CN105056027A - 切面红色土茯苓的有效部位及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开的是切面红色土茯苓的有效部位及其应用，本发明表明总黄酮部位为切面红色土茯苓的有效部位，此外所述的总黄酮部位是黄酮类成分占总黄酮部位固体的比例超过90％。申请人经过反复试验、筛选、比较和总结，本发明还确定了切面红色土茯苓有效部位总黄酮部位的制备方法(也即提取方法)，试验结果以切面红色土茯苓中主要化学成分落新妇苷峰面积计，其含量占总量的59.8％，以总黄酮各成分的峰面积和计，其含量占总量的94.2％，表明该制备方法制得的总黄酮部位纯度高、效果好。试验结果还表明该制备方法重复性、稳定性较好。

Description

切面红色土茯苓的有效部位及其应用

技术领域

本发明涉及切面红色土茯苓的有效部位及其应用，属于中药技术的领域。

技术背景

土茯苓为百合科植物光叶菝葜(SmilaxglabraRoxb.)的干燥根茎，土茯苓的应用广泛，是药食同源的传统药材，具有解毒，除湿，通利关节等功效。市售土茯苓切面均为白色，，而产于贵州的土茯苓切面却为红色，故贵州苗族称之“红土茯苓”，是具有贵州地域特点的苗族常用大宗传统药材，蕴藏量大并有资源优势。《土茯苓的生药学研究》(贵阳中医学院学报，第33卷第3期，第18-20页，2011年5月。)对切面为红色(文中也称红棕色)的土伏苓作了药材性状鉴别、粉末显微鉴别以及薄层鉴别，鉴别结果见《土茯苓的生药学研究》一文，研究结果表明断面红色与断面白色的土茯苓(即普通土茯苓)在性状、显微特征上均有较大的差异；该文参照2010版药典方法改进后进行了薄层鉴别研究，断面红色或白色的土茯苓在斑点数量、颜色及亮度上有较大的区别，表明二者所含成分有较大差异。《断面红棕色及类白色土茯苓抗炎作用的比较研究》(中药药理与临床，2012；28(6)，第103页-105页，2012年)对断面红棕色及类白色土茯苓抗炎作用进行了比较研究。研究结果表明，在一般抗炎作用中，与白色土茯苓相比，断面红棕色土茯苓显示了其对渗出型炎症模型(小鼠毛细血管通透性)、增殖型炎症模型(小鼠棉球肉芽肿)、炎症物质NO浓度测定(大鼠急性炎症)均有更为优异的抑制作用。但是，目前尚未有关于切面红色土茯苓在抗炎等功能中有效部位的确定、该有效部位的提取工艺及其它应用的研究和报道。

发明内容

本发明目的在于，提供一种切面红色土茯苓的有效部位。此外本发明还提供了它在治疗或预防类风湿性关节炎药物中的新应用。

本发明的技术方案:切面红色土茯苓有效部位，为切面红色土茯苓的总黄酮部位。

上述的切面红色土茯苓有效部位中，所述的总黄酮部位为总黄酮的乙酸乙酯部位。

前述的切面红色土茯苓有效部位中，所述的总黄酮部位是黄酮类成分占总黄酮部位固体的比例超过90％。

前述的切面红色土茯苓有效部位中，通过高效液相分析，所得图谱中含有以下7个峰：

峰1(5-O-咖啡酰基莽草酸)：保留时间7.14min，峰面积409455；

峰2(黄酮类成分)：保留时间10.204min，峰面积211285；

峰3(新落新妇苷)：保留时间12.786min，峰面积343899；

峰4(落新妇苷)：保留时间13.569min，峰面积3238258；

峰5(新异落新妇苷)：保留时间15.844min，峰面积632227；

峰6(异落新妇苷)：保留时间16.556min，峰面积297982；

峰7(黄杞苷)：保留时间18.083min，峰面积328977；

色谱条件：

HypersilODS2C18色谱柱流动相：A为0.05％磷酸水，B为乙腈，梯度洗脱：0～20min，10％～24％；梯度曲线均为直线；流速：0.8mL/min；柱温：25℃；检测波长：291nm；进样量10μL。

前述的切面红色土茯苓有效部位中，该有效部位的制备方法依次包括以下步骤；

a、提取工艺：称取一定量的切面红色土茯苓药材粗粉，第一次加入10倍量的70％的乙醇浸泡过夜，回流提取1.5h(冷凝管有液滴滴出，并微沸后开始计时)，过滤，得滤液；第二次加入8倍量的70％的乙醇，回流提取1h(冷凝管有液滴滴出，并微沸后开始计时)，过滤，得滤液；第三次加入8倍量的70％的乙醇，回流提取1h(冷凝管有液滴滴出，并微沸后开始计时)，过滤，得滤液，合并3次滤液，60℃减压回收乙醇；

b、除糖工艺：将70％的乙醇提取物60℃减压回收乙醇，浓缩至与原药材的比例为1.5:1时，取出，放冷至室温后。量取浓缩液的体积，再缓慢加入一定量的95％的乙醇，使含醇量达到85％，缓慢搅匀，于4℃的冰箱中放置过夜，第二日取出，过滤沉淀，再用95％的乙醇洗涤沉淀3～5次，直至洗涤液颜色清淡为止，过滤沉淀，合并滤液，55℃减压回收乙醇，得除糖中间物；

c、除鞣工艺：将除糖中间物加入一定量的蒸馏水，使其呈良好的流动状态，以流浸膏完全溶解且不粘壁为宜，取出，放冷至室温，倒入适宜容器中，再加入4％的明胶水溶液，两者体积比约为1:1，加入明胶水溶液后，缓慢摇动使其充分混匀，不可用力搅拌，室温静置1h，待其完全沉淀后，再加入一定量的95％的乙醇，使其含醇量为85％，缓慢摇动使其充分混匀，不可用力搅拌，再室温静置1h后，用玻璃棒沿内壁缓慢搅拌使其充分混匀，让鞣质成良好的沉淀状态，封口，室温下放置过夜，第二日取出，过滤沉淀，再用95％的乙醇洗涤沉淀3～5次，直至洗涤液颜色清淡为止，过滤沉淀，合并所有滤液，50℃减压回收乙醇，得除鞣中间物；

d、萃取工艺：将除鞣中间物加入一定量的甲醇溶液，使其充分溶解，除去甲醇不溶物(即过量明胶)，过滤，合并滤液，50℃减压回收甲醇至干。再加入一定量的蒸馏水，使其充分溶解。取出，放冷，用乙酸乙酯进行萃取，静置分层得到下层水溶液，同法乙酸乙酯反复萃取数次，直至乙酸乙酯层颜色清淡为止，合并乙酸乙酯萃取液，50℃减压回收溶剂至干，使旋转蒸发瓶内形成良好的结晶状态，得成品。

前述的切面红色土茯苓有效部位中，该有效部位的使用剂量为0.05g/kg～0.25g/kg。

前述的切面红色土茯苓有效部位中，该有效部位的使用剂量为0.1g/kg或0.2g/kg。

前述的切面红色土茯苓有效部位中，该有效部位可制成任何一种临床上或药学上可接受的制剂。

前述的切面红色土茯苓有效部位在制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的应用。

前述的切面红色土茯苓有效部位在制备治疗或预防类风湿性关节炎的保健品或者其它功能性食品的应用。

前述的切面红色土茯苓有效部位中，切面红色土茯苓总黄酮部位对大鼠佐剂性关节炎预防性给药实验中，所述的大鼠佐剂性关节炎的实验模型造模方法是：

a、第一次免疫刺激：取卡介苗冻干粉，80℃灭活1h后，与液体石蜡于研钵内研磨混匀，制备成含卡介苗浓度3mg/ml的混悬液，即弗氏完全佐剂，备用；将大鼠使用乙醚麻醉后，以75％酒精常规消毒，然后在右足足趾皮下以0.1ml/只注射弗氏完全佐剂，达到刺激机体免疫的目的；

b、正式造模：第一次免疫刺激7天后，取卡介苗冻干粉，80℃灭活1h后，与液体石蜡于研钵内研磨混匀，制备成含卡介苗浓度15mg/ml的混悬液，即弗氏完全佐剂，备用；将大鼠使用乙醚麻醉后,剔掉尾根部的毛发，以75％酒精消毒，然后在尾根部经皮内以0.1ml/只注射弗氏完全佐剂，以诱导大鼠佐剂性关节炎模型。

与现有技术比较，本发明的有益效果如下：

1、本发明切面红色土茯苓的有效部位为总黄酮部位，试验表明总黄酮部位在渗出型炎症模型(小鼠腹腔毛细血管通透性)、增生型炎症模型(小鼠棉球肉芽肿)中的抑制率优于其它部位，说明总黄酮部位确实为切面红色土茯苓抗炎有效部位。

2、申请人经过反复试验、筛选、比较和总结，确定了切面红色土茯苓有效部位总黄酮部位的制备方法(也即提取方法)，试验结果以切面红色土茯苓中主要化学成分落新妇苷峰面积计，其含量占总量的59.8％，以总黄酮各成分的峰面积和计，其含量占总量的94.2％，表明该制备方法制得的总黄酮部位纯度高、效果好。试验结果还表明该制备方法重复性、稳定性较好。

3、动物急毒实验表明，本发明经口给药的安全范围很大、无毒性，安全性较高。

4、本发明的总黄酮部位在低、中剂量(0.05g/kg-0.25g/kg)时，特别是剂量为0.1g/kg时，该部位供试药对于小鼠慢性增殖型炎症的抑制率均高于其他剂量，且增大或减小该最优剂量(0.1g/kg)都使得切面红色土茯苓总黄酮对于增殖型炎症的抑制率降低，因此本发明的总黄酮部位的最优剂量系0.1g/kg。同时，该有效部位还能下调胸腺、脾脏及肾上腺指数，并且能够抑制关节滑膜TNF-α及脾脏中IL-6的表达。在三个剂量中，低剂量(0.1/kg)略优于中剂量(0.2/kg)与高剂量(0.4/kg)。重复实验的结果也表明，低剂量(0.1/kg)对大鼠AA模型具有明显预防作用同时对于机体的物质代谢影响较小。

5、本发明经试验表明，切面红色土茯苓有效部位具有治疗或预防类风湿性关节炎的功能。

附图说明：

图1是对二甲苯致小鼠腹部毛细血管通透性抑制率柱状图；

图2是重复实验中对二甲苯致小鼠腹部毛细血管通透性抑制率柱状图；

图3是贵州产切面红色土茯苓中精制总黄酮部位HPLC色谱图；

图4是总黄酮部位HPLC特征性图谱图；

图5是第1次实验对小鼠棉球肉芽肿抑制率柱状图；

图6是第2次实验对小鼠棉球肉芽肿抑制率柱状图；

图7是第3次实验对小鼠棉球肉芽肿抑制率柱状图；

图8是AA大鼠原发性足肿胀度变化趋势图；

图9是对AA大鼠原发性病变血清NO动态含量趋势图；

图10是大鼠佐剂性关节炎预防性给药实验中AA大鼠体质量变化趋势图；

图11是大鼠佐剂性关节炎预防性给药实验中AA大鼠足肿胀度变化趋势图；

图12是大鼠佐剂性关节炎预防性给药实验中AA大鼠AI变化趋势图；

图13是大鼠佐剂性关节炎预防性给药实验中AA大鼠脏器指数柱状图；

图14是AA大鼠滑膜TNF-及脾脏IL-6mRNA相对表达量图；

图15是大鼠佐剂性关节炎预防性给药重复实验中AA大鼠体质量变化趋势图；

图16是大鼠佐剂性关节炎预防性给药重复实验中AA大鼠足肿胀度变化趋势图；

图17是大鼠佐剂性关节炎预防性给药重复实验中AA大鼠AI变化趋势图；

图18是大鼠佐剂性关节炎预防性给药重复实验中AA大鼠脏器(脾脏)指数柱状图；

图19是大鼠佐剂性关节炎预防性给药重复实验中AA大鼠脏器(胸腺)指数柱状图；

图20是大鼠佐剂性关节炎预防性给药重复实验中AA大鼠脏器(肾上腺指数)指数柱状图；

图21是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药实验中AA大鼠体质量变化趋势图；

图22是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药实验中AA大鼠足肿胀度变化趋势图；

图23是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药实验中AA大鼠AI变化趋势；

图24是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药实验中脏器(脾脏)指数柱状图；

图25是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药实验中脏器(脾脏)指数柱状图；

图26是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药实验中脏器(肾脏)指数柱状图；

图27是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药实验中脏器(肾上腺)指数柱状图；

图28是AA大鼠血清NO水平柱状图；

图29是AA大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平柱状图；

图30是AA大鼠滑膜TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA表达量图；

图31是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药重复实验中AA大鼠体质量变化趋势图；

图32是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药重复实验中AA大鼠足肿胀度变化趋势图；

图33是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药重复实验中AA大鼠AI变化趋势图；

图34是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药重复实验中脏器(脾脏)指数柱状图；

图35是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药重复实验中脏器(脾脏)指数柱状图；

图36是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药重复实验中脏器(肾脏)指数柱状图；

图37是大鼠佐剂性关节炎治疗性给药重复实验中脏器(肾上腺)指数柱状图；

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步说明。

实施例1：贵州产切面红色土茯苓有效部位为贵州产切面红色土茯苓的总黄酮部位，该有效部位的制备方法依次包括以下步骤；

a、提取工艺：称取一定量的切面红色土茯苓药材粗粉，第一次加入10倍量的70％的乙醇浸泡过夜，回流提取1.5h(冷凝管有液滴滴出，并微沸后开始计时)，过滤，得滤液；第二次加入8倍量的70％的乙醇，回流提取1h(冷凝管有液滴滴出，并微沸后开始计时)，过滤，得滤液；第三次加入8倍量的70％的乙醇，回流提取1h(冷凝管有液滴滴出，并微沸后开始计时)，过滤，得滤液，合并3次滤液，60℃减压回收乙醇；

b、除糖工艺：将70％的乙醇提取物60℃减压回收乙醇，浓缩至与原药材的比例为1.5:1时，取出，放冷至室温后。量取浓缩液的体积，再缓慢加入一定量的95％的乙醇，使含醇量达到85％，缓慢搅匀，于4℃的冰箱中放置过夜，第二日取出，过滤沉淀，再用95％的乙醇洗涤沉淀3～5次，直至洗涤液颜色清淡为止，过滤沉淀，合并滤液，55℃减压回收乙醇，得除糖中间物；

c、除鞣工艺：将除糖中间物加入一定量的蒸馏水，使其呈良好的流动状态，以流浸膏完全溶解且不粘壁为宜，取出，放冷至室温，倒入适宜容器中，再加入4％的明胶水溶液，两者体积比约为1:1，加入明胶水溶液后，缓慢摇动使其充分混匀，不可用力搅拌，室温静置1h，待其完全沉淀后，再加入一定量的95％的乙醇，使其含醇量为85％，缓慢摇动使其充分混匀，不可用力搅拌，再室温静置1h后，用玻璃棒沿内壁缓慢搅拌使其充分混匀，让鞣质成良好的沉淀状态，封口，室温下放置过夜，第二日取出，过滤沉淀，再用95％的乙醇洗涤沉淀3～5次，直至洗涤液颜色清淡为止，过滤沉淀，合并所有滤液，50℃减压回收乙醇，得除鞣中间物；

d、萃取工艺：将除鞣中间物加入一定量的甲醇溶液，使其充分溶解，除去甲醇不溶物(即过量明胶)，过滤，合并滤液，50℃减压回收甲醇至干。再加入一定量的蒸馏水，使其充分溶解。取出，放冷，用乙酸乙酯进行萃取，静置分层得到下层水溶液，同法乙酸乙酯反复萃取数次，直至乙酸乙酯层颜色清淡为止，合并乙酸乙酯萃取液，50℃减压回收溶剂至干，使旋转蒸发瓶内形成良好的结晶状态，得成品。

一、以下是贵州产切面红色土茯苓的总黄酮部位为贵州产(切面红色)土茯苓抗炎有效部位的试验。

1.研究目的

运用小鼠毛细血管通透性模型和小鼠棉球肉芽肿模型对贵州产(切面红色)土茯苓个可能有效部位进行筛选，最终找到贵州产(切面红色)土茯苓的抗炎有效部位。

2.小鼠毛细血管通透性实验

2.1实验目的

运用小鼠毛细血管通透性实验方法进行贵州产(切面红色)土茯苓抑制抗急性渗出型炎症的有效部位筛选。

2.2实验动物

雄性KM小鼠，18～22g。

2.3实验分组及给药

分为模型对照组、药材醇提物组、多糖部位组、鞣质部位组、总黄酮部位组和阳性药(氢化可的松)组，每组10只小鼠。除阳性药外，各供试药均用0.5％CMC-Na配制0.7g/ml(相当于7g/kg生药量)，氢化可的松用生理盐水配制成2mg/ml。分别为氢化可的松组20mg/kg，其他供试药组7g/kg，模型对照组给予等量0.5％CMC-Na。氢化可的松组为皮下注射给药，其他各组均为灌胃给药。实验前两天开始进行预给药。

2.4实验原理

二甲苯为致炎物质，当涂于小鼠腹部去毛皮肤后，引起局部的炎症反应，导致富含蛋白质的液体外渗至血管外，当于静脉内注入伊文思蓝后，与血浆白蛋白结合的伊文思蓝即可从亢进的毛细血管内向血管外渗出，于滴二甲苯处形成蓝色斑块，根据染料渗出量的多少，判定各组炎症的炎症程度的指标。

2.5实验方法

实验当天给药1h后，于小鼠尾静脉注射0.5％伊文思蓝生理盐水(0.1ml/10g)，在提前褪毛区域中心处均匀涂以30μl二甲苯。20min后处死小鼠，沿着备皮区域剪下皮肤，之后剪成碎块放入离心管，在离心管中加至6ml的丙酮硫酸钠溶液，浸泡皮肤样本24h。将皮肤浸出液3000r/min离心10分钟，吸取上清液测定，空白对照用之前所配丙酮硫酸钠溶液。于紫外-可见分光光度计波长为590nm处测定吸光度值。

3.小鼠棉球肉芽肿实验

3.1实验目的

运用小鼠棉球肉芽肿模型进行贵州产(切面红色)土茯苓抑制慢性增殖型炎症的有效部位筛选。

3.2实验动物

雄性KM小鼠，18～22g。

3.3实验分组及给药

分为模型对照组、药材醇提物组、多糖部位组、鞣质部位组、总黄酮部位组和阳性药(醋酸泼尼松)组，每组10只小鼠。除阳性药外，各供试药均用0.5％CMC-Na配制0.7g/ml(相当于7g/kg生药量)，醋酸泼尼松用生理盐水配制成0.7mg/ml。分别为醋酸泼尼松组7mg/kg，其他供试药组7g/kg，模型对照组给予等量0.5％CMC-Na。均为灌胃给药。实验前两天开始进行预给药。

3.4实验原理

本实验系应用棉球埋入动物局部皮下，可产生与临床某些炎症后期病理变化相似的纤维细胞增生以及肉芽组织形成，可作为筛选抑制慢性增殖型炎症药物的模型。

3.5实验方法

实验前，制作10±1mg的棉球，经高温蒸汽灭菌后，于50℃烘箱中烘干备用。

实验当天给药1h后，腹腔注射4％水合氯醛模型对照溶液(0.1ml/10g)，待麻醉后，于小鼠左右腋下分别植入一个高压灭菌棉球(10±1mg)，缝合伤口。每天灌胃1次，连续16天，于第16天给药1h后处死小鼠后取出棉球，剔除脂肪组织，70℃烘箱中烘干4h，称重。比较各组肉芽肿重量，该实验重复两次。

最后数据采用SPSS20.0统计分析软件分析处理，所有数据均以表示，两组间的比较采用独立样本T检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

4.实验小结

实验结果表明(见表1～2及图1～2)，贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮无论对于急性渗透型炎症还是慢性增殖型炎症都表现出了显著的抑制作用，而贵州产(切面红色)土茯苓总多糖和总鞣质则未表现出显著而稳定的抑制效果。说明贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮确实为贵州产(切面红色)土茯苓抗炎有效部位。故下一步将进一步探索贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮的急性毒性与剂量关系。

表1对小鼠腹部毛细血管通透性的影响

注:与模型对照组相比较**P<0.01，*P<0.05(下同)

表2重复实验中对小鼠腹部毛细血管通透性的影响

二、以下是贵州产切面红色土茯苓药材中总黄酮的小鼠急性毒性试验。

1.研究目的

考察贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮部位的急性毒性，并为之后的该有效部位抗炎量效关系试验提供剂量参考。

2.实验原理

急性毒性试验，又称单次给药急性毒性试验，是指24h内一次或多次给予动物受试物后，产生的毒性反应。包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应。

最大给药量，最大给药量指单次或24小时内多次(2～3次)给药所采用的最大给药剂量。最大给药量试验是指在合理的给药浓度及合理的给药容量的条件下，以允许的最大剂量给予实验动物，观察动物出现的反应。

最大耐受量，又称最大耐受浓度：指药物在除急性毒性动物实验外的实验(短期重复实验、亚慢性毒性实验、慢性毒性实验)中不引起实验动物死亡的最大剂量或浓度。

3.实验动物

KM小鼠，雌雄各半，共20只，18～22g。

4.实验方法

正式实验前，每次使用4只鼠，雌雄各半，以最大的可给药浓度(0.7g/ml)和给药体积在24h内，分3次(体积依次分别为0.4ml/10g、0.3ml/10g、0.3ml/10g)进行给药，两次间相隔5h，观察最大给药量是否会造成小鼠死亡，若出现死亡，则按倍数降低给药量，再进行预试，直至找到全不死剂量及全部死亡剂量；若未出现小鼠死亡，则按此给药量进行正是实验给药。

正式实验时，次给药4h内密切观察，之后每日上、下午各观察一次，详细记录小鼠体重、行为、状态、分泌物、饮食饮水等。按预实验所得到的最大给药量在24h内，分3次(体积依次分别为0.4ml/10g、0.3ml/10g、0.3ml/10g)进行给药，密切观察小鼠的状态，观察持续14天，最后将小鼠进行大体解剖，观察主要脏器情况。

正式实验前，每次使用4只鼠，雌雄各半，以最大的可给药浓度和给药体积在24h内，分3次(体积依次分别为0.4ml/10g、0.3ml/10g、0.3ml/10g)进行给药，两次间相隔5h，观察最大给药量是否会造成小鼠死亡，若出现死亡，则按倍数降低给药量，再进行预试，直至找到全不死剂量及全部死亡剂量；若未出现小鼠死亡，则按此给药量进行正是实验给药。

正式实验时，次给药4h内密切观察，之后每日上、下午各观察一次，详细记录小鼠体重、行为、状态、分泌物、饮食饮水等。按预实验所得到的最大给药量在24h内，分3次(体积依次分别为0.4ml/10g、0.3ml/10g、0.3ml/10g)进行给药，密切观察小鼠的状态，观察持续14天，最后将小鼠进行大体解剖，观察主要脏器情况。

4.结果

4.1中毒表现及时间在前两次给药后，雌雄小鼠活动均正常，无中毒反应。第三次给药后，雌鼠反应依旧正常，而雄鼠则表现为活动及进食减少，腹部贴地，部分雄鼠出现腹式呼吸

4.2小鼠死亡或状况在观察的14天中，无小鼠死亡，并且小鼠体重正常增长。

4.3将死亡小鼠进行大体解剖，进行肉眼观察，查看组织病变情况肝脏呈紫红色，无斑点和肿块，正常充盈；心脏呈鲜红色，无斑点和肿块，正常；肺脏为海绵状，淡粉色，无斑点和肿块，肺叶正常无收缩；肾脏呈暗红色、蚕豆状，无斑点和肿块，无缩小或肿大；脾脏呈紫红色，无斑点和肿块，正常；肾上腺：雌鼠的呈淡黄色，正常大小；而雄鼠的呈黄色，略有缩小。

5.实验小结

此次急毒实验三次给药的贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮剂量总和达到70g/kg，说明供试药经口给药的安全范围很大，毒性小，但与剂量的相关性较小，同时也验证文献中所提到的落新妇苷的生物利用度低的特点，雌雄鼠对与药物的反应略有不同，雌鼠活动正常，而雄鼠则活动减少，可能贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮对于雄鼠的抗炎免疫作用效应要比雌鼠要强。下一步实验将探索贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮抗炎的量效关系及发挥抗炎作用的最优剂量。

三、以下是贵州产切面红色土茯苓药材中总黄酮的验证试验。

取一定量的上述总黄酮部位结晶，用甲醇溶解，于高效液相色谱仪进行含量检测，结果以切面红色土茯苓中主要化学成分落新妇苷峰面积计，其含量占总量的59.8％，以总黄酮各成分的峰面积和计，其含量占总量的94.2％。故结果表明所提取的总黄酮部位为精制黄酮部位，色谱图见图3。

总黄酮部位黄酮类成分含量：

如图4和表3所示，总黄酮部位特征性图谱：

色谱条件：

仪器岛津LC-20A液相色谱仪，紫外检测器(SER1ALNO20134405524)；HypersilODS2C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)流动相：A为0.05％磷酸水，B为乙腈(V/V)，梯度洗脱：0～20min，10％～24％；梯度曲线均为直线。流速：0.8mL/min；柱温：25℃；检测波长：291nm；进样量10μL。

表3总黄酮部位HPLC特征性图谱各成分信息表

总黄酮部位各成分中除5-O-咖啡酰基莽草酸外，其余成分均为黄酮类成分，故由所占总黄酮部位HPLC图谱总峰面积比例可知，黄酮类成分占总黄酮部位固体的比例超过90％。

四、贵州产(切面红色)土茯苓抗炎有效部位量效关系试验。

1.研究目的

运用小鼠棉球肉芽肿实验方法进行贵州产(切面红色)土茯苓抗炎有效部位抑制炎症增殖期的量效关系进行考察。并找到该有效部位的抗炎最优剂量。

2.实验动物

雄性KM小鼠，18～22g。

3.实验分组及给药

分为模型对照组、4～5个抗炎有效部位梯度剂量组、醋酸泼尼松组(在第三次实验中设置)，每组12～14只小鼠。除阳性药外，各有效部位梯度剂量组供试药均用0.5％CMC-Na配制成相应浓度，醋酸泼尼松用0.5％CMC-Na配制成0.7mg/ml。均以0.1ml/10g，模型对照组给予等量0.5％CMC-Na。均为灌胃给药。实验前两天开始进行预给药。

4.实验原理

本实验系应用棉球埋入动物局部皮下，可产生与临床某些炎症后期病理变化相似的纤维细胞增生以及肉芽组织形成，可作为筛选抑制慢性增殖型炎症药物的模型。

5.实验方法

实验当天给药1h后，腹腔注射4％水合氯醛模型对照溶液(0.1ml/10g)，待麻醉后，于小鼠左右腋下分别植入一个高压灭菌棉球(10±1mg)，缝合伤口。每天灌胃1次，连续16天，于第16天给药1h后处死小鼠后取出棉球，剔除脂肪组织，70℃烘箱中烘干4h，称重。比较各组肉芽肿重量，经三次实验找到贵州产(切面红色)土茯苓抗慢性增殖型炎症的有效部位的量效关系及抗炎最优剂量。

以便为大鼠佐剂关节炎模型实验提供计量参考。

最后数据采用SPSS20.0统计分析软件分析处理，所有数据均以表示，两组间的比较采用独立样本T检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

6.实验小结

本实验采用小鼠棉球肉芽肿模型来探讨贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮对慢性炎症反应的量效关系作用及发挥抗炎作用的最优剂量。

综合3次实验的结果(见表4～6及图5-7)，在贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮各剂量组中，以0.1g/kg剂量对于慢性增殖型炎症的抑制率最高，说明0.1g/kg剂量的贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮确实是抗小鼠棉球肉芽肿模型炎症的最优剂量。并且通过两步显著性检验(即低或高剂量组和最优剂量组均与模型对照组有显著差异，并且低或高剂量组与最优剂量组也具有显著性差异)，结果表明贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮抑制增殖型模型炎症药效与药物剂量存在量效依赖性，并且该量效依赖性可能是一种双向相性量效关系，即增大或减小该最优剂量(0.1g/kg)都使得贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮对于增殖型炎症的抑制率降低。下一步实验将验证在小鼠抗炎实验中所得到的最优剂量是否能在大鼠抗炎实验中得到体现。

表4第1次实验对小鼠棉球肉芽肿的影响

注:与模型对照组相比较**P<0.01，*P<0.05；与贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮低剂量组相比较##P<0.01，#P<0.05。

表5第2次实验对小鼠棉球肉芽肿的影响

注:与模型对照组相比较**P<0.01，*P<0.05；与贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮中剂量1相比较##P<0.01，#P<0.05。

表6第2次实验对小鼠棉球肉芽肿的影响

注:与模型对照组相比较**P<0.01，*P<0.05；与贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮中剂量1组相比较##P<0.01，#P<0.05

实施例2：贵州产切面红色土茯苓有效部位在制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的应用。

一、大鼠足跖佐剂致炎实验

1.研究目的

(1)通过观察大鼠足跖佐剂致炎急性期(原发性)连续动态足跖肿胀程度及血清中NO的浓度变化情况，了解贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮对佐剂所致大鼠足跖急性炎症的动态影响。

(2)进一步考察贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮对大鼠佐剂性关节炎原发性期炎症的最优剂量。

2.实验动物

雄性SD大鼠，160～180g。

3.实验分组及给药

分为空白对照组、模型对照组、醋酸泼尼松组、3个有效部位剂量组，每组10只大鼠。醋酸泼尼松用0.5％CMC-Na配制0.7mg/ml，3个有效部位剂量组供试药用0.5％CMC-Na配制成相应浓度。均以0.1ml/10g进行给药，模型对照组给予等量0.5％CMC-Na。均为灌胃给药。实验前两天开始进行预给药。

4.实验原理

大鼠佐剂性关节炎原发性病变主要表现为早期致炎部位的局部炎症反应，在发病过程中，致炎部位开始发生急性渗出性足肿胀，足跖发生持续性肿胀，血液中炎症物质NO升高，约持续3天后逐渐降低。从注射之日后连续3天监测大鼠血清中NO水平(浓度)的动态释放量，比较不同组间的差异。

5.。实验方法

(1)动物模型的建立

实验当日给药1h后，将大鼠放入充满乙醚气体的密闭盒子中麻醉后取出，于每只大鼠右后足跖皮内注射0.1ml弗氏完全佐剂致炎。对照组用等体积的生理盐水同法注射。

(2)检测指标

1)足跖肿胀度

测定致炎前用数显测厚仪测量每个大鼠两只后足足跖厚度，从致炎后4小时及其后4天，每天测量两只后足足跖厚度，足跖肿胀度＝致炎足足跖厚度-非致炎足足跖厚度。

2)血清动态NO含量

于致炎之后的3天中，每天对大鼠进行内眦眶(眼眶后静脉丛取血)取血，于3500r/min，离心10min，分离出血清于-20℃冻存，测定血清中的NO含量，测定方法同NO试剂盒说明书。

最后数据采用SPSS20.0统计分析软件分析处理，所有数据均以表示，两组间的比较采用独立样本T检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

6.实验小结

实验结果表明，在抑制效果方面，以醋酸泼尼松为最佳，中剂量(0.2g/kg)的贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮和贵州产(切面红色)土茯苓药材醇提物则与之接近，低剂量(0.1g/kg)和高剂量(0.4g/kg)有一定的抑制作用，但并不十分稳定。这说明中剂量(0.2g/kg)的贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮对AA大鼠原发性期的急性足肿胀抑制效果略优于另两个剂量。各供试药组能够显著降低血液中的NO含量，其中以中剂量(0.2g/kg)的贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮和贵州产(切面红色)土茯苓醇提物抑制效果最好，说明了贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮和贵州产(切面红色)土茯苓醇提物发挥抗炎作用，可能是通过抑制机体中NO的释放，降低局部细小血管的通透性，来发挥抗炎作用的。本实验证实了贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮对于大鼠佐剂性关节炎原发性炎症具有良好的抑制作用。但其是否对那么大鼠佐剂性关节炎继发性炎症具有预防作用？接下来，将进一步探讨贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮对于大鼠佐剂性关节炎继发性炎症的预防作用效果。结果见表7～8及图8～9。

表7对AA大鼠原发性足肿胀度的影响

注:与模型对照组比较*P<0.05，**P<0.01(下同)

表8对AA大鼠原发性炎症血清NO动态含量的影响

二、大鼠佐剂性关节炎预防性给药实验。

1.研究目的

观察贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮部位对大鼠佐剂性关节炎的影响，评价供试药对RA的预防作用及其机制。

2.实验动物

雄性SD大鼠，160～180g。

3.实验分组及给药

分为空白对照组、模型对照组、药材醇提物组、3个有效部位剂量组、醋酸泼尼松组，每组8只大鼠。药材醇提物用0.5％CMC-Na配制0.7g/ml(生药计终浓度)，3个有效部位剂量组供试药用0.5％CMC-Na配制成相应浓度，将醋酸泼尼松，加入0.5％CMC-Na溶液，配制成相当于0.7mg/ml。均以1ml/100g进行给药，模型对照组给予等量0.5％CMC-Na。均为灌胃给药。实验当天开始进行给药，共给药18天。

4.实验原理

弗氏完全佐剂(FCA)诱导的大鼠佐剂性关节炎是一种免疫性关节炎症病变，与人的类风湿性关节炎相似。经历急性局部炎症(造模后1～4天)和急性炎症缓解，多发性关节炎和全身炎症(10～28天)。造模采用大鼠尾根部内注射法：于大鼠尾根部内注射FCA致炎。原发病变主要表现为致炎局部的炎症反应，继发病变(对侧足)一般在致炎后8～18天左右出现，16～28天左右达到高峰。

5.实验方法

(1)模型建立

第一次免疫刺激：取卡介苗冻干粉，80℃灭活1h后，与液体石蜡于研钵内研磨混匀，制备成含卡介苗浓度3mg/ml的混悬液，即弗氏完全佐剂(completefreund’sadjuvant，CFA)，备用。将大鼠使用乙醚麻醉后，以75％酒精常规消毒，然后在右足足趾皮下注射CFA(0.1ml/只)，达到刺激机体免疫的目的。

正式造模：第一次免疫刺激7天后，取卡介苗冻干粉，80℃灭活1h后，与液体石蜡于研钵内研磨混匀，制备成含卡介苗浓度15mg/ml的混悬液，即弗氏完全佐剂(completefreund’sadjuvant，CFA)，备用。将大鼠使用乙醚麻醉后,剔掉尾根部的毛发，以75％酒精消毒，然后在尾根部经皮内注射CFA(0.1ml/只)，以诱导大鼠佐剂性关节炎模型(adjuvant-inducedarthritis，AA)。

(2)指标测定

1)每日测定体重及观察全身性炎症的情况，并于造模后第7、9、11、13、15、17天分别测量大鼠后足足跖厚度并进行关节炎指数评分(arthritisindex，AI)。

注：关节指数按5级评分法评价，根据4只肢体的病变程度累计积分，计算出AI。0分：无红肿；1分：足小趾关节红肿；2分：趾关节和足跖均肿胀；3分：踝关节以下的足爪均肿胀；4分：包括踝关节在内的全部足爪红肿。把各个关节的积分累计起来，即为每只大鼠的AI。

足肿胀度＝(致炎后右足跖体积-造模前右足跖体积+致炎后左足跖体积-造模前左足跖体积)/2

2)第18天称重并给药1h后于大鼠股动脉取血，脱颈处死动物，摘取称定脾脏、胸腺、肾上腺称重，摘除一侧滑膜用于实时荧光PCR实验(滑膜及脾脏用于测定IL-6、TNF-αmRNA的表达情况)。滑膜及脾脏，需立即放入干冰盒中保存，并于实验结束后，将血清、脾脏、滑膜样本均置于-80℃冰箱中保存。注：脏器指数＝脏器重量(mg)/体重(g)

最后数据采用SPSS20.0统计分析软件分析处理，所有数据均以表示，两组间的比较采用独立样本T检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

6.实验小结

实验结果表明，AA大鼠模型对照组继发性足肿胀非常明显，贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮能明显抑制AA太鼠继发性足跖肿胀程度的发展并下调关节炎指数，并能维持大鼠体质量正常增长，对大鼠AA有明显预防作用，同时不同于糖皮质激素，不影响动物的体内物质代谢，而能显著改善AA大鼠的状态。同时，该有效部位还能下调胸腺、脾脏及肾上腺指数，并且能够抑制关节滑膜TNF-α及脾脏中IL-6的表达。结果见表9～17及图10～20。

实验结果表明，贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮的低剂量(0.1g/kg)和中剂量(0.2g/kg)对于大鼠佐剂性关节炎的发生具有较为明显的预防作用。下一步将通过大鼠佐剂性关节炎预防性给药重复实验，验证贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮的低剂量(0.1g/kg)的预防作用是否可靠。

表9对AA大鼠体质量的影响

注:与模型对照组相比较**P<0.01，*P<0.05(下同)

表10对AA大鼠足肿胀度的影响

表11对AA大鼠AI的影响

表12对AA大鼠肾上腺、胸腺及脾脏指数的影响

表13对AA大鼠滑膜TNF-及脾脏IL-6mRNA表达量的影响(n＝5)

三、大鼠佐剂性关节炎预防性给药重复实验。

1.研究目的

观察贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮部位对大鼠佐剂性关节炎预防作用的影响，考察该部位对RA的预防作用及剂量是否具有重复性。

2.实验动物

同前

3.实验分组及给药

分为空白对照组、模型对照组、有效部位剂量(0.1g/kg)组、醋酸泼尼松组，每组10只大鼠。药材醇提物用0.5％CMC-Na配制0.7g/ml(生药计终浓度)，有效部位剂量组供试药用0.5％CMC-Na配制成0.01g/ml浓度，将醋酸泼尼松，加入0.5％CMC-Na溶液，配制成相当于0.7mg/ml。均以1ml/100g进行给药，模型对照组给予等量0.5％CMC-Na。均为灌胃给药。实验当天开始进行给药，共给药18天。

4.实验原理

同前

5.实验方法

(1)模型建立

同前

(2)指标测定

1)每日测定体重及观察全身性炎症的情况，并于造模后第7、10、13、16、19天分别测量大鼠后足足跖厚度并进行关节炎指数评分。足肿胀度计算及评分方法同前。

2)第19天称重并给药1h后于大鼠股动脉取血，脱颈处死动物，摘取称定脾脏、胸腺、肾上腺称重。脏器指数＝脏器重量(mg)/体重(g)。

最后数据采用SPSS20.0统计分析软件分析处理，所有数据均以表示，两组间的比较采用独立样本T检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

6.实验小结

实验结果表明贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮对AA大鼠佐剂性关节炎的发生具有显著的抑制作用，经预防给药后，大鼠的关节肿胀程度降低，脏器指数下调，关节炎指数提示贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮抑AA大鼠关节炎症及进程，实验结果的趋势与上一次实验接近。同时也验证了上一次实验做得到预防性给药贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮剂量(0.1g/kg)具有重复性。下一步实验将考察该有效部位AA大鼠佐剂性关节炎是否具有治疗作用。对于结果见表14～17及图15～20。

表14贵州产(切面红色)土茯苓对AA大鼠体质量的影响

注:与模型对照组比较*P<0.05，**P<0.01(下同)

表15贵州产(切面红色)土茯苓对AA大鼠足肿胀度的影响

表16贵州产(切面红色)土茯苓对AA大鼠关节炎指数的影响

表17对AA大鼠肾上腺、肾脏、胸腺及脾脏指数的影响

四、大鼠佐剂性关节炎治疗性给药实验。

1.研究目的

观察贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮部位对大鼠佐剂性关节炎的的影响，初步评价该部位对RA的治疗作用及其部分作用机制。

2.实验动物

雄性SD大鼠，160～180g。

3.实验分组及给药

分为空白对照组、将模型成功大鼠分为模型对照组、药材醇提物组、3个有效部位剂量组、来氟米特组，雷公藤多苷组，每组10～12只大鼠。药材醇提物用0.5％CMC-Na配制0.7g/ml(生药计终浓度)，3个有效部位剂量组供试药用0.5％CMC-Na配制成相应浓度，将雷公藤多苷，加入0.5％CMC-Na溶液，配制成相当于1mg/ml。均以1ml/100g进行给药，均为灌胃给药。于造模后第7天开始进行给药，来氟米特组(前3天剂量为5.8mg/kg，其后以2.3mg/kg剂量维持给药)，空白对照组及模型对照组给予等体积0.5％CMC-Na溶液，共计给药21天。

4.实验原理

同前

5.实验方法

(1)模型建立

同前

(2)指标测定

1)每日测定体重及观察全身性炎症的情况，并于第二次造模后第7天起每隔两天测量一次大鼠后足足跖厚度并进行关节炎指数评分。足肿胀度计算及评分方法同前。

2)第29天给药1h后于大鼠股动脉取血，脱颈处死动物，摘除称定脾脏、胸腺、肾脏、肾上腺重量，摘除一侧滑膜用于实时荧光PCR实验(用于测定IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的表达情况)，取材当中，摘除滑膜及脾脏后，立即放入干冰盒中保存，实验结束后，血清(ELISA法测定NO、IL-1β、IL-6、TNF-α含量)、脾脏、滑膜样本均置于-80℃冰箱中保存。

最后数据采用SPSS20.0统计分析软件分析处理，所有数据均以表示，两组间的比较采用独立样本T检验，P<0.05认为差异有统计学意义。抑制率(％)＝[(模型对照组－供试药组)/(模型对照组－空白对照组)]×100％。

6.实验小结

实验结果表明，贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮能够明显降低AA大鼠的足肿胀度，下调关节炎指数，维持体重正常增长，同时下调AA大鼠血清中的TNF-α、IL-1β及IL-6水平，并抑制AA大鼠滑膜组织中TNF-α、IL-1β及IL-6mRNA的表达水平，进而控制RA的病情发展。结果见表18～23及图18～30。

实验结果表明，贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮是贵州产(切面红色)土茯苓治疗RA的有效部位，该有效部位的低剂量(0.1g/kg)与中剂量(0.2g/kg)对于AA大鼠的有较好的干预作用，并且作用优于雷公藤多苷，该成分不仅可以改善AA大鼠的表现而且有可能延缓其病情。下一步是进行一次大鼠佐剂性关节炎治疗性给药的重复实验，以观察该有效部位的低剂量(0.1g/kg)对于AA大鼠的治疗作用是否可靠。

表18切面红色土茯苓对AA大鼠体质量的影响

注:与模型对照组相比较**P<0..01，*P<0..05(下同)

表19对AA大鼠足肿胀度的影响

表20对AA大鼠AI的影响

表21对AA大鼠肾上腺、肾脏、胸腺及脾脏指数的影响

表22对AA大鼠血清NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响

表23对AA大鼠滑膜TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA表达量的影响(n＝6)

五、大鼠佐剂性关节炎治疗性给药重复实验。

1.研究目的

观察贵州产(切面红色)土茯苓总黄酮部位对大鼠佐剂性关节炎的的影响，考察该部位对RA的治疗作用。验证上一次实验所得到的实验结果是否可靠。

2.实验动物

雄性SD大鼠，160～180g。

3.实验分组及给药

分为空白对照组、将模型成功大鼠分为模型对照组、1个有效部位剂量(0.1g/kg)组、来氟米特组，每组10～12只大鼠。有效部位剂量组供试药用0.5％CMC-Na配制成0.01g/ml浓度，均为灌胃给药。于造模后第7天开始进行给药，来氟米特组(前3天剂量为5.8mg/kg，其后以2.3mg/kg剂量维持给药)，空白对照组及模型对照组给予等体积0.5％CMC-Na溶液，共计给药21天。

4.实验原理

同前

5.实验方法

(1)模型建立

同前

(2)指标测定

1)每日测定体重及观察全身性炎症的情况，并于第二次造模后第7天起每隔两天测量一次大鼠后足足跖厚度并进行关节炎指数评分。评分方法同前。

2)第29天给药1h后于大鼠股动脉取血，脱颈处死动物，摘除称定脾脏、胸腺、肾脏、肾上腺重量。脏器指数＝脏器重量(mg)/体重。

3)最后数据采用SPSS20.0统计分析软件分析处理，所有数据均以表示，两组间的比较采用独立样本T检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

6.实验小结

本次大鼠佐剂性关节炎治疗性给药重复性实验实验结果如体质量变化、足肿胀度、关节炎指数、脏器指数的趋势与上一次治疗性给药实验相同，上次实验所得到的治疗性给药切面红色土茯苓总黄酮的最优剂量(0.1g/kg)也得到了验证，说明该剂量对于治疗大鼠佐剂性关节炎的疗效可靠。结果见表24～27及图31～37。

表24切面红色土茯苓对AA大鼠体质量的影响

注:与模型对照组比较*P<0.05，**P<0.01(下同)

表25切面红色土茯苓对AA大鼠足肿胀度的影响

表26切面红色土茯苓对AA大鼠关节炎指数的影响

表27对AA大鼠肾上腺、肾脏、胸腺及脾脏指数的影响

Claims (10)

1.切面红色土茯苓的有效部位，其特征在于：为切面红色土茯苓的总黄酮部位。

2.根据权利要求1所述的切面红色土茯苓有效部位，其特征在于：所述的总黄酮部位为总黄酮的乙酸乙酯部位。

3.根据权利要求1或2所述的切面红色土茯苓有效部位，其特征在于：所述的总黄酮部位是黄酮类成分占总黄酮部位固体的比例超过90％。

4.根据权利要求1或2所述的切面红色土茯苓有效部位，其特征在于：通过高效液相分析，所得图谱中含有以下7个峰：

峰1：保留时间7.14min，峰面积409455；

峰2：保留时间10.204min，峰面积211285；

峰3：保留时间12.786min，峰面积343899；

峰4：保留时间13.569min，峰面积3238258；

峰5：保留时间15.844min，峰面积632227；

峰6：保留时间16.556min，峰面积297982；

峰7：保留时间18.083min，峰面积328977；

色谱条件：

HypersilODS2C18色谱柱流动相：A为0.05％磷酸水，B为乙腈，梯度洗脱：0～20min，10％～24％；梯度曲线均为直线；流速：0.8mL/min；柱温：25℃；检测波长：291nm；进样量10μL。

5.根据权利要求1至4任一项所述的切面红色土茯苓有效部位，其特征在于：该有效部位的制备方法依次包括以下步骤；

a、提取工艺：称取切面红色土茯苓药材粗粉，第一次加入10倍量的70％的乙醇浸泡过夜，回流提取1.5h，过滤，得滤液；第二次加入8倍量的70％的乙醇，回流提取1h，过滤，得滤液；第三次加入8倍量的70％的乙醇，回流提取1h，过滤，得滤液，合并3次滤液，60℃减压回收乙醇；

b、除糖工艺：将70％的乙醇提取物60℃减压回收乙醇，浓缩至与原药材的比例为1.5:1时，取出，放冷至室温后；量取浓缩液的体积，再缓慢加入95％的乙醇，使含醇量达到85％，缓慢搅匀，于4℃的冰箱中放置过夜，第二日取出，过滤沉淀，再用95％的乙醇洗涤沉淀3～5次，直至洗涤液颜色清淡为止，过滤沉淀，合并滤液，55℃减压回收乙醇，得除糖中间物；

c、除鞣工艺：将除糖中间物加入蒸馏水，使其呈良好的流动状态，以流浸膏完全溶解且不粘壁为宜，取出，放冷至室温，倒入适宜容器中，再加入4％的明胶水溶液，两者体积比约为1:1，加入明胶水溶液后，缓慢摇动使其充分混匀，不可用力搅拌，室温静置1h，待其完全沉淀后，再加入95％的乙醇，使其含醇量为85％，缓慢摇动使其充分混匀，不可用力搅拌，再室温静置1h后，用玻璃棒沿内壁缓慢搅拌使其充分混匀，让鞣质成良好的沉淀状态，封口，室温下放置过夜，第二日取出，过滤沉淀，再用95％的乙醇洗涤沉淀3～5次，直至洗涤液颜色清淡为止，过滤沉淀，合并所有滤液，50℃减压回收乙醇，得除鞣中间物；

d、萃取工艺：将除鞣中间物加入甲醇溶液，使其充分溶解，除去甲醇不溶物，过滤，合并滤液，50℃减压回收甲醇至干；再加入蒸馏水，使其充分溶解；取出，放冷，用乙酸乙酯进行萃取，静置分层得到下层水溶液，同法乙酸乙酯反复萃取数次，直至乙酸乙酯层颜色清淡为止，合并乙酸乙酯萃取液，50℃减压回收溶剂至干，使旋转蒸发瓶内形成良好的结晶状态，得成品。

6.根据权利要求1至5任一项所述的切面红色土茯苓有效部位，其特征在于：该有效部位的使用剂量为0.01g/kg～0.5g/kg。

7.根据权利要求6所述的切面红色土茯苓有效部位，其特征在于：该有效部位的使用剂量为0.05g/kg～0.25g/kg。

8.根据权利要求7所述的切面红色土茯苓有效部位，其特征在于：该有效部位的使用剂量为0.1g/kg或0.2g/kg。

9.根据权利要求1至8任一项所述的切面红色土茯苓有效部位在制备治疗或预防类风湿性关节炎的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的切面红色土茯苓有效部位，其特征在于：切面红色土茯苓总黄酮部位对大鼠佐剂性关节炎预防性给药实验中，所述的大鼠佐剂性关节炎的实验模型造模方法是：

a、第一次免疫刺激：取卡介苗冻干粉，80℃灭活1h后，与液体石蜡于研钵内研磨混匀，制备成含卡介苗浓度3mg/ml的混悬液，即弗氏完全佐剂，备用；将大鼠使用乙醚麻醉后，以75％酒精常规消毒，然后在右足足趾皮下以0.1ml/只注射弗氏完全佐剂，达到刺激机体免疫的目的；

b、正式造模：第一次免疫刺激7天后，取卡介苗冻干粉，80℃灭活1h后，与液体石蜡于研钵内研磨混匀，制备成含卡介苗浓度15mg/ml的混悬液，即弗氏完全佐剂，备用；将大鼠使用乙醚麻醉后,剔掉尾根部的毛发，以75％酒精消毒，然后在尾根部经皮内以0.1ml/只注射弗氏完全佐剂，以诱导大鼠佐剂性关节炎模型。