CN111175406A - 一种同时检测血液样品中多种水溶性维生素的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测血液样品中多种水溶性维生素的方法，首先通过简单的提取方法对生物样本进行前处理，然后进入色谱分离及质谱检测，针对每种维生素分别选择一对定性离子和一对定量离子，以各种维生素的相对保留时间和定性离子对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本方法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。本发明首次实现了应用LC‑MS技术对一份血清样本中的十三种水溶性维生素同时检测的目的，减小了干扰物影响，该方法操作简便快速分析时间仅10min，高通量、成本低，有效监测人体内水溶性维生素水平，对维生素的合理、安全补充具有指导意义，易于临床推广及普及。

Description

一种同时检测血液样品中多种水溶性维生素的方法及其应用
技术领域
本发明属于维生素分析检测领域，涉及一种同时检测血液样品中多种水溶性维生素的方法及其应用。
背景技术
维生素，分为脂溶性和水溶性维生素两类，是维持人体生命活动必须的一类有机物质，也是保持人体健康的重要活性物质。维生素缺乏或过量均会导致营养性疾病的发生，维生素B1，维生素B2，维生素B3-烟酸，维生素B3-烟酰胺，维生素B5，维生素B6-吡哆胺，维生素B6-吡哆醛，维生素B6-吡哆醇，维生素B7，维生素B9，维生素B12，维生素B13和维生素C均属于水溶性维生素，人体十三种水溶维生素缺乏或过量时会表现出不同的症状：维生素B1缺乏会导致脚气病；厌食、腹胀、消化不良、便秘；心脏功能失调等；维生素B2缺乏会导致舌炎、口角炎；脂溢性皮炎；妊娠妇女缺铁性贫血等；维生素B3缺乏可产生糙皮病，表现为皮炎、舌炎、口咽、腹泻及烦躁、失眠感觉异常等症状等；维生素B5缺乏会导致痛风或风湿性关节炎；低血糖等；维生素B6缺乏会导致慢性炎症；神经兴奋性增强、烦躁不安、睡眠不安、全身性抽搐等；维生素B7缺乏会导致皮炎、湿疹、生长迟缓；维生素B9缺乏会导致巨幼红细胞性贫血；高同型半胱氨酸血症；流产、早产、胎儿神经血管畸形、先天愚形。维生素B12缺乏会产生巨红细胞性贫血(恶性贫血)，脊髓变形，神经和周围神经退化等；牙龈出血以及恶心、食欲不振、体重减轻等症状；维生素B13具有改善肝功能，促进肝细胞的修复作用和其它新功能。可治疗痛风病，改进脑血管循环，增加吞噬细胞活性，提高组织再生能力，有助于治愈伤口。还可用于免疫辅药；维生素C缺乏会坏血症；口疮和口腔溃疡、牙龈出血、牙齿松动、皮肤色素沉着等症状。
现有技术中，常用的维生素检测方法主要包括毛细管电泳法、电化学分析法、高效液相色谱法、高效液相色谱质谱联用法等。其中电泳法、电化学法、高效液相色谱法存在一定的缺点，如：结果差异大、线性差、衍生化操作复杂、通量小等。而液相色谱质谱具有高灵敏度、高精确度、高通量的特点，因此，研究出一种基于液相色谱质谱联用的方法测定体内维生素并将其应用于临床愈发显得重要。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测血液样品中多种水溶性维生素的液质联用分析方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明第一方面，提供了一种血液水溶性维生素的检测方法，采用液质联用方法进行检测，包括以下步骤：
一.溶液的制备
供试品溶液制备：取样品加入到甲醇、乙腈溶液中，混匀离心，取上清后再加入水：甲醇，得供试品溶液；
标准品溶液的制备：将各标准品用甲酸和甲醇/水溶液溶解配制成标准品母液，将各标准品母液液用乙腈/甲醇进行稀释至同一容量瓶中，得到系列不同浓度的混合标准品溶液；
内标溶液制备：将各内标用甲酸和甲醇/水溶液溶解配制成标准品母液，将各标准品母液液用乙腈/甲醇进行稀释至同一容量瓶中，得到系列不同浓度的混内标溶液；
二.测定
将上述制备的供试品溶液、标准品和内标溶液进行LC-MS测定。通过本发明使用超高效液相色谱-质谱法检测血清中十三种水溶性维生素，特异性强，灵敏性高，通量高，结果客观易于分析，尤其适合临床普及应用。
根据本发明的实施例，所述样品为血浆或血清样品。
根据本发明的实施例，其中洗脱采用梯度方式洗脱，流动相A为10mM乙酸铵和0.01％甲酸混合的水溶液，流动相B为0.01％甲酸和10mM乙酸铵混合的乙腈溶液。
根据本发明的实施例，所述供试品溶液制备的操作为：取血清样品200～300μL，加入甲醇：乙腈溶液800～900μL，混匀，离心，取上清氮气吹干后加入甲醇溶液得供试品溶液。
根据本发明的实施例，标准品溶液制备的操作为：用甲酸和甲醇/水溶液配制各标准品的标准储备液，将各标准储备液用乙腈/甲醇进行稀释至同一容量瓶中，得到系列不同浓度的标准品溶液。
根据本发明的实施例，梯度洗脱程序为：0-1.5min 98％B，1.5-2.5min 98％-85％B，2.5-6min 85％-50％B，6-7.5min 50％-25％B，7.5-7.51min 25％-98％B，7.51-10min98％B。
根据本发明的实施例，MS检测的条件为：
电喷雾离子源ESI源；采用正离子扫描模式；雾化气流量：3L/min；加热气流量:10L/min；接口温度：300℃；加热块温度：400℃；DL温度：250℃；干燥气流量：10L/min。
根据本发明的实施例，MS检测过程中化合物测量参数如下表所示，
Figure BDA0002378105190000021
Figure BDA0002378105190000031
。
根据本发明的实施例，色谱柱为WATERS ACQUITY UPLC色谱柱：2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为35～40℃；优选的，柱温为35℃。
本发明第二方面，提供了一种用超高效液相色谱串联质谱法同时检测血液样品中十三种水溶性维生素的试剂盒，包括混合标准品母液，内标工作液，甲醇/乙腈(1:1,V/V)，水：甲醇(50:50,V/V)，乙腈/甲醇(75:25，v/v)，含有10mM乙酸铵和体积分数0.01％甲酸的乙腈：水(90：10)，含有0.01％甲酸和10mM乙酸铵的水溶液、质控；所述十三种水溶性维生素为维生素B1，维生素B2，维生素B3-烟酸，维生素B3-烟酰胺，维生素B5，维生素B6-吡哆胺，维生素B6-吡哆醛，维生素B6-吡哆醇，维生素B7，维生素B9，维生素B12，维生素B13和维生素C。
根据本发明的实施例，将标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴；进行线性回归分析得回归方程。将相应维生素峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中十三种水溶性的浓度。
根据本发明的实施例，包括质控品：含有三个水平的低、中、高浓度质控血清，质控品由人工血清添加混合维生素标准物质制得，并通过检测确定靶值。
根据本发明的实施例，通过岛津8050LC-MS/MS法检测300份儿童，孕妇和成人样本，样本检测范围如下：
维生素C：4.0-16.0μg/mL，维生素B1：1.3-12.0ng/mL，维生素B2：3.0-19.0ng/mL，维生素B3-烟酸：12.0-37.0ng/mL，维生素B3-烟酰胺：5.0-50.0ng/mL，维生素B5：12.0-58.0ng/mL，维生素B6-吡哆醛：0.5-8.0ng/mL，维生素B6-吡哆胺：0.5-12.0ng/mL，维生素B6-吡哆醇：0.6-15.0ng/mL，维生素B7：0.1-2.0ng/mL，维生素B9：4.0-32.0ng/mL，维生素B12：0.2-2.1ng/mL，维生素B13：7.0-13.0ng/mL。
本发明的有益效果是：
本发明通过对样本前处理方法和超高效液相色谱-质谱条件的优化，建立了一种同时检测血液样品中多种水溶性维生素的方法，特别是同时测定血清中维生素B1，维生素B2，维生素B3-烟酸，维生素B3-烟酰胺，维生素B5，维生素B6-吡哆胺，维生素B6-吡哆醛，维生素B6-吡哆醇，维生素B7，维生素B9，维生素B12，维生素B13、维生素C的方法，并进行精确的定性和定量分析。一是降低了检测成本，二是节省时间，三是减少采集被检测人的血量，四是可以对多种维生素的补充提供依据，综合而言是一种样本处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。
本发明用超高效液相色谱-质谱法检测血清中十三种水溶性维生素，特异性强，灵敏性高,通量高，结果客观易于分析，尤其适合临床普及应用。基于该方法的试剂盒不仅可以对营养性疾病患者进行病因诊断，还可以对潜在的维生素缺乏者进行用药指导，减少盲目补充维生素的现象发生。
本发明针对十三种维生素分别选择一对定性离子和一对定量离子，以各种维生素的相对保留时间和定性离子对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本方法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性,避免检测结果失真。
本发明首次实现了应用LC-MS技术对一份血清样本中的十三种水溶性维生素同时检测的目的，用两对离子分别进行定量和定性保证了检测物的特异性，降低了干扰物影响，该方法操作简便快速分析时间仅10min，通量高、成本低，有效监测人体内水溶性维生素水平，对维生素的合理、安全补充具有指导意义，易于临床推广及普及。
本发明通过岛津8050LC-MS/MS法检测300份儿童，孕妇和成人样本，样本检测精准度高，能显著提高检测方法的灵敏度，实用性强，有利于维生素的监督检查，提供了维生素技术支持。
附图说明
图1为本发明实施例1的维生素B1的色谱图；
图2为本发明实施例1的维生素B2的色谱图；
图3为本发明实施例1的维生素B3-烟酸的色谱图；
图4为本发明实施例1的维生素B3-烟酰胺的色谱图；
图5为本发明实施例1的维生素B5的色谱图；
图6为本发明实施例1的维生素B6--吡哆胺的色谱图；
图7为本发明实施例1的维生素B6--吡哆醛的色谱图；
图8为本发明实施例1的维生素B6--吡哆醇的色谱图；
图9为本发明实施例1的维生素B7的色谱图；
图10为本发明实施例1的维生素B9的色谱图；
图11为本发明实施例1的维生素B12的色谱图；
图12为本发明实施例1的维生素B13的色谱图；
图13为本发明实施例1的维生素C的色谱图。
具体实施方式
下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。
(1)样本预处理
供试品溶液制备：取200μL血清至离心管中，加入800μL甲醇：乙腈(甲醇：乙腈，1:1，V/V；其中含20μL内标工作液)，震荡混匀5min，4℃放置10min以沉淀蛋白。17000rpm离心10min，取上清800μL，转移至新1.5mL EP管中，氮气吹干(2mL/min流量)。再加入100μL水：甲醇(水：甲醇体积比为50:50,V/V)复溶，可作为供试品溶液进行色谱分析。同时配制标准工作液(又名标准品溶液)和内标工作液(又名内标溶液)。
(2)超高效液相色谱-质谱检测方法(LC-MS)
仪器及条件：
色谱柱：WATERS ACQUITY UPLC@BEH Amide Column(
Figure BDA0002378105190000052
1.7μm，2.1mm×100mm，1/pkg，HILIC色谱柱)；柱温：35℃；进样体积：10μL；流速：0.5ml/min；流动相A：水(含有0.01％甲酸+10mM乙酸铵)；流动相B：乙腈:水(90:10，含有0.01％甲酸+10mM乙酸铵)。梯度洗脱条件如表1：
表1梯度洗脱条件
Figure BDA0002378105190000051
Figure BDA0002378105190000061
质谱参数：
ESI源，MRM正负离子扫描模式；雾化气流量：3L/min；加热气流量:10L/min；接口温度：300℃；加热块温度：400℃；DL温度：250℃；干燥气流量：10L/min。MRM质谱参数如表2：
表2MRM质谱参数
Figure BDA0002378105190000062
色谱柱对化合物检测的影响
色谱条件以及梯度洗脱条件同上述步骤(2)超高效液相色谱-质谱检测方法，仅将亲水的Hilic柱子改为C18柱，比较十三种水溶性维生素的检测范围。
结果发现，不能有效地检测出水溶性维生素B6-吡哆醇、维生素B6-吡哆醛以及维生素B6-吡哆胺的含量。可能是因为水溶性维生素极性大，C18柱的保留时间不够长，不能检测到水溶性维生素B6-吡哆醇、维生素B6-吡哆醛以及维生素B6-吡哆胺。
流动相对化合物检测的影响
色谱条件以及梯度洗脱条件同上述步骤(2)超高效液相色谱-质谱检测方法，仅将流动相中的乙酸铵改为其他溶剂，比较十三种水溶性维生素的检测范围。
结果发现，改为其他溶液作为流动相溶液，不能有效一次性检测到水溶性维生素。
(3)计算结果
标准工作液(又名标准品溶液)的配制：标准品用含0.1％甲酸和0.2mg/mL DTT的甲醇/水溶液溶解，配置成标准品母液浓度为1mg/mL的标准品母液，用乙腈/甲醇稀释不同倍数，按比例混合后，配成一定梯度的水溶性混合标准溶液分装备用，作为标准品混标溶液。
内标工作液(又名内标溶液)的配制：内标用含0.1％甲酸和0.2mg/mL DTT的甲醇/水(50:50,v/v)溶液溶解，除维生素B12-[13C7]配置成内标母液浓度为1μg/mL外，本发明其余维生素分别配置成浓度为1mg/mL的内标母液。再使用乙腈/甲醇(75:25,v/v)稀释不同倍数，按一定比例混合成水溶性维生素内标工作液，用于样本提取。
将标准液配置不同浓度梯度，绘制标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴，进行线性回归分析得回归方程。将相应维生素峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中十三种水溶性的浓度。
样本检测
分别取儿童、孕妇，成人样本各100份按本发明液相色谱-质谱方法进行检测，得到样本检测范围值(表3)如下：
表3样本检测范围值
Figure BDA0002378105190000071
根据以上样本检测范围值，建立标准曲线，结果发现：
如图1，用本发明方法测定0.0028～7.27ng/mL的维生素B1标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好。
如图2，用本发明方法测定0.1775～454.5455ng/mL的维生素B2标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好。
如图3，用本发明方法测定2.8409～7272.7273ng/m L的维生素B3-烟酸标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好。
如图4，用本发明方法测定0.2840～727.2727ng/mL的维生素B3-烟酰胺标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好。
如图5，用本发明方法测定
Figure BDA0002378105190000081
的维生素B5标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好。
如图6，用本发明方法测定0.0142～36.3636ng/mL的维生素B6-吡哆胺标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好。
如图7，用本发明方法测定
Figure BDA0002378105190000082
的维生素B6-吡哆醛标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好。
如图8，用本发明方法测定
Figure BDA0002378105190000083
的维生素B6-吡哆醇标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好。
如图9，用本发明方法测定
Figure BDA0002378105190000084
的维生素B7标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好。
如图10，用本发明方法测定
Figure BDA0002378105190000085
的维生素B9标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好。
如图11，用本发明方法测定
Figure BDA0002378105190000086
的维生素B12标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好。
如图12，用本发明方法测定
Figure BDA0002378105190000087
的维生素B13标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好。
如图13，用本发明方法测定
Figure BDA0002378105190000088
的维生素C标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好。
在上述优化的条件，本发明用超高效液相色谱-质谱法检测血清中十三种水溶性维生素，特异性强，灵敏性高,通量高，结果客观易于分析，尤其适合临床普及应用。基于该方法的试剂盒不仅可以对营养性疾病患者进行病因诊断，还可以对潜在的维生素缺乏者进行用药指导，减少盲目补充维生素的现象发生。

Claims (9)

1.一种血液水溶性维生素的检测方法，其特征在于，采用液质联用方法进行检测，包括以下步骤：
一.溶液的制备
供试品溶液制备：取血液样品加入到甲醇、乙腈溶液中，混匀离心，取上清后再加入水：甲醇，得供试品溶液；
标准品溶液的制备：将各标准品用甲酸和甲醇/水溶液溶解配制成标准品母液，将各标准品母液液用乙腈/甲醇进行稀释至同一容量瓶中，得到系列不同浓度的混合标准品溶液；
内标溶液制备：将各内标用甲酸和甲醇/水溶液溶解配制成标准品母液，将各标准品母液液用乙腈/甲醇进行稀释至同一容量瓶中，得到系列不同浓度的混内标溶液；
二.测定
将上述制备的供试品溶液、标准品和内标溶液进行LC-MS测定。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述血液样品为血液中血浆或血清样品。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，其中洗脱采用梯度方式洗脱，流动相A为10mM乙酸铵和0.01％甲酸混合的水溶液，流动相B为0.01％甲酸和10mM乙酸铵混合的乙腈溶液。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液制备的操作为：取样品200～300μL，加入甲醇：乙腈溶液800～900μL，混匀，离心，取上清氮气吹干后加入甲醇溶液得供试品溶液。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，标准品溶液制备的操作为：用甲酸和甲醇/水溶液配制各标准品的标准储备液，将各标准储备液用乙腈/甲醇进行稀释至同一容量瓶中，得到系列不同浓度的标准品溶液。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：梯度洗脱程序为：0-1.5min 98％B，1.5-2.5min 98％-85％B，2.5-6min 85％-50％B，6-7.5min 50％-25％B，7.5-7.51min25％-98％B，7.51-10min 98％B。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，MS检测的条件为：
电喷雾离子源ESI源；采用正离子扫描模式；雾化气流量：3L/min；加热气流量:10L/min；
接口温度：300℃；加热块温度：400℃；DL温度：250℃；干燥气流量：10L/min。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，MS检测过程中组分测量参数如下所示：
Figure FDA0002378105180000011
Figure FDA0002378105180000021
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：色谱柱为WATERS ACQUITY UPLC色谱柱：2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为35～40℃；优选的，柱温为35℃。
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