むものに絞り込むステップと、を有することを特徴とする請求項１に記載の質量分析データ解析方法。
前記ステップb)が、前記未知物質のMSⁿスペクトルから組成式を導出し、前記既知物質の部分構造の候補と前記付加部分構造の候補の組み合わせの中から該組成式が一致するものを組み合わせの候補として作成するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の質量分析データ解析方法。
前記ステップb)において使用する前記既知物質の部分構造の候補及び／又は前記付加部分構造の候補を、ユーザが指定できるようにしていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の質量分析データ解析方法。
さらに、前記ステップc)で作成した前記構造候補に対して、該構造候補の各々から生じるフラグメントイオンピークを推定するステップと、推定されたフラグメントイオンピークを前記未知物質のフラグメントイオンピークと比較することにより、該構造候補を該未知物質の構造として蓋然性の高い順にランク付けするステップと、を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の質量分析データ解析方法。
未知物質のMSⁿ分析（n≧2）による結果と該未知物質に類似する既知物質の構造情報とに基づいて該未知物質の構造を推定する質量分析データ解析装置であって、
a) 前記既知物質の構造式のデータが格納された既知物質用記憶手段と、
b) 付加部分構造の候補の構造式のデータが格納された付加部分構造用記憶手段と、
c) 前記既知物質用記憶手段から参照された前記既知物質の構造式を用いて、該既知物質の部分構造の候補を作成する部分構造候補作成手段と、
d) 前記既知物質の部分構造の候補と前記付加部分構造の候補との組み合わせの中から、組み合わせ後の質量の総和が前記未知物質の質量と一致するものを組み合わせの候補として作成する組み合わせ候補作成手段と、
e) 前記組み合わせの候補の各々が採り得る構造を前記未知物質の構造候補として作成する構造候補作成手段と、
を有することを特徴とする質量分析データ解析装置。
前記既知物質用記憶手段がさらに、前記既知物質のMSⁿスペクトルのデータと、該MSⁿスペクトル上のフラグメントイオンピーク及び／又はニュートラルロスに対応する該既知物質の部分構造のデータを有し、
前記部分構造候補作成手段がさらに、前記既知物質のMSⁿスペクトルと前記未知物質のMSⁿスペクトルに共通するフラグメントイオンピーク及び／又はニュートラルロスを検出する検出手段と、前記既知物質の部分構造の候補を、前記共通するフラグメントイオンピーク及び／又はニュートラルロスに対応する該既知物質の部分構造を含むものに絞り込む部分構造候補絞り込み手段と、を有する
ことを特徴とする請求項６に記載の質量分析データ解析装置。
前記組み合わせ候補作成手段が、前記未知物質のMSⁿスペクトルから組成式を導出し、前記既知物質の部分構造の候補と前記付加部分構造の候補の組み合わせの中から、該組成式が一致するものを組み合わせの候補として作成するものであることを特徴とする請求項６又は７に記載の質量分析データ解析装置。
前記組み合わせ候補作成手段がさらに、該組み合わせ候補作成手段において使用する前記既知物質の部分構造の候補及び／又は前記付加部分構造の候補をユーザが指定するための候補指定手段を有することを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の質量分析データ解析装置。
さらに、前記構造候補作成手段が作成した構造候補に対して、該構造候補の各々から生じるフラグメントイオンピークを推定し、推定されたフラグメントイオンピークを前記未知物質のフラグメントイオンピークと比較することにより、蓋然性が高い順に前記構造候補をランク付けするランク付け手段を有することを特徴とする請求項６〜９のいずれかに記載の質量分析データ解析装置。
コンピュータを請求項６〜１０のいずれかに記載の質量分析データ解析装置として動作させるための質量分析データ解析用プログラム。