CN108760954A - 一种检测畜禽粪便样本中多种真菌毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测畜禽粪便样本中多种真菌毒素的方法，将样本经β‑葡萄糖醛酸酶酶解之后，经乙腈/水溶液（84/16，v/v,含10%NaCl）超声提取、离心、浓缩、复溶后直接在TQS三重四级杆液相色谱串联质谱仪中以甲醇和5 mmol/L醋酸铵的水溶液（含0.1%甲酸）作为流动相进行梯度洗脱分析，15种真菌毒素能够达到有效分离。本发明的方法没有复杂的衍生净化步骤，具有简便快捷、经济高效的特点，能够同时快速地检测样本中多种真菌毒素，可有效检测样本中的真菌毒素残留量。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，具体地，涉及一种用于检测畜禽粪便样本中多种真菌毒素的方法。
背景技术
真菌毒素，是一类由霉菌在生长过程中产生的有毒次级代谢产物，对人和动物都有极大的危害。目前报道的真菌毒素已有400多种，在自然界中广泛存在于各类粮食谷物及其他食品当中，导致大量的饲料原料、饲料或食品被其污染，其中常被用作食品、饲料或者饲料原料的玉米、大豆、麸糠等尤其容易发生霉变进而被其产生的真菌毒素污染。动物食品因其独特的口感和富含营养物质而广受人们的喜爱，当这些被污染的原料被不良商家用饲料或被加工成饲料后喂养动物，会通过对其机体内遗传物质、蛋白质和各种酶类物质的合成进行抑制以及破坏细胞结构等作用途径引起机体的急性或亚急性中毒，同时也会导致毒素在机体内的残留。一旦这些污染的谷物或动物食品被人们食用，会严重危害人类的健康。
目前，关于霉菌毒素的检测方法已有诸多研究报道，如：薄层色谱法(TLC)，但其灵敏度差，不能满足当前高要求的痕量分析；免疫分析法(ELISA)虽然灵敏度高、特异性强，但其存在较多干扰因素而易造成假阳性，多用于样本初筛或快速检测，不能作为准确定量分析方法；气相色谱法(GC)、气相色谱串联质谱法(GC-MS/MS)虽然检出限低、重现性好，但其样本分析前还需衍生化，检测速度较慢，对于同时检测多种霉菌毒素不适用。由于液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)的宽实用性和高选择性使其具备高通量分析能力，目前已成为真菌毒素检测方法的应用重点。
目前学者研究重点主要是黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和镰刀菌毒素类，而且现有霉菌毒素检测方法检测样本基质主要集中于食品原料、较少同时检测动物粪便中多种毒素代谢物、检测限也难以满足食品安全监控需求。因此，建立一种快速简便、高通量、高灵敏度的用于检测畜禽粪便中4类常见霉菌毒素(伏马毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮)及其代谢标志物残留的方法，能为代谢工作者的研究提供思路，也可应用于动物源食品中真菌毒素的痕量分析，具有重要意义。
发明内容
为此，本发明提供一种用于检测样本中真菌毒素的方法，其包括以下步骤：
(1)样本前处理：
A、将待测样本在冷冻干燥机中干燥后使用高速粉碎机粉碎混匀，-20℃冻存或直接进入下一步；
B、酶解：称取粉碎后的样本于离心管中，加入酶缓冲液，涡旋混匀后振荡酶解，
优选地，称取粉碎后的样本1.00～5.00g，更优选地，称取粉碎后的样本2.00～3.00g，最优选地，称取粉碎后的样本2.00g，
优选地，所述离心管为具塞离心管，更优选地，所述离心管体积为30～100mL，更优选地，所述离心管为40～60mL，最优选地，所述离心管为50mL，
所述酶缓冲液为β-葡萄糖醛酸酶缓冲液，优选地，所述酶缓冲液加入量为5～30μL，更优选地，所述酶缓冲液加入量为8～15μL，最优选地，所述酶缓冲液加入量为10μL；
C、振荡超声提取：在酶解后的样本中加入提取溶剂，涡旋振荡，超声萃取，
优选地，所述涡旋振荡的时间为1～10min，更优选地，所述涡旋振荡的时间为3～8min，最优选地，所述涡旋振荡时间为5min；
D、离心浓缩：将超声提取的样本离心，转移上清液在水浴下氮气吹干，残渣用提取试剂定容至1mL，并超声帮助复溶，涡旋，
优选地，所述离心的转速为3000～6000rpm，更优选地，所述离心的转速为4000～5000rpm，最优选地，所以离心的转速为4500rpm，
优选地，所述离心的时间为5～20min，更优选地，所述离心的时间为8～15min，最优选地，所述离心的时间为10min，
优选地，所述转移上清液的体积为1～10mL，更优选地，所述转移上清液的体积为3～7mL，最优选地，所述转移上清液的体积为5mL，
优选地，所述水浴的温度为30～60℃，更优选地，所述水浴的温度为40～50℃，最优选地，所述水浴的温度为45℃，
优选地，所述超声的时间为0.2～1min，更优选地，所述超声的时间为0.3～0.7min，最优选地，所述超声的时间为0.5min；
E、过滤分析：将复溶得到的溶液过有机滤膜后待测，
优选地，所述滤膜的孔径为0.1～0.5μm，更优选地，所述滤膜的孔径为0.2μm；
(2)将待测液在TQS三重四级杆液相色谱串联质谱仪中进行梯度洗脱分析，色谱条件如下：
Agilent Poroshell 120，EC-C18色谱柱(2.7μm，3.0mm×100mm)；
流动相A为甲醇；
流动相B为醋酸铵水溶液，所述醋酸铵水溶液的浓度为1～10mmol/L，优选地，所述醋酸铵水溶液的浓度为3～7mmol/L，更优选地，所述醋酸铵水溶液的浓度为5mmol/L；
流速为0.2～0.6mL/min，优选地，流速为0.3～0.5mL/min，更优选地，流速为0.4mL/min；
进样量1～5μL，优选地，上样量为2～4μL，更优选地，上样量为3μL；
柱温20～60℃，优选地，柱温为30-50℃，更优选地，柱温为40℃，质谱条件如下：
雾化气压采用电喷雾ESI﹢和ESI﹣离子源；质谱分析范围m/z 200～800；喷雾电压：3.0kV(ESI﹢)和2.5kV(ESI﹣)；离子源温度150℃；脱溶剂气温度500℃；锥孔反吹气流量150L/h；脱溶剂气流量1000L/h；碰撞池压力7.0bar；多反应离子监测(MRM)采集。
在本发明的实施方案中，所述真菌毒素选自伏马毒素B1(FB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮中的至少一种，例如1、2、3、4种，优选为4种，其中，
脱氧雪腐镰刀菌烯醇包括DON、DOM、3-ADON、15-ADON和FUSX；
赭曲霉毒素包括OTA、OTB和OTα；
玉米赤霉烯酮包括ZEA、ZAN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZAL和β-ZAL。
在本发明的实施方案中，所述核样本为粪便样本，优选地，为畜禽类动物粪便样本，更优选地，为鸡粪便样本。
在本发明的实施方案中，所述样本的采集方法为将带挂钩托盘挂于蛋鸡笼子下方，24h后分别收集托盘中全部新鲜粪便。
在本发明的实施方案中，所述振荡酶解的温度为20～50℃，优选地，所述振荡酶解的温度为30～40℃，更优选地，所述振荡酶解的温度为37℃。
在本发明的实施方案中，所述振荡酶解的时间为0.5～12h，优选地，所述振荡酶解的时间为1～10h，例如为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h，再例如为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5h，更优选地，所述振荡酶解的时间为1～3h，最优选地，所述振荡酶解的时间为2h。
在本发明的实施方案中，所述提取试剂乙腈水溶液，优选地，所述乙腈水溶液的浓度为乙腈/水体积比：84/16，更优选地，所述乙腈水溶液中还含有10％NaCl，优选地，所述乙腈水溶液中还含有乙酸，所述乙腈/水/乙酸的体积比为80/19/1。
在本发明的实施方案中，所述超声萃取的时间为5～100min，更优选地，所述超声萃取的时间为10～60min，例如为10、20、30、40、50、60min，再例如为15、25、35、45、55min，最优选地，所述超声萃取的时间为20min。
在本发明的实施方案中，所述超声萃取的温度为10-100℃，更优选地，所述超声萃取的温度为20～70℃，例如为20、30、40、50、60、70℃，再例如为25、35、45、55、65℃，最优选地，所述超声萃取的温度为45℃或50℃。
在本发明的实施方案中，所述流动相B还含有甲酸，优选地，所含甲酸的量为0.05％、0.1％、0.2％、0.5％，更优选地，所含甲酸的量为0.1％。
在本发明的实施方案中，所述梯度洗脱的程序如下：
本发明的有益效果
本发明基于TQS三重四级杆液相色谱串联质谱仪检测动物粪便样本基质中15种霉菌毒素的方法，具有以下优点：
(1)本方法通过对动物实验采集的粪便样本进行酶解条件的优化，与同类方法采用理论推理和空白基质添加待测分析物混匀后酶解提取相比，更加可靠，不仅有助于使与粪便组织结合的毒素游离，同时也有助于复溶液的过滤。
(2)样本酶解后，经乙腈/水溶液(84/16，v/v,含10％NaCl)超声提取、离心、浓缩、复溶后直接在TQS三重四级杆液相色谱串联质谱仪中进行分析，没有复杂的衍生化、净化步骤，前处理过程简单，成本低廉，操作安全。
(3)该方法线性、灵敏度、回收率、精密度等特性满足欧盟相关标准要求，可用于大规模动物粪便样本中15种霉菌毒素的分析调查。
附图说明
图1显示了15种真菌毒素标准品溶液的多反应监控色谱图(A：空白溶剂；B：粪便空白基质)。
图2示出了不同提取溶剂对粪便基质中15种真菌毒素的加标回收率的影响。
图3示出了不同超声萃取时间对粪便基质中15种真菌毒素的加标回收率的影响。
图4示出了不同酶解时间对粪便基质中15种真菌毒素的加标回收率的影响。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1
1、实验材料与方法
(1)仪器、试剂与材料
TQS三重四级杆液相色谱串联质谱仪(美国Waters公司)；XYC-12A型氮吹仪(上海析友分析仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；LL 3000冷冻干燥机(丹麦Heto PowerDry公司)；Heraeus Multifuge X 3高速离心机(美国Thermo Fisherscientific公司)；超声波清洗器(昆山超声仪器公司)；高速粉碎机(上海鼎广机械设备公司)；电子分析天平(德国Sartorius公司)；涡旋振荡器、均质机均为实验室常用仪器。
甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；乙酸、醋酸铵(色谱纯，美国Aladdin公司)；100000Uβ-葡萄糖醛酸酶(美国Sigma-Aldrich公司)，用50mmol/L醋酸铵溶液配制成10000Uβ-葡萄糖醛酸酶缓冲液于4℃下保存备用；真菌毒素标准品(美国Sigma-Aldrich公司)：FB1、DON、DOM、3-ADON、15-ADON、FUSX、OTA、ZEA、α-ZOL、β-ZOL、α-ZAL、β-ZAL为固体粉末标准物；OTB、OTα、ZAN(10μg/mL)。
(2)实验方法
①真菌毒素混合标准液的制备：精密称取伏马毒素B1(FB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON、DOM、3-ADON、15-ADON、FUSX)、赭曲霉毒素(OTA、OTB、OTα)、玉米赤霉烯酮(ZEA、ZAN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZAL、β-ZAL)共15种真菌毒素固体粉末各1mg，分别用乙腈配置成浓度为100μg/mL标准储备液；再用乙腈/水溶液(50/50，v/v)稀释各标准储备液配制成各个毒素终浓度均为1μg/mL的混合标准工作液。标准储备液均避光保存于-20℃；标准工作液于4℃保存备用，保存期限为2个月；
②样本前处理：准确称取粪便样本2.00g(精确至0.01g)于50mL具塞离心管中，加入10uLβ-葡萄糖醛酸酶缓冲液，涡旋混匀，于37℃振荡2h，酶解后加入10mL乙腈/水溶液含10％NaCl(84/16，v/v)，涡旋振荡5min，45℃超声萃取30min，4500rpm离心10min，转移5mL上清液在45℃水浴下氮气吹干，残渣用乙腈/水溶液(84/16，v/v)定容至1mL，并超声0.5min帮助复溶，涡旋，过0.2μm有机滤膜后待测。
③LC-MS/MS条件：
色谱条件：Agilent Poroshell 120，EC-C18色谱柱(2.7μm，3.0mm×100mm)；流动相A为甲醇，B为5mmol/L醋酸铵的水溶液(含0.1％甲酸)；流速为0.4mL/min；进样量3μL；柱温40℃。梯度洗脱程序见表1：
表1最佳梯度洗脱程序
质谱条件：雾化气压采用电喷雾ESI﹢和ESI﹣离子源；质谱分析范围m/z200～800；喷雾电压：3.0kV(ESI﹢)和2.5kV(ESI﹣)；离子源温度150℃；脱溶剂气温度500℃；锥孔反吹气流量150L/h；脱溶剂气流量1000L/h；碰撞池压力7.0bar。采用多重反应监测模式(MRM)监测，15种霉菌毒素的检测参数见表2。
表2多反应监控模式下15种霉菌毒素的MS/MS参数
注:a,定量离子；b,定义为定量离子峰面积与定性离子峰面积的比值；c,分配系统值。
④方法学验证：根据欧盟2002/657/EC、401/2006/EC的标准对该方法进行验证，包括对线性、灵敏度、检出限(LOD)和定量限(LOQ)、回收率、精密度和专属性的考察。
⑤数据分析：差异显著性检验选用SPSS 19.0软件中的单因素方差分析(one-wayANOVA)进行统计分析，并采用origin 8.5软件作图，组间显著性检验用Duncan氏多重比较，以P<0.05作为差异显著水平，所有结果均表示为平均值±标准误。
2、实验条件的选定
(1)色谱条件优化
在流动相为甲醇和含5mmol/L醋酸铵水溶液(含0.1％甲酸)条件下分别选用正负离子模式对各分析物质进行母离子全扫描，大多数分析物在ESI﹢模式下呈现的离子丰度要比ESI﹣模式下呈现的离子丰度更高，但是玉米赤霉烯酮类毒素在ESI﹣模式下[M-H]-离子丰度最高。由于某些真菌毒素含有羧酸基团如伏马毒素，酸性条件有利于其离子化并增大离子响应值，所以本发明选择在弱洗脱溶液水相中分别加入含0.05％、0.1％、0.2％、0.5％的甲酸，结果显示ESI﹢模式下可提高多数分析物离子化效率使其信号丰度有明显改善，减小基线干扰，同时在含0.1％甲酸条件下对玉米赤霉烯酮类毒素检测灵敏度的影响可接受。因此，本发明最终选择甲醇和5mmol/L醋酸铵水溶液(含0.1％甲酸)作为最佳流动相，经过梯度洗脱程序优化后，15种真菌毒素达到有效分离，其溶剂标准品溶液和基质标准品溶液的多反应监控色谱图见图1。
(2)样本前处理条件优化
①提取溶剂的优化：样本前处理效果不但直接影响待分析物的最终检测结果，还会对使用的分析仪器产生较大影响。动物粪便这类样本，成分复杂，存在多种内源性干扰成分，同时15种待分析物的极性差异使得提取溶剂的选择比较困难。在现有技术的基础上，本发明比较了(方法a)乙腈/水溶液(84/16，v/v)、(方法b)乙腈/水溶液(84/16，v/v，含10％NaCl)、(方法c)乙腈/水/乙酸溶液(80/19/1，v/v/v)三种不同提取溶剂对粪便基质中15种真菌毒素在20μg/kg加标水平下回收率的影响，结果见图2。使用三种不同提取溶剂对粪便样本基质分别试验，方法b除FB1回收率在69％，其它待分析物均有较好的回收率，并且较方法a、e提取液更加澄清、减少共提物，可减小对分析仪器和色谱柱的损害，因此最终选择乙腈/水溶液(84/16，v/v，含10％NaCl)作为粪便样本中15种霉菌毒素的提取溶剂。
②超声萃取时间及温度的优化：适宜的超声萃取条件可增强溶剂的穿透力加速待分析物的释放并溶入溶剂，从而提高提取效率，同时超声温度也可能对萃取效果产生一定的影响，因此本发明比较了超声萃取时间及温度对15种真菌毒素在20μg/kg加标水平下回收率的影响，其中超声萃取时间对回收率的影响见图3。结果显示，在6个不同时间(0，10，20，30，40，50min)条件下，粪便样本基质中待分析物在20min时超声萃取效率较高，并且总体上玉米赤霉烯酮毒素类的萃取率高于其它毒素，当继续增加超声时间时，15种待分析物萃取率虽各有所降低或升高但并不显著。
确定粪便样本基质的最佳超声萃取时间为20min后，分别比较了在20，35，50，65℃时样本基质中待分析物加标回收率，结果发现不同超声萃取温度对粪便样本基质中待分析物加标回收率虽有不同程度升高但并无显著影响，但是温度过高又容易将体系中的一些杂质提取出来导致基质效应增加。因此本发明最终确定粪便样本基质的最佳超声萃取时间为20min，最佳超声萃取温度为50℃，该条件下既能满足较高萃取效率的要求，又可节省能耗。
③酶解条件的优化：某些真菌毒素如呕吐毒素类在体内代谢过程中容易与葡萄糖醛酸螯合，形成水溶性较强的缀合物而不容易被有机溶剂提取。已有研究表明，采用β-葡萄糖醛酸酶对牛奶样本酶解两小时后提取效果较好，因此，本发明选用β-葡萄糖醛酸酶酶解目标粪便基质，同时比较了酶解时间对毒素游离效果的影响，结果见图4。结果显示，6个不同酶解时间(0，2，4，6，8，10h)条件下，粪便样本酶解2h时毒素由结合态变成游离态效果较好，检测到的待分析物含量最多。这可能是由于酶解时间太短时毒素没有释放完全，如果酶解时间过长又容易出现较多的杂质而影响提取效果使待分析物回收率下降。因此，本发明选用β-葡萄糖醛酸酶酶解目标粪便基质，酶解时间为2h。
本方法通过对动物实验采集的粪便样本进行酶解条件的优化，与同类方法采用理论推理和空白基质添加待测分析物混匀后酶解提取相比，更加可靠，所以该方法能够更好的应用到实际样本的真菌毒素含量检测中。
3、实验方法的验证
(1)标准曲线和方法的灵敏度
基质校准曲线用于评估方法线性。根据样本前处理方法制得空白样本提取液，然后用其稀释各毒素的标准工作液配制成浓度范围在1-400ng/mL内的至少5个浓度的基质混合标准液，每个浓度水平3份平行，并重复分析2次。标准曲线通过绘制峰面积(y)vs各毒素浓度(x)，相关系数通过最小平方值来计算。根据得到的线性回归方程和拟合度并分别根据定性离子通道中信噪比(S/N＝3)和定量离子通道中信噪比(S/N＝10)计算检出限(Limitof detection，LOD)和定量限(Limit of quantity，LOQ)，以此体现方法的灵敏度，结果见表3。
如表3所示，粪便样本基质中各待测物的基质校准曲线在一定浓度范围内相关系数R2均大于0.996，呈现良好的线性关系。粪便样本基质中15种霉菌毒素的检出限为0.06～1.00μg/kg，定量限为0.13～2.00μg/kg，满足欧盟建立的限量标准或建议值。
表3粪便样本基质的线性、检出限和定量限
(2)方法的回收率和精密度
回收率试验通过在空白样本中添加高、中、低3个浓度水平(每个水平3个平行)的真菌毒素进行(即通过提取前加标和提取后加标待测物峰面积比值来算)。精密度则通过重复性和重现性来计算其中重复性(日内相对标准偏差，RSDr)，是通过在同一天分析3个浓度水平的加标样本来计算相对标准偏差；重现性(日间相对标准偏差，RSDR)，是通过连续3天重复上述步骤来实现(回收率在70％～120％和RSD<20％被认为是可接受的)。
结果如表4所示，粪便基质样本中不同添加水平的真菌毒素的平均回收率在72％～116％之间，与我国国家标准《实验室质量控制规范食品理化检测》中要求的当被分析物含量小于0.1mg/kg时回收率需达到70％～120％一致，满足分析要求。
表4粪便样本基质的加标回收率和精密度(n＝3)
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种用于检测样本中真菌毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样本前处理：
A、将待测样本在冷冻干燥机中干燥后使用高速粉碎机粉碎混匀，-20℃冻存或直接进入下一步；
B、酶解：称取粉碎后的样本于离心管中，加入酶缓冲液，涡旋混匀后振荡酶解，
优选地，称取粉碎后的样本1.00～5.00g，更优选地，称取粉碎后的样本2.00～3.00g，最优选地，称取粉碎后的样本2.00g，
优选地，所述离心管为具塞离心管，更优选地，所述离心管体积为30～100mL，更优选地，所述离心管为40～60mL，最优选地，所述离心管为50mL，
所述酶缓冲液为β-葡萄糖醛酸酶缓冲液，优选地，所述酶缓冲液加入量为5～30μL，更优选地，所述酶缓冲液加入量为8～15μL，最优选地，所述酶缓冲液加入量为10μL；
C、振荡超声提取：在酶解后的样本中加入提取溶剂，涡旋振荡，超声萃取，
优选地，所述涡旋振荡的时间为1～10min，更优选地，所述涡旋振荡的时间为3～8min，最优选地，所述涡旋振荡时间为5min；
D、离心浓缩：将超声提取的样本离心，转移上清液在水浴下氮气吹干，残渣用提取试剂定容至1mL，并超声帮助复溶，涡旋，
优选地，所述离心的转速为3000～6000rpm，更优选地，所述离心的转速为4000～5000rpm，最优选地，所以离心的转速为4500rpm，
优选地，所述离心的时间为5～20min，更优选地，所述离心的时间为8～15min，最优选地，所述离心的时间为10min，
优选地，所述转移上清液的体积为1～10mL，更优选地，所述转移上清液的体积为3～7mL，最优选地，所述转移上清液的体积为5mL，
优选地，所述水浴的温度为30～60℃，更优选地，所述水浴的温度为40～50℃，最优选地，所述水浴的温度为45℃，
优选地，所述超声的时间为0.2～1min，更优选地，所述超声的时间为0.3～0.7min，最优选地，所述超声的时间为0.5min；
E、过滤分析：将复溶得到的溶液过有机滤膜后待测，
优选地，所述滤膜的孔径为0.1～0.5μm，更优选地，所述滤膜的孔径为0.2μm；
(2)将待测液在TQS三重四级杆液相色谱串联质谱仪中进行梯度洗脱分析，色谱条件如下：
Agilent Poroshell 120，EC-C18色谱柱(2.7μm，3.0mm×100mm)；
流动相A为甲醇；
流动相B为醋酸铵水溶液，所述醋酸铵水溶液的浓度为1～10mmol/L，优选地，所述醋酸铵水溶液的浓度为3～7mmol/L，更优选地，所述醋酸铵水溶液的浓度为5mmol/L；
流速为0.2～0.6mL/min，优选地，流速为0.3～0.5mL/min，更优选地，流速为0.4mL/min；
进样量1～5μL，优选地，上样量为2～4μL，更优选地，上样量为3μL；
柱温20～60℃，优选地，柱温为30-50℃，更优选地，柱温为40℃，
质谱条件如下：
雾化气压采用电喷雾ESI﹢和ESI﹣离子源；质谱分析范围m/z 200～800；喷雾电压：3.0kV(ESI﹢)和2.5kV(ESI﹣)；离子源温度150℃；脱溶剂气温度500℃；锥孔反吹气流量150L/h；脱溶剂气流量1000L/h；碰撞池压力7.0bar；多反应离子监测(MRM)采集。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真菌毒素选自伏马毒素B1(FB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮中的至少一种，例如1、2、3、4种，优选为4种，其中，
脱氧雪腐镰刀菌烯醇包括DON、DOM、3-ADON、15-ADON和FUSX；
赭曲霉毒素包括OTA、OTB和OTα；
玉米赤霉烯酮包括ZEA、ZAN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZAL和β-ZAL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本为粪便样本，优选地，为畜禽类动物粪便样本，更优选地，为鸡粪便样本，
优选地，所述样本的采集方法为将带挂钩托盘挂于蛋鸡笼子下方，24h后分别收集托盘中全部新鲜粪便。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述振荡酶解的温度为20～50℃，优选地，所述振荡酶解的温度为30～40℃，更优选地，所述振荡酶解的温度为37℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述振荡酶解的时间为0.5～12h，优选地，所述振荡酶解的时间为1～10h，例如为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h，再例如为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5h，更优选地，所述振荡酶解的时间为1～3h，最优选地，所述振荡酶解的时间为2h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取试剂乙腈水溶液，
优选地，所述乙腈水溶液的浓度为乙腈/水体积比：84/16，
更优选地，所述乙腈水溶液中还含有10％NaCl，
优选地，所述乙腈水溶液中还含有乙酸，所述乙腈/水/乙酸的体积比为80/19/1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声萃取的时间为5～100min，更优选地，所述超声萃取的时间为10～60min，例如为10、20、30、40、50、60min，再例如为15、25、35、45、55min，最优选地，所述超声萃取的时间为20min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述超声萃取的温度为10-100℃，更优选地，所述超声萃取的温度为20～70℃，例如为20、30、40、50、60、70℃，再例如为25、35、45、55、65℃，最优选地，所述超声萃取的温度为45℃或50℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相B还含有甲酸，优选地，所含甲酸的量为0.05％、0.1％、0.2％、0.5％，更优选地，所含甲酸的量为0.1％。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序如下：
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| CN110749691A (zh) * | 2019-12-23 | 2020-02-04 | 山东畜牧兽医职业学院 | 一种测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的hplc-ms/ms方法 |
Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN103243148A (zh) * | 2013-05-06 | 2013-08-14 | 上海市农业科学院 | 一种检测β-葡聚糖酶酶活的方法 |
| CN103543221A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-01-29 | 王加启 | 同时检测牛奶中多种霉菌毒素的方法 |
| CN107144645A (zh) * | 2017-04-11 | 2017-09-08 | 河南省粮油饲料产品质量监督检验中心 | 一种同时检测多种真菌毒素的方法 |
-
2018
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110749691A (zh) * | 2019-12-23 | 2020-02-04 | 山东畜牧兽医职业学院 | 一种测定婴幼儿辅助食品中黄曲霉毒素及其同系物的hplc-ms/ms方法 |
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