KR100623164B1 - 뇌신경 보호효과를 갖는 신규한 은행잎 엑스를 정제하는방법 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 뇌신경 보호효과를 갖는 신규한 은행잎 엑스(Ginkgo Biloba Leaves Extract, GBB)의 정제방법 및 이로부터 얻어진 정제물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 정제방법에 따른 은행잎 정제물은 뇌신경 보호효과를 갖는 테르펜 화합물들과 바이플라본 화합물들의 함량을 크게 높이고, 조직인자 저해작용으로 인한 출혈시간을 연장시키는 부작용을 나타내는 프로안토시아니딘과 알킬프탈산을 제거함으로써 뇌신경 보호 활성이 향상되므로, 이를 함유하는 조성물은 신경세포의 사멸에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환 즉, 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병 등의 예방 및 치료를 위한 의약품으로 이용될 수 있다.
은행잎, 정제물, 징골리드, 바일로발리드, 바이플라본, 뇌신경 보호, 뇌허혈, 퇴행성 뇌질환, 치매, 알츠하이머병, 정제방법, 약학 조성물
Description
본 발명은 뇌신경 보호효과를 갖는 신규한 은행잎 엑스(Ginkgo Biloba Leaves Extract, GBB)의 정제방법 및 이로부터 얻어진 은행잎 정제물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
뇌허혈(cerebral ischemia)은 뇌혈관 질환의 하나인 뇌졸중(stroke)에서 가장 많이 나타나는 형태로서, 이로 인하여 뇌신경 세포에 손상이 생겨 중추신경계의 기능에 있어서 여러 가지 장애를 일으킨다.
뇌허혈은 신경세포를 손상시켜 신체마비, 인식장애, 시각 또는 언어 장애등 심각한 문제를 일으키는 질환으로서, 주로 내경동맥 또는 중대뇌 동맥의 폐쇄가 가장 큰 원인이 되고 있다.
뇌졸중으로 발생하는 뇌신경 세포 손상의 원인은 흥분성 신경 전달 물질의 과도한 유리, 자유 라디칼(free radical)의 생성, 뇌 단백질 생성의 저해, 유전자 발현 이상 및 면역 반응의 활성화 등으로 설명될 수 있으나, 뇌신경 세포 손상 기전의 복잡성 등으로 인하여 아직까지 뇌졸중으로 발생하는 뇌신경 세포의 손상을 보호해 줄 수 있는 치료제가 개발되지 못한 실정이다.
현재 뇌허혈 치료제로 NMDA(N-methyl-D-aspartate)글루타메이트(glutamate) 수용체의 길항제, 칼슘 통로(Ca2+channel) 차단제, 단백질 키나제 C(protein kinase C)의 억제제 등이 연구 개발되고 있으나, 임상에서 부작용 때문에 또는 효능이 검정되지 않아서 폐기되고 있다.
최근에는 소듐 통로(Na+ channel) 차단제, NOS(nitric oxide synthase) 억제제와 여러 종류의 신경 영양성(neurotrophic) 인자도 뇌신경 보호에 효과가 있는 것으로 관찰되어 이들을 응용한 약물을 개발하려는 연구가 진행되고 있다(Keyser J.D., et al., Trends Neurosci., 22, pp535-540, 1999).
이와 같이 다양한 원인으로 발생하는 뇌졸중에 대한 치료 약물은 단일한 작용 기전이 아닌, 다양한 작용기전을 갖는 약물들 또는 이러한 약물의 복합 투여가 더 효과적일 수 있다.
은행나무(Ginkgo biloba L.)의 잎으로부터 추출하여 제조된 종래의 은행잎 엑스는 여러 가지 있으며, 현재 우울증, 뇌질환에 수반하는 기억력과 집중력의 손상 등의 임상적인 용도로서 보건당국의 승인을 받아 판매되고 있다.
그러나 다음과 같은 여러 가지 질환들, 예를 들면, 뇌졸중, 외상으로 인한 뇌손상, 황반 변성(macular degeneration), 치매, 무산소증(anoxia), 정신질환, 그 밖의 가벼운 중추신경계 질환에 대하여 종래의 은행잎 엑스는 효과가 있는 것으로 연구되고 있고, 또한 부가적으로 항혈소판 활성, 혈류 개선 작용, 자유 라디칼 소거 작용 등이 있는 것으로 보고되어 왔으나, 이러한 효능 및 효과의 목적으로 임상에 적용하기에는 종래의 은행잎 엑스는 그 약효가 약하다고 한다(Elovic E.P., et al., Journal of Head Trauma Rehabilitation,
16(6), pp603-607, 2001).
은행잎 엑스에 함유되어 있는 생물활성을 나타내는 주성분은 플라보노이드계 화합물(flavonoids), 테르펜계 화합물(terpenes)과 축합형 탄닌인 프로안토시아니딘류(proanthocyanidins)이며, 그 밖에 알러지를 일으킨다고 알려진 알킬페놀류(alkyl phenols)가 있다.
은행잎의 플라보노이드 성분은 화학적으로 플라보놀 글리코시드류(flavonol glycosides)와 바이플라본류(biflavones)로 분류할 수 있으며, 후자에 속하는 화합물로서는 시아도피티신(sciadopitysin), 징게틴(ginkgetin), 이소징게틴(isoginkgetin), 바일로베틴(bilobetin), 아멘토플라본(amentoflavone) 등 6종이 보고되었으며, 플라보놀 글리코시드류에 속하는 화합물들은 22종이 밝혀졌으며 이들을 크게 3종류의 그룹으로 분류할 수 있다. 즉 비당체(aglycone)의 종류에 따라 캠페롤(kaempferol), 퀘르세틴(quercetin) 및 이소람네틴(isorhamnetin)의 배당체로 대별될 수 있다.
테르펜류 화합물은 징골리드(ginkgolide) A, B, C 및 J와 바일로발리드(bilobalide)로 알려져 있다.
종래의 은행잎 엑스는 플라보놀 글리코시드가 24%, 탄닌 성분인 프로안토시아니딘이 7%, 테르펜 화합물이 6%를 함유하지만 바이플라본은 거의 함유하지 않도록 표준화한 것, 또는 플라보놀 글리코시드가 25%, 테르펜 화합물이 6% 함유하도록 표준화 된 것이다(Maclennan K.M., et al., Progress in Neurobiology,
67, pp235-257, 2002).
이러한 관점에서 천연물, 특히 은행잎 엑스가 나타내는 약리작용을 재평가하여 그 효용성을 제고시켜 뇌졸중 또는 뇌허혈의 치료제로서 개발 가능성을 재검토해 보는 것은 매우 타당하다. 왜냐하면 현재 사용되고 있는 종래의 은행잎 엑스의 중추신경계에 대한 임상적인 효과와 그 약리작용 기전에 관한 많은 연구 논문이 축적되어 있으나(Maclennan K.M., et al., Progress in Neurobiology,
67, pp235-257, 2002), 이러한 많은 연구 논문 중에서 뇌허혈을 일으킨 실험동물 모델에서의 연구 성과에 의하면 은행잎 엑스 성분 중에서 바일로발리드, 징골리드 A 및 B는 각각 10, 50 및 100 mg/kg의 높은 용량에서 뇌경색 병소를 감소시키지만, 종래의 은행잎 엑스는 200 mg/kg의 용량으로 정맥 주사하여도 뇌경색 병소를 감소시키지 못한다는 연구 논문이 발표된 바 있기 때문에(Krieglstein J., et al., European J. Pharmaceutical Sciences,
3, pp39-48, 1995) 계속적인 뇌신경 보호 작용에 관한 연구의 필요성이 제기 되어 왔다.
또한, 혈액응고 제 Ⅲ인자(FⅢ)인 조직인자(TF)는 혈관 내피 세포막에 존재하며 혈관이 손상되거나, 인체가 스트레스를 받을 때 또는 암, 당뇨, 동맥경화 등의 질환이 있을 때 혈액내로 유입되면서 혈액응고 제 Ⅶ인자(FⅦ)와 결합하여 혈액 응고계의 외인계 경로를 개시시킨다. 뿐만 아니라 혈액응고 제 Ⅸ인자(FⅨ)와도 결합하여 혈액응고 내인계 경로도 개시시켜 혈액을 응고시켜 지혈반응에 관계한다(Kelley, R.F., Tissue factor(thromboplastin), Wiley Encyclopedia of Molecular Medicine, vol.5, pp3181-3185, 2002).
따라서 본 발명자들은 천연물로부터 조직인자 저해작용을 검색하여 항혈액 응고제를 발굴하기 위하여 조직인자의 활성을 간단히 측정하는 방법을 연구하였고(Han Y.N., et al., Arch. Pharm. Res., 21, pp549-554, 1998), 모과나무(Chaenomeles sinensis (Thunb) Koehne) 열매로부터 다수의 조직인자 저해제를 찾아낸 바 있다(Lee M.H., et al., Arch. Pharm. Res., 25, pp842-850, 2002; Lee M.H., et al., Planta Medica, 69, pp327-331, 2003).
이에 본 발명자들은 은행잎 엑스 중에 함유되어 있는 출혈시간을 연장시키는 부작용을 나타내는 성분들을 제거한 신규 은행잎 엑스가 뇌허혈 동물 모델에서 10 ~ 20 mg/kg의 용량으로 뇌경색 병소를 크게 감소시켜, 뇌신경 보호 효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 뇌신경 보호효과를 갖는 신규한 은행잎 엑스(Ginkgo Biloba Leaves Extract, GBB)의 정제방법 및 이로부터 얻은 은행잎 정제물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 뇌신경 보호효과를 갖는 신규한 은행잎 엑스(Ginkgo Biloba Leaves Extract, GBB)를 정제하는 정제방법을 제공하는데, 구체적으로는, 본 발명은 은행잎 건조분말을 메탄올, 에탄올 또는 아세톤 유기용매 단독 또는 물과의 혼합용매, 바람직하게는 30 내지 60% (v/v)의 혼합비를 갖는 유기용매 및 물의 혼합용매로 약 90 내지 100℃에서 1 시간 내지 12시간 동안 환류추출 또는 1일 내지 7일간 퍼콜레이션 추출법을 통하여 조추출물을 수득하고, 이 조추출물에 헥산을 가하여 헥산 가용부를 제거하고 남은 잔사에 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용부를 얻고, 여기에 증류수를 가하여 세척한 후 남은 에틸아세테이트 가용층을 농축한 후 이 농축액에 에탄올을 가하여 3시간 내지 24시간 실온 방치 후 여과, 감압농축 및 건조하는 건조공정을 포함함을 특징으로 하는 정제공정을 거쳐 수득되는 은행잎 추출 정제물 (본원에서 GBB 로 정의함) 및 그 정제방법을 제공한다.
상기 정제방법으로 통하여 얻어지는 추출 정제물(GBB)은 뇌신경 보호효과를 나타내는 성분의 함량이 증가되고, 부작용을 유발하거나 뇌신경 보호효과가 없는 성분을 제거함을 특징으로 하며, 구체적으로는 뇌신경보호 효과를 나타내는 성분인 테르펜(terpene)류의 징콜라이드 (ginkgolide) A, B, C 및 J; 약 11%, 바일로발리드(bilobalide); 4%와 같은 테르펜 화합물 약 15%; 시아노피티신 (sciadopitisin), 징게틴(ginkgetin), 이소징게틴 (isoginkgetin), 바일로베틴 (bilobetin), 아멘토 플라본(amentoflavone) 등의 바이플라보노이드 (biflavonoid)계 성분 약 4.5%; 뇌신경 보호효과가 없는 성분인 플라보놀 글리코시드 8% 이하; 부작용을 유발하는 성분 5 ppm 이하를 함유함을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 정제 방법에 의하여 제조된 은행잎 정제물(GBB)이 혈액응고계에 관련된 조직인자 저해작용으로 인한 출혈 시간을 연장시키는 프로안토시아니딘 (proanthocyanidine) 화합물, 출혈 시간을 연장시키고 설사를 일으키는 알킬프탈산 화합물과 같은 부작용 유발 성분 및 뇌신경 보호 효과가 거의 없는 플라보놀 글리코시드 성분이 실질적으로 거의 제거된 것임을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 구체적으로,
상기 은행잎 엑스를 정제하는 방법을 보다 구체적으로 설명하면,
실온에서 건조된 은행잎 분말을 그 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 2 내지 10배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜, 이들의 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:3의 혼합비를 갖는 물 및 메탄올, 에탄올, 아세톤과의 혼합용매로 20 내지 120℃, 바람직하게는 90 내지 100℃의 추출 온도에서 약 1 시간 내지 4일, 바람직하게는 2 시간 내지 3 일 동안 열수 추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 또는 퍼콜레이숀법 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각 추출 또는 퍼콜레이숀법의 추출방법으로 상기 추출공정을 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 4회 반복하여 추출물을 수득한 후, 여과하여 여과된 조 추출물을 제조하는 제 1단계;
상기 제 1단계의 1차 추출물에 동일 부피의 헥산 또는 헵탄을 가하여 2 내지 4회 추출 분획하여, 알킬프탈산과 같은 부작용 유발성분이 다량 함유된 상층부(Fr. H 해당)를 제거하고 하층부의 극성 용매층만을 분취한 다음 감압 농축하여 부작용 성분을 제거된 제 1차 정제물을 얻는 제 2단계;
상기 제 2단계에서 얻은 제 1차 정제물에 추출하기에 적절한 용량, 바람직하게는 정제물 부피의 약 1 내지 100배 부피, 보다 바람직하게는 10 내지 20배 부피의 에틸아세테이트를 가하여 추출분획하여 미정제된 에틸아세테이트 가용성의 제 2차 정제물을 회수하는 제 3단계;
상기 제 3단계에서 얻은 제2차 정제물에 추출하기에 적당량, 바람직하게는 정제물 부피의 약 1 내지 100분의 1 부피, 보다 바람직하게는 10 내지 5분의 1 부피의 증류수를 가하여 에틸아세테이트 가용성 제2차 정제물을 세척함으로서 주로 수용성 물질이 많이 함유된 분획(Fr. W에 해당)을 제거하여 제 3차 정제물을 얻는 제 4단계;
상기 제 4 단계에서 얻은 제 3차 정제물에 추출하기에 적당량, 바람직하게는 정제물 부피의 약 1 내지 100배 부피, 보다 바람직하게는 10 내지 20 배 부피의 에탄올을 가하여 3시간 내지 24시간, 바람직하게는 6시간 내지 12시간 동안 실온에서 방치한 후, 이 추출액을 여과함으로서 프로안토시아니딘과 다당체 결합체(Fr. P에 해당) 또는 플라보놀 글리코시드 등(Fr. C에 해당)의 효능이 없거나 부작용 유발성분이 다량 함유된 잔사 분획을 제거하고 여액을 감압농축 및 건조함으로서 뇌보호 활성성분인 테르펜계 화합물(Fr. A에 해당) 및 바이플라본계 성분(Fr. B에 해당)이 다량 함유된 본 발명의 은행잎 정제물 (GBB)을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 정제방법으로 정제된 은행잎 정제물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 정제방법에 의해 정제된 은행잎 엑스는 실험동물의 국소뇌허혈로 유발한 신경세포 손상에 대하여 신경세포 보호 작용이 있음이 확인된다.
따라서 본 발명에서는 뇌신경 보호효과를 갖는 은행잎 엑스가 신경세포사에 의하여 유발되는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 위한 의약품으로 이용될 수 있음을 보여준다.
또한, 상기 은행잎 엑스는 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 천연물로부터 분리해낸 성분으로써, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 은행잎 엑스를 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.
상기 퇴행성 뇌질환은 신경세포사에 의하여 유발되는 것을 특징으로 하며, 신경세포사에 의하여 유발되는 퇴행성 뇌질환으로는 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 또는 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병이 포함될 수 있다.
본 발명의 정제방법에 의해 정제된 뇌신경 보호효과를 갖는 은행잎 엑스를 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명에 따른 은행잎 엑스를 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사제의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 정제 및 멸균 주사제의 형태이다.
상세하게는, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 은행잎 엑스에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로 는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 은행잎 엑스는 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500 mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 은행잎 엑스의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경혈, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 은행잎 엑스는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 에탄올을 이용한 조추출물 및 1차 정제물의 제조
9월말에서 11월초에 채취한 푸른색 또는 노란색 은행잎을 실온에서 건조하여 분말로 한 다음, 4호체를 통과한 것을 사용하였다. 은행잎 분말 3 kg에 45%(v/v) 에탄올 수용액 30L를 가하고 90 ~ 100℃에서 2 ~ 5시간 가열, 환류 추출한다. 추출액을 실온으로 냉각시키고 여과지를 통하여 여과한다. 상기 과정을 1회 더 반복한 후, 은행잎 분말 찌꺼기를 45%(v/v)에탄올 15L로 세척하고 세척액을 여과지를 통하여 여과한다.
여액 및 세액을 모으고(약 60L) 여기에 헥산 60L를 가하여 3회 반복하여 추출한 다음, 45%에탄올 층을 55℃ 이하에서 감압하에 농축하며, 농축액이 약 3kg이 될 때 농축을 중단한다. 이 때 농축액 중의 에탄올 농도는 5%(v/v) 이하로 한다.
실시예 2. 아세톤을 이용한 조추출물 및 1차 정제물의 제조
상기 실시예 1에서 사용한 은행잎 분말 3kg에 아세톤 12L를 가하여 실온에서 3일간 퍼콜레이숀법을 수행한다. 3일 후 추출액을 용출하면서 은행잎 분말에 아세톤 8L를 가한다. 용출액이 8L가 될 때 용출을 중단하고 2일간 퍼콜레이숀한다. 2일 후 추출액을 용출하면서 다시 아세톤 8L를 은행잎 분말에 가하고 2일 간 2회 반복 하여 퍼콜레이숀한다. 용출액을 모아 여과지로 여과하고, 여액을 40℃ 이하에서 감압하에 농축하고 아세톤을 회수하여 아세톤 엑스 654g을 얻는다. 얻어진 아세톤 엑스에 에탄올 3L를 가하여 녹이고, 교반하면서 물 6L를 조금씩 가하여 에탄올의 농도가 33% 되도록 희석한다. 희석한 용액을 24시간 동안 10 ~ 15℃에서 방치한 다음 여과지로 여과하여 침전물을 제거한다.
여액에 헥산 9L를 가하여 추출한다. 헥산 9L로 2회 더 반복하여 추출한 다음 33% 에탄올층을 55℃이하에서 감압하에 농축하여 농축액이 약 2kg이 될 때 농축을 중단한다. 이 때 농축액 중의 에탄올 농도는 5%(v/v) 이하로 한다.
실시예 3. 은행잎 정제물(GBB)의 제조
상기 실시예 1 및 2에서 농축된 농축액으로부터 에틸아세테이트 가용추출물을 제조하기 위하여 농축액을 실온으로 식힌 다음 에틸아세테이트 3L로 3회 추출한다. 에틸아세테이트층을 모으고 여기에 증류수 1.8 ~ 0.9L를 가하여 에틸아세테이트층을 세척한다. 에틸아세테이트층을 분리하여 완전히 농축시켜 에틸아세테이트를 회수한다. 농축한 후 잔사에 에탄올 약 1L를 가하여 녹이고 12시간이상 실온에 방치한 후 여과지로 여과한 다음, 여액을 농축하여 건조시켜 에틸아세테이트 가용 은행잎 엑스(GBB)약 54 ~ 66g을 얻는다.
참조예 1. 종래 추출법에 의한 은행잎 엑스의 제조
상기 실시예 1에서 사용한 은행잎 분말 100g에 67%(v/v)아세톤 수용액, 100% 메탄올, 100% 아세톤 및 45%(v/v)에탄올 수용액을 각각 2L씩을 가하여, 실온에서 때때로 흔들어 주면서 퍼콜레이숀법으로 3일간 추출하였다. 각각의 용출액을 여과지를 통해 여과하고, 여액을 50℃에서 감압하에 농축하여 67% 아세톤 엑스 36.7g, 100% 메탄올 엑스 23.3g, 100% 아세톤 엑스 21.8g 및 45%에탄올 엑스 26.2g을 각각 수득 하였다.
참조예 2. 상법에 의한 은행잎의 추출 및 용매 분획물의 제조
단계 1 : 상기 실시예 1에서 사용한 은행잎 분말 6.0kg에 67%(v/v) 아세톤 수용액 60L를 가하고 3일간 실온에서 퍼콜레이숀법으로 추출하였다. 67% 아세톤 수용액 60L로 2회 더 퍼콜레이숀법에 따라 추출하였다. 추출액을 모아 여과지를 통해 여과하고, 여액을 50℃ 이하에서 감압하에 농축하여 아세톤을 대부분을 제거하였다.
단계 2 : 농축액이 약 6.0kg이 될 때 농축을 중단하고 실온까지 식힌 다음, 클로로포름 6L로 3회 추출하고 클로로포름층을 모아 50℃이하에서 농축하여 클로로포름 엑스 354g을 얻었다. 클로로포름 엑스 354g을 90%(v/v) 메탄올 3L에 녹이고 헥산 3L로 3회 추출하고, 헥산층을 모아 50℃이하에서 감압하에 농축하여 헥산 엑스(Fr.H) 209g을 얻었다.
단계 3 : 90%메탄올층에 물 6L를 소량씩 가하면서 잘 교반하여 30% 메탄올 용액으로 조절하였다. 실온에 하룻 밤을 방치한 다음, 생성한 침전물을 원심분리하여 따로 보관하고, 상등액에 에틸아세테이트 9L로 3회 추출하고, 에틸아세테이트 층을 모아 50℃에서 감압하에 농축하여 150g의 엑스(Fr.A)를 얻었다.
단계 4 : 위의 단계 3에서 따로 보관한 침전물과 단계 2에서 클로로포름층을 취하고 남은 수층을 서로 합하여 현탁시킨 후 에틸아세테이트 6L로 3회 추출하고, 에틸아세테이트층을 모아 50℃에서 감압하에 농축하여 82g의 엑스(Fr.B)를 얻었다.
단계 5 : 위의 단계 4에서 에틸아세테이트로 추출하고 남은 수층을 부탄올 6L로 3회 추출하고, 부탄올층을 모아 60℃에서 감압하에 농축하여 710g의 엑스(Fr.C)를 얻었다.
단계 6 : 위의 단계 5에서 부탄올로 추출하였을 때 부탄올층과 수층의 중간에 생성된 침전물을 모아 동결건조하여 진한 적갈색의 분말 57g(Fr.P)를 얻었다.
단계 7 : 위의 단계 6에서 수층을 모아 60℃에서 감압하에 농축하여 620g의 엑스(Fr.W)를 얻었다.
실험예 1. 신규한 은행잎 엑스(GBB)의 유효성분 분석
상기 실시예 3의 방법에 의해 제조된 신규한 은행잎 엑스(GBB)의 미량 성분 및 유효성분 분석을 아래와 같이 수행하였다.
1-1. 알킬프탈산의 검출
신규한 은행잎 엑스(GBB) 1g을 EtOH 5ml 에 녹이고, 여기에 헵탄을 가하여 정확히 25ml 로 하여 검액으로 하였다. 따로 알킬프탈산 표준품 (실험예 2 참조) 일정량을 헵탄에 녹여 3, 4, 5, 6, 7 μg/ 25ml 용액으로 조제하여 표준액으로 하 였다.
검액 및 표준액을 각각 5μl씩 실리카겔 박층판에 점적하고 전개용매로서 헥산:에틸아세테이트:빙초산 혼합용매(40:10:1)로 크로마토그래피를 실시하고 자외선(254nm)을 조사하였을 때 분홍색 형광이 Rf치 0.38에 나타난다. 검액의 형광 반점의 크기와 색깔 농도를 표준액의 것과 비교하여 분석하였다.
1-2. 징골리드 A, B, C 및 J의 정량 분석
문헌(Tang C., et al., J. Pharm. Biomed. Anal.,
33
, pp811-817, 2003
)의 방법으로 정량하였다.
1-3. 바이플라본류의 정량 분석
문헌(Chang S.K, et al., Kor. J. Pharmacogn., 24(1), pp54-57, 1993)의 방법으로 정량하였다.
1-4. 플라보놀 글리코시드류의 정량 분석
문헌 (Kang G.S., et al., Kor. J. Pharmacogn., 24(1), pp47-53, 1993)의 방법으로 정량하였다.
1-5. 아미노산의 정량 분석
아미노산 분석기로 정량하였다.
1-6. 프로안토시아니딘의 정량 분석
문헌(Broadhust R.B. et al., J. Sci. Fd. Agric.,
29, pp788-794, 1978)의 방법으로 정량하였다.
상기 실시예 3의 방법에 의해 제조된 신규한 은행잎 엑스(GBB)에는 부작용 유발 성분인 알킬프탈산이 5ppm 이하로 존재하며, 프로안토시아니딘은 거의 존재하지 않았으며, 유효성분을 분석한 결과, 징골리드 A, B, C 및 J는 모두 합하여 11.0±2.0%이고 바일로발리드는 4.0±2.0%로써 테르펜 화합물은 15.0±3.0%를 함유하는 것으로 나타났으며, 시아도피티신, 징게틴, 이소징게틴, 바일로베틴 및 아멘토플라본과 같은 바이플라본 화합물은 4.5±1.5%를 함유하였다. 플라보놀 글리코시드 중에서 쿠마로일(coumaroyl)기를 가진 것이 주로 검출되었으며 플라보놀 글리코시드는 8%이하로 함유되어 있었다.
종래의 일반적인 제조방법에 의해 제조된 67% 아세톤 가용 은행잎 엑스 (참고예 2의 Fr.A+Fr.C)와 상기 실시예 3의 방법의 제조방법에 의한 신규한 은행잎 엑스(GBB)의 성분 함량 차이는 플라보놀 글리코시드에 있어서 각각 20 ~ 30% 와 8% 이하이고, 프로안토시아니딘은 각각 10%와 거의 함유하지 않음으로 나타났으며, 테르펜 화합물은 각각 약 6%전후와 약 15%전후이고, 바이플라본은 각각 거의 함유하지 않음과 약 4.5%전후로 함유되어 있는 것으로 비교되었다.
또한, 종래의 일반적인 제조방법에 의해 제조된 67% 아세톤 가용 은행잎 엑스 (참고예 2의 Fr.A+Fr.C)에는 상당량의 아미노산이 함유되어 있고 특히, 아르기 닌, 프롤린, 알라닌이 주로 함유되어 있으나, 상기 실시예 3의 방법의 제조방법에 의한 신규한 은행잎 엑스(GBB)에는 아미노산이 거의 혼입되어 있지 않다. 그리고 종래의 일반적인 제조방법에 의해 제조된 67% 아세톤 가용 은행잎 엑스는 15단계의 추출 공정에 따라 제조되지만(Maclennan K.M. et al., Progress in Neurobiology, 67, pp235-257, 2002), 상기 실시예 3의 방법의 제조방법에 의한 신규한 은행잎 엑스(GBB)는 상기 실시예 3에서와 같은 총 4 내지 5 단계의 간단한 추출 공정으로 제조되기 때문에 제조 단가가 저렴한 장점이 기대됨을 확인하였다.
실험예 2. 참조예 2 분획물들로부터 조직인자 저해 활성 성분의 동정
상기 참조예 2의 분획물 중 Fr.H로부터 조직인자 저해 활성이 강하게 나타나는 성분을 검색한 결과, 하기 물성치를 갖는 미황색 분말의 알킬프탈산이 은행잎의 부작용을 나타내는 성분임을 확인하고 또한 하기와 같은 물성치를 통하여 하기 신규 구조의 화학식 Ⅰ 의 알킬 프탈산을 분리하고 동정하였다.
융점: 약 40℃,
TLC Rf: 0.38 (UV에서 분홍색 형광(254nm), 전개용매; 헥산 : 에틸아세테이트 : 빙초산 혼합용매=40:10:1),
UV λmax(ε, hexane) : 247.7(18,070), 319.6(10,030)
IR νmax(KBr, cm-1) : 3009, ~3000, 1647, 1609, 1449, 1302, 1246, 1211, 822, 707,
1H- NMR (500MHz, CDCl3) : 0.82 (3H, t, J=7.1Hz, H′15), 1.51(2H, quint., J=7.5Hz, H′14), 2.90(2H, t, J=7.5Hz, H′1), 5.27(2H, m, H′8 and H′
9), 6.68(1H, dd, J=7.4, 1.2, H6), 6.78(1H, dd, J=8.2, 1.2, H4), 7.25(1H, dd, J=7.4, 8.2, H5), 11.0(br.s),
13C-NMR δ (75MHz, CDCl3): 표 1 참조
EI-MS m/z(%):374(20, M+), 356(22, M+-H2O), 346(5,M+-CO), 338(13, 356-H2O), 328(6, 356-CO), 152(100).
상기 화합물의 메틸에스테르의 이화학적 데이터를 하기와 같이 나타내었다.
UV λmax(ε, hexane) : 245.7(12,010), 315.4(7,220),
IR νmax(KBr,cm-1) : 3059, 1736, 1667, 1609, 1449, 1315, 1250, 1211, 816, 709 ; 1H- NMR (300MHz, CDCl3): 0.89 (3H, t, J=6.9Hz, H′15), 1.53(2H, quint., J=7.5Hz, H′14), 2.87(2H, t, H′1), 3.96(3H, s, OCH3), 5.35(2H, m, H′8 and H′9), 6.72(1H, dd, J=7.5, 1.2, H6), 6.84(1H, dd, J=8.4, 1.2, H4), 7.28(1H, dd, J=7.5, 8.4, H5), 11.1(1H,s, COOH),
13C-NMR δ(75MHz, CDCl3): 표 1 참조 ; EI-MS m/z(%):388(49, M+), 360(31, M+-H2O), 334(69), 328(21), 166(100),
| C | 알킬프탈산 | 메틸알킬프탈레이트 |
| 1(C) | 110.5 | 108.7 |
| 2(C) | 110.5 | 108.7 |
| 3(C) | 147.9 | 143.2 |
| 4(CH) | 115.9 | 112.5 |
| 5(CH) | 135.4 | 131.1 |
| 6(CH) | 122.8 | 119.4 |
| 1′(CH2) | 36.4 | 33.4 |
| 2′(CH2) | 31.9 | 28.8 |
| 3′(CH2) | 29.3 | 26.1 |
| 4′(CH2) | 29.4 | 26.3 |
| 5′(CH2) | 29.5 | 26.3 |
| 6′(CH2) | 29.6 | 26.4 |
| 7′(CH2) | 27.1 | 24.0 |
| 8′(CH) | 129.8 | 126.8 |
| 9′(CH) | 129.9 | 126.8 |
| 10′(CH2) | 26.9 | 23.7 |
| 11′(CH2) | 29.8 | 26.7 |
| 12′(CH2) | 29.7 | 26.6 |
| 13′(CH2) | 32.0 | 28.9 |
| 14′(CH2) | 22.3 | 19.1 |
| 15′(CH2) | 14.0 | 10.9 |
| 1-COOH | 176.4 | - |
| 2-COOH | 163.6 | 159.6 |
| 1-COOCH3 | - | 169.0 |
| 1-COOCH3 | - | 48.9 |
실험예 3. 각 용매 분획물로부터 조직인자(TF)의 혈액응고 작용 측정
은행잎 엑스 중에서 조직인자 저해제를 찾아내기 위하여 조직 인자 저해 활성이 가장 강한 67% 아세톤 추출물로부터 상기 참고예 2에서와 같이 여러 가지 용매 분획물을 얻고, 각 분획물로부터 성분을 분리 및 정제하여 조직인자 저해 활성을 측정하였다.
조직인자의 활성은 프로트롬빈 시간(prothrombin time)을 측정하므로써 평가하였다(Han Y.N., et al., Arch. Pharm. Res., 21(5), pp549-554, 1998).
3-1. 조직인자의 분리
스프라그-도올리계(sprague-dawly) 수컷의 뇌 또는 폐 조직 5g에 생리식염수 20ml를 가하고 1분간 마쇄한 후 4℃, 2000 rpm에서 20분간 원심분리하고, 상등액을 다시 초원심분리기로 4℃, 105,000×g에서 1시간 원심분리하였다. 침전물을 생리식염수 5ml로 현탁시켜 이를 조직인자 원액으로 하였다. -15℃에서 보관하여 사용하였다.
3-2. 조직인자의 활성측정
플라스틱 시험관을 37℃ 수욕중에 담가두고 0.313% 구연산나트륨 혈장 100㎕, 조직인자 원액을 생리식염수로 희석한 것 100㎕를 가한 다음 반응액을 잘 섞고 혈장이 응고할 때까지의 시간(프로트롬빈 시간)을 측정하였다. 이를 2회 반복 실시하여 그 평균값을 취하였다. 프로트롬빈의 시간은 폐의 경우 18초, 뇌의 경우 30초가 될 때 조직인자의 활성을 100%로 정하고, 조직인자를 넣지 않고 생리식염수만을 넣고 측정한 혈장응고시간을 조직인자 0% 활성으로 하여 조직인자 각 농도에 따른 혈장응고 촉진작용(%)를 계산하였다. 조직인자 농도를 로그 수치로 x축에, 혈장응고 촉진작용(%)를 y축에 표시하여 표준곡선을 그렸다. 이 곡선에서 50% 혈장응고 촉진작용을 나타내는 조직인자의 양을 임의로 1단위로 정하였다. 또한, 여러 농도의 시료에 대하여, 각 농도 당 2개의 검액에 대해 조직인자에 대한 저해율(%)를 측정하였고, 그래프 상에서 조직인자를 50% 저해하는 검액의 농도를 산출하였다.
3-3. 조직인자 저해작용의 측정
조직인자 원액을 적절히 생리식염수로 희석한 것과 천연물 시료 용액을 70:30의 비율로 미리 섞어 놓은 것을 100㎕ 으로 사용하여 상기 실험예 1-2의 방법으로 혈액응고 시간을 측정하여, 하기의 수학식 1 에 의하여 저해율(%)을 계산하였다.
천연물 시료는 70%(v/v) 아세톤용액 (0.25mM Tris 완충액 30부피 : 아세톤 70부피)으로 녹여 사용하였다(Lee M.H. and Han Y.N., Planta Medica,
69, pp327-331, 2003).
Au : 저해제를 넣지 않고 조직인자만 넣었을 때의 조직인자 활성(unit)
Bu : 조직인자와 저해제를 모두 넣었을 때의 조직인자 활성(unit)
상기 실험 결과, 상기 참고예 1 에서 조제한 4종의 은행잎 엑스 중에서 67% 아세톤 엑스가 가장 강하게 조직 인자를 저해하였으며, 조직인자 1 단위를 50% 저해하는 물질의 양인 IC50의 값은 0.51㎍이었다. 아세톤 엑스와 45%에탄올 엑스에서는 67% 아세톤 엑스의 약 1/20 정도의 미약한 조직인자 저해 활성을 나타내었다. 또한, 용매 분획물 중에서 조직인자 저해 작용은 Fr.P > Fr.H > Fr.W > Fr.C의 순 서로 강하게 나타났으며, Fr.A 와 Fr.B에서는 조직인자 저해 활성이 나타나지 않았다(표 2 참조).
| 추출물 및 성분 | IC50(㎍/unit) |
| 67%(v/v)아세톤 엑스 | 0.51 |
| 100% 메탄올 엑스 | 1.05 |
| 100% 아세톤 엑스 | 10.95 |
| 45%(v/v)에탄올 엑스 | 10.87 |
| Fr.H | 1.30 |
| Fr.A | 작용없음 |
| Fr.B | 작용없음 |
| Fr.C | 7.03 |
| Fr.P | 0.58 |
| Fr.W | 2.32 |
실험예 4. 참조예 2의 각 용매 분획물로부터 분리한 조직인자 저해 활성 성분으로부터 조직인자(TF)의 혈액응고 작용 측정
Fr.P, Fr.W 및 Fr.C 중에서 조직인자 저해 활성 성분인 프로안토시아니딘을 확인 및 정량하는 방법은 산성 바닐린 정색법을 활용하였다(Broadhust R.B. et al., J. Sci. Fd. Agric., 29, pp788-794, 1978).
Fr.C는 플라보놀 글리코시드와 프로안토시아니딘을 함유하는 분획부로써 플라보놀 글리코시드 성분 중 퀘르세틴에서 미약한 조직인자의 저해 활성이 나타났다. 조직인자 저해 활성이 없는 Fr.A 와 Fr.B는 각각 테르펜 화합물과 바이플라본을 함유하는 분획부로써, Fr.A에서 분리된 징골리드 A, B, C 및 바일로발리드와 Fr.B에서 분리된 시아도피티신, 징게틴, 이소징게틴 및 바일로베틴에서는 조직인자 저해 활성이 나타나지 않았다 (표 3 참조).
| 성분 | IC50 (㎍/unit) | |
| Fr.H | 알킬프탈산 | 0.61 |
| 바일로볼 | 2.73 | |
| 아나카르딘산 | 3.02 | |
| Fr.A | 징골리드 A | 작용없음 |
| 징골리드 B | 작용없음 | |
| 징골리드 C | 작용없음 | |
| 바일로발리드 | 작용없음 | |
| Fr.B | 시아도피티신 | 작용없음 |
| 징게틴 | 작용없음 | |
| 이소징게틴 | 작용없음 | |
| 바일로베틴 | 작용없음 | |
| Fr.C | 퀘르세틴 | 118.50 |
| 캠페롤 | 작용없음 | |
| 이소람네틴 | 작용없음 | |
| 루틴 | 작용없음 | |
| Fr.P | 프로안토시아니딘 | 0.10 |
| Fr.W | 아르기닌 | 작용없음 |
| 프롤린 | 작용없음 | |
| 알라닌 | 작용없음 | |
실험예 5. 알킬프탈산, 신규한 은행잎 엑스와 참고예 2의 Fr. C의 경구투여가 흰쥐의 뇌 조직인자 활성 및 출혈시간에 미치는 영향 연구 실험
상기 실험예 3과 4의 시험관내 실험에서 은행잎에 존재하는 주된 조직인자 저해활성 성분이 알킬프탈산과 프로안토시아닌임을 밝혔으므로, 알킬프탈산 및 프로안토시아니딘이 여전히 함유되어 있는 종래의 일반적인 제조방법에 의해 제조된 은행잎 엑스(참고예 2의 Fr.C)가 동물실험에서도 조직인자를 저해하는가를 규명하고, 또한 신규한 은행잎 엑스(실시예 3)은 조직인자를 저해하는 부작용이 있는가를 동물실험에 의해 밝히고자 하였다.
체중 200-230g의 스프라그-도올리계(sprague-dawly)계 수컷 흰쥐를 한 군당 6마리씩으로 나누고, 실험 당일 오후 한 시부터 물만 공급하면서 절식시키고, 오후 5시와 다음 날 오전 10시에 시료를 1% CMC (carboxymethycellulose) 용액에 현탁하여 상기 알킬프탈산 0.2, 0.6, 2.0 mg/kg, 실시예 3의 시료(신규한 은행잎 엑스) 200mg/kg, 종래의 일반적인 방법에 의해 제조된 은행잎 엑스(참고예 2의 Fr.C)의 시료 0.5, 3.0, 18.0 mg/kg을, 대조군은 시료 대신 1% CMC를 각각 경구투여하였다. 상기한 용량을 1/2로 나누어 12시간 간격으로 2회 경구투여하고, 두 번째 경구투여 2시간 후에 쇼듐 펜토바르비탈을 40mg/kg 용량으로 복강 주사하여 마취 시켰다. 마취된 흰쥐의 꼬리 끝에서 0.3cm 자른 후 곧 37.5℃ 생리식염수에 담그고 지혈 될 때까지의 시간을 측정하였다. 출혈시간을 측정한 후 흰쥐를 희생시키고 뇌를 적출하고 난 후 뇌의 조직인자 활성을 상기 실험예 3의 방법으로 측정하였다. 각 실험군으로부터 측정된 수치의 평균값을 ± 표준오차로 나타내었다(*p < 0.05, **p<0.001). 또한 실험동물에게 시료를 두 번째 투여한 후 동물의 행동을 관찰하였을 때 설사를 일으키는 부작용을 발견하고 설사하는 흰쥐의 수를 세어 한 군당 6마리중에서 설사하는 흰쥐의 수를 측정하였다(표 4 참조).
상기 측정 결과, 본 발명의 알킬프탈산과 프로안토시아니딘이 제거된 상기 실시예 3의 신규한 은행잎 엑스는 설사를 일으키지 않으며, 조직인자를 저해하지 않고, 출혈시간도 연장시키지 않았으나 이와 비교하여 상기 실험예 2에서 동정된 화합물인 알킬프탈산과 프로안토시아니딘을 함유하는 종래의 일반적인 제조방법에 의해 제조된 67% 아세톤 가용 은행잎 엑스(참고예 2의 Fr.C)가 흰쥐에 경구 투여하 였을 때 설사를 일으키는 부작용을 나타내며, 혈액응고계의 개시 인자인 조직인자를 강하게 저해함으로써 출혈시간을 연장시킴을 확인하였다(표 4 참조).
| 용량(mg/kg) | 설사 | 출혈시간(초) | 출혈시간 연장율(%) | 뇌조직인자활성 (units/mg 단백질) | 뇌조직인자 활성저해율 (%) | |
| 대조군 | 1% CMC | 0/6 | 175±12 | - | 706±69 | - |
| 알킬프탈산 | 0.2 | 1/6 | 192±21 | 10 | 657±47 | 7 |
| 0.6 | 5/6 | 200±13 | 14 | 264±25* | 63 | |
| 2.0 | 6/6 | 257±10 | 47 | 234±32* | 67 | |
| 실시예3 | 200 | 0/6 | 169±9 | - | 964±35 | - |
| 참고예2의 Fr.C | 0.5 | 0/6 | 204±10* | 121 | 507±33** | 47 |
| 3.0 | 1/6 | 316±18** | 187 | 357±23** | 63 | |
| 18.0 | 2/6 | 346±40** | 205 | 130±9** | 87 | |
실험예 6. 일시적 국부 뇌허혈 동물 모델에서 시료의 경구투여에 의한 신경보호 작용의 측정
6-1. 실험동물 준비
실험동물은 7주령의 스프라그-도올리계(sprague-dawly)의 수컷 흰쥐, 260 ~ 270g 체중의 것을 공급받아 7일간 사육실에서 적응시켜 사용하였으며, 명암 주기는 12시간씩 자동으로 조절되는 환경에서 사육하였다. 사육실의 온도는 23±2℃로 유지되었고, 습도는 55±10%로 하였으며, 먹이와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.
6-2. 뇌허혈 동물모델 제작
뇌허혈 동물모델을 만들기 위하여 중대뇌 동맥 폐쇄(middle cerebral artery occlusion, MCAO) 수술을 하였다(Nagasawa H. et al., Stroke, 20, pp1037-1043, 1989). 뇌허혈은 120분 동안 중대뇌 동맥을 폐쇄하고 재관류를 하여 22시간 동안 유지하였다. 모든 수술 과정에서 체온 저하를 막기 위하여 가열 받이(pad), 가열 램프를 이용하여 체온을 37±0.5℃로 유지하였다. 시료의 투여는 뇌허혈 유발 2 시간 및 재관류 후 2시간 후에 알킬프탈산과 프로안토시아니딘이 제거된 상기 실시예 3의 신규한 은행잎 엑스 10, 20, 40, 80 mg/kg 농도로 생리식염수에 녹이거나 현탁시켜 경구 투여하였고, 양성 대조 약물로 급성 뇌졸중의 치료제로 알려져 있는 MCI-186을 10mg/kg으로 경구 투여하였다(Tanaka M., Folia Pharmacol. Jan., 119, pp301-308, 2002). 또한, 대조군으로 생리식염수를 상기 시료들과 동량으로 경구 투여하였다.
6-3. 뇌허혈 손상의 조직학적 평가
뇌조직 손상을 평가하기 위하여 중대뇌 동맥 폐쇄 24시간 후에 뇌를 적출하여 2,3,5-트리페닐 테트라 졸리움 클로라이드(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride)로 염색하였다. 염색된 뇌절편을 10% 포르말린 중성 완충액에 담가 고정시킨 후 컴퓨터에 저장하였다. 뇌경색이 일어난 부위의 면적(infarct area, mm2)은 컴퓨터화된 영상분석계를 사용하여 측정하였으며, 경색 용적(infarct volume, mm3)은 각 절편의 경색 면적의 총 합계를 절편의 두께로 곱하여 계산하였다. 측정된 값은 평균±SEM로 나타내었다(*p<0.05, **p<0.01).
상기 실험의 결과, 표 5에서 보는 바와 같이, 생리식염수를 대조군으로 실험한 경우 뇌손상의 부피가 350.6±20.3 mm3(평균±SEM)이었으며, 양성 대조군으로 MIC-186을 투여한 경우 180.3±19.0으로서 약 47.8%의 유의한 뇌손상 병소 감소 효과가 있음을 확인하였다(p<0.05). 이 때 본 발명의 신규한 은행잎 엑스 10mg/kg 용량군은 31.3%(p<0.01), 20mg/kg 용량군은 54.2%(p<0.05)의 유의한 뇌손상 병소 감소 효과가 있음을 관찰할 수 있었다. 또한, 신규한 은행잎 엑스의 용량을 더 높인 40 및 80 mg/kg의 용량군에서도 각각 55.3%와 60.0%의 유의한 뇌손상 병소 감소 효과를 관찰하였다(p<0.01). 종래의 은행잎 엑스는 본 실험예 6과 같은 방법의 실험동물 모델에서 200mg/kg의 용량으로 정맥 주사하여도 뇌손상에 의한 병소를 감소시키지 못하지만(Krieglstein J., et al., Eup. J. Pharm. Sci., 3, pp39-48, 1995), 본 발명은 신규 은행잎 엑스가 하기 표 5에서 보는 바와 같이 20mg/kg의 용량으로 경구 투여에 의해, 양성 대조약물(MIC-186) 10mg/kg 투여군 보다 더 강한 뇌신경 보호 효과를 나타냄을 확인하였다(표 5 참조).
| 실험군(n=5) | 용량(mg/kg) | 뇌경색 용량(mm3) | 뇌신경 보호 효과(%) |
| 생리식염수 투여군 | - | 350.6±20.3 | - |
| MCI-186 투여군 | 10 | 183.0±19.0* | 47.8 |
| 실시예 3 (신규한 은행잎 엑스) | 10 | 240.7±14.8** | 31.3 |
| 20 | 160.5±21.3* | 54.2 | |
| 40 | 156.8±12.7** | 55.3 | |
| 80 | 140.1±20.4** | 60.0 |
실험예 7. 일시적 국부 뇌허혈 동물 모델에서 시료의 정맥 투여에 의한 신경보호 작용의 측정
상기 실험예 6과 동일한 실험 과정을 수행하고, 시료를 정맥 투여하여 나타난 뇌신경 보호 효과를 경구 투여시와 비교하여 관찰하였다. 측정된 값은 평균±SEM로 나타내었다(**p<0.01).
상기 실험의 결과, 표 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 신규한 은행잎 엑스 20mg/kg 용량을 정맥 투여한 군에서 47.9%의 유의적인 뇌신경 보호 효과를 나타내었으며(p<0.01), 경구 투여한 군에서 51.6%의 유의적인 뇌신경 보호 효과를 나타내었다(표 6 참조).
| 실험군(n=5) | 용량(mg/kg) | 뇌경색 용량(mm3) | 뇌신경 보호 효과(%) |
| 생리식염수 투여군 | - | 350.2±20.1 | - |
| MCI-186 투여군 | 10 | 184.6±18.5** | 47.3 |
| 실시예 3 경구 투여군 | 20 | 169.5±19.8** | 51.6 |
| 실시예 3 정맥 투여군 | 20 | 182.6±25.6** | 47.9 |
실험예 8. 일시적 국부 뇌허혈 동물 모델에서 참조예 2의 용매 분획물, 실시예 3의 신규한 은행잎 엑스와 이들의 혼합물 시료의 경구투여에 의한 신경보호 작용의 측정
상기 실험예 6과 동일한 실험 과정을 수행하고, 상기 참고예 2의 각 용매 분획물 20mg/kg와 각 용매 분획물 10mg/kg과 실시예 3의 신규한 은행잎 엑스 10mg/kg 의 혼합물을 각각 경구 투여하여 뇌신경 보호 효과를 관찰하였다. 측정된 값은 평균±SEM로 나타내었다(*p<0.05, **p<0.01).
상기 실험의 결과, 은행잎 엑스의 여러 가지 용매 분획물을 20mg/kg의 용량으로 각각 경구 투여하였을 때, Fr.A는 29.0%, Fr.B 20.6%, Fr.C 10.8%, Fr.H 4.8%, Fr.P 6.7%의 뇌손상 보호 효과가 측정되었으나, 모두 통계적으로 유의성이 나타나지 않았다. 또한, 실시예 3의 신규한 은행잎 엑스 10mg/kg와 각 용매 분획물 10mg/kg을 혼합하여 20mg/kg의 용량을 경구 투여한 결과, 신규한 은행잎 엑스와 Fr.A 혼합물 투여군은 51.7%, Fr.B 혼합물 투여군은 42.1%의 유의적인 뇌손상 보호 효과를 나타내었다. Fr.A에는 징골리드와 바일로발리드와 같은 테르펜 화합물이 함유하는 분획이며, Fr.B는 바이플라본 화합물을 주로 함유하는 분획으로써, 이 두가지 분획물이 본 발명의 신규한 은행잎 엑스의 뇌손상 보호 효과를 증강시킴을 확인하였다.
반면에 신규한 은행잎 엑스와 Fr.C 혼합물 투여군, 신규한 은행잎 엑스와 Fr.H 혼합물 투여군, 신규한 은행잎 엑스와 Fr.P 혼합물 투여군에서는 모두 신규한 은행잎 엑스의 뇌신경 보호 효과(p<0.05)를 감소시키거나 또는 소멸시킴을 확인하였다. 이들 Fr.C, Fr.H, Fr.P는 상기 표 2 내지 표 3에서와 같이 조직인자를 저해하는 성분을 함유하는 분획물이며, 조직인자 저해작용이 강할수록 신규 은행잎 엑스의 뇌신경 보호 효과를 크게 저해시킴을 확인하였다(표 7 참조).
| 실험군 | 투여용량(mg/kg) | 뇌경색 용량(mm 3 ) | 뇌신경보호효과(%) |
| 생리식염수 투여군 | - | 350.2±20.3 | - |
| MCI-186 투여군 | 10 | 183.4±19.1** | 47.6 |
| Fr.A 투여군 | 20 | 248.5±23.6 | 29.0 |
| Fr.B 투여군 | 20 | 278.0±30.7 | 20.6 |
| Fr.C 투여군 | 20 | 312.3±23.4 | 10.8 |
| Fr.H 투여군 | 20 | 333.4±21.7 | 4.8 |
| Fr.P 투여군 | 20 | 326.7±35.9 | 6.7 |
| 실시예 3 | 10 | 235.1±21.4 | 32.9 |
| 20 | 159.5±18.9** | 54.5 | |
| 실시예 3과 Fr.A 혼합물 | 10+10 | 169.3±21.1** | 51.7 |
| 실시예 3과 Fr.B 혼합물 | 10+10 | 202.7±25.5** | 42.1 |
| 실시예 3과 Fr.C 혼합물 | 10+10 | 265.1±31.4 | 24.3 |
| 실시예 3과 Fr.H 혼합물 | 10+10 | 294.5±49.9 | 15.9 |
| 실시예 3과 Fr.P 혼합물 | 10+10 | 330.1±29.6 | 5.7 |
실험예 9. 일시적 국부 뇌허혈 동물 모델에서 시료의 투여시간에 따른 신경보호 작용의 측정
일시적 국부 뇌허혈 동물 모델에서 본 발명의 신규한 은행잎 엑스의 투여 시간에 따른 치료창(therapeutic window)을 관찰하기 위하여, 실험예 6과 동일한 실험 과정을 수행하고, 뇌손상 유발 후 1, 3 시간, 2, 4 시간 및 3, 5 시간에 걸쳐 실시예 3의 신규한 은행잎 엑스를 40mg/kg로 경구 투여하고 양성 대조군으로 MCI-186을 10mg/kg, 대조군으로 생리식염수를 40mg/kg로 경구 투여하여 뇌신경 보호 효과를 관찰하였다. 측정된 값은 평균±SEM로 나타내었다(*p<0.05, **p<0.01).
상기 실험의 결과, 뇌손상을 일으킨 후, 신규 은행잎 엑스를 1, 3시간에 투여한 군에서 59.4%, 2, 4시간에 투여한 군에서 56.1%, 3, 5시간에 투여한 군에서 49.0%의 뇌신경 보호 효과를 나타냄을 확인하였다. 즉, 뇌손상 후 빠른 시간내에 약물의 처치가 이루어질수록 뇌신경 보호 효과과 증가하며, 뇌 손상 후 5시간 이내 에 약물을 투여할 경우에 뇌손상 보호 효과가 나타날 수 있음을 확인하였다(표 8 참조).
| 실험군(n=5) | 용량(mg/kg) | 뇌경색 용량(mm3) | 뇌신경보호효과(%) |
| 생리식염수 투여군 | - | 350.4±19.4 | - |
| MIC-186 투여군 | 10 | 185.2±18.9** | 47.1 |
| 실시예 3의 1, 3시간 투여군 | 40 | 142.4±23.2** | 59.4 |
| 실시예 3의 2, 4시간 투여군 | 40 | 153.8±12.2** | 56.1 |
| 실시예 3의 3, 5시간 투여군 | 40 | 178.7±51.1* | 49.0 |
실험예 10. 급성독성 실험
10-1. 경구투여
ICR계 마우스(몸무게 25±5 g)와 스프라그-도올리계(sprague-dawly) 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 실시예 3의 신규 은행잎 정제물을 각각 100, 500, 1000 및 2000 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었으며, 체중증가, 사료 섭취량 등에서도 유의한 이상이 전혀 발견되지 않았다.
실험 결과, 본 발명의 조성물은 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.
본 발명의 신규한 은행잎 엑스는 아래와 같은 제형으로 제조될 수 있으며, 아래의 제제 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한 되는 것은 아니다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 3의 은행잎 엑스 건조분말 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 3의 은행잎 엑스 건조분말 20 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 3의 은행잎 엑스 건조분말 20 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 3의 은행잎 엑스 건조분말 20 mg
글리세린 적량
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 3의 은행잎 엑스 건조분말 200 ㎎
설탕 20 g
이성화당 20 g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 1000 ㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 뇌신경 보호효과를 갖는 신규한 은행잎 엑스의 정제 방법은 종래 은행잎 엑스의 정제 공정에 비하여 간단하고 제조 단가가 저렴하며 설사 및 출혈 시간을 연장시키는 등의 부작용을 유발하는 성분들을 완전히 제거하여 유효성분인 테르펜과 바이플라본의 함량을 크게 높힘으로써, 본 발명의 신규한 은행잎 엑스를 유효성분으로 함유하는 조성물은 뇌허혈에 의해 유도되는 신경세포 손상을 보호하는 효과 있으므로 신경세포의 사멸에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환 즉, 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병 등의 예방 및 치료를 위한 의약품으로 이용될 수 있다.
Claims (8)
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- 은행잎 건조분말을 메탄올, 에탄올 또는 아세톤 유기용매 단독 또는 물과의 혼합용매로 약 90 내지 100℃에서 1시간 내지 12시간 동안 환류추출 또는 1일 내지 7일간 퍼콜레이션 추출법을 통하여 조추출물을 수득하고, 이 조추출물에 헥산을 가하여 헥산 가용부를 제거하고 남은 잔사에 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용부를 얻고, 여기에 증류수를 가하여 세척한 후 남은 에틸아세테이트 가용층을 농축한 후, 이 농축액에 에탄올을 가하여 3시간 내지 24시간 실온 방치 후 여과, 여과물을 감압농축 및 건조하는 건조공정을 포함함을 특징으로 하는 정제공정을 거쳐 수득되는 은행잎 추출 정제물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 약학조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 에어로졸 형태를 포함하는 경구형 제형인 약학조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 약학조성물은 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액 형태인 약학조성물.
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