CN103919768B

CN103919768B - 一种含有异银杏双黄酮和白果内酯的药物组合物及其制剂

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Publication number: CN103919768B
Application number: CN201410127176.3A
Authority: CN
Inventors: 吴静
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-03-30
Filing date: 2014-03-30
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2034-03-30
Also published as: CN103919768A

Abstract

本发明提供了一种含有异银杏双黄酮和白果内酯的药物组合物及其制剂，其包括异银杏双黄酮、氨基酸和白果内酯；所述氨基酸为精氨酸或赖氨酸。本发明提供的含有异银杏双黄酮和白果内酯是药物组合物制备的制剂稳定性优秀，具有更好的药理作用。

Description

一种含有异银杏双黄酮和白果内酯的药物组合物及其制剂

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种含有异银杏双黄酮和白果内酯的药物组合物及其制剂。

背景技术

银杏(GinkgobilobaL.)是一种重要的药用植物，银杏叶是银杏科植物银杏的叶子，其味苦涩、性平，其所含的银杏总黄酮和萜内酯具有重要的药用价值。异银杏双黄酮，英文名Isoginkgetin；分子式＝C₃₂H₂₂O₁₀；分子量：566.51；结构式为：

《异银杏双黄酮对血小板功能的影响》(中药新药与临床药理，1992年第4期)证实了异银杏双黄酮具有抗血小板粘附聚集功能及抑制血栓形成作用，《异银杏双黄酮对缺氧大鼠的氧自由基清除作用》(中药新药与临床药理，1993年第4期)进一步证实了异银杏双黄酮对缺氧大鼠的氧自由基清除作用。

目前市场上出现的银杏类制剂主要以银杏总内酯和总黄酮为有效部位，尚未出现异银杏双黄酮和白果内酯类制剂。但这些中药注射制剂是多组分的有效部位，其发生不良反应无法追溯，给医生和患者带来潜在的隐患。

发明内容

基于上述原因，本发明科研组经过若干次创造性试验，研究表明一种新的药物组合物：异银杏双黄酮和白果内酯；本发明的目的在于提供一种含有异银杏双黄酮和白果内酯的药用组合物及其制备方法。

本发明的目的在于提供一种上述异银杏双黄酮组合物的制备方法。

本发明通过下述技术方案实现的。

一种含有异银杏双黄酮和白果内酯的药物组合物，含有异银杏双黄酮、丙二醇、氨基酸和白果内酯；所述氨基酸为精氨酸和赖氨酸；所述异银杏双黄酮、氨基酸和白果内酯的重量比依次为12∶1-10∶0.5-8。

所述异银杏双黄酮、氮基酸和白果内酯的重量比为12∶2-8∶1-5。

所述异银杏双黄酮、氨基酸和白果内酯的重量比依次为3∶2∶1。

所述的一种药物组合物制备成注射制剂。

所述的组合物的制备方法，包括以下步骤：取异银杏双黄酮、氨基酸、白果内酯和注射用水混合完全，搅拌至澄清，调节pH值6.5-7.3，得到浓度为60-150mg/ml的药液；超滤后分装药液，灌装，得到注射剂。

一种异银杏双黄酮的制备方法，包括以下步骤：

(1)取银杏叶提取物，按照每重量份银杏叶提取物加入5-10体积份的70％-90％低级醇水溶液配置成溶液，于4℃下保存8-16h，得到银杏叶提取物冷浸液；所述低级醇水溶液为甲醇或乙醇或丙醇的水溶液；

(2)将步骤(1)所述的银杏叶提取物冷浸液于室温超声30-60min，过滤，蒸干，得到固体粗提物；

(3)步骤(2)得到固体粗提物经丙酮溶解后，柱层析法洗脱固体粗提物的溶解液，其洗脱液为体积比为1∶2∶0.2的丙酮∶石油醚∶氨水，洗脱速度为每小时200-250mL，收集洗脱液，收集时间为14-16h；

(4)将步骤(3)所得洗脱液用盐酸萃取，收集酸液后以氯仿萃取，水相用氨水调节其pH为8-9，离心收集沉淀；

(5)将步骤(4)所得沉淀以超纯水反复洗涤脱色3次，-80℃冻干；

(6)将步骤(5)所得用乙酸乙酯重结晶，制得异银杏双黄酮。

具体实施方式

本发明所述异银杏双黄酮、白果内酯均由成都瑞芬思生物科技有限公司购买所得；本发明所述银杏叶提取物符合中国药典一部银杏叶提取物质量标准，购自成都瑞芬思生物科技有限公司；其中异银杏双黄酮也可以根据本发明所述方法制备。

本发明所述的精氨酸、赖氨酸购自张家港市思普生化有限公司。

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

制备实施例

实施例1

(1)取银杏叶提取物50g，用250ml的70％甲醇溶液配置成溶液，于4℃下保存8h，得到银杏叶提取物冷浸液；

(2)将步骤(1)所述的银杏叶提取物冷浸液于室温超声30min，过滤，蒸干，得到固体粗提物；

(3)步骤(2)得到固体粗提物经丙酮溶解后，柱层析法洗脱固体粗提物的溶解液，其洗脱液为体积比为1∶2∶0.2的丙酮∶石油醚∶氨水，洗脱速度为每小时200ml，收集洗脱液，收集时间为14h；

(4)将步骤(3)所得洗脱液用盐酸萃取，收集酸液后以氯仿萃取，水相用氨水调节其pH为8，离心收集沉淀；

(5)将步骤(4)所得沉淀以超纯水洗涤脱色3次，-80℃冻干；

(6)将步骤(5)所得单体用乙酸乙酯重结晶，制得异银杏双黄酮精品，纯度99.0％。

实施例2

(1)取银杏叶提取物50g，用300ml的80％乙醇配置成溶液，于4℃下保存10h，得到银杏叶提取物冷浸液；

(2)将步骤(1)所述的银杏叶提取物冷浸液于室温超声40min，过滤，蒸干，得到固体粗提物；

(3)步骤(2)得到固体粗提物经丙酮溶解后，柱层析法洗脱固体粗提物的溶解液，其洗脱液为体积比为1∶2∶0.2的丙酮∶石油醚∶氨水，洗脱速度为每小时220mL，收集洗脱液，收集时间为14.5h；

(4)将步骤(3)所得洗脱液用盐酸萃取，收集酸液后以氯仿萃取，水相用氨水调节其pH为8.5，离心收集沉淀；

(5)将步骤(4)所得沉淀以超纯水洗涤脱色3次，-80℃冻干；

(6)将步骤(5)所得单体用乙酸乙酯重结晶，制得异银杏双黄酮精品，纯度99.6％。

实施例3

(1)取银杏叶提取物50g，用400ml的90％丙醇配置成溶液，于4℃下保存12h，得到银杏叶提取物冷浸液；

(2)将步骤(1)所述的银杏叶提取物冷浸液于室温超声50min，过滤，蒸干，得到固体粗提物；

(3)步骤(2)得到固体粗提物经丙酮溶解后，柱层析法洗脱固体粗提物的溶解液，其洗脱液为体积比为1∶2∶0.2的丙酮∶石油醚∶氨水，洗脱速度为每小时250mL，收集洗脱液，收集时间为16h；

(4)将步骤(3)所得洗脱液用盐酸萃取，收集酸液后以氯仿萃取，水相用氨水调节其pH为9，离心收集沉淀；

(5)将步骤(4)所得沉淀以超纯水洗涤脱色3次，-80℃冻干；

(6)将步骤(5)所得单体用乙酸乙酯重结晶，制得异银杏双黄酮精品，纯度99.5％。

实施例4

(1)取银杏叶提取物50g，用500ml的75％丙醇配置成溶液，于4℃下保存10h，得到银杏叶提取物冷浸液；

(2)将步骤(1)所述的银杏叶提取物冷浸液于室温超声45min，过滤，蒸干，得到固体粗提物；

(3)步骤(2)得到固体粗提物经丙酮溶解后，柱层析法洗脱固体粗提物的溶解液，其洗脱液为体积比为1∶2∶0.2的丙酮∶石油醚∶氨水，洗脱速度为每小时240mL，收集洗脱液，收集时间为15h；

(4)将步骤(3)所得洗脱液用盐酸萃取，收集酸液后以氯仿萃取，水相用氨水调节其pH为8.7，离心收集沉淀；

(5)将步骤(4)所得沉淀以超纯水洗涤脱色3次，-80℃冻干；

(6)将步骤(5)所得单体用热乙酸乙酯重结晶，制得异银杏双黄酮精品，纯度99.7％。

制剂实施例

实施例5

取异银杏双黄酮12g、精氨酸1g、白果内酯8g和注射用水混合完全，搅拌至澄清，调节pH值6.5，得到浓度为60mg/ml的药液；超滤后分装药液，灌装，得到注射剂。

实施例6

取实施例4制备的异银杏双黄酮12g、精氨酸2g、白果内酯0.5g和注射用水混合完全，搅拌至澄清，调节pH值7，得到浓度为150mg/ml的药液；超滤后分装药液，自-45℃起分段升温真空冷冻干燥，制得注射用冻干粉针剂。

实施例7

取实施例1制备的异银杏双黄酮12g、赖氨酸2g、白果内酯1g和注射用水混合完全，搅拌至澄清，调节pH值7.3，得到浓度为100mg/ml的药液；超滤后分装药液，灌装，得到注射剂。

实施例8

取实施例2制备的异银杏双黄酮12g、赖氨酸7g、白果内酯5g和注射用水混合完全，搅拌至澄清，调节pH值6.8，得到浓度为80mg/ml的药液；超滤后分装药液，，自-45℃起分段升温真空冷冻干燥，制得注射用冻干粉针剂。

实施例9

取实施例3制备的异银杏双黄酮12g、赖氨酸10g、白果内酯4g和注射用水混合完全，搅拌至澄清，调节pH值6.7，得到浓度为90mg/ml的药液；超滤后分装药液，灌装，得到注射剂。

实施例10

取异银杏双黄酮12g、精氨酸8g、白果内酯4g和注射用水混合完全，搅拌至澄清，调节pH值7，得到浓度为70mg/ml的药液；超滤后分装药液，灌装，得到注射剂。

试验例1异银杏双黄酮测定试验

测定方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％醋酸水溶液(70∶30)为流动相；检测波长为330nm。理论板数按银杏双黄酮峰计算不低于3000。

对照品溶液的制备精密称取异银杏双黄酮对照品，用甲醇溶解制成0.01mg/ml的对照品溶液。

供试品溶液的制备

取银杏双黄酮提取物(或者制剂)，精密称定，用甲醇超声溶解制成0.01mg/ml的供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本实验例参照以下对比文件的方法制备了异银杏双黄酮，并采用本发明中的测试方法，测定了异银杏双黄酮的含量及产率，结果见表1。

样品1为参照专利201110224735.9的实施例1的方法制备的异银杏双黄酮提取物；

样品2为参照专利200910067430.4的实施例1的方法制备的异银杏双黄酮提取物；

表1异银杏双黄酮提取方法测试结果

	样品1	样品2	实施例1	实施例2
					纯度	87.4％	97.3％	99.0％	99.6％
提取率	0.376	0.172	0.47	0.48

试验例2

本试验例测试了本发明制备的异银杏双黄酮提取物的稳定性。

样品1为实施例1产品；

样品2为实施例2产品；

样品3为实施例4产品；

样品4为采用专利201110224735.9实施例1的方法得到的HPLC纯度为87.4％的异银杏双黄酮；

样品5为采用专利200910067430.4实施例1的方法得到的HPLC纯度为97.3％的异银杏双黄酮；

样品各取1g，本实验按照中国药典2010版第二部附录XIXC药物稳定性试验指导原则进行，结果如下：

表2加速试验结果

样品

0个月

1个月

2个月

3个月

6个月

9个月

1

99.0％

98.9％

98.8％

98.6％

98.5％

2

99.6％

99.5％

99.3％

99.2％

99.0％

3

99.7％

99.6％

99.5％

99.3％

99.2％

4

87.4％

84.8％

81.7％

77.5％

75.1％

71.9％

5

97.3％

96.6％

94.6％

91.2％

87.9％

73.7％

表3长期试验结果

样品

0个月

3个月

6个月

9个月

12个月

18个月

1

99.0％

98.8％

98.6％

98.5％

98.2％

98.1％

2

99.6％

99.3％

99.2％

99.0％

98.9％

98.6％

3

99.7％

99.5％

99.3％

99.2％

99.0％

98.9％

4

87.4％

77.5％

75.1％

71.9％

68.5％

66.4％

5

97.3％

91.2％

87.9％

73.7％

70.4％

69.5％

本发明提供的异银杏双黄酮的含量较高，通过加速试验及长期稳定试验考察，结果表明本发明的异银杏双黄酮提取物相对于现有技术具有更好的稳定性，加速、长期试验纯度含量变化小。

试验例3组合物筛选试验

(1)大鼠手术与器械

SD大鼠(雄性，220～230g)按1200mg/kg剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线于皮毛用止血钳夹紧，准备在远心端插管。

(2)插管

插管为硅烷化过的聚乙烯胶管，分三段，中段为聚乙烯胶管，长60.0mm，内径3.5mm；两端为相同的聚乙烯管，管长100.0mm，内径1.0mm，外径2.0mm该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为1.0mm。将编好号的干净青霉素小瓶中分别装入6cm长的黑色手术线，称重；然后取出丝线，按照编号放入准备好的插管的中段较粗的插管中。

打开大鼠右侧动脉夹，用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)，然后将插管的动脉端插入大鼠右侧颈总动脉，将计算量的肝素缓缓注入大鼠体内。

(3)试验药物：

试验1组：异银杏双黄酮12mg/kg，银杏内酯A4mg/kg。

试验2组：异银杏双黄酮12mg/kg，银杏内酯B4mg/kg。

试验3组：异银杏双黄酮12mg/kg，银杏内酯C4mg/kg。

试验4组：异银杏双黄酮12mg/kg，银杏内酯D4mg/kg。

试验5组：异银杏双黄酮12mg/kg，银杏内酯M4mg/kg。

试验6组：异银杏双黄酮12mg/kg，白果内酯4mg/kg。

夹闭大鼠右侧颈动脉夹，拔下插管静脉端的注射器，将吸有计算量的药品水溶的药液注射器插入插管的静脉端，打开大鼠右侧颈动脉夹，将药品缓缓推入大鼠体内。夹闭右侧颈动脉夹，将茶馆的静脉端插入分离好的大鼠左侧颈静脉，打开动脉夹，使血液开始循环。并同时开始计时。此过程中插管中央的粗管中的丝线上会因为血液循环而产生血栓。

(4)血栓称重

计时开始15分钟后，剪断动静脉插管，停止循环，用眼科镊小心取出丝线，在滤纸上轻轻蘸掉血滴，放入事先称重好的青霉素小瓶中，精确称重并记录。计算出血栓的湿重。

统计各组的血栓湿重并做t检验。结果见表4。

表4试验药物在大鼠模型上的抗血栓活性

注：与生理盐水组相比，**P＜0.01，*P＜0.05.

试验结论：通过上述试验表明，异银杏双黄酮和白果内酯的组合物与生理盐水组比较具有极显著性差异(P＜0.01)，因此，申请人选择人异银杏双黄酮和白果内酯的组合物。

试验例3处方优化试验

试验药物组：

试验1组：异银杏双黄酮12g，精氨酸1g，白果内酯0.5g。

试验2组：异银杏双黄酮12g，精氨酸2g，白果内酯1g。

试验3组：异银杏双黄酮12g，精氨酸5g，白果内酯4g。

试验4组：异银杏双黄酮12g，精氨酸7g，白果内酯5g。

试验5组：异银杏双黄酮12g，精氨酸8g，白果内酯4g。

试验6组：异银杏双黄酮12g，精氨酸1g，白果内酯8g。

试验7组：异银杏双黄酮12g，赖氨酸10g，白果内酯0.5g。

试验8组：异银杏双黄酮12g，赖氨酸10g，白果内酯8g。

制备方法：取异银杏双黄酮、氨基酸、白果内酯和注射用水混合完全，搅拌至澄清，调节pH值7.3，得到浓度为120mg/ml的药液；超滤后分装药液，灌装，得到注射剂。

取90只健康SD大鼠，体重180-220g目标范围内，随机分为九组，各组均尾静脉给药14天，最后一次给药后2h，经麻醉后从腹主动脉取血。取血后以3.8％枸橼酸钠抗凝(9∶1)，混匀。分装于试管中，自动平衡离心机，1000转/分离心5～8分钟(20～25℃条件下)，用取样器，小心吸取上层液，即富含血小板血浆(PRP)，室温下放置备用。用微量进液器在不同比色杯中加入11μl的胶原(Collagen)、二磷酸腺苷(ADP)，按比浊法用TYXN-91智能血液凝集仪测定大鼠用药后体外血小板5min聚集率，同时计算血小板聚集抑制率。

聚集抑制率％＝(对照管聚集百分率-试验管聚集百分率)/对照管聚集百分率×100

试验结果：见表5。

表5对胶原和二磷酸腺苷诱导大鼠体外血小板凝集率、抑制率的影响

结果表明：当异银杏双黄酮、氨基酸和白果内酯的重量比为12∶1～10∶0.5～8内时对血小板凝集具有作用，当异银杏双黄酮、氨基酸和白果内酯的重量比依次为3∶2∶1时抑制作用最强。

试验例4制剂加速试验

按实施例6、8的制备方法制备样品，在温度为40℃土2℃、相对湿度75％±5％的条件下放置6个月，在试验期间第1个月、第2个月、第3个月、第6个月末分别取样一次，按稳定性重点考察项目检测。检测结果见表6。

表6加速试验结果

结果表明，本发明药物制剂在加速条件下各项性质是稳定的。

试验例2异银杏双黄酮、白果内酯组合物抑制血栓形成作用

试验动物：体重250～350g健康大鼠32只，雌雄各半。

试验药物：

试验1组：生理盐水。

试验2组：舒血宁注射液(北京双鹤高科天然药物有限责任公司)。

试验3组：异银杏双黄酮12mg，精氨酸8mg，白果内酯4mg。

试验4组：阿司匹林。

试验方法：

大鼠血小板血栓：将32只随机分成4组，用乌拉坦(45mg/kg)腹腔麻醉后，缓慢静脉给药，试验2、3组的给药量为10mg/kg，试验4组阿司匹给药量为40mg/kg，试验1组给予等体积生理盐水对照液。分离左侧颈外静脉及右侧颈总动脉，静脉肝素(50μg/kg)化后将内径2mm、长8cm的聚乙烯管内置一根长6cm的4号手术丝线，两端各套一根内径0.8mm长10cm的聚乙烯管，管内充满50μg/ml的肝素生理盐水，将管一端插入颈外静脉，另一端插入颈总动脉。舌下静脉给药，给药10分钟后，开放动静脉回路15分钟，中断血流，迅速取出丝线称重，总重量减去丝线重为血栓重量。并按下式计算各组血栓形成抑制率，结果见表7。

抑制率(％)＝(对照组血栓重-给药组血栓重)×100％/对照组血栓重

表7对大鼠血小板血栓形成的影响

组别	例数	血栓重量(mg)	抑制率(％)
				1	8	18.3±5.4	-
2	8	13.4±3.2*	26.78
				3	8	8.3±4.1**#	54.64
4	8	7.6±2.4**#	58.47

注：与试验1组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与试验2组比较#P＜0.05。

结论：与试验1组(生理盐水组)比较，试验2组(舒血宁注射液)的血栓重量有显著性差异(p＜0.05)，而试验3组、试验4组具有极显著差异(P＜0.01)；试验3组血栓重则明显减轻，并与试验4组(阿司匹林)相似。与试验2组比较，试验3组的血栓形成抑制率明显增高，且与试验4组相当。

Claims

1.一种含有异银杏双黄酮和白果内酯的药物组合物，其特征在于，由异银杏双黄酮、氨基酸和白果内酯组成；所述氨基酸为精氨酸或赖氨酸；所述异银杏双黄酮、氨基酸和白果内酯的重量比依次为12∶1-10∶0.5-8。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述异银杏双黄酮、氨基酸和白果内酯的重量比为12:2-8:1-5。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述异银杏双黄酮、氨基酸和白果内酯的重量比依次为3:2:1。

4.根据权利要求1-3任一项所述的药物组合物，其特征在于药物组合物制备成注射制剂。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，注射制剂的制备方法为：取异银杏双黄酮、氨基酸、白果内酯和注射用水混合完全，搅拌至澄清，调节pH值6.5-7.3，得到浓度为60-150mg/ml的药液；超滤后分装药液，灌装，得到注射剂。

6.根据权利要求1-3任一项所述的药物组合物，其中异银杏双黄酮的制备方法为：

(3)步骤(2)得到固体粗提物经丙酮溶解后，柱层析法洗脱固体粗提物的溶解液，其洗脱液为体积比为1：2：0.2的丙酮：石油醚：氨水，洗脱速度为每小时200-250mL，收集洗脱液，收集时间为14-16h；

(5)将步骤(4)所得沉淀以超纯水反复洗涤脱色3次，-80℃冻干；

(6)将步骤(5)所得用乙酸乙酯重结晶，制得异银杏双黄酮。