CN107509997B - 一种基于内源糖苷酶酶解结合树脂吸附脱除白果致毒成分的方法及其制备的产品和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于内源糖苷酶酶解结合树脂吸附脱除白果致毒成分的方法及其制备的产品和应用，该方法包括：(1)白果处理得白果果仁；(2)再加缓冲液磨浆得白果果仁浆液；(3)将浆液保温搅拌使内源糖苷酶将MPNG水解为MPN；(4)酶解后浆液进行两次粗滤，两次离心，得到上清I和II、粗滤截留物II、沉淀II；(5)合并上清I和II，通过树脂吸附，收集滤液或穿出液；(6)合并粗滤截留物II、沉淀II和滤液或穿出液，干燥后得脱毒的白果粉；收集树脂洗脱浓缩干燥后得MPN粗品。该方法有效地去除白果中的MPN和MPNG，工艺操作安全简单，获得脱毒的白果粉，促进白果深加工产业发展，充分发挥白果的营养和保健价值。

Description

一种基于内源糖苷酶酶解结合树脂吸附脱除白果致毒成分的 方法及其制备的产品和应用
技术领域
本发明属食品工程领域，具体涉及一种基于内源糖苷酶酶解结合树脂吸附脱除白果致毒成分的方法及其制备的产品和应用。
背景技术
银杏(Ginkgo biloba L.)是中国的古老珍贵树种之一，为一科一属一种的特殊植物，我国广泛种植，产量占全世界的70％。银杏种实的核俗称白果，其核仁为可食用部分。由于其营养丰富，自古以来被当作养生延年的上品。医学界认为白果有良好的保健医疗效果，白果的药用功能主要是敛肺气、定喘咳、止带虫、缩小便等。近年研究分析表明，白果除含有蛋白质、脂肪、淀粉和糖类之外，还含有丰富的有益于身体的维生素、微量元素和重要的氨基酸。近年又有研究认为，白果具有高效广谱杀菌、耐缺氧、抗疲劳和延缓衰老作用。因此，白果被列入卫生部公布的药食同源食品目录，而且已成为医药、化妆品等的重要原料。
尽管白果极具营养和医疗价值，但是食用白果导致中毒甚至死亡的例子时有报道。对中国2006～2016年新闻报道的白果中毒病例进行统计，结果显示除2007年和2011年未有白果中毒病例报道外，其它年份都有报道。在报道的36例中毒病例中，儿童中毒21例，占总数的58.3％，青年中毒13例，占总数的36.1％，老年中毒2例，占总数的5.6％，白果可以使各个年龄段的人群中毒，相对而言儿童更容易引起中毒。白果中毒病例日本也常有报道。对日本自1881年到2011年白果中毒病例报道进行统计，结果显示1881年日本报道了第一例白果中毒病例。第一个病例报道高峰出现在第二次世界大战之后的50、60年代。70年代后，白果中毒病例报道数明显下降。2000年后，出现了第二个病例报道高峰。白果中毒致死率在日本为13％左右，自20世纪70年代以来没有致死病例。
由于中毒事例报道常发，为了防止不良事件的发生，在日常食用白果时只能采取限量食用，如不能超过6颗或10颗等。这种无理论依据的估量式食用，不仅不能满足人们对这一营养医疗价值俱佳的药食同源食品的食用需求，还大大限制了白果食品加工业的发展，导致白果滞销，果农、白果加工企业经济损失，影响了银杏产业的健康发展。
为了改变这种状况，必须搞清楚白果的致毒成分是什么，并采取适当的方法去除，以提供安全的白果食品加工原料。归纳总结国内外的研究情况，认为白果中致毒成分可能为：氰苷类物质、银杏酚酸、4’-O-甲基吡哆醇(4’-O-methylpyridoxine,MPN)。早期认为白果也像苦杏仁一样含有苦杏仁苷及其同系物类的氰苷类物质，这类物质在白果加工或食用后通过水解产生氢氰酸而产生毒性，但是国内外的研究均表明现有的检测方法在白果中未能检测到氰化物的存在(Suzu,M.Fukuoka Igaku Zasshi,1959,50:5394-5398；Kobayashi,M.Nagano-ken Eisei Kenkyusho Chosa Kenkyu Hokoku,1959,16:1-12；Nishijima,M.etal.Tokyo-to Eisei Kenkyusho Nempo,1975,26:183-186；杨剑婷等.食品科技,2010,35:286-290)。银杏酚酸为漆酚酸类化合物，包括银杏酸、白果酚、白果二酚。银杏叶、白果外种皮、白果果仁中均含有银杏酚酸类化合物，白果外种皮含量最高，银杏叶次之，白果果仁中含量最少。现在的研究表明，银杏酚酸具有强烈的致敏作用而不是致毒作用。食用白果中毒的症状主要是痉挛、抽搐、失去意识。1988年日本学者Keiji等采用多步分离结合动物实验，根据分离物引起的中毒症状，最终分离并获得了白果果仁致毒成分，经结构鉴定为4’-O-甲基吡哆醇(Keiji,W.et al.Chem Pharm Bull,1988,36:1779-1782)。2011年，Daisuke等研究表明，白果果仁中也存在4’-O-甲基吡哆醇的糖基化产物，即4’-O-甲基吡哆醇-5’-葡萄糖苷(MPN-5’-glucoside,MPNG)，MPNG同样也具有致毒作用(Daisuke,K.et al.FoodChemistry,2011,126:1198-1202)。可以看出，目前的研究已明确白果果仁中的致毒成分主要是MPN和MPNG。
伴随着白果中毒事件的不断出现，白果脱毒也一直是研究的热点，有不少文献报道。第一类是使用化学试剂如一定浓度的碳酸钠或碳酸氢钠溶液泡洗白果，以希望除去白果中的氰苷类物质。第二类是使用有机溶剂萃取结合物理分离方法的使用以希望除去白果中的银杏酚酸类物质，如专利CN101785559B公开的方法。可以看出这两类方法在对白果致毒成分的认识上存在局限，并不是以脱除MPN和MPNG为目标。2016年，专利CN105901476A公开了“基于物理与酶促联合方法解除白果毒性的方法”，该方法中将MPN作为了脱毒对象之一。但是，该方法存在以下不足：(1)对白果致毒成分的认识上仍存在缺陷，将氰苷类物质作为脱毒对象之一，忽略了重要致毒成分MPNG；(2)白果果仁中并不天然存在MPN解毒酶，即使有天然存在的MPN解毒酶，在整果中酶的区室化也难以发挥降解作用；(3)公开方法的第一、第二步的高温处理，灭活了果中存在的糖苷酶，从而阻止了分析测定前的制样过程中MPNG水解成MPN，所以处理后测定的MPN含量降低，并不是MPN降解了，而是MPNG不能转化为MPN，实际上MPN和MPNG的总量并没有变化(Daisuke,K.et al.Food Chemistry,2011,126:1198-1202)，所以并没有达到脱除MPN和MPNG的目的；(4)步骤繁琐，反复高温处理，能耗高，需人工去胚芽，工作效率低。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种脱除白果致毒成分的方法，该方法通过内源糖苷酶将MPNG水解为MPN，再结合树脂吸附可以有效地去除白果中的MPN(4’-O-甲基吡哆醇)，并且工艺操作安全，获得不含MPN和MPNG的白果粉原料，促进白果深加工产业的健康发展，充分发挥白果的营养和保健价值。
本发明还提供该方法制备得到的脱除白果致毒成分的白果粉和MPN粗品及其应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种脱除白果致毒成分的方法，包括如下步骤：
(1)白果脱壳去内种皮，得白果果仁；
(2)向白果果仁中加缓冲液在自然温度下进行白果果仁磨浆，得白果果仁浆液；
(3)将白果果仁浆液在一定温度下搅拌保温一定时间，在内源糖苷酶的作用下将MPNG水解为MPN；
(4)内源糖苷酶酶解后的白果果仁浆液进行粗滤，得粗滤截留物I和粗滤透过液I，粗滤透过液I离心，得沉淀I和上清I；合并粗滤截留物I和沉淀I加入去离子水混合均匀，再次粗滤，得粗滤截留物II和粗滤透过液II，粗滤透过液II离心，得沉淀II和上清II；
(5)合并上清I和II，经树脂静态或动态吸附，静态吸附后滤出树脂得滤液或动态吸附后收集穿出液；
(6)合并粗滤截留物II、沉淀II和步骤(5)中的滤液或穿出液，经干燥后得到脱除了MPN和MPNG的白果粉；收集结合有MPN的树脂，经溶剂洗脱，收集洗脱液浓缩干燥后得MPN粗品，树脂经再生后重复使用。
其中，步骤(2)所述缓冲液为0-100mM的盐溶液，pH 3.5-8.5，所述盐溶液的浓度为0时即使用的缓冲液为去离子水，缓冲液重量为白果果仁重量的2-8倍，磨浆粒度达到20-100目。盐溶液通常选用磷酸氢二钠-柠檬酸溶液、柠檬酸-柠檬酸钠溶液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液、磷酸二氢钾-氢氧化钠溶液、Tris-HCl溶液等。
作为优选，步骤(3)所述白果果仁浆液在20-60℃、40-250rpm搅拌保温60-240分钟，使得白果内源糖苷酶将MPNG充分水解为MPN。
作为优选，步骤(4)所述粗滤使用粗滤介质截留颗粒大小为80-120目，所述的离心转速为3000-10000rpm，离心时间为5-30分钟，所述的加入去离子水重量为粗滤截留物I和沉淀I总重量的0.5-5倍。
其中，步骤(5)所述的树脂为凝胶型或大孔型酸性阳离子交换树脂，树脂使用量为上清I和II总重量的5-60％；树脂的骨架材料为苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、环氧系、乙烯吡啶系、脲醛系和氯乙烯系中的一种或多种。
作为优选，步骤(6)所述溶剂为C1-C3的短链醇类的水溶液，醇的体积含量10-90％，溶剂的使用量为树脂重量的1-10倍。
作为优选，步骤(6)所述的干燥为常规干燥、喷雾干燥、冷冻干燥、滚筒干燥中的一种或几种。
本发明所述的脱除白果致毒成分的方法所制备得到的脱除白果致毒成分的白果粉和MPN粗品。
本发明所述的脱除白果致毒成分的方法所制备得到的脱除白果致毒成分的白果粉在制备白果食品、药品、化妆品和作为日用品加工的原料或配料中的应用。
本发明所述的脱除白果致毒成分的方法所制备得到的MPN粗品在制备药物、生物农药和生物杀虫剂中的应用。
白果中同时存在MPN和MPNG两种毒性成分，一种树脂很难达到对不同极性的MPN和MPNG的100％吸附。本发明以白果的真正致毒成分MPN和MPNG作为脱毒对象，加缓冲液对白果果仁磨浆，打破白果果仁中天然存在的内源糖苷酶与MPNG的区室化分隔，通过保温、搅拌，促使内源糖苷酶将MPNG水解成MPN，再结合离子交换树脂的使用，特异性地吸附MPN，可以通过使用一步树脂快速吸附去除，从而实现白果致毒成分的精准脱除。本发明脱毒靶向性强，过程操作简单，安全高效，减少溶剂的使用，工艺路线简单。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明利用白果果仁中天然存在的内源糖苷酶类将MPNG降解为MPN，便于使用一种离子交换树脂实现致毒成分的完全吸附脱除，避免因MPN和MPNG性质差异造成的吸附脱除不完全；该方法实现了MPN和MPNG的精准脱除，工艺操作简单、能耗低，易于工业化放大；致毒成分脱除率高，白果中MPN和MPNG的脱除率可以达到100％。
(2)本发明脱除白果致毒成分的靶向性更明确，以白果的真正致毒成分MPN和MPNG作为脱毒对象，而不是以银杏酚酸和/或氰苷类物质作为脱毒对象；脱毒过程不使用有毒有机溶剂，没有有毒有机溶剂的多步反复萃取，工艺操作安全，产品无有毒有机溶剂残留。
(3)本发明对白果果仁中存在的银杏酚酸类物质也有脱除效果；致毒成分脱除过程中白果营养成分损失少，得到的脱除白果致毒成分的白果粉可以使用在白果食品、药品、化妆品和作为日用品加工的原料或配料，得到的MPN可用于制备药物、生物农药和生物杀虫剂。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)取5公斤白果，脱壳、漂洗并去膜质内种皮，得3.6公斤白果果仁；
(2)加7.5公斤去离子水磨浆，得11公斤平均粒度达到40目的白果果仁浆液；
(3)11公斤白果果仁浆液在37℃于120rpm搅拌保温60分钟，使内源糖苷酶将MPNG水解为MPN；
(4)内源糖苷酶酶解后的白果果仁浆液用装有80目不锈钢粗滤网的过滤器进行粗滤，得粗滤截留物I 3.4公斤，粗滤透过液I 7.4公斤；粗滤透过液I于6000rpm离心15分钟，得上清I 7.2公斤，沉淀I 0.2公斤；粗滤截留物I 3.4公斤和沉淀I 0.2公斤合并，加入3.6公斤的去离子水搅拌混匀，用装有80目不锈钢粗滤网的过滤器进行粗滤，得粗滤截留物II3.4公斤，粗滤透过液II 3.6公斤；粗滤透过液II 3.6公斤于6000rpm离心15分钟，得上清II3.5公斤，沉淀II 0.1公斤；
(5)合并上清I和II共得10.7公斤上清，加入大孔型苯乙烯系酸性阳离子交换树脂D001 1.5公斤自然温度下50rpm静态吸附2小时，滤出树脂，得滤液10.5公斤；
(6)合并粗滤截留物II 3.4公斤、沉淀II 0.1公斤和步骤(5)中的滤液10.5公斤，经喷雾干燥后得脱除MPN和MPNG的白果粉1.95公斤；步骤(5)滤出的树脂用5倍体积的40％甲醇溶液洗脱，收集洗脱液浓缩后经真空干燥得0.1公斤MPN粗品。本实施例的工艺流程如图1所示。
实施例2
(1)取5公斤白果，脱壳、漂洗并去膜质内种皮，得3.6公斤白果果仁；
(2)加10公斤50mM pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液磨浆，得13.4公斤平均粒度达到60目的白果果仁浆液；
(3)13.4公斤白果果仁浆液在40℃于80rpm搅拌保温80分钟，使内源糖苷酶将MPNG水解为MPN；
(4)内源糖苷酶酶解后的白果果仁浆液用装有80目不锈钢粗滤网的过滤器进行粗滤，得粗滤截留物I 3.3公斤，粗滤透过液I 10公斤；粗滤透过液I于3000rpm离心30分钟，得上清I 9.85公斤，沉淀I 0.15公斤；粗滤截留物I 3.3公斤和沉淀I 0.15公斤合并，加入5公斤的去离子水搅拌混匀，用装有80目不锈钢粗滤网的过滤器进行粗滤，得粗滤截留物II3.3公斤，粗滤透过液II 4.8公斤；粗滤透过液II 4.8公斤于3000rpm离心30分钟，得上清II4.6公斤，沉淀II 0.2公斤；
(5)合并上清I和II共得14.45公斤上清，缓慢加入装有3.0公斤凝胶型苯乙酸系酸性阳离子交换树脂LH-004的色谱柱中，收集穿出液14.3公斤；
(6)合并粗滤截留物II3.3公斤、沉淀II 0.2公斤和步骤(5)中的穿出液14.3公斤，经冷冻干燥后得脱除MPN和MPNG的白果粉1.8公斤，用5倍体积的50％乙醇溶液洗脱步骤(5)中结合有MPN的树脂柱，收集洗脱液浓缩后经冷冻干燥得0.13公斤MPN粗品。
实施例3
(1)取5公斤白果，脱壳、漂洗并去膜质内种皮，得3.6公斤白果果仁；
(2)加12公斤100mM pH 6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液磨浆，得15.5公斤平均粒度达到80目的白果果仁浆液；
(3)15.5公斤白果果仁浆液在45℃于40rpm搅拌保温100min，使内源糖苷酶将MPNG水解为MPN；
(4)内源糖苷酶酶解后的白果果仁浆液用装有100目不锈钢粗滤网的过滤器进行粗滤，得粗滤截留物I 3.3公斤，粗滤透过液I 12公斤；粗滤透过液I于10000rpm离心5分钟，得上清I 11.7公斤，沉淀I 0.3公斤；粗滤截留物I 3.3公斤和沉淀I 0.3公斤合并，加入7.0公斤的去离子水搅拌混匀，用装有120目不锈钢粗滤网的过滤器进行粗滤，得粗滤截留物II3.4公斤，粗滤透过液II 7.0公斤；粗滤透过液II 7.0公斤于10000rpm离心5分钟，得上清II6.75公斤，沉淀II 0.25公斤。
(5)合并上清I和II共得18.45公斤上清，缓慢加入装有4.5公斤大孔型丙烯酸系酸性阳离子交换树脂D151的色谱柱中，收集穿出液18.3公斤；
(6)合并粗滤截留物II3.4公斤、沉淀II 0.25公斤和步骤(5)中的穿出液18.3公斤，经滚筒干燥后得脱除MPN和MPNG的白果粉1.82公斤，用4倍体积的60％丙醇溶液洗脱步骤(5)中结合有MPN的树脂柱，收集洗脱液浓缩后经真空干燥得0.14公斤MPN粗品。
实施例4
实施例4与实施例1的方法相同，不同之处在于：步骤(2)加入白果果仁重量2倍的pH为8.5，100mM的Tris-HCl溶液进行磨浆，磨浆粒度达到20目；步骤(3)白果果仁浆液在在20℃，转速为250rpm，搅拌保温180分钟；步骤(4)粗滤使用粗滤介质截留颗粒大小为120目，加入去离子水重量为粗滤截留物I和沉淀I总重量的0.5倍；步骤(5)树脂使用量为上清I和II总重量的5％；步骤(6)所述溶剂醇的体积含量10％，溶剂的使用量为树脂重量的10倍。
实施例5
实施例5与实施例1的方法相同，不同之处在于：步骤(2)加入白果果仁重量8倍的pH为3.5，10mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行磨浆，磨浆粒度达到100目；步骤(3)白果果仁浆液在在60℃，转速为40rpm，搅拌保温240分钟；步骤(4)粗滤使用粗滤介质截留颗粒大小为100目，加入去离子水重量为粗滤截留物I和沉淀I总重量的5倍；步骤(5)树脂使用量为上清I和II总重量的60％；步骤(6)所述溶剂醇的体积含量90％，溶剂的使用量为树脂重量的1倍。
试验例
测试本发明实施例1-3中白果粉中的MPN和MPNG含量以及银杏酚酸类物质的含量，同时考察本发明的白果营养成分损失和有机溶剂残留，结果如表1所示。
其中，对比例1采用专利CN101785559B的方法处理实施例1中的白果。
对比例2采用CN105901476A的方法处理实施例1中的白果。
对比例3采用文献(Keiji,W.et al.Chem Pharm Bull,1988,36:1779-1782)中的方法处理实施例1中的白果。
表1
MPN和MPNG含量 银杏酚酸 营养成分损失 有机溶剂残留
实施例1 0 0 损失少 无
实施例2 0 0 损失少 无
实施例3 0 0 损失少 无
对比例1 大于200ug/g 微量 损失大 有
对比例2 大于100ug/g 少量 损失少 无
对比例3 大于30ug/g 少量 损失大 有
由表1可以看出，本发明利用内源糖苷酶类将MPNG降解为MPN，便于使用一种离子交换树脂实现致毒成分的完全吸附脱除，避免因MPN和MPNG性质差异造成的吸附脱除不完全，实现MPN和MPNG的精准脱除，工艺操作简单、能耗低，致毒成分脱除率高。与对比例相比本发明白果中MPN和MPNG的脱除率可以达到100％；并且银杏酚酸也可以有效脱出，同时白果中营养成分几乎不损失或者损失少，也不会存在有机溶剂残留，方便后续加工使用。

Claims (5)

1.一种基于内源糖苷酶酶解结合树脂吸附脱除白果致毒成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）白果脱壳去内种皮，得白果果仁；
（2）向白果果仁中加缓冲液在自然温度下进行白果果仁磨浆，得白果果仁浆液，步骤（2）所述缓冲液为0-100 mM的盐溶液，所述盐溶液的浓度为0时即使用的缓冲液为去离子水；
（3）将白果果仁浆液搅拌保温，在内源糖苷酶的作用下将MPNG水解为MPN；
（4）内源糖苷酶酶解后的白果果仁浆液进行粗滤，得粗滤截留物I和粗滤透过液I，粗滤透过液I离心，得沉淀I和上清I；合并粗滤截留物I和沉淀I加入去离子水混合均匀，再次粗滤，得粗滤截留物II和粗滤透过液II，粗滤透过液II离心，得沉淀II和上清II；
（5）合并上清I和II，经树脂静态或动态吸附，静态吸附后滤出树脂得滤液或动态吸附后收集穿出液；
（6）合并粗滤截留物II、沉淀II和步骤（5）中的滤液或穿出液，经干燥后得到脱除了MPN和MPNG的白果粉；收集结合有MPN的树脂，经溶剂洗脱，收集洗脱液浓缩干燥后得MPN粗品，树脂经再生后重复使用；
步骤（3）所述白果果仁浆液在20-60℃、40-250 rpm搅拌保温60-240分钟；
步骤（4）所述粗滤使用粗滤介质截留颗粒大小为80-120目，所述的离心转速为3000-10000 rpm，离心时间为5-30分钟，所述的加入去离子水重量为粗滤截留物I和沉淀I总重量的0.5-5倍；
步骤（5）所述的树脂为凝胶型或大孔型酸性阳离子交换树脂，树脂使用量为上清I和II总重量的5-60%；树脂的骨架材料为苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、环氧系、乙烯吡啶系、脲醛系和氯乙烯系中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的脱除白果致毒成分的方法，其特征在于，步骤（2）所述缓冲液为pH 3.5-8.5的盐溶液或者去离子水，缓冲液重量为白果果仁重量的2-8倍，磨浆粒度达到20-100目。
3.根据权利要求1所述的脱除白果致毒成分的方法，其特征在于，步骤（6）所述溶剂为C1-C3的短链醇类的水溶液，醇的体积含量10-90%，溶剂的使用量为树脂重量的1-10倍。
4.根据权利要求1所述的脱除白果致毒成分的方法，其特征在于，步骤（6）所述的干燥为常规干燥、喷雾干燥、冷冻干燥和滚筒干燥中的一种或几种。
5.一种权利要求1所述的脱除白果致毒成分的方法所制备得到的脱除白果致毒成分MPN和MPNG的白果粉以及MPN粗品。
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