KR20070112271A

KR20070112271A - 저함량의 4'-ｏ-메틸 피리독신 및/또는 비플라본을 가지는은행나무 추출물의 개선된 제조방법

Info

Publication number: KR20070112271A
Application number: KR1020077023531A
Authority: KR
Inventors: 클레멘즈 에르델메이어; 헤르만 하우어; 에곤 코흐; 프리드리히 랑
Original assignee: 닥터 빌마르 쉬바베 게엠바하 운트 코 카게
Priority date: 2005-05-03
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2007-11-22
Also published as: US20060251746A1; AU2006243378B2; ES2310408T3; WO2006117169A1; BRPI0611093A2; CA2606843C; AR054270A1; US20080286391A1; JP4304230B2; CN104189025A; BRPI0611093B1; PT1868625E; AU2006243378A1; CA2606843A1; CN101175505A; PL1868625T3; DE102005061948A1; RU2007143632A; MX2007013398A; KR100933721B1

Abstract

본 발명은 감소된 함량의 4'-O-메틸 피리독신 및/또는 비플라본을 가지는 은행나무 추출물의 개선된 다단계 제조방법에 있어서, 상기 감소는 흡착수지 및/또는 이온교환체의 여과에 기인하고, 상기 제거될 물질들은 상기 수지상에 잔여하는 것을 특징으로 하는 은행나무 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 감소된 함량의 4'-O-메틸 피리독신 및/또는 비플라본을 가지는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능한 은행나무 추출물 및 이들의 용도에 관한 것이다.

은행나무, 4'-O-메틸 피리독신, 비플라본, 흡착수지, 이온교환체

Description

저함량의 4'-Ｏ-메틸 피리독신 및/또는 비플라본을 가지는 은행나무 추출물의 개선된 제조방법{Improved Method for Preparing Ginkgo Extracts Having a Low Content of 4'-Ｏ-Methyl Pyridoxine and/or Biflavones}

본 발명은 감소된 함량의 4'-O-메틸 피리독신 및/또는 비플라본을 가지는 은행나무 추출물의 개선된 다단계 제조방법에 관한 것으로, 상기 감소는 흡착수지 및/또는 이온교환체의 여과에 기인하고, 상기 제거될 물질들은 상기 수지상에 잔여하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 상기 방법에 의해 수득가능하며, 감소된 함량의 4'-O-메틸 피리독신 및/또는 비플라본을 가지는 은행나무 추출물 및 이들의 용도에 관한 것이다.

수십년 동안 은행나무 잎 유래의 추출물은 약제로 사용되고 있다. 이들은 현재 다른 유형의 치매 및 그 증상 뿐만 아니라 대뇌 및 말초 혈액 순환 장애 치료용으로 사용되고 있다. 상기 효능과 관련된 성분은 테르펜 락톤(terpene lactones)[징코라이드(ginkgolides) A,B 및 C, 빌로발라이드(bilobalide)] 뿐만 아니라 플라본 글리코사이드(glycosides of flavones)[케르세틴(quercetin), 캠퍼 롤(kaempferol) 및 이소르함네틴(isorhamnetin)]이다. 은행나무의 잎은 원하는 효능을 주지 않고, 위험 및 부작용을 초래하는 성분 또한 함유하고 있다. 징코산(ginkgolic acids)과 같은 무극성 식물 성분외에, 이러한 성분들은 4'-O-메틸 피리독신 및 비플라본이다. 효능이 있는 동시에 가능한 안전하고, 부작용이 낮은 은행나무 추출물에서, 이러한 화합물들은 최대한으로 존재하면 안된다.

4'-O-메틸 피리독신은 경련성 발작 및 무의식과 같은 중독 증상을 유발하기도 한다. 따라서, 이러한 화합물은 징코톡신(ginkgotoxin)으로 불리워진다. 은행나무에 함유된 비플라본은 항체 독소의 잠재력을 나타내고 접촉성 알레르기를 유도하기도 한다. 은행나무에 함유된 이러한 비플라본은 주로 아멘토플라본(amentoflavone), 빌로베틴(bilobetin), 징크제틴(ginkgetin), 이소징크제틴(isoginkgetin) 및 사이아도피신(sciadopitysin)과 같은 화합물이다.

4'-O-메틸 피리독신 :

비플라본 :

아멘토플라본 : R¹ = R² = R³ = H

빌로베틴 : R¹ = R³ = H, R² = OCH₃

징크제틴 : R³ = H, R¹ = R² = OCH₃

이소징크제틴 : R¹ = H, R² = R³ = OCH₃

사이아도피신 : R¹ = R² = R³ = OCH₃

4'-O-메틸 피리독신 및 동시에 비플라본을 감소시키는 방법 뿐만 아니라 수득된 추출물은 이미 EP 1 037 646 B1에 개시되어 있다. 여기서, 4'-O-메틸 피리독신은 산성 양이온 교환체를 이용하여 유지되고, 비플라본은 활성화된 탄소 상에 흡착된다. 바람직하게 이러한 감소 단계는 EP 1 037 646 B1(3 페이지)에 따른 방법의 f)단계 후 예를들어, "상기 용액을 납화합물 또는 불용성 폴리아마이드(polyamide)로 처리하는 단계" 후에 수행된다. 상기 EP 1 037 646 B1의 방법은 DE 39 40 091 C2에 최초로 기재된 방법에 기초한 것이다.

EP 1 037 646 B1에서, 비플라본 및 4'-O-메틸 피리독신의 감소는 상기 방법의 한 단계(단계 f)에서 수행되는데, 여기서, 상대적으로 높은 함량의 납염(lead salts) 및 암모늄염이 존재하여 이온 교환체의 증가된 양이 사용되어야 한다.

게다가, 비플라본 및 4'-O-메틸 피리독신의 감소는 단지 조합하여 기재되고 청구되고 있다. 그러나 향후에 추출 조성물의 가능한 적은 변형의 요건을 고려하 여, 성립 가능할 한계에 따라, 비플라본 또는 4'-O-메틸 피리독신만을 제거하는 것이 바람직하기도 하다.

게다가, EP 1 037 646 B1에 기재된 4'-O-메틸 피리독신 함량 50ppm 미만 및 비플라본 함량 100ppm 미만은 여전히 비교적으로 높다. 또한, EP 1 037 646 B1이 비교예를 기재하고 있지 않기 때문에, 실시예 2 및 3에서 달성된 감소의 실제 정도는 이 문헌으로부터 알 수 없다.

따라서, 본 발명의 목적은, 상기 기재된 단점을 갖지 않는, 저함량의 4'-O-메틸 피리독신 및/또는 비플라본을 가지는 은행나무 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이며, 특히,

● 이 때, 잘 재생할 수 있고 및/또는 매우 저렴한 흡착제가 사용되고,

● 20ppm 미만, 바람직하게는 10ppm미만, 더욱 바람직하게는 2ppm 미만의 4'-O-메틸 피리독신 함량 및/또는 20ppm 미만, 바람직하게는 10ppm 미만, 더욱 바람직하게는 5ppm 미만의 비플라본 함량을 유도하며, 및

● 바람직하게 20~30중량%(더욱 바람직하게는 22.0~27.0%)의 플라보노이드 함량, 바람직하게 함량 4.5~8.5중량%(더욱 바람직하게는 5.0~7.0%, 바람직하게 징코라이드 A,B 및 C는 2.8~3.4%이고, 빌로발리드는 2.6~3.2%)의 테르펜 락톤 함량 및 징코산의 함량(5ppm 이하)을 유도하며, 이 때, 상기 22.0~27.0%의 플라보노이드 함량, 5.0~7.0%(징코라이드 A,B 및 C는 2.8~3.4%이고, 빌로발리드는 2.6~3.2%)의 테르펜 락톤 함량 및 징코산의 함량(5ppm 이하)은 독일 약전 2003[German Pharmacopoeia, ("Deutsches Arzneibuch" : DAB)]의 필요조건을 충족시킨다.

상기 DAB에 따르면 플라보노이드는 산성 가수분해 후 케르세틴, 캠퍼롤 및 이소햄네틴의 형태로 측정되고, 플라보노이드 글리코사이드로서 산정된다.

이러한 목적은 흡착 수지를 이용한 비플라본의 분리 및/또는 산성 이온 교환체를 통한 4'-O-메틸 피리독신의 분리에 의해 해결된다.

본 발명에 따른 추출물을 제조하기 위하여, 바람직하게는 다음 방법이 수행되었는데, 여기서, a)~i)단계 뿐만 아니라 m)단계는 필수적이라고 DE 39 40 091 C2에 이미 기재되어 있고, 특히 상기 방법의 자세한 내용과 관련하여 전체 기재 내용은 본 발명에 참고로서 통합될 것이다:

a) 20~90중량%의 함량을 갖는 물-함유 아세톤, 탄소원자 1~3개를 갖는 물-함유 알칸올(메탄올, 에탄올, n-프로판올 및 이소프로판올) 및 20~90중량% 함량의 무수메탄올을 이용하여, 20~100℃, 바람직하게 40~60℃에서 은행나무 잎(약제)을 추출하는 단계, 이 때, 약제:용매 양의 비율은 1:4~1:20, 바람직하게는 1:5~1:10임,

b) 상기 용매를 증발시킴으로써 상기 유기 용매를 10중량% 이하의 함량(바람직하게 5중량% 이하)으로 분리하는 단계, 이 때, 물은 최종 증류 단계 중에 첨가될 수도 있음,

c) 5~25중량%(바람직하게 15~20중량%)의 고체 함량이 되도록 상기 잔류 수용액을 물로 희석시키고, 25℃이하(바람직하게 10~12℃)로 상기 용액을 냉각한 다음, 침전물이 형성될 때까지 상기 남아있는 수성 용액을 방치하는 단계,

d) 잔류 수용액을 황산암모늄으로 처리하고(바람직하게 40중량%까지의 함량으로, 더욱 바람직하게 25~35중량% 함량으로), 이어서, 메틸에틸케톤(methyl ethyl ketone) 또는 메틸에틸케톤과 아세톤의 혼합물(바람직하게 9:1~4:6의 비율로, 특히 6:4의 비율로)을 이용하여 적어도 한번 상기 용액을 추출하는 단계,

e) 상기 수득된 추출물을 농축한 다음(바람직하게 50~70중량%의 고체함량으로), 50중량% 물 및 50중량% 에탄올을 함유하고 10중량%의 고체함량을 갖는 용액을 수득하도록 상기 추출물을 에탄올과 물의 혼합물로 희석하는 단계,

f) 갈색(brown)에서 암갈색(umber)으로 색이 변할 때까지 상기 용액을 납 화합물(바람직하게 아세트산납(lead acetate), 수산화 아세트산납(lead hydroxide acetate), 질산납(lead nitrate) 또는 불용성 폴리아마이드[(바람직하게 폴리아마이드 6, 폴리아마이드 6,6 또는 가교결합된 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)(폴리비돈(polyvidone))]로 처리하는 단계,

g) 60~100℃의 끓는점을 갖는 지방족(aliphatic) 또는 씨클로 지방족(cycloaliphatic) 용매를 이용하여 상기 여과된 용액을 추출하는 단계,

h) 잔류 수성-알콜의 용액을 농축하고, 그 후, 상기 용액을 황산암모늄으로 처리하여, 상기 용액을 메틸에틸케톤 및 에탄올로 추출하는 단계(상기 용액은 약 5% 이하의 에탄올 함량으로 감소된 압력하에서 농축되고, 20중량%의 함량으로 황산암모늄을 첨가하며, 8:2~5:5, 바람직하게는 6:4의 비율로 상기 용매를 이용하여 추출됨),

i) 50~70중량%의 고체함량이 되도록 상기 수득된 유기상을 농축하는 단계,

k) 탄소원자 1~3개를 갖는 수성 알칸올에서 상기 농축물을 용해시킨 다음, 선택적으로 상기 생성물을 여과하는 단계,

l) 흡착수지 및/또는 이온 교환체로 여과하는 단계, 및 이 때, 상기 제거될 물질들은 상기 수지 상에 잔여함,

m) 5%미만의 물 함량을 갖는 건조 추출물을 수득하기 위하여 감소된 압력하에서 상기 농축물을 건조하는 단계(바람직하게 최대 60~80℃에서).

본 발명에 따른 방법의 장점은 상기 감소 단계가 상기 방법의 마지막에서 수행되는 것이다. 따라서, 더 적은 양의 이온교환체가 사용되고 특히, 4'-O-메틸 피리독신 및/또는 비플라본의 저함량이 수득된다.

단계 l)에서 바람직한 흡착수지는 Diaion HP-20, HP-21 또는 Sepabeads SP-207, 및 SP-850과 같은 선택적으로 치환된 스티렌계(styrenes)/디비닐벤젠계(divinylbenzenes) 기반 수지이다. 바람직한 이온 교환체는 Merck I 또는 Amberlite IR-120과 같은 강산성 이온 교환체이다. 상기 여과단계는 추가 용매를 이용하는 통상적인 세척단계를 선택적으로 포함한다. k)단계에서 상기 수성 알칸올은 각각 20~90중량%의 함량을 갖는 메탄올, 에탄올, n-프로판올 또는 이소프로판올이고, 바람직하게는 수성 에탄올에서 특히 40~60중량%의 농도가 바람직하다.

본 발명의 목적은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하고, 다음 함량을 나타내는 추출물, 특히 건조 추출물에 관한 것이다:

● 4'-O-메틸 피리독신 20ppm미만, 바람직하게 10ppm미만, 더욱 바람직하게 2ppm미만 및/또는

● 비플라본 20ppm미만, 바람직하게 10ppm미만, 더욱 바람직하게 2ppm미만.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하고, 다음의 추가적인 함량을 나타내는 추출물, 특히 건조 추출물에 관한 것이다.

● 플라보노이드 20~30중량%, 바람직하게 22.0~27.0중량%,

● 테르펜 락톤 4.5~8.5중량%, 바람직하게 5.0~7.0중량% 및

● 징코산 10ppm미만, 바람직하게 5ppm미만.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하고, 다음의 추가적인 함량을 나타내는 추출물, 특히 건조 추출물에 관한 것이다.

● 플라보노이드 20~30중량%, 바람직하게 22.0~27.0중량%,

● 징코라이드 A, B 및 C 전체 2.5~4.5중량%, 바람직하게 2.8~3.4중량%,

● 빌로발라이드 2.0~4.0중량%, 바람직하게 2.6~3.2중량%,

● 징코산 10ppm미만, 바람직하게 5ppm미만,

● 비플라본 20ppm미만, 바람직하게 10ppm미만, 더욱 바람직하게 5ppm미만.

유럽약전(European Pharmacopoeia)에 따라, 건조 추출물은 적어도 95중량%의 건조잔여물을 갖는다.

본 발명에 따른 추출물은 바람직하게 경구적으로 가루, 과립, 정제(tablet), 당의정(코팅된 정제) 또는 캡슐의 형태로 투여될 수 있다. 정제를 제조하기 위해서, 상기 추출물은 락토스(lactose), 셀룰로스(cellulose), 실리콘 디옥사이드(silicon dioxide), 크로스카멜로스(croscarmellose) 및 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate)과 같이 약학적으로 수용가능한 적절한 보조제(adjuvants)와 혼합되고, 선택적으로 제공된 예를들어, 하이드록시메틸셀룰로스(hydroxymethylcellulose), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 색소(pigments)[티타늄 디옥사이드(titanium dioxide), 아이론 옥사이드(iron oxide)와 같은] 및 탤컴(talcum)으로 제조된 적절한 코팅과 함께 정제로 압착된다. 본 발명에 따른 추출물은 안정제, 충전제 등과 같은 보조제의 선택적 첨가와 함께 캡슐에 채워질 수 있다. 하루에 투여되는 추출물의 복용량은 10~2000mg, 바람직하게 50~1000mg, 더욱 바람직하게 100~500mg이다.

게다가, 본 발명은 약제, 식품 또는 이러한 추출물과 활성성분 및/또는 약학적으로 수용가능한 보조제와 같은 다른 물질과의 혼합을 선택적으로 함유하는 다른 제제(preparation)에 관한 것이다. 여기서 사용된 "식품"이란 용어는 특히 식이식품, 식이보충제품 뿐만 아니라 의학식품 및 식이보충제를 의미한다.

실시예 1 및 2 뿐만 아니라 비교예 1 및 2에서 사용된 추출물 용액의 제조

은행나무의 마른잎(약제)을 아세톤/물 60/40(w/w)(단계 a))로 제조된 용매를 이용하여(w/w)(예를들어, 약제-용매 비율은 1:7) 약 50℃에서 7회 추출하였다.

상기 유기 용매를 대부분 상기 추출물로부터 분리하였고(단계 b)), 약 10중량%의 고체함량이 되도록 상기 잔류 농축된 수용액을 물로 희석하였다. 상기 용액을 교반하에서 약 12℃로 냉각시키고, 생성된 침전물을 제거하였다(단계 c)).

약 30중량%의 황산암모늄을 상기 잔류 수용액에 첨가하였고, 상기 형성된 용액은 6:4 비율의 메틸에틸케톤과 아세톤 혼합물을 이용하여 추출하였다(단계 d)).

상기 수득된 추출물을 대부분 농축하고, 따라서 상기 농축물을 물 및 에탄올로 희석하여 10중량%의 고체함량에서 50중량% 물 및 50중량% 에탄올을 함유한 용액을 수득하였다(단계 e)). 상기 용액을 여과하였고, 상기 여과액에 수산화 아세트산납의 수용액을 첨가하였다(단계 f)).

추가로 여과한 후, 상기 잔류 수성 알콜성 용액을 헵탄으로 추출하였다(단계 g)).

그 후, 상기 잔류 수성 알콜성 용액을 감소된 압력하에서 약 5%함량의 에탄올이 되도록 농축하고, 황산암모늄을 첨가하여 물 함량 기준으로 20중량%의 함량이 달성되었다.

상기 수득된 용액을 6:4 비율의 메틸에틸케톤과 에탄올의 혼합물을 이용하여 추출하였다(단계 h)).

상기 생성된 유기 상을 대부분 농축하였다(약 55중량%의 고체함량)(단계 i)). 그 후 상기 생성물은 에탄올 및 물을 희석하여 약 75%의 에탄올 함량 및 약 15%의 고체함량을 갖는 용액을 수득하였다(단계 k)).

실시예 1: 감소된 함량의 4'-O- 메틸 피리독신을 가지는 은행나무 추출물

상기 기재된 제조방법에 따라 수득된 1249g의 추출물 용액을 약 40%(w/w)의 에탄올 함량이 되도록 물로 조절하였고, 50ml(건조 추출물의 0.28ml/g에 상응) Amberlite IR-120(강산성 이온 교환체)(컬럼: 약 2×16.5cm; 유속: 약 8ml/min)(단계 l))에 적용시킨 후, 50% 에탄올(w/w) 200ml로 세척하였다. 상기 생성된 용액을 회전식 증발기(rotary evaporator)에서 농축하고, 50℃ 진공에서 건조시켰다(단계 m)): 179.4g.

다음의 표에서 알 수 있듯이, 효능과 관련한 성분의 함량을 본질적으로 변경함 없이 0.4ppm의 4'-O-메틸 피리독신 함량을 달성하였다.

비교예 1: 본 발명의 단계 l)에 따른 감소가 없는 은행나무 추출물

실시예 1에서 사용된 98.4g의 추출물 용액을 증발에 의해 농축하였고, 50℃ 진공에서 건조하였다: 14.7g.

실시예 2a): 감소된 함량의 비플라본을 가지는 은행나무 추출물

상기 기재된 제조방법에 따라 수득된 500g의 추출물 용액을 약 40%(w/w)의 에탄올 함량이 되도록 물로 조절하고, 400ml(건조 추출물의 5.7ml/g에 상응) Sepabeads SP-850(흡착수지)(컬럼: 약 4×32cm; 유속: 약 8ml/min)(단계 l))에 적용시킨 후, 2L의 40% 에탄올(w/w)로 세척하였다. 10%의 상기 생성된 용액(259.3g)을 회전식 증발기에서 농축하였고 냉동-건조시켰다(단계 m)): 6.92g. 남아 있는 90%의 용액을 실시예 2b)에서 사용하였다.

다음의 표에서 알 수 있듯이, 효능과 관련한 성분의 함량을 본질적으로 변경함 없이 1ppm 미만의 비플라본 함량을 달성하였다.

실시예 2b): 감소된 함량의 4'-O- 메틸 피리독신 및 비플라본을 가지는 은행나무 추출물

실시예 2a)에서 수득된 90%의 상기 용액을 25ml(건조 추출물의 0.40ml/g에 상응) Amberlite IR-120(강산성 이온 교환체)(컬럼: 약 1.5×11cm; 유속: 약 10ml/min)(단계 l))에 적용시킨 후, 40% 에탄올(w/w) 100ml로 헹구었다. 상기 생성된 용액을 회전식 증발기에서 농축하였고 냉동-건조시켰다(단계 m)): 61.67g.

다음의 표에서 알 수 있듯이, 효능과 관련한 성분의 함량을 본질적으로 변경함 없이 각각 0.4ppm의 4'-O-메틸 피리독신 함량 및 1ppm 미만의 비플라본의 함량을 달성하였다.

비교예 2: 본 발명의 단계 l)에 따른 감소가 없는 은행나무 추출물

실시예 2a)에서 사용된 50g의 추출물 용액은 증발에 의해 농축하였고, 냉동-건조시켰다: 7.05g.

비교예 3: EP 1 037 646 B1에 따른 납화합물 (단계 f))로 처리 후 비플라본 및 4'-O- 메틸 피리독신이 감소된 은행나무 추출물

은행나무의 마른잎(약제)을 아세톤/물 60/40(w/w)로 제조된 용매를 이용하여(w/w)(예를들어, 약제-용매 비율은 1:7) 약 50℃에서 7회 추출하였다.

상기 유기 용매를 대부분 상기 추출물로부터 분리하였고, 약 10중량%의 고체함량이 되도록 상기 남은 농축된 수용액을 물로 희석하였으며, 교반하에서 약 12℃로 냉각한 다음, 상기 결과 침전물을 제거하였다.

약 30중량%의 황산암모늄을 상기 잔류 수용액에 첨가하였고, 상기 형성된 용액은 6:4 비율의 메틸에틸케톤과 아세톤 혼합물을 이용하여 추출하였다.

상기 수득된 추출물을 대부분 농축하고, 따라서 상기 농축물을 물 및 에탄올로 희석하여 10중량%의 고체함량에서 50중량% 물 및 50중량% 에탄올을 함유한 용액을 수득되었다. 상기 용액을 여과하였고, 상기 여과액에 수산화 아세트산납의 수 용액을 첨가하여, 다시 여과시켰다(단계 f)).

150ml의 수득된 용액(건조 추출물의 부분: 7.1%; 에탄올함량: 약 50%)을 2.5g 활성탄소로 실온에서 30분 동안 교반하였다. 상기 여과물을 4.2ml(최종 추출물의 0.28ml/g에 상응) 강산성 양이온 교환체(Merck I) 컬럼에 적용하였다. 상기 이온 교환체 컬럼을 4×5ml EtOH(50%)로 세척하였다.

상기 혼합된 용출액은 3×70ml n-헥산을 이용하여 흔들어 추출하였다. 상기 에탄올/물 상(phase)을 회전식 증발기상에서 농축하였고, 물로 100g으로 희석하였 다. 상기 수득된 추출물 용액을 3:2비율의 메틸에틸케톤:에탄올의 혼합물 1×40ml, 2×30ml 및 1×20ml로 추출하였다. 여기서, 15g의 황산암모늄을 상분리 달성을 위하여 첨가하였다.

25g 황산암모늄을 첨가한 후 실온에서 약 1시간 동안 상기 유기상을 교반하였다. 상기 용해되지 않은 황산암모늄 뿐만 아니라 상기 형성된 수상을 분리하였다. 상기 추출물 용액을 약 50℃에서 회전식 증발기상에서 농축하였고 60℃에서 진공에서 건조시켰다: 14.8g.

다음의 표에서 알 수 있듯이, 52ppm의 4'-O-메틸 피리독신 함량 및 31.3ppm의 비플라본의 함량으로, 따라서 본 발명에 따른 실시예 2b)와 비교하여 상당히 높은 함량 및 열등한 감소 결과를 달성하였다.

표 1에 기재된 플라보노이드, 테르펜 락톤 및 징코산의 함량의 측정을 DAB에 따라 수행하였다.

4'-O-메틸 피리독신의 양적 측정을 Sep Pak Plus C18 카트리지로 농축한 다음, Bond Elut LRC-SCX 카트리지로 농축한 후 HPLC 및 형광검출을 이용하여 수행하였으며, 여기서, Phenomenex Prodigy 5μ ODS-3 HPLC 컬럼 및 트리플루오로 아세트 산(trifluoroacetic acid(pH 2)): 메탄올=9:1(v/v)→메탄올 변화(gradient)를 이용하였다.

표 1에 기재된 비플라본 함량의 측정은 9:1(v/v)의 물:아세토니트릴(acetonitrile)+0.3vol% 인산(85%)→아세토니트릴+0.3vol% 인산의 변화를 이용하여 HPLC 및 Waters Nova Pak C18을 거쳐 340nm에서 UV 검출을 이용하여 수행하였 다.

각 경우에서, 높은, 한정된 순도 등급을 갖는 표준품질(reference substances)을 이용하여 측정을 수행하였다.

[표 1] 상기 기재된 실시예에 따른 추출물의 조성

추출물	실시예 1	비교예 1	실시예 2a)	실시예 2b)	비교예 2	비교예 3
플라보노이드[%]	24.86	24.51	27.17	25.32	25.89	22.78
징코글라이드 A,B,C[%]	3.28	2.94	2.97	3.04	2.97	3.40
빌로발라이드[%]	3.17	3.03	3.18	3.14	3.07	3.07
테르펜 락톤[%]	6.45	5.97	6.15	6.18	6.04	6.47
징코산[ppm]	< 5	< 5	< 5	< 5	< 5	< 5
4'-O-메틸 피리독신 [ppm]	0.4	104.5	164	0.8	89	52
아멘토플라본[ppm]	68.5	78.7	n.d.(< 1)	n.d.(< 1)	81.6	12.6
빌로베틴[ppm]	123.3	120.4	n.d.(< 1)	n.d.(< 1)	136.4	10.4
징코제틴[ppm]	86.3	82.1	n.d.(< 1)	n.d.(< 1)	86.1	2.7
이소징코제틴[ppm]	103.3	104.4	n.d.(< 1)	n.d.(< 1)	111.5	4.8
사이아도피신[ppm]	44.0	43.0	n.d.(< 1)	n.d.(< 1)	44.0	0.8
비플라본의 총량[ppm]	425.4	428.6	n.d.(< 5)	n.d.(< 5)	459.6	31.3

n.d.= 검출불가능(not detectable)

Claims

다음 단계를 포함하는, 감소된 함량의 4'-O-메틸 피리독신(4'-O-methyl pyridoxine) 및/또는 비플라본(biflavones)을 가지는 은행나무 추출물의 제조방법:

a) 물-함유 아세톤(acetone), 탄소원자 1~3개를 갖는 물-함유 알칸올(alkanol) 또는 무수메탄올(anhydrous methanol)을 이용하여 은행나무 잎을 추출하는 단계;

b) 상기 용매를 10중량% 이하 함량으로 농축하여 유기 용매를 분리하는 단계, 이 때, 마지막 증류단계에서 물이 첨가될 수도 있음;

c) 5~25중량%의 고체함량이 되도록 잔류 수용액을 물로 희석하고, 25℃이하로 냉각한 다음, 침전물이 형성될 때까지 방치하는 단계;

d) 잔류 수용액을 황산암모늄(ammonium sulfate)으로 처리한 다음, 이어서 메틸에틸케톤(methyl ethyl ketone) 또는 메틸에틸케톤과 아세톤의 혼합물을 이용하여 적어도 한번 추출하는 단계;

e) 상기 수득된 추출물을 농축한 다음, 10중량%의 고체함량에서 50중량%의 물 및 50중량%의 에탄올을 함유하는 용액을 수득하기 위하여 에탄올-물 혼합물로 희석하는 단계;

f) 상기 용액을 납 화합물 또는 불용성 폴리아마이드로 처리하는 단계;

g) 60~100℃의 끓는 점을 갖는 지방족(aliphatic) 또는 시클로지방족(cycloaliphatic) 용매를 사용하여 상기 여과된 용액을 추출하는 단계;

h) 잔류 수성-알콜성 용액을 농축한 다음, 황산암모늄으로 처리하고, 메틸에틸케톤 및 에탄올로 추출하는 단계;

i) 50~70중량%의 고체함량이 되도록 상기 수득된 유기상을 농축하는 단계;

k) 탄소원자 1~3개를 갖는 수상의 알칸올에서 상기 농축물을 용해시킨다음, 선택적으로 여과하는 단계;

l) 흡착수지 및/또는 이온 교환체로 여과하는 단계, 이 때, 상기 제거되는 물질은 수지 상에 잔여함, 및

m) 5% 미만의 물 함량을 갖는 건조 추출물을 수득하기 위하여 감소된 압력에서 상기 농축물을 건조하는 단계.
제1항에 있어서, k)단계에서 상기 수성 알칸올은 수성 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 수성 에탄올은 에탄올 함량이 40~60중량%인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, l)단계에서 상기 흡착 수지는 선 택적으로 치환된 스티렌계/디비닐벤젠계 기반 수지인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, l)단계에서 상기 이온 교환체는 강산성 이온 교환체인 것을 특징으로 하는 방법.
다음의 함량을 가지는 것을 특징으로 하는 은행나무 잎 추출물:

· 4'-O-메틸 피리독신 20ppm 미만 및/또는

· 비플라본 20ppm 미만.
제6항에 있어서, 4'-O-메틸 피리독신 함량이 10ppm 미만인 것을 특징으로 하는 추출물.
제6항에 있어서, 4'-O-메틸 피리독신 함량이 2ppm 미만인 것을 특징으로 하는 추출물.
제6항 또는 제8항에 있어서, 비플라본 함량이 10ppm 미만인 것을 특징으로 하는 추출물.
제6항 또는 제8항에 있어서, 비플라본 함량이 5ppm 미만인 것을 특징으로 하는 추출물.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 함량을 가지는 것을 특징으로 하는 추출물:

·플라보노이드(flavonoids) 20~30중량%,

·테르펜 락톤(terpene lactones) 4.5~8.5중량% 및

·징코산(ginkgolic acids) 10ppm 미만.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 함량을 가지는 것을 특징으로 하는 추출물:

·플라보노이드 22.0~27.0중량%,

·테르펜 락톤 5.0~7.0중량% 및

·징코산 5ppm 이하.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 다음의 함량을 가지는 것을 특징으로 하는 추출물:

·플라보노이드 22.0~27.0중량%,

·징코라이드(ginkgolides) A, B 및 C 전체 2.8~3.4중량%,

·빌로발라이드(bilobalid) 2.6~3.2중량% 및

·징코산 5ppm 이하.
약제, 식품 또는 치매 및 그 증상 및/또는 대뇌 및 말초 혈액 순환 장애 치료용 제제(preparation)를 위한 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 추출물의 용도.
제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 은행나무 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 약제, 식품 또는 다른 제제.