CN113671093A

CN113671093A - 快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法

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Publication number: CN113671093A
Application number: CN202010400289.1A
Authority: CN
Inventors: 张昱; 王思齐; 杨佳宾; 胡建成
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2020-05-13
Filing date: 2020-05-13
Publication date: 2021-11-19

Abstract

本发明公开了一种快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，能快速、精确进行人体尿液中有机污染物痕量检测，利用液液萃取结合高效液相色谱—质谱技术，能够高效、快速的同时检测尿液中5种对羟基苯甲酸类物质。该方法步骤如下：将尿样解冻，并加入内标物；然后使用液液取提取、净化样品中的对羟基苯甲酸类物质；再通过高效液相色谱—质谱仪检测尿液中目标物的含量。本发明样品预处理成本低，利用实验室常见的耗材就能完成，能在各类前处理实验室完成。此方法检测速度快，自动化程度高，响应灵敏，便于产业化应用，是一种简便、快捷、准确的定性定量检测方法，适于推广应用。

Description

快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法

技术领域

本发明涉及一种防腐剂物质的检测方法，特别是涉及一种尿液中防腐剂物质对羟基苯类化合物的检测方法，应用于人体尿液中有机污染物痕量检测领域。

背景技术

对羟基苯甲酸酯类防腐剂，是一种广泛应用，具有典型内分泌干扰物特性的有机化合物。作为防腐剂，和其他种类防腐剂相比具有无气味、用量少、成本低、安全性好等优点，因此被广泛应用于化妆品、食品和药物中作为防腐剂、防霉剂和杀菌剂等。常用的对羟基苯甲酸酯主要包括以下几种：对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、苄酯和庚酯等。该类物质具有潜在的内分泌干扰特性，其作为新兴污染物的安全性得到人们的广泛关注，直接导致了某些国家和跨国组织对其作为商业产品的生产监管。

人体尿液组成成分十分复杂，并且对检测仪器干扰较大，因此需要对尿样样品进行预处理。液液萃取串联高效液相色谱质谱方法具有快速、灵敏及分离度较高的优势，目前已成为有机物预处理和分析的重要方法之一。现有的微波萃取、固相萃取柱在检测尿液样本中的有机物时，存在着杂质不能有效去除、基质干扰大、检测种类有限和回收率低等一系列问题。如何快速、准确、高效检测尿液中防腐剂物质对羟基苯类化合物成为亟待了解决的技术问题。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，通过对人体尿液的进行预处理，以改善现有处理方法的过程复杂，且成本较高的技术问题。同时，本发明检测对羟基苯甲酸酯类物质采用高效液相色谱质谱联用的检测方法，该检测方法能够同时检测5种对羟基苯甲酸类物质，包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯和1种人体代谢物对羟基苯甲酸，检测过程快速、高效、低成本、高度自动化且便于推广应用。

为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，包括以下步骤：

a.样品的预处理：

在尿液样本中加入内标物混匀，得到预处理样品；

b.使用液液萃取柱进行富集净化处理：

具体流程为：对在所述步骤a中制备的预处理样品进行多次萃取，用乙酸乙酯作为萃取剂，每次萃取向样品中加入至少4mL乙酸乙酯，混合物在涡旋混合器中振荡至少30分钟，然后在不低于3000g下离心至少5分钟，进行萃取分离，并重复萃取分离至少两次；每次提取的上清液转移到一个干净的聚丙烯(PP)管中，最后在氮气气氛条件下将上清液蒸发到接近干燥状态，再加入1mL甲醇，通过0.22mm尼龙滤网过滤进入小瓶，放入到高效液相色谱瓶中用于检测，备用；

c.利用高效液相色谱—质谱联用仪测定样品中目标物的含量：

建立目标污染物的标准曲线，以浓度为纵坐标，以峰面积为横坐标；

采用内标法，在高效液相色谱—质谱联用仪上，定量检测尿样中提取到的目标物的浓度。本发明使用的尿液处理方法能够用于快速处理尿液样品，得到适合高效液相色谱质谱仪检测的样品，处理成本低，效率高，检测方法的准确度和精确度均较高。

作为本发明优选的技术方案，内标物采用对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、d₄-MeP和¹³C₆-p-HB中的任意一种或者任意多种标准品试剂，每种标准品试剂各10ng。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤a中，将不多于0.5mL的尿液与100μL/1M乙酸铵混合，并向尿液样本中加入内标物，在不高于37℃恒温振荡至少12小时混匀，得到预处理样品。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤a中，将不多于0.5mL的尿液与100μL/1M乙酸铵、30单位β-葡萄糖醛酸酶混合，并向尿液样本中加入内标物，在不高于37℃恒温振荡至少12小时混匀，得到预处理样品。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤b中，对在所述步骤a中制备的预处理样品进行3次萃取。

作为本发明优选的技术方案，在所述步骤c中，高效液相色谱—质谱仪的检测条件为：

柱温40℃，进样体积为10μL，流速为0.3mL/min；

流动相采用HPLC级甲醇(A)和含0.1％甲酸的超纯水(B)；

梯度(％wt.A)如下：0min，10％；4min，50％；8min，95％；12min，95％；

干燥气体流量：5L/min，干燥气体温度：300℃，鞘气体温度：300℃，鞘层气体流量：11L/min，雾化器压力：60psi，喷嘴电压500V，毛细管电压：4500V。

作为本发明优选的技术方案，对羟基苯甲酸类物质为对羟基苯甲酸脂类和对羟基苯甲酸。

作为本发明优选的技术方案，对羟基苯甲酸类物质为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，以及1种人体代谢物对羟基苯甲酸。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1.本发明使用液液萃取串联高效液相色谱质谱技术，具有的稳定性高、重复性好、结果准确的优势；

2.本发明方法从方法学验证角度结果显示，利用本发明方法检测尿液中对羟基苯甲酸酯物质的标准曲线线性相关程度良好，R²均大于0.999；回收率在91.14-98.26％之间；定量限范围在0.01-0.19ng/mL之间；

3.本发明方法日内精密度和日间精密度均满足要求，相对标准偏差(RSDs)分别小于9.8％。方法精密度较好，重复性高，结果准确灵敏、可靠，适用范围广。

附图说明

图1为本发明实施例二方法的对羟基苯甲酸酯色谱图。

图2为本发明实施例二方法的对羟基苯甲酸酯标准曲线图。

具体实施方式

以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：

实施例一：

在本实施例中，一种快速检测样品中对羟基苯甲酸类物质的方法，采用内标法检验实验室超纯水样本中对羟基苯甲酸酯物质的回收率，包括以下步骤：

a.样品的预处理：

接取6份超纯水样，将0.5mL的超纯水与100μL/1M乙酸铵混合，并向样本中加入内标物，内标物采用对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、d₄-MeP和¹³C₆-p-HB多种标准品试剂，每种标准品试剂各10ng，在37℃恒温振荡12小时混匀，得到预处理样品；

b.使用液液萃取柱进行富集净化处理：

具体流程为：对在所述步骤a中制备的预处理样品进行多次萃取，用乙酸乙酯作为萃取剂，每次萃取向样品中加入4mL乙酸乙酯，混合物在涡旋混合器中振荡30分钟，然后在3000g下离心5分钟，进行萃取分离，并重复萃取分离3次；每次提取的上清液转移到一个干净的聚丙烯(PP)管中，最后在氮气气氛条件下将上清液蒸发到接近干燥状态，再加入1mL甲醇，通过0.22mm尼龙滤网过滤进入小瓶，放入到高效液相色谱瓶中用于检测，备用；

建立目标污染物的标准曲线，以浓度为纵坐标，以峰面积为横坐标；采用内标法，在高效液相色谱—质谱联用仪上，定量检测样品中提取到的目标物的浓度；高效液相色谱—质谱仪的检测条件为：

柱温40℃，进样体积为10μL，流速为0.3mL/min；

流动相采用HPLC级甲醇(A)和含0.1％甲酸的超纯水(B)；

实验测试分析：

本实施例快速检测样品中对羟基苯甲酸类物质的方法，采用液液萃取结合高效液相色谱质谱联用方法。本实施例所述对羟基苯甲酸类物质为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸。计算加标回收率。加标回收率的计算公式为：RE％＝(C₂V₂-C₁V₁)/C₀V₀；

其中：RE：加标回收率，％；C₀：混合标准液的浓度，ng/mL；V₀：混合标准液的体积，mL；C₁：空白样品的检测浓度，ng/mL；V₁：空白样品定容时的体积，mL；C₂：加入混合标准液的样品的检测浓度ng/mL；V₂:加入混合标准液的样品定容时的体积，mL。

本实施例实测结果：5种物质加标回收率为67.57—101.91％，本方法检测准确性较好。通过加标回收率实验可以对检验结果进行校正，排除人为操作误差，降低基质干扰效应。

实施例二：

本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，采用内标法实际样品中对羟基苯甲酸酯浓度的测定，随机收集6份人体晨尿，使用本发明步骤a中液液萃取方法进行净化与富集，之后采用本发明步骤b中高效液相色谱—质谱的方法对样品中目标物的实际浓度进行分析检测，包括以下步骤：

a.样品的预处理：

接取6份超纯水样，将0.5mL的尿液与100μL/1M乙酸铵、30单位β-葡萄糖醛酸酶混合，并向尿液样本中加入内标物，内标物采用对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、d₄-MeP和¹³C₆-p-HB多种标准品试剂，每种标准品试剂各10ng，在37℃恒温振荡12小时混匀，得到预处理样品；

b.使用液液萃取柱进行富集净化处理：

建立目标污染物的标准曲线，以浓度为纵坐标，以峰面积为横坐标；采用内标法，在高效液相色谱—质谱联用仪上，定量检测尿样中提取到的目标物的浓度；高效液相色谱—质谱仪的检测条件为：

柱温40℃，进样体积为10μL，流速为0.3mL/min；

流动相采用HPLC级甲醇(A)和含0.1％甲酸的超纯水(B)；

实验测试分析：

本实施例检测得到6份尿液中的对羟基苯甲酸酯物质浓度如下表1所示，内标校正结果如表2。实验结果说明本方法可以应用于人体尿液中对羟基苯甲酸酯的测定。

表1.五种对羟基苯甲酸酯的浓度检测结果

超纯水

1

2

3

4

5

6

回收率

对羟基苯甲酸丁酯

107.23％

97.36％

97.91％

109.92％

93.86％

105.19％

101.91％

对羟基苯甲酸丙酯

91.30％

80.56％

78.23％

99.50％

93.47％

70.63％

85.61％

对羟基苯甲酸乙酯

87.86％

77.13％

75.40％

87.80％

84.39％

67.80％

80.06％

对羟基苯甲酸甲酯

95.40％

80.38％

84.56％

97.08％

91.99％

102.87％

92.04％

对羟基苯甲酸

47.91％

44.01％

58.69％

76.75％

84.48％

93.59％

67.57％

晨尿

1

2

3

4

5

6

回收率

对羟基苯甲酸丁酯

93.92％

69.28％

84.06％

114.46％

84.92％

94.00％

90.11％

对羟基苯甲酸丙酯

98.22％

87.88％

96.30％

104.77％

85.06％

77.93％

91.69％

对羟基苯甲酸乙酯

108.98％

88.68％

89.18％

121.77％

86.10％

75.92％

95.10％

对羟基苯甲酸甲酯

102.47％

86.20％

96.63％

106.36％

99.63％

87.72％

96.50％

对羟基苯甲酸

65.23％

58.17％

53.12％

79.27％

41.70％

50.03％

57.92％

表2.五种对羟基苯甲酸酯的浓度校正结果

本实施例快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，采用液液萃取结合高效液相色谱质谱联用方法。本实施例所述对羟基苯甲酸类物质为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，以及1种人体代谢物对羟基苯甲酸。图1为本实施例方法的对羟基苯甲酸酯色谱图，可见响应值良好。本实施例高效液相色谱—质谱仪型号为安捷伦1260型液相色谱仪，色谱柱为Poroshell120EC-C18反相柱(3×100mm，2.7μm，安捷伦)。图2为本实施例方法的对羟基苯甲酸酯标准曲线图，可见相关性系数为R²均大于0.999。利用本实施例方法检测尿液中对羟基苯甲酸酯物质的标准曲线线性相关程度良好，回收率在91.14-98.26％之间；定量限范围在0.01-0.19ng/mL之间。本实施例方法日内精密度和日间精密度均满足要求，相对标准偏差(RSDs)分别小于9.8％。方法精密度较好，重复性高，结果准确灵敏、可靠，适用范围广。

本实施例快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，能进行人体尿液中有机污染物痕量检测，对防腐剂物质对羟基苯甲酸酯进行精确和快速检测，利用液液萃取结合高效液相色谱—质谱联用方法，能够高效、快速的同时检测尿液中4种对羟基苯甲酸酯，包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，以及1种人体代谢物对羟基苯甲酸。本实施例方法使用的尿液处理方法能够用于快速处理尿液样品，得到适合高效液相色谱质谱仪检测的样品，处理成本低，效率高，检测方法的准确度和精确度均较高。

综上所述，本发明快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，能快速、精确进行人体尿液中有机污染物痕量检测，适合用于防腐药物对羟基苯甲酸酯物质的检测，利用液液萃取结合高效液相色谱—质谱技术，能够高效、快速的同时检测尿液中5种对羟基苯甲酸酯，包括对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、对羟基苯甲酸。该方法包括以下步骤：将尿样解冻，并加入内标物；然后使用液液取提取、净化样品中的5种对羟基苯甲酸酯；再通过高效液相色谱—质谱仪检测尿液中目标物的含量。本发明对尿样的处理步骤简单，操作方便，稳定性好，能够快速得到适于液质联用仪检测的样品；样品预处理成本低，利用实验室常见的耗材就能完成，能在各类前处理实验室完成。此方法能够同时对5种对羟基苯甲酸酯进行快速高效地检测，检测速度快，自动化程度高，响应灵敏，回收率能达到91.14-98.26％之间，便于产业化应用，是一种简便、快捷、准确的定性定量检测方法，适于推广应用。

实施例三：

本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：

a.样品的预处理：

接取6份超纯水样，将0.5mL的尿液与100μL/1M乙酸铵混合，并向尿液样本中加入内标物，内标物采用对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、d₄-MeP和¹³C₆-p-HB多种标准品试剂，每种标准品试剂各10ng，在37℃恒温振荡12小时混匀，得到预处理样品；

b.使用液液萃取柱进行富集净化处理：

柱温40℃，进样体积为10μL，流速为0.3mL/min；

流动相采用HPLC级甲醇(A)和含0.1％甲酸的超纯水(B)；

实验测试分析：

本实施例与实施例二的不同之处在于，在所述步骤a中进行样品的预处理时，将0.5mL的尿液与100μL/1M乙酸铵混合，没有采用β-葡萄糖醛酸酶。本实施例任然通过采用乙酸铵，对人体尿液的进行预处理，以此改善现有处理方法的过程复杂，且成本较高的技术问题。本实施例快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，能进行人体尿液中有机污染物痕量检测，对防腐剂物质对羟基苯甲酸酯进行精确和快速检测，利用液液萃取结合高效液相色谱—质谱联用方法，能够高效、快速的同时检测尿液中4种对羟基苯甲酸酯，包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，以及1种人体代谢物对羟基苯甲酸。本实施例方法使用的尿液处理方法能够用于快速处理尿液样品，得到适合高效液相色谱质谱仪检测的样品，处理成本低，效率高，检测方法的准确度和精确度均较高。

上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.样品的预处理：

在尿液样本中加入内标物混匀，得到预处理样品；

b.使用液液萃取柱进行富集净化处理：

采用内标法，在高效液相色谱—质谱联用仪上，定量检测尿样中提取到的目标物的浓度。

2.根据权利要求1所述快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，其特征在于：内标物采用对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯、d₄-MeP和¹³C₆-p-HB中的任意一种或者任意多种标准品试剂，每种标准品试剂各10ng。

3.根据权利要求1所述快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，其特征在于：在所述步骤a中，将不多于0.5mL的尿液与100μL/1M乙酸铵混合，并向尿液样本中加入内标物，在不高于37℃恒温振荡至少12小时混匀，得到预处理样品。

4.根据权利要求1所述快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，其特征在于：在所述步骤a中，将不多于0.5mL的尿液与100μL/1M乙酸铵、30单位β-葡萄糖醛酸酶混合，并向尿液样本中加入内标物，在不高于37℃恒温振荡至少12小时混匀，得到预处理样品。

5.根据权利要求1所述快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，其特征在于：在所述步骤b中，对在所述步骤a中制备的预处理样品进行3次萃取。

6.根据权利要求1所述快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，其特征在于：在所述步骤c中，高效液相色谱—质谱仪的检测条件为：

柱温40℃，进样体积为10μL，流速为0.3mL/min；

流动相采用HPLC级甲醇(A)和含0.1％甲酸的超纯水(B)；

7.根据权利要求1所述快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，其特征在于：所述对羟基苯甲酸类物质为对羟基苯甲酸脂类和对羟基苯甲酸。

8.根据权利要求7所述快速检测人体尿液中对羟基苯甲酸类物质的方法，其特征在于：所述对羟基苯甲酸类物质为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，以及1种人体代谢物对羟基苯甲酸。