CN114441673B - 一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法，步骤如下：向血清样品中加入适量内标溶液后，再加入提取剂Ⅰ，涡旋振荡使样品混合均匀，静置，再向样品中加入提取剂Ⅱ，涡旋振荡，将全部样品转移至超滤管中，高速离心，取出超滤管，转移下层离心出来的提取液至进样板中，加入提取剂Ⅲ，涡旋振荡后混合均匀，上样液相色谱‑串联质谱仪进行检测。本方法可以快速准确同时检测血清中11种水溶性维生素，前处理简单易操作，省时省力，高效精准，一次测试、一针进样检测11种水溶性维生素，极大的提高了医疗检验的效率和准确率，方便医者和患者，给人体中水溶性维生素的含量监测提供了有效可行的依据。

Description

一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体地，涉及一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法。

背景技术

水溶性维生素是维持人体生命活动必须的一类有机物，参与机体代谢的调节，也是保持人体健康的重要活性物质。其在人体内含量很少，但不可缺，如果长期缺乏某种维生素，就会引起生理机能障碍而发生某种疾病。

硫胺素（VB1）能够保持循环、消化、神经和肌内正常功能，调节胃肠道功能，脱羧酶辅酶的组成成分，参加糖代谢，预防脚气病；缺乏会引起神经炎、脚气病、食欲不振、消化不良、生长迟缓等症状。

核黄素（VB2）是体内许多辅酶的组成成分，参与体内的氧化还原反应，是蛋白、糖、脂肪酸代谢和能量利用所必须的物质；缺乏会引起口腔溃疡、皮炎、口角炎、舌炎、唇裂症、角膜炎、畏光等症状。

维生素B3包括烟酸（VB3-Na）和烟酰胺（VB3-Nm），在体内主要以辅酶NAD和NADP的形式参与机体氧化还原反应的递氢过程，可促进铁的吸收和血细胞的形成，维持皮肤的正常生理功能和消化液的分泌，提高中枢神经的兴奋性，扩张末梢血管，降低血清胆固醇的含量；缺乏会引起糖类、脂肪、蛋白质的代谢障碍，表现为腹泻、粗皮、痴呆等症状。

泛酸（VB5）是体内合成辅酶A的原料，以乙酰辅酶A的形式参与物质代谢，与草酰乙酸结合形成柠檬酸，进入三羧酸循环；乙酰辅酶也能与胆碱相结合形成乙酰胆碱，从而影响植物性神经的功能，进而调控心肌、平滑肌、腺体的活动；乙酰辅酶A又是胆固醇和类固醇类激素的前体，可在脂肪酸、丙酮酸、α-酮戊二酸的氧化和乙酰化作用等酶反应过程种发挥作用；缺乏时可导致糖类、脂肪、蛋白质的代谢障碍，乙酰胆碱合成减少，肝脏乙酰化解毒作用减弱，肾上腺皮质激素合成及造血功能障碍等一系列临床病例变化。

维生素B6包括吡哆醇（VB6-PA）和磷酸吡哆醛（VB6-PLP），缺乏会引起转氨酶和脱羧合成受阻、蛋白质代谢障碍、以生长不良、皮炎、痫病样抽搐、骨短粗等为临床症状的一种营养代谢病。

生物素（VB7）是合成维生素C的必要物质，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质。是一种维持人体自然生长、发育和正常人体机能健康必要的营养素。生物素在脂肪合成、糖质新生等生化反应途径中扮演重要角色，是构成视觉细胞内的感光物质，能维持上皮组织结构的完整和健全。 生物素能增强机体的免疫反应和感染的抵抗力，稳定正常组织的溶酶体膜，维持机体的体液免疫、细胞免疫并影响一系列细胞因子的分泌。大剂量可促进胸腺增生，如同免疫增强剂合用，可使免疫力增强。能维持正常生长发育。 生物素缺乏时，生殖功能衰退，骨骼生长不良，胚胎和幼儿生长发育受阻。用于治疗动脉硬化、中风、脂类代谢失常、高血压、冠心病和血液循环障碍性的疾病。生物素是秃头一族的救星，不但防止落发及头顶见光颇见功效，还能预防现代人常见的少年白发。它在维护皮肤健康中也扮演着重要角色。至于安定神经系统方面的功效至今尚未获得证实，但对忧郁、失眠确有一定助益。

叶酸（VB9，5-甲基四氢叶酸是其体内活性形式）是蛋白质和核酸合成的必需因子，在细胞分裂和繁殖中起重要作用；缺乏时会引起生长缓慢、皮肤病变、巨幼红细胞性贫血、生殖功能降低等症状，叶酸缺乏是全世界公认的一个保健问题，特别是婴儿、青少年和孕妇。

甲基丙二酸（MMA）参与钴胺素（VB12）的代谢，可反映体内VB12的水平，表现为MMA升高，VB12缺乏，可引起不可逆的神经系统损害、贫血、骨质疏松等病症。

水溶性维生素的检测经历了多种方法,主要为毛细管电泳法、电化学分析法、高效液相色谱法、高效液相色谱质谱联用法等。其中电泳法、电化学法、高效液相色谱法存在一定的缺点，灵敏度较低、结果差异大、易受其他内源性化合物干扰，操作繁琐；随着现代质谱技术的快速发展，色谱串联质谱因其灵敏度高，特异度强，能进行大量样本的快速测试，目前已成为检测水溶性维生素的主要方法。现有基于LC-MS/MS技术开发用于水溶性维生素检测的专利或者方法各有各的优点，但仍然具有如下一些缺点。1.低通量，检测目标物少。2.前处理净化不够彻底容易污染色谱柱和质谱仪；3.样品前处理复杂，制备成本高。

CN 111398439 A采用的是蛋白沉淀法去提取净化样本，净化效果很差，色素脂肪等杂质难以去除，对色谱柱和质谱系统会产生较大的污染，而且对样本产生了多倍的稀释，降低了检测的灵敏度。

经过现有技术的检索，公开号为CN 111398439 A的专利文献中，检测的维生素种类比较少，只检测6种，而且其中好几种都不是人体内的活性物质（维生素B6需要检测活性物质磷酸吡哆醛，维生素B9需要检测活性物质5-甲基四氢叶酸，维生素B12需要检测活性物质甲基丙二酸），对于难检测的磷酸吡哆醛和甲基丙二酸也不检测，没有同时解决多个问题。

本专利提供的方法对人血清中水溶性维生素的检测具有检测种类多，易操作，检测时间短，检测通量高，灵敏度高，特异性强，检测范围宽等优点。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法。

本发明的目的是通过以下方案实现的：

本发明提供一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法，包括如下步骤：

（1）对血清样品进行前处理，向血清样品中加入内标溶液后，再加入提取剂Ⅰ，涡旋振荡使样品混合均匀，静置；所述提取剂Ⅰ为含盐酸的水溶液；

（2）再向静置后的样品中加入提取剂Ⅱ，涡旋振荡混合均匀；所述提取剂Ⅱ为含甲醇的水溶液；

（3）然后将步骤（2）所得全部样品转移至超滤管（3-10KD）中，高速离心；

（4）取出超滤管（3-10KD），转移下层离心出来的提取液至进样板中，加入提取剂Ⅲ，涡旋振荡后混合均匀；所述提取剂Ⅲ为含氢氧化钠的水溶液；

（5）将步骤（4）所得样品上样至液相色谱-串联质谱仪进行检测得到各水溶性维生素的峰面积值；

（6）根据各水溶性维生素的标准曲线计算得到各水溶性维生素的浓度。

本发明首次采用分子截留的方式去提取净化样品，不同于蛋白沉淀法和固相萃取柱法。分子截留的原理是通过超滤膜在压力的作用下使小分子物质通过超滤膜，大分子物质被留在超滤膜上，截留住蛋白质、色素和脂肪等大分子干扰物，使样品得到净化。三种提取剂配合分子截留法，能提取净化全部11种水溶性维生素。

进一步地，所述内标溶液为，含维生素B1、维生素B2、烟酸、烟酰胺、维生素B5、磷酸吡哆醛、吡哆酸、维生素B7、维生素B9 、5-甲基四氢叶酸和甲基丙二酸的水溶液，所述内标溶液中含有浓度为1mg/mL的VC。

进一步地，所述内标溶液中，各维生素的浓度如下：维生素B1为（50-100）ng/mL、维生素B2为（30-100）ng/mL、烟酸为（100-200）ng/mL、烟酰胺为（100-200）ng/mL、维生素B5为（300-800）ng/mL、磷酸吡哆醛为（200-800）ng/mL、吡哆酸为（50-150）ng/mL、维生素B7为（10-30）ng/mL、维生素B9为（50-90）ng/mL 、5-甲基四氢叶酸为（50-150）ng/mL和甲基丙二酸为（1500-2500）ng/mL。

进一步地，提取剂Ⅰ为（1.2-3.0）mol/L的盐酸水溶液，提取剂Ⅱ为含（0.1-2）g/L的BHT甲醇水（1:1）溶液，提取剂Ⅲ为（0.2-2）mol/L的氢氧化钠水溶液。

提取剂Ⅰ的加入是为了调节磷酸吡哆醛的提取效率。提取剂Ⅰ加到样品中后，样品的PH值为（1-3），若降低提取剂Ⅰ的浓度后，将样本的PH值调整至3，4、5和6，发现磷酸吡哆醛的提取效率越来越低，说明提取剂Ⅰ浓度需要大，而加大提取剂Ⅰ的浓度后，样本的PH值小于1，磷酸吡哆醛的提取效率没有提高，说明提取剂Ⅰ的浓度在（1.2-3.0）mol/L范围内能取得最优的效果。

提取剂Ⅱ的加入是为了调节维生素B2、维生素B9、和5-甲基四氢叶酸的提取效率。当提取剂Ⅱ的加入量变大或减小时，VB2、VB9-FA、5-MTFH的提取效率均变低，说明提取剂Ⅱ的浓度在（0.1-2）g/L范围内能取得最优的效果。

提取剂Ⅲ的加入是为了调节烟酸、烟酰胺、维生素B1和甲基丙二酸的提取效率。当提取剂Ⅲ加入的量变大时，维生素B1和甲基丙二酸提取效率明显下降，而当提取剂Ⅲ加入量变小时，烟酸和烟酰胺的提取效率明显下降，说明提取剂Ⅲ的浓度在（0.2-2）mol/L范围内能取得最优的效果。

进一步地，液相色谱条件为：

流动相A：含（0.2-0.9）wt%甲酸和（2-15）mmol/L醋酸铵的水溶液；

流动相B：含（0.2-0.9）wt %甲酸和（2-15）mmol/L醋酸铵的甲醇溶液；

色谱柱型号：C18 30x50mm （1.7-3）μm；

柱温：40℃；

进样量：10μL。

进一步地，液相色谱的梯度洗脱程序为：0-2.5min，流动相A 100％；2.5-3.5min，流动相A由100％降为55％，流动相B 45%；3.5-4.5min，流动相A降为5％，流动相B升为95%；4.5-4.6min，流动相A保持5％，流动相B保持95%；4.6-5min，流动相A升为100％。

进一步地，质谱条件为，电喷雾离子源，正负离子MRM 扫描分析，离子源参数：正模式电压值3500V，负模式电压值3500V，鞘气：40Arb，辅助气：15Arb，吹扫气：0Arb，离子传输管温度：350℃，离子源温度：350℃。

进一步地，制作水溶性维生素标准曲线所使用的水溶性维生素标准品储备液为：用（1%-5%）氨水的水溶液配制的浓度为1000mg/L的维生素B1、烟酸、烟酰胺、维生素B5、磷酸吡哆醛、吡哆酸、5-甲基四氢叶酸、甲基丙二酸；用二甲亚砜配制的浓度为100mg/L的维生素B2、浓度为1000mg/L的维生素B7、维生素B9。

进一步地，所述（1%-5%）氨水的水溶液中含有浓度为1mg/mL的VC，所述二甲亚砜中含有浓度为1mg/mL的VC。

进一步地，本发明方法能同时检测出11种水溶性维生素，检出限可达到0.2 ng/mL。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、样品前处理采用分子截留的方式，能快速去除血清种的蛋白、脂肪、色素等杂质，相较于传统的SPE净化方法大大提高了前处理效率，而且降低了水溶性维生素的损失；相较于传统的蛋白沉淀方法，样本净化的更干净、彻底，并且也没有稀释样本，能很大程度降低在进样分析检测时对色谱柱和质谱仪的损耗和提高检测的灵敏度，能检测更低浓度含量的血清样本。

2、采用超高效液相色谱-串联质谱方法检测11种水溶性维生素，该方法同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测。（1）特异性高， 可以极大的避免交叉反应的干扰,从而提高准确度。（2）采用同位素内标法定量，可以极大的消除基质效应，能够达到准确定量。（3）高通量，一次前处理，一针进样可同时检测11种水溶性维生素，能检测的水溶性维生素种类非常全面，而且仪器分析时间短，5分钟之内就能完成检测分析。(4)样品制备简单快速，而且净化效果良好。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为VB1外标和内标质谱图；

图2为VB3-Na外标和内标质谱图；

图3为VB3-Nm外标和内标质谱图；

图4为VB6-PLP外标和内标质谱图；

图5为MMA外标和内标质谱图；

图6为VB6-PA外标和内标质谱图；

图7为VB5外标和内标质谱图；

图8为5-MTFH外标和内标质谱图；

图9为VB9-FA外标和内标质谱图；

图10为VB7外标和内标质谱图；

图11为VB2外标和内标质谱图；

图12为VB2校准曲线；

图13为VB3-Na校准曲线；

图14为VB3-Nm校准曲线；

图15为VB5校准曲线；

图16为VB6-PA校准曲线；

图17为VB6-PLP校准曲线；

图18为VB7校准曲线；

图19为5-MTFH校准曲线；

图20为VB9-FA校准曲线；

图21为MMA校准曲线；

图22为VB1校准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种血清中11种水溶性维生素的液相色谱-串联质谱检测方法，方法的原理：通过调节血清样本的PH值，使水溶性维生素游离后，采用分子截留的方式截取血清种的蛋白质和色素等大分子，使水溶性维生素得到提取和净化，采用耐水色谱柱分离水溶性维生素，在液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统上采用多反应监测（MRM）模式定量检测。包括如下步骤：对血清样品进行前处理，向血清样品中加入适量同位素内标后，再加入提取剂Ⅰ，涡旋振荡设定时间Ⅰ使样品混合均匀，静置设定时间Ⅱ，再向样品中加入提取剂Ⅱ，涡旋振荡设定时间Ⅲ，将全部样品转移至超滤管中，高速离心设定时间Ⅳ，取出超滤管，转移下层离心出来的提取液至进样板中，加入提取剂Ⅲ，涡旋振荡设定时间Ⅴ后混合均匀，上样液相色谱-串联质谱仪进行检测。本方法可以快速准确同时检测血清中11种水溶性维生素，前处理简单易操作，省时省力，高效精准，一次测试、一针进样检测11种水溶性维生素，极大的提高了医疗检验的效率和准确率，方便医者和患者，给人体中水溶性维生素的含量监测提供了有效可行的依据。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。

实施例1

（一）试剂的配制：

提取剂Ⅰ：用移液枪移取4mL超纯水至试剂瓶中，再用移液枪吸取（0.5-1.25）ml浓盐酸（36%-38%）至试剂瓶中，混匀，得到（1.2-3.0）moL/L的盐酸溶液，即为提取剂Ⅰ。提取剂Ⅰ在样本中加入（10-50）μL；

提取剂Ⅱ：用天平称取（0.6-12）mg BHT至试剂瓶中，用移液枪加入3mL甲醇和3mL超纯水至试剂瓶中，超声混溶后得到提取剂Ⅱ。提取剂Ⅱ在样本中加入（30-100）μL；

提取剂Ⅲ：用天平称取（40-400）mg氢氧化钠至试剂瓶中，用移液枪加入5mL超纯水，超声10min使氢氧化钠完全溶解，得到提取剂Ⅲ；提取剂Ⅲ在样本中加入（2-15）μL；

内标溶液：含维生素B1-13C3为（50-100）ng/mL、维生素B2-13C415N2为（30-100）ng/mL、烟酸-D4为（100-200）ng/mL、烟酰胺-D4为（100-200）ng/mL、维生素B5-13C315N为（300-800）ng/mL、磷酸吡哆醛-D5为（200-800）ng/mL、吡哆酸-D3为（50-150）ng/mL、维生素B7-D4为（10-30）ng/mL、维生素B9-D4为（50-90）ng/mL 、5-甲基四氢叶酸-13CD4为（50-150）ng/mL和甲基丙二酸-D3为（1500-2500）ng/mL的水溶液（内含1mg/mLVC）；

标准品储备液：分别准确称取维生素B1(VB1) 10mg、烟酸(VB3-Na)10mg、烟酰胺（VB3-Nm）10mg、维生素B5（VB5） 10mg、磷酸吡哆醛（VB6-PLP）10mg、吡哆酸（VB6-PA）10mg、5-甲基四氢叶酸（5-MTFH）10mg、甲基丙二酸（MMA）10mg用含2%氨水的水溶液（内含1mg/mLVC）定容至10mL，得到上述8种维生素的储备液1000mg/L；

分别准确称取维生素B2（VB2） 1mg、维生素B7(VB7) 10mg、维生素B9(VB9-FA)10mg用二甲亚砜（内含1mg/mLVC）定容至10mL，得到上述3种维生素的储备液，其中B2储备液100mg/L，B7和B9储备液1000mg/L；储备液可于-80℃以下避光保存（30天）。

（二）样品的前处理：

加入200 μL样本到反应试管中，加入20 μL内标溶液，加入10-50μL（例如40μL）提取剂Ⅰ，涡旋震荡混匀1min，静置2min；加入30-100μL（例如50μL）提取剂Ⅱ，涡旋震荡混匀1min；将反应管中的液体全部转移到超滤管（3-10KD）中，超滤管（3-10KD）盖好盖子，放入离心机，14000r/min离心20min。将上述离心好的超滤管（3-10KD）中的下层溶液转移40μL至96孔进样板，加入2-15μL （例如10μL）提取液Ⅲ，1000r/min，振荡5min，上液相色谱-串联质谱仪检测。

液相色谱串联质谱仪为上海睿康生物科技有限公司的RZ-500系列。

（三）液相色谱-串联质谱仪检测条件

（a）色谱条件：

流动相A：含（0.2-0.9）wt%甲酸和（2-15）mmol/L醋酸铵的水溶液；

流动相B：含（0.2-0.9）wt %甲酸和（2-15）mmol/L醋酸铵的甲醇溶液；

色谱柱型号：C18 30x50mm （1.7-3）μm；

柱温：40℃；

进样量：10μL；

采用梯度淋洗的方式，流速及梯度见表1。

表1、高效液相色谱分离流速及梯度

（b）质谱条件：

电喷雾离子源（ESI），正负离子MRM 扫描分析，离子源参数：正模式电压值3500V，负模式电压值3500V，鞘气：40Arb，辅助气：15Arb，吹扫气：0Arb，离子传输管温度：350℃，离子源温度：350℃；Q1/Q3 离子通道分别选择见表2。

表2、母离子、子离子参数表

分析物	Q1母离子 (m/z)	Q3碎片离子(m/z)	离子通道功能
				维生素B1	265.1	122.1	定量
维生素B1	265.1	144.1	定性
				维生素B2	377.2	243.2	定量
维生素B2	377.2	172.1	定性
				烟酸	124.1	78.1	定量
烟酸	124.1	80.1	定性
				烟酰胺	123.1	80.1	定量
烟酰胺	123.1	78.1	定性
				维生素B5	220.1	90.1	定量
维生素B5	220.1	202.2	定性
				磷酸吡哆醛	248.1	150.1	定量
磷酸吡哆醛	248.1	94.1	定性
				吡哆酸	184.1	166.1	定量
吡哆酸	184.1	148.1	定性
				维生素B7	245.1	227.1	定量
维生素B7	245.1	97.1	定性
				维生素B9	442.3	295.2	定性
维生素B9	442.3	176.1	定量
				5-甲基四氢叶酸	460.2	313.2	定量
5-甲基四氢叶酸	460.2	180.1	定性
				甲基丙二酸	117.0	73.0	定量
甲基丙二酸	117.0	55.1	定性
				维生素B1-IS	269.1	122.1	内标
维生素B2-IS	383.2	249.2	内标
				烟酸-IS	128.0	84.1	内标
烟酰胺-IS	127.1	84.0	内标
				维生素B5-IS	224.1	94.1	内标
磷酸吡哆醛-IS	253.1	155.1	内标
				吡哆酸-IS	187.1	166.1	内标
维生素B7-IS	249.1	231.2	内标
				维生素B9-IS	446.2	299.2	内标
5-甲基四氢叶酸-IS	464.2	317.3	内标
				甲基丙二酸-IS	120.0	76.1	内标

（四）线性范围和灵敏度测试

试验中使用不含水溶性维生素的空白血清（脱碳）样本，向空白血清中分别添加不同浓度的各水溶性维生素，配制得到6个不同浓度的维生素加标样品系列，其中每种水溶性维生素的浓度分别为：

VB1为0.5ng/mL,1ng/mL,2.5ng/mL,5ng/mL,25ng/mL,50ng/mL;

VB2为0.5ng/mL,1ng/mL,2.5ng/mL,5ng/mL,25ng/mL,50ng/mL；

VB3-Na为2ng/mL,4ng/mL,10ng/mL,20ng/mL,100ng/mL,200ng/mL;

VB3-Nm为2ng/mL,4ng/mL,10ng/mL,20ng/mL,100ng/mL,200ng/mL;

VB5为5ng/mL,10ng/mL,25ng/mL,50ng/mL,250ng/mL,500ng/mL;

VB6-PLP为5ng/mL,10ng/mL,25ng/mL,50ng/mL,250ng/mL,500ng/mL;

VB6-PA为1ng/mL,2ng/mL,5ng/mL,10ng/mL,50ng/mL,100ng/mL;

VB7为0.2ng/mL,0.4ng/mL,1ng/mL,2ng/mL,10ng/mL,20ng/mL;

VB9-FA为0.8ng/mL,1.6ng/mL,4ng/mL,8ng/mL,40ng/mL,80ng/mL;

5-MTFH为1ng/mL,2ng/mL,5ng/mL,10ng/mL,50ng/mL,100ng/mL;

MMA为20ng/mL,40ng/mL,100ng/mL,200ng/mL,1000ng/mL,2000ng/mL。

将上述配制的样品按前述样品前处理的方法进行实验处理后上质谱仪检测，将检测数据经过质谱仪软件的线性拟合后得到线性范围、标准曲线方程、线性相关系数和检出限，分别见表3所示，标准曲线图如图12至图22所示。

表3、各水溶性维生素线性范围及方程

化合物	线性范围(ng/mL)	线性方程	相关系数	检出限(ng/mL)
					VB1	0.5-50	Y=2.814e-1X-9.852e-2	0.9991	0.5
VB2	0.5-50	Y=1.294e-1X+4.5e-2	0.9991	0.5
					VB3-Na	2-200	Y=3.461e-2X+7.127e-2	0.9952	2
VB3-Nm	2-200	Y=5.045e-2X+8.226e-2	0.9981	2
					VB5	5-500	Y=2.241e-2X-3.604e-2	0.9988	5
VB6-PLP	5-500	Y=7.677e-2X+1.237e-1	0.9990	5
					VB6-PA	1-100	Y=6.536e-2X+1.498e-2	0.9985	1
VB9-FA	0.8-80	Y=7.998e-2X+2.825e-3	0.9915	0.8
					5-MTFH	1-100	Y=5.285e-2X+1.476e-2	0.9998	1
MMA	20-2000	Y=1.829e-3X-4.151e-3	0.9992	20
					VB7	0.2-20	Y=1.496e-1X+4.914e-2	0.9985	0.2

由表3可知各水溶性维生素曲线相关性良好， (R>0.99)，偏差(difference)小于20%。

（五）精密度和准确度测试

试验中使用不含水溶性维生素的空白血清（脱碳）样本，向空白血清中分别添加低浓度、中等浓度和高浓度的水溶性维生素的标液，每个浓度配制6个平行样，按前述样本前处理步骤去试验处理后上质谱仪检测，得到数据见表4。其中，低浓度(VB1 1.5ng/mL、VB21.5ng/mL、VB3-Na 6ng/mL、VB3-Nm 6ng/mL、VB5 15ng/mL、VB6-PLP 15ng/mL、VB6-PA 3ng/mL、VB9-FA 2.4ng/mL、5-MTFH 3ng/mL、MMA 60ng/mL、VB7 0.6ng/mL)、中等浓度(VB17.5ng/mL、VB2 7.5ng/mL、VB3-Na 30ng/mL、VB3-Nm 30ng/mL、VB5 75ng/mL、VB6-PLP 75ng/mL、VB6-PA 15ng/mL、VB9-FA 12ng/mL、5-MTFH 15ng/mL、MMA 300ng/mL、VB7 3ng/mL)和高浓度(VB1 37.5ng/mL、VB2 37.5ng/mL、VB3-Na 150ng/mL、VB3-Nm 150ng/mL、VB5 375ng/mL、VB6-PLP 375ng/mL、VB6-PA 75ng/mL、VB9-FA 60ng/mL、5-MTFH 75ng/mL、MMA 1500ng/mL、VB7 15ng/mL)

表4、空白血清添加回收率和精密度

由表4可知，样品检测的精密度和准确度均良好（CV<15%,DIFF<15%）。

（六）临床样本的检测

选取10份正常人的血清样本，按前述样本前处理的步骤去实验处理后上质谱仪检测，得到数据见表5。

表5、 临床样本检测结果

由表5可知，用此方法检测的正常人血清中的各水溶性维生素的结果均在参考范围内。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (7)

1.一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）对血清样品进行前处理，向200μL血清样品中加入20μL内标溶液后，再加入10-50μL提取剂Ⅰ，涡旋振荡使样品混合均匀，静置；

（2）再向静置后的样品中加入30-100μL提取剂Ⅱ，涡旋振荡混合均匀；

（3）然后将步骤（2）所得全部样品转移至3-10KD的超滤管中，高速离心；

（4）取出超滤管，转移下层离心出来的提取液至进样板中，加入2-15μL提取剂Ⅲ，涡旋振荡后混合均匀；

（5）将步骤（4）所得样品上样至液相色谱-串联质谱仪进行检测得到各水溶性维生素的峰面积值；

（6）根据各水溶性维生素的标准曲线计算得到各水溶性维生素的浓度；

其中，提取剂Ⅰ为（1.2-3.0）mol/L的盐酸水溶液，提取剂Ⅱ为含（0.1-2）g/L的BHT甲醇水1:1溶液，提取剂Ⅲ为（0.2-2）mol/L的氢氧化钠水溶液；所述多种水溶性维生素包括维生素B1、维生素B2、烟酸、烟酰胺、维生素B5、磷酸吡哆醛、吡哆酸、维生素B7、维生素B9 、5-甲基四氢叶酸和甲基丙二酸。

2.根据权利要求1所述的一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法，其特征在于，液相色谱条件为：

流动相A：含（0.2-0.9）%甲酸和（2-15）mmol/L醋酸铵的水溶液；

流动相B：含（0.2-0.9）%甲酸和（2-15）mmol/L醋酸铵的甲醇溶液；

色谱柱型号：C18 30x50mm 3μm；

柱温：40℃；

进样量：10μL。

3.根据权利要求1所述的一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法，其特征在于，液相色谱的梯度洗脱程序为：0-2.5min，流动相A 100％；2.5-3.5min，流动相A由100％降为55％，流动相B 45%；3.5-4.5min，流动相A降为5％，流动相B升为95%；4.5-4.6min，流动相A保持5％，流动相B保持95%；4.6-5min，流动相A升为100％。

4.根据权利要求1所述的一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法，其特征在于，质谱条件为，电喷雾离子源，正负离子MRM 扫描分析，离子源参数：正模式电压值3500V，负模式电压值3500V，鞘气：40Arb，辅助气：15Arb，吹扫气：0Arb，离子传输管温度：350℃，离子源温度：350℃。

5.根据权利要求1所述的一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法，其特征在于，制作水溶性维生素标准曲线所使用的水溶性维生素标准品储备液为：用（1%-5%）氨水的水溶液配制的浓度为1000mg/L的维生素B1、烟酸、烟酰胺、维生素B5、磷酸吡哆醛、吡哆酸、5-甲基四氢叶酸、甲基丙二酸；用二甲亚砜配制的浓度为100mg/L的维生素B2、浓度为1000mg/L的维生素B7、维生素B9。

6.根据权利要求5所述的一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法，其特征在于，（1%-5%）氨水的水溶液中含有浓度为1mg/mL的VC，所述二甲亚砜中含有浓度为1mg/mL的VC。

7.根据权利要求1所述的一种基于液相色谱串联质谱同时检测血清中多种水溶性维生素的方法，其特征在于，所述方法能同时检测出11种水溶性维生素，检出限可达到0.2ng/mL。

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