JP2017198703A - 質量分析によってエストラジオールを検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
程;さらに好ましくは、精製の前に酸性化する工程;好ましくはギ酸を用いて酸性化する工程を含み得る。異なる好ましい実施形態では、この方法は、試験サンプル中に存在し得るタンパク質由来の遊離のエストラジオールに対して十分な量の塩をこの試験サンプルに添加する工程と;好ましくはイオン化の前に添加する工程;さらに好ましくは精製の前に添加する工程;好ましくは硫酸アンモニウムを添加する工程を含み得る。特に好ましい実施形態では、100mMの硫酸アンモニウムを試験サンプルに対して、この試験サンプル中での硫酸アンモニウムの最終濃度が約57mMに添加する。
の乱流を利用するクロマトグラフィーの形態を指す。HTLCは質量分析による分析の前に2つの不特定の薬物を含むサンプルの調製に適用されている。例えば、Zimmer et al.,J.Chromatogr.A 854:23〜35(1999)を参照のこと;また、さらにHTLCを説明している、米国特許第5,968,367号、同第5,919,368号、同第5,795,469号、および同第5,772,874号も参照のこと。当業者は、「乱流」を理解する。液体がゆっくりかつスムーズに流れる場合、その流れは「層流」と呼ばれる。例えば、HPLCカラムを通じて移動する低い流速の流れは層流である。層流では、液体の粒子の動きは、粒子が一般には直線で動くにつれて古くなっている。速い流速では、水の慣性は、液体の摩擦力および乱流の結果を上回る。不規則な境界と接触していない液体は、摩擦によって遅くなるかまたは不均一な表面によって偏向される境界を「追い越す(outruns)」。液体が乱れて流される場合、その液体は渦巻き(eddics)および渦(whirls)(または渦形(vortices))で流れ、ここではその流れが層流である場合よりも「のろのろ進む(drag)」。液体の流れが層流または乱流であるときを決定するのに役立つ多くの参考文献が利用可能である(例えば、Turbulent Flow Analysis:Measurement and Prediction,P.S. Bernard & J.M.
Wallace,John Wiley & Sons,Inc.,(2000);An Introduction to Turbulent Flow,Jean Mathieu & Julian Scott,Cambridge University Press(2001))。
and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry」と題された同第6,107,623号、「DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry」と題された同第6,268,144号、「Surface−Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes」と題された同第6,124,137号、Wright et al.,Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2:264〜76(1999);ならびにMerchantおよびWeinberger,Electrophoresis 21:1164〜67(2000)を参照のこと。
中の気相イオン化は、極性の低い種を分析するためにはESIよりも有効であり得る。
元素が微粒化およびイオン化されるような十分に高い温度で部分的にイオン化されたガスと相互作用する方法を指す。
たイオンを体液サンプル中のエストラジオールの量に対して関連付ける工程。このような好ましい実施形態では、この方法の定量限界は、80pg/mL以下である。他の好ましい実施形態では、エストラジオールは、質量分析の前に誘導体化されない。特定の好ましい実施形態では、この方法は、エストラジオール前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する工程をさらに含んでいてもよく、ここでこの断片イオンの少なくとも1つが145.10±0.5の質量/電荷比を有する。いくつかの好ましい実施形態では、この方法は、体液サンプル中に存在し得るタンパク質由来の遊離エストラジオールに対して十分な量でこの体液サンプルに対して試薬を添加する工程を含み得る。関連の好ましい実施形態では、この方法は、体液サンプルに対して塩試薬を添加する工程;好ましくはイオン化の前に添加する工程;さらに好ましくは精製の前に添加する工程;好ましくは硫酸アンモニウムを添加する工程を含み得る。特に好ましい実施形態では、100mMの硫酸アンモニウムを体液サンプルに対して、その体液サンプル中で約57mMの硫酸アンモニウムという最終濃度に添加する。
5.10±0.5の質量/電荷比を有する。他の好ましい実施形態では、この方法は、試験サンプルに対して塩試薬を添加する工程;好ましくはイオン化の前に添加する工程;さらに好ましくは精製の前に添加する工程;好ましくは硫酸アンモニウムを添加する工程を含んでいてもよい。特に好ましい実施形態では、100mMの硫酸アンモニウムを試験サンプルに対して、この試験サンプル中で約57mMの硫酸アンモニウムという最終濃度に添加する。
ールである。好ましい実施形態では、質量分析計で検出可能な内部エストラジオール標準イオンは、276.15±0.5、260.10±0.5、187.10±0.5、161.10±0.5、147.10±0.5、および135.10±0.5の質量/電荷比を有するイオンからなる群より選択される。特に好ましい実施形態では、内部エストラジオール標準の前駆イオンは、276.15±0.5および260.10±0.5の質量/電荷比を有しているイオンからなる群より選択され;かつ1つ以上の断片イオンは、18
7.10±0.5、161.10±0.5、147.10±0.5、および135.10±0.5の質量/電荷比を有しているイオンからなる群より選択される。
プル中のエストラジオールの存在または量に関連付ける。
女性では、約1.3%のエストラジオールが遊離型で循環され、ここでその残りは性ホルモン結合グロブリン(SHBG)およびアルブミンに結合されている。エストラジオールは、SHBGに対して、高い親和性(約40%)で、またはアルブミンに対して低い親和性で結合する。
組み合わせて用いて、質量分析の前にエストラジオールを精製してもよい。このような実施形態では、サンプルは、分析物を捕獲するHTLC抽出カートリッジを用いて抽出してもよく、次いでイオン化の前に第二のHTLCカラム上で、または分析的HPLCカラム上に溶出およびクロマトグラフィーされてもよい。これらのクロマトグラフィー手順を含む工程は、自動的な形式で連結することが可能であるので、分析物の精製の間の操作者の関与についての要件を最小限にすることができる。この特徴によって、時間および費用の節約をもたらし、かつ操作者の過ちの機会を排除することができる。
る。
ム、例えばMSシステムに接続する。従って、操作者は、オートサンプラーにサンプルのトレイを置いてもよく、残りの操作はコンピューター制御下で行い、選択された全てのサンプルの精製および分析を行う。
種々の実施形態では、試験サンプル中に存在するエストラジオールを、当業者に公知の任意の方法によってイオン化することができる。質量分析は、質量分析計を用いて行い、質量分析計には、さらなる分析のために断片化されたサンプルをイオン化し、荷電された分子を生成するためのイオン源を備える。例えば、サンプルのイオン化は、電子イオン化、化学的イオン化、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、光子イオン化、大気圧化学イオン化(APCI)、光イオン化、大気圧光イオン化(APPI)、高速原子衝撃(FAB)、液体二次イオン化(LSI)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)、フィールド・イオン化、フィールド・デソープション、熱スプレー/プラズマスプレーイオン化、表面増強レーザー脱離イオン化(SELDI)、誘導結合プラズマ(ICP)および粒子ビームイオン化によって行ってもよい。当業者は、イオン化方法の選択は、測定されるべき分析物、サンプルの種類、検出器の種類、正対負のモードの選択などに基づいて決定できることを理解するであろう。
化されて1つ以上の断片イオン(娘イオンまたは生成物イオンとも呼ばれる)を生じ、次にこれが第二のMS手順で分析される。前駆イオンの注意深い選択によって、特定の分析物によって生成されるイオンのみが断片化チャンバに渡され、ここで不活性ガスの原子と衝突して娘イオンを生じる。前駆イオンおよび断片イオンの両方が所定のセットのイオン化/断片化条件下で再現性の方式で産生されるので、MS/MS技術は、極めて強力な分析ツールをもたらすことができる。例えば、濾過/断片化の組み合わせを用いることによって妨害物質を排除することが可能で、特に、生体サンプルなどの複雑なサンプルでは有用であり得る。
の分子の量に対して関連付けるための多数の他の方法が当業者に周知である。
の過程は衝突活性化解離(CAD)と呼ばれる。生成された断片イオンは、四重極3(Q3)に通過し、ここでエストラジオールの断片イオンが選択されるが、他のイオンは排除される。
ルの1つ以上のイオンのピークに基づいた較正標準曲線を用いて、元の分析物、例えば、エストラジオールの絶対量に変換してもよい。
血液は、添加物なしでVacutainer中に収集して、室温、18〜25℃で30分間凝固させた。全体的な溶血および/または脂肪血症を呈したサンプルは除外した。
を調製し、A標準についてはメタノールで、B標準については剥離血清で希釈した。
913−1000または等価物)を用いて、1mg/mLのd5−エストラジオールスト
ック標準(2,4,16,16,17−d5エストラジオール)を調製し、これを用いて
1,000,000pg/mLの中間体ストック標準を重水素化メタノールで調製した。このd5−エストラジオール中間体ストック標準を用いて、DI水中で5000pg/m
Lの作業用d5−エストラジオール内部標準を調製した。1mLのd5−エストラジオール中間ストック標準を、200mLのメスフラスコでDI水を用いてその容積に希釈した。
液体クロマトグラフィー(LC)サンプルは、200μLの標準、コントロール、または患者サンプルを96−ウェルのプレートにピペッティングすることによって準備した。正のイオンモードでの試行の場合、300μLの20%ギ酸を、各々のウェルに約11%(V/V)の最終濃度で送達した。負のイオンモードで試行する場合、300μLの100mMの硫酸アンモニウム溶液を各々のウェルに対して、約57mMの硫酸アンモニウムの最終濃度で添加した。さらに、25μLの5000pg/mLのd5−エストラジオー
ル標準を各々のウェルに添加した。このサンプルをLCの前に30〜45分間室温でインキュベートした。
る他の分析物からエストラジオールを分離した。移動相Aは超純水(HPLC等級)であって、移動相Bは100%メタノールであった。HPLC勾配は、40%の有機勾配で開始し、これは約5.33分で100%まで傾斜した。分析物は、77%メタノール勾配でHPLCカラムを溶出した。次に、分離されたサンプルをエストラジオールの定量のためにMS/MSに供した。
MS/MSは、Finnigan TSQ Quantum Ultra MS/MSシステム(Thermo Electron Corporation)を用いて行った。全てがThermo Electronからの以下のソフトウェアプログラムを、本明細書に記載の実施例に用いた:Tune Master V1.2または、それより新しいもの、Xcalibur V2.0 SR1、またはそれより新しいもの、TSQ Quantum 1.4またはそれより新しいもの、LCQuan V2.0またはそれより新しいもの、およびXReport 1.0またはそれより新しいもの。分析HPLCカラムを出ていく液体の溶媒/分析物は、Thermo Finnigan MS/MSアナライザーの加熱されたネブライザー界面に流れた。その溶媒/分析物混合物を、界面の加熱配管中で蒸気に変換した。噴霧された溶媒中の分析物を、界面のコロナ放電針によってイオン化し、これによって噴霧された溶媒/分析物混合物に電圧を印加する。
3つの品質管理(QC)プールをチャコール剥離血清から調製して、10、200および800pg/mLの濃度までエストラジオールでスパイクした。
エストラジオールのゼロ標準を、10個の複製で行って、測定された値の方がそれにともなう不確実度よりも大きいポイントである、アッセイの検出限界を決めた。LODは、ゼロ濃度からの2標準偏差(SD)として適宜決定した。ゼロ標準についての得られたピーク面積比を統計学的に分析し、ここでは0.021の平均値および0.006のSDであった。エストラジオールのアッセイのLODは2.0pg/mLであった。
アッセイ中のエストラジオール検出の直線性を確立するため、ゼロ標準に割り当てた1つのブランク、および11個のスパイクした血清標準を調製して、5つの別の日に分析した。5つの連続試行からの二次回帰で0.995以上という相関係数が得られ、ここでは±20%の精度で2〜2000pg/mLという定量可能な線形範囲が明らかになった。
マトリックス特異性は、水、剥離血清およびプールした血清を用いて評価して、患者サンプルが線形の方式で希釈できるか否かを決定した。このサンプルは、較正実施後に二連で行った。正確性は以下のとおりであった:
スパイクされたサンプルからエストラジオールを回収する能力を決定するために、濃度が既知の2例の患者サンプルを、3レベル(低、中、高)のエストラジオールでスパイクした。回収はスパイクされた量を予想濃度で割ることによって算出した。平均回収はそれぞれ低、中および高レベルで92%、108%および98%であった。
の対象を取り除く。
Claims (33)
- 試験サンプル中のエストラジオールの量を決定するための方法であって:
(a)前記試験サンプルから液体クロマトグラフィーによってエストラジオールを精製する工程;
(b)前記試験サンプルから精製された前記エストラジオールをイオン化して、タンデム型質量分析によって検出可能な1つ以上のイオンを生成する工程、ここで該1つ以上のイオンは271.14±0.5の質量/電荷比を有するイオンを含む;及び
(c)前記エストラジオールイオン(単数または複数)の量をタンデム型質量分析によって検出し、ここで前記エストラジオールイオン(単数または複数)の量が前記試験サンプル中のエストラジオールの量に対して関連付けられる工程、
を含み、
定量限界が25pg/mL以下であり、かつエストラジオールが質量分析の前に誘導体化されない、方法。 - 前記液体クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)である、請求項1に記載の方法。
- 前記精製工程がさらに、高乱流液体クロマトグラフィー(HTLC)、続いて高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記エストラジオールイオンが、183.10±0.5及び145.10±0.5の質量/電荷比を有するイオンからなる群より選択される1つ以上のイオンをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記イオン化が、271.14±0.5の質量/電荷比を有する前駆イオンを生成する工程と、183.10±0.5及び145.10±0.5の質量/電荷比を有するイオンからなる群より選択される1つ以上の断片イオンを生成する工程とを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記イオン化工程の前に、前記試験サンプルに存在し得るタンパク質からエストラジオールを遊離させるために十分な量で試薬が前記試験サンプルに添加される、請求項1に記載の方法。
- 前記試薬が、前記試験サンプルを酸性にするのに十分な量で添加される、請求項6に記載の方法。
- 前記試薬がギ酸である、請求項7に記載の方法。
- 前記試薬が塩である、請求項6に記載の方法。
- 前記塩が硫酸アンモニウムである、請求項9に記載の方法。
- 前記試験サンプル中に存在するグルクロン酸化エストラジオール及び非グルクロン酸化エストラジオールの両方が検出及び測定される、請求項1に記載の方法。
- 前記試験サンプルが体液である、請求項1に記載の方法。
- 体液サンプル中のエストラジオールの量をタンデム型質量分析によって決定するための方法であって:
(a)前記体液サンプルから液体クロマトグラフィーによってエストラジオールを精製する工程;
(b)271.14±0.5の質量/電荷比を有している前記エストラジオールの前駆イオンを生成する工程;
(c)前記前駆イオンの1つ以上の断片イオンを生成する工程であって、前記1つ以上の断片イオンの少なくとも1つが、183.10±0.5の質量/電荷比を有するイオンフラグメントを含む工程;及び
(d)工程(b)もしくは(c)またはその両方で生成される前記イオンの1つ以上の量を検出する工程、及び前記検出されたイオンを前記体液サンプル中の前記エストラジオールの量に対して関連付ける工程、
を含む方法。 - 定量限界が25pg/mL以下である、請求項13に記載の方法。
- 前記エストラジオールが質量分析の前に誘導体化されない、請求項13に記載の方法。
- 前記液体クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)である、請求項13に記載の方法。
- 前記精製工程がさらに、高乱流液体クロマトグラフィー(HTLC)、続いて高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記前駆イオンが271.14±0.5の質量/電荷比を有し、前記1つ以上の断片イオンが、145.10±0.5の質量/電荷比を有する断片イオンを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記イオン化工程の前に、前記体液サンプルに存在し得るタンパク質からエストラジオールを遊離させるために十分な量で試薬が前記体液サンプルに添加される、請求項13に記載の方法。
- 前記試薬が塩である、請求項19に記載の方法。
- 前記塩が硫酸アンモニウムである、請求項20に記載の方法。
- 前記体液サンプル中に存在するグルクロン酸化エストラジオール及び非グルクロン酸化エストラジオールの両方が検出及び測定される、請求項13に記載の方法。
- 試験サンプル中のエストラジオールの量を決定するための方法であって:
(a)前記試験サンプルに存在し得るタンパク質からエストラジオールを遊離させるために十分な量で試薬を前記試験サンプルに添加する工程;
(b)前記試験サンプルから液体クロマトグラフィーによってエストラジオールを精製する工程と;
(c)前記試験サンプルから精製されたエストラジオールをイオン化して、タンデム型質量分析によって検出可能な1つ以上のイオンを生成する工程、ここで該1つ以上のイオンは271.14±0.5の質量/電荷比を有するイオンを含む;及び
(d)前記エストラジオールイオン(単数または複数)の量をタンデム型質量分析によって負のイオンモードで検出し、ここで前記エストラジオールイオン(単数または複数)の量が前記試験サンプル中のエストラジオールの量に対して関連付けられる工程、
を含む方法。 - 定量限界が25pg/mL以下である、請求項23に記載の方法。
- 前記エストラジオールが質量分析の前に誘導体化されない、請求項23に記載の方法。
- 前記液体クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィー(HPLC)である、請求項23に記載の方法。
- 前記精製工程がさらに、高乱流液体クロマトグラフィー(HTLC)、続いて高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記試薬が塩である、請求項23に記載の方法。
- 前記塩が硫酸アンモニウムである、請求項28に記載の方法。
- 前記エストラジオールイオンが、183.10±0.5及び145.10±0.5の質量/電荷比を有するイオンからなる群より選択される1つ以上のイオンを含む、請求項23に記載の方法。
- 前記イオン化が、271.14±0.5の質量/電荷比を有する前駆イオンを生成する工程と、183.10±0.5及び145.10±0.5の質量/電荷比を有するイオンからなる群より選択される1つ以上の断片イオンを生成する工程とを含む、請求項23に記載の方法。
- 前記試験サンプル中に存在するグルクロン酸化エストラジオール及び非グルクロン酸化エストラジオールの両方が検出及び測定される、請求項23に記載の方法。
- 前記試験サンプルが体液である、請求項23に記載の方法。
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