CN101175505A - 制备具有低含量的4’-o-甲基吡哆醇和/或双黄酮的银杏提取物的改进方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备具有降低含量的4′－O－甲基吡哆醇和/或双黄酮的银杏(ginkgo biloba)提取物的改进多步骤方法，其中排除是通过经吸附剂树脂和/或离子交换剂过滤进行且待去除的物质仍保留在树脂上。本发明进一步涉及可由本发明的方法获得的具有降低含量的4′－O－甲基吡哆醇和/或双黄酮的银杏提取物，以及其用途。

Description

制备具有低含量的4’-O-甲基吡哆醇和/或双黄酮的银杏提取物的改进方法
技术领域
本发明涉及一种制备具有降低含量的4′-O-甲基吡哆醇和/或双黄酮的银杏(ginkgobiloba)提取物的改进多步骤方法，其中排除是通过经吸附剂树脂和/或离子交换剂过滤实现且待去除的物质仍保留在树脂上。本发明进一步涉及可由本发明的方法获得的具有降低含量的4′-O-甲基吡哆醇和/或双黄酮的银杏提取物，以及其用途。
背景技术
几十年来，使用银杏叶提取物作为药物。当前，其用于治疗各种痴呆和其症状以及脑和周围血液循环病症。与功效相关的成分为萜类内酯(银杏内酯(ginkgolide)A、B和C以及白果内酯(bilobalide))以及黄酮的糖苷(槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempferol)和异鼠李素(isorhamnetin))。银杏叶同时也含有不促成所要功效但可能导致危险和副作用的组分。除诸如银杏酸(ginkgolic acid)的非极性植物成分外，这些组分为4′-O-甲基吡哆醇和双黄酮。因此，在有效且同时尽可能安全且具有尽可能低的副作用的银杏提取物中，应尽最大可能不存在这些化合物。
4′-O-甲基吡哆醇可引起诸如抽搐发作和无意识的中毒症状。因此，这一化合物也称为银杏毒素(ginkgotoxin)。银杏中所含有的双黄酮展现免疫毒性潜能且可能引发接触性过敏。银杏中所含有的这些双黄酮主要为化合物穗花杉双黄酮(amentoflavone)、白果黄素(bilobetin)、银杏黄素(ginkgetin)、异银杏双黄酮(isoginkgetin)和金松双黄酮(sciadopitysin)。
4′-O-甲基吡哆醇：
Figure S2006800134122D00021
双黄酮：
Figure S2006800134122D00022
穗花杉双黄酮：R1＝R2＝R3＝H
白果黄素：    R1＝R3＝H，R2＝OCH3
银杏黄素：    R3＝H，R1＝R2＝OCH3
异银杏双黄酮：R1＝H，R2＝R3＝OCH3
金松双黄酮：  R1＝R2＝R3＝OCH3
同时排除4′-O-甲基吡哆醇和双黄酮的方法以及所获得的提取物已描述于EP1037646B1中。其中，4′-O-甲基吡哆醇是使用酸性阳离子交换剂滞留且双黄酮吸附在活性碳上。优选地，这些排除步骤在EP1037646B1的方法的步骤f)(第3页)之后，即“用铅化合物或不溶性聚酰胺处理溶液”之后进行。EP1037646B1的方法是基于最初描述于DE3940091C2中的方法。
在EP1037646B1中，双黄酮和4′-O-甲基吡哆醇的排除在方法的某一阶段(步骤f))进行，其中存在相对高含量的铅盐和铵盐，致使必须使用增加量的离子交换剂。
此外，双黄酮和4′-O-甲基吡哆醇的排除仅以组合形式描述和主张。然而，根据将来可能建立的限制和鉴于尽可能少地改质提取组合物的要求，可能希望仅移除双黄酮或4′-O-甲基吡哆醇。
此外，EP1037646B1中所追求的小于50ppm的4′-O-甲基吡哆醇和小于100ppm的双黄酮的含量仍相对较高。因为EP1037646B1并未描述比较实例，所以从这一参考文献也不能看出实例2和3中所达成的排除的实际程度。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供不具有上述缺点的制备具有低含量的4′-O-甲基吡哆醇和/或低含量的双黄酮的银杏提取物的方法，且具体来说
●其中使用可充分再循环和/或非常廉价的吸附剂，
●其产生小于20ppm、优选小于10ppm且尤其优选小于2ppm的4′-O-甲基吡哆醇含量和/或小于20ppm、优选小于10ppm且尤其优选小于5ppm的双黄酮含量，和
●其产生优选含量为20重量％至30重量％(尤其优选22.0％至27.0％)的类黄酮，4.5重量％至8.5重量％(尤其优选5.0至7.0％，优选2.8％至3.4％的银杏内酯A、B和C和2.6％至3.2％的白果内酯)的萜类内酯和银杏酸(至多5ppm)的提取物，其中22.0％至27.0％的类黄酮，5.0％至7.0％的萜类内酯(其中2.8％至3.4％的银杏内酯A、B和C与其中2.6％至3.2％的白果内酯)和银杏酸(至多5ppm)的所述含量满足德国药典2003(German Pharmacopoeia 2003)(“Deutsches Arzneibuch”；DAB)的要求。
根据DAB，确定类黄酮在酸性水解后呈槲皮素、山奈酚和异鼠李素形式且以黄酮的糖苷形式计算。
这一目的可通过使用吸附剂树脂分离双黄酮和/或经由酸性离子交换剂分离4′-O-甲基吡哆醇来解决。
为制造本发明的提取物，优选进行如下方法，其中步骤a)至i)以及m)已基本描述于DE3940091C2中，其所有揭露内容，尤其关于方法的细节将以引用的方式并入本申请案中：
a)在20-100℃、优选40-60℃的温度下使用含量为20-90重量％的含水丙酮、具有1至3个碳原子且含量为20-90重量％的含水烷醇(甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇)或无水甲醇提取银杏叶(药物)，其中药物∶溶剂的比率等于1∶4至1∶20，优选1∶5至1∶10，
b)通过蒸发溶剂直到含量为至多10重量％(优选至多5重量％)分离有机溶剂，其中在最后蒸馏步骤期间可添加水，
c)用水稀释剩余水溶液直到固体含量为5重量％至25重量％(优选15重量％至20重量％)，将溶液冷却至低于25℃(优选约10℃至12℃)的温度且使剩余水溶液静置直到形成沉淀，
d)用硫酸铵处理剩余水溶液(优选直到含量为至多40重量％、尤其优选25重量％至35重量％)且接着使用甲乙酮或甲乙酮与丙酮的混合物(比率优选为9∶1至4∶6、尤其6∶4)将溶液提取至少一次，
e)浓缩所获得的提取物(优选直到固体含量为50重量％至70重量％)且用乙醇与水的混合物稀释提取物以获得含有50重量％水和50重量％乙醇且固体含量为10重量％的溶液，
f)用铅化合物(优选乙酸铅、乙酸氢氧化铅、硝酸铅或氢氧化铅水性悬浮液)处理溶液直到出现颜色由棕色变为红棕色，或用不溶性聚酰胺(优选聚酰胺6、聚酰胺6，6或交联聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮(polyvidone)))处理，
g)使用沸点为60℃至100℃的脂族或环脂族溶剂提取经过滤的溶液，
h)浓缩剩余醇水溶液，接着用硫酸铵处理溶液且用甲乙酮和乙醇提取溶液，(优选将溶液在减压下浓缩直到乙醇含量为至多约5％，添加硫酸铵直到含量为20重量％且用8∶2至5∶5、优选6∶4比率的溶剂提取)，
i)浓缩所获得的有机相直到固体含量为50重量％至70重量％，
k)将浓缩物溶解于具有1至3个碳原子的烷醇水溶液中且视情况过滤产物，
l)经吸附剂树脂和/或离子交换剂过滤，其中待去除的物质仍保留在树脂上，和
m)在减压下干燥浓缩物(优选在60℃至80℃的最高温度下)以获得水含量小于5％的干燥提取物。
本发明方法的优点在于排除步骤在方法的末期进行。因此，必须使用较小量的离子交换剂且尤其获得低含量的4′-O-甲基吡哆醇和/或双黄酮。
在步骤1)中的优选吸附剂树脂为基于视情况经取代苯乙烯/二乙烯基苯的树脂，诸如Diaion HP-20、HP-21或Sepabeads SP-207或SP-850。优选离子交换剂为强酸性离子交换剂，诸如Merck I或Amberlite IR-120。过滤视情况包括使用另一溶剂普通冲洗。步骤k)中的烷醇水溶液为含量分别为20-90重量％的甲醇水溶液、乙醇水溶液、正丙醇水溶液或异丙醇水溶液，优选乙醇水溶液，尤其优选为浓度为40重量％至60重量％。
本发明的一标的为提取物，具体来说为干燥提取物，其可由本发明的方法获得且展现以下含量：
●小于20ppm、优选小于10ppm且尤其小于2ppm的4′-O-甲基吡哆醇，和/或
●小于20ppm、优选小于10ppm且尤其小于5ppm的双黄酮。
此外，本发明的标的为提取物，具体来说为干燥提取物，其可由本发明的方法获得且展现以下其他含量：
●20重量％至30％重量％、优选22.0重量％至27.0重量％的类黄酮，
●4.5重量％至8.5重量％、优选5.0重量％至7.0重量％的萜类内酯，和
●小于10ppm，优选不超过5ppm的银杏酸。
本发明的另一标的为提取物，具体来说为干燥提取物，其可由本发明的方法获得且展现以下含量：
●20重量％至30％重量％、优选22.0重量％至27.0重量％的类黄酮，
●总计2.5重量％至4.5重量％的银杏内酯A、B和C，优选总计2.8重量％至3.4重量％的银杏内酯A、B和C，
●2.0重量％至4.0重量％、优选2.6重量％至3.2重量％的白果内酯，
●小于10ppm、优选不超过5ppm的银杏酸，和
●小于20ppm、优选小于10ppm、尤其优选小于2ppm的4′-O-甲基吡哆醇，和/或
●小于20ppm、优选小于10ppm且尤其优选小于5ppm的双黄酮。
根据欧洲药典，干燥提取物通常具有至少95重量％的干燥残余物。
本发明的提取物可以散剂、颗粒剂、锭剂、糖衣药丸(包衣锭剂)或胶囊形式投与，优选经口投与。为制备锭剂，将提取物与合适的医药学上可接受的诸如乳糖、纤维素、二氧化硅、交联羧甲纤维素和硬脂酸镁的佐剂混合，且压制成视情况具有由例如羟甲基纤维素、聚乙二醇、颜料(诸如二氧化钛、氧化铁)和滑石制成的合适包衣的锭剂。本发明的提取物也可填充到胶囊中，视情况在添加诸如稳定剂、填充剂等的佐剂的情况下。剂量为使得每天投与10mg至2000mg，优选50mg至1000mg且尤其优选100mg至500mg的提取物的剂量。
本发明的另一标的为含有视情况与诸如活性成分和/或医药学上可接受的佐剂的其他物质组合的这些提取物的药物、食品或其他制剂。如本文所使用的术语“食品”尤其指营养食品、饮食增补品以及医药食物和营养增补剂。
附图说明
无
具体实施方式
实例
制备实例1和2以及比较实例1和2中所使用的提取物溶液
在约50℃的温度下提取干银杏叶(药物)，使用其重量(w/w)的7倍(即，药物-溶剂比率为1∶7)的丙酮/水60/60(w/w)提取(步骤a))。
将有机溶剂与提取物在很大程度上分离(步骤b))且用水稀释剩余浓水溶液直到固体含量为约10重量％。将溶液在搅拌下冷却至约12℃的温度，且移除所得沉淀(步骤c))。
将约30重量％的硫酸铵添加到剩余水溶液中且使用比率为6∶4的甲乙酮与丙酮的混合物提取所形成的溶液(步骤d))。
将所获得的提取物在很大程度上浓缩且将所获得的浓缩物用水和乙醇稀释，以使得获得固体含量为约10重量％的含有50重量％水和50重量％乙醇的溶液(步骤e))。过滤溶液且向滤液中添加乙酸氢氧化铅水溶液(步骤f))。
进一步过滤后，用庚烷提取剩余醇水溶液(步骤g))。
接着，将剩余醇水溶液在减压下浓缩直到乙醇含量为约5％，且添加硫酸铵，以使得获得以水含量计约20重量％的含量。
使用比率为6∶4的甲乙酮与乙醇的混合物提取所获得的溶液(步骤h))。
将所得有机相在很大程度上浓缩(固体含量为约55重量％)(步骤i))。然后，用乙醇和水稀释产物，以使得获得乙醇含量为约75％且固体含量为约15％的溶液(步骤k))。
实例1：具有降低含量的4′-O-甲基吡哆醇的银杏提取物
将1249g根据上述制备方法获得的提取物溶液用水调节直到乙醇含量为约40％(w/w)且施加于50ml(对应于每克干燥提取物0.28ml)Amberlite IR-120(强酸性离子交换剂)(管柱：约2×16.5cm；流速：约8ml/min)(步骤I))，接着用200ml 50％乙醇(w/w)冲洗。将所得溶液在旋转蒸发器上浓缩且在真空中在50℃下干燥(步骤m))：179.4g。
由下表可见，在基本上未改变与功效相关的成分的含量的情况下，达成0.4ppm的4′-O-甲基吡哆醇含量。
比较实例1：未经本发明的步骤l)排除的银杏提取物
将98.4g实例1中所使用的提取物溶液通过蒸发浓缩且在真空中在50℃下干燥：14.7g。
实例2a)：具有降低含量的双黄酮的银杏提取物
将500g根据上述制备方法获得的提取物溶液用水调节直到乙醇含量为约40％(w/w)且施加于400ml(对应于每克干燥提取物5.7ml)Sepabeads SP-850(吸附剂树脂)(管柱：约4×32cm；流速：约8ml/min)(步骤l))，接着用总计约2l的40％乙醇(w/w)冲洗。将所得溶液的10％(259.3g)在旋转蒸发器上浓缩且冷冻干燥(步骤m))：6.92g。溶液的剩余90％用于实例2b)。
由下表可见，在基本上未改变与功效相关的成分的含量的情况下，分别达成小于1ppm的双黄酮含量。
实例2b)：具有降低含量的4′-O-甲基吡哆醇和双黄酮的银杏提取物
将实例2a)中所获得的溶液的90％(2334.1g)施加于25ml(对应于每克干燥提取物0.40ml)Amberlite IR-120(强酸性离子交换剂)(管柱：约1.5×11cm；流速：约10ml/min)(步骤l))，接着用100ml 40％乙醇(w/w)冲洗。将所得溶液在旋转蒸发器上浓缩且冷冻干燥(步骤m))：61.67g。
由下表可见，在基本上未改变与功效相关的成分的含量的情况下，分别达成0.4ppm的4′-O-甲基吡哆醇含量和小于1ppm的双黄酮含量。
比较实例2：未经本发明的步骤l)排除的银杏提取物
将50g实例2a)中所使用的提取物溶液通过蒸发浓缩且冷冻干燥：7.05g。
比较实例3：根据EP1037646B1用铅化合物处理(步骤f))后，经双黄酮排除和4′-O-甲基吡哆醇排除的银杏提取物
在约50℃的温度下提取干银杏叶(药物)，使用其重量(w/w)的7倍(即，药物-溶剂比率为1∶7)的丙酮/水60/60(w/w)提取。
将有机溶剂与提取物在很大程度上分离，且将剩余浓水溶液用水稀释直到固体含量为约10重量％，在搅拌下冷却至约12℃的温度且移除所得沉淀。
将约30重量％的硫酸铵添加到剩余水溶液中且使用比率为6∶4的甲乙酮与丙酮的混合物提取所形成的溶液。
将所获得的提取物在很大程度上浓缩且将所获得的浓缩物用水和乙醇稀释，以使得获得固体含量为约10重量％的含有50重量％水和50重量％乙醇的溶液。过滤溶液，向滤液中添加乙酸氢氧化铅水溶液，且再次过滤(步骤f))。
在室温下，将150ml所获得的溶液(干燥提取物部分：7.1％；乙醇含量：约50％)与2.5g(对应于每克最终产物0.17g)活性碳一起搅拌30分钟。将滤液施加于具有4.2ml(对应于每克最终产物0.28ml)强酸性阳离子交换剂(Merck I)的管柱。用4×5ml EtOH(50％)洗涤离子交换剂管柱。
使用3×70ml正己烷通过震荡提取组合的洗出液。将乙醇/水相在旋转蒸发器上浓缩且用水稀释到100g。将所获得的提取物溶液用1×40ml、2×30ml和1×20ml比率为3∶2的甲乙酮∶乙醇混合物提取，其中添加15g硫酸铵实现相分离。
添加25g硫酸铵后，将有机相在室温下搅拌1h。分离未溶解的硫酸铵以及所形成的水相。将提取物溶液在旋转蒸发器上在50℃下浓缩且在真空中在60℃下干燥：14.8g。
由下表可见，根据本发明达成52ppm的4′-O-甲基吡哆醇含量和31.3ppm的双黄酮含量且因此与实例2b)相比含量显著较高且排除结果较差。
表1中所列的类黄酮、萜类内酯和银杏酸的含量的测定根据DAB进行。
4′-O-甲基吡哆醇的定量测定在经Sep Pak Plus C18滤筒富集，接着经Bond ElutLRC-SCX滤筒富集后借助于HPLC和荧光检测进行，其中使用Phenomenex Prodigy 5μODS-3 HPLC管柱和三氟乙酸(pH2)∶甲醇＝9∶1(v/v)→甲醇的梯度。
表1中所列的双黄酮的含量的测定借助于HPLC和UV检测在340nm下经由WatersNova Pak C18管柱使用水∶乙腈为9∶1(v/v)+0.3体积％磷酸(85％)→乙腈+0.3体积％磷酸的梯度进行。
在各情况下，校正是使用具有高确定纯度等级的参考物质进行。
表1：以上所给出的实例的提取物的组成
提取物 实例1    比较实例1  实例2a)   实例2b)    比较实例2    比较实例3
类黄酮[％] 24.86     24.51  27.17   25.32     25.89     22.78
银杏内酯A、B、C[％] 3.28     2.94  2.97   3.04     2.97     3.40
白果内酯[％] 3.17     3.03  3.18   3.14     3.07     3.07
萜类内酯[％] 6.45     5.97  6.15   6.18     6.04     6.47
银杏酸[ppm] ＜5     ＜5  ＜5   ＜5     ＜5     ＜5
4′-O-甲基吡哆醇[ppm] 0.4     104.5  164   0.8     89     52
穗花杉双黄酮[ppm] 68.5     78.7  n.d.(＜1)   n.d.(＜1)     81.6     12.6
白果黄素[ppm] 123.3     120.4  n.d.(＜1)   n.d.(＜1)     136.4     10.4
银杏黄素[ppm] 86.3     82.1  n.d.(＜1)   n.d.(＜1)     86.1     2.7
异银杏双黄酮[ppm] 103.3     104.4  n.d.(＜1)   n.d.(＜1)     111.5     4.8
金松双黄酮[ppm] 44.0     43.0  n.d.(＜1)   n.d.(＜1)     44.0     0.8
双黄酮的总量[ppm] 425.4     428.6  n.d.(＜5)   n.d.(＜5)     459.6     31.3
n.d.＝不可检测

Claims (15)

1.一种制造具有降低含量的4′-O-甲基吡哆醇和/或双黄酮的银杏(ginkgo biloba)提取物的方法，其特征在于所述方法的以下步骤：
a)使用含水丙酮、具有1至3个碳原子的含水烷醇或无水甲醇提取银杏叶，
b)通过浓缩所述溶剂直到含量为至多10重量％分离所述有机溶剂，其中在最后的蒸馏步骤期间可添加水，
c)用水稀释所述剩余水溶液直到固体含量为5重量％至25重量％，冷却至低于25℃的温度且使其静置直到形成沉淀，
d)用硫酸铵处理所述剩余水溶液且接着使用甲乙酮或甲乙酮与丙酮的混合物提取至少一次，
e)浓缩所获得的提取物且用乙醇-水混合物稀释以获得固体含量为10重量％的含有50重量％水和50重量％乙醇的溶液，
f)用铅化合物或不溶性聚酰胺处理所述溶液，
g)使用沸点为60℃至100℃的脂族或环脂族溶剂提取所述过滤溶液，
h)浓缩所述剩余醇水溶液，接着用硫酸铵处理且用甲乙酮和乙醇提取，
i)浓缩所获得的有机相直到固体含量为50重量％至70重量％，
k)将所述浓缩物溶解于具有1至3个碳原子的烷醇水溶液中且视情况过滤，
l)经吸附剂树脂和/或离子交换剂过滤，其中所述待去除的物质仍保留在树脂上，和
m)在减压下干燥所述浓缩物以获得水含量小于5％的干燥提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤k)中的所述烷醇水溶液为乙醇水溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述乙醇水溶液为含量为40重量％至60重量％的乙醇。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中步骤1)中的所述吸附剂树脂为基于视情况经取代苯乙烯/二乙烯基苯的树脂。
5.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中步骤1)中的所述离子交换剂为强酸性离子交换剂。
6.一种银杏叶提取物，其特征在于具有以下含量：
小于20ppm的4′-O-甲基吡哆醇，和/或
小于20ppm的双黄酮。
7.根据权利要求6所述的提取物，其特征在于4′-O-甲基吡哆醇的含量小于10ppm。
8.根据权利要求6所述的提取物，其特征在于4′-O-甲基吡哆醇的含量小于2ppm。
9.根据权利要求6至8中任一权利要求所述的提取物，其特征在于双黄酮的含量小于10ppm。
10.根据权利要求6至8中任一权利要求所述的提取物，其特征在于双黄酮的含量小于5ppm。
11.根据权利要求6至10中任一权利要求所述的提取物，其特征在于具有以下含量：
20重量％至30重量％的类黄酮，
4.5重量％至8.5重量％的萜类内酯，和
小于10ppm的银杏酸(ginkgolic acid)。
12.根据权利要求6至10中任一权利要求所述的提取物，其特征在于具有以下含量：
22.0重量％至27.0重量％的类黄酮，
5.0重量％至7.0重量％的萜类内酯，和
至多5ppm的银杏酸。
13.根据权利要求6至10中任一权利要求所述的提取物，其特征在于具有以下含量：
22.0重量％至27.0重量％的类黄酮，
总计2.8重量％至3.4重量％的银杏内酯(ginkgolide)A、B和C，
2.6重量％至3.2重量％的白果内酯(bilobalid)，和
至多5ppm的银杏酸。
14.一种根据权利要求6至13中任一权利要求所述的提取物的用途，其用于制造供治疗痴呆和其症状和/或脑或周围血液循环病症用的药物、食品或其他制剂。
15.一种药物、食品或其他制剂，其特征在于含有根据权利要求6至13中任一权利要求所述的银杏提取物。
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