背景技术
痛风为嘌呤代谢紊乱及尿酸排泄减少所致,其发病率逐年增高。各国的发病率不同,亚洲近10年发病率逐渐上升。国外资料表明,成人高尿酸血症的发病率高达5%,痛风的患病率达0.13%—0.37%。随着我国人民群众生活水平的不断提高,人们的饮食结构有很大改变,高嘌呤、高蛋白、高脂肪。进入21世纪,痛风病已成为继糖尿病之后的人类第二大代谢疾病。临床特点是:高尿酸血症、急性关节炎反复发作、痛风石形成、慢性关节炎和关节畸形,以及在病程后期出现尿酸结石和痛风性肾实质性病变。此病一般多发于有家族史30岁以上男性,临床表现为急性痛风性关节炎:多夜间及临晨突发,受累关节及拇趾;还可引发肾结石及肾病:肾尿酸结石阻塞泌尿系统引起肾绞痛和血尿,多数患者有肾性高血压及蛋白尿,少数可发展为肾功能衰竭。痛风已经成为二十一世纪全球面临的新的急待控制的疾病之一。
痛风一般间歇性发作,发病时主要表现为拇趾关节、踝关节及指关节等部位红肿,且伴随有针刺、刀割般的锐性疼痛,多数患者还会伴发高烧。一般病程超过5年的患者就会出现痛风结石,痛风结石可导致关节严重变形,使患者无法正常行走,甚至无法握取笔、书、筷子等日常物品,痛风石治疗不及时的话会自行破溃,伤口经年不愈,并最终会因感染而迫使患者截肢致残。部分患者还会因痛风并发冠心病、高血压、糖尿病等疾病。尤其是病程超过十年以上的痛风性肾病患者,如果对病情不加以控制,很容易引发肾绞痛、血尿肾直至引发肾功能衰竭及尿毒症,最终,有的患者不得不依靠肾移植来维持生命。
在治疗学上,抗痛风药主要针对痛风发生的病理生理学机制,可通过抑制尿酸合成、促进尿酸排泄或抑制炎症反应而发挥抗痛风作用。痛风急性发作的治疗主要采用非水杨酸类非甾体抗炎药和秋水仙碱,慢性痛风的主要治疗目的是降低血中尿酸含量,常用丙磺舒和别嘌醇等。然而,这些药物均因疗效有限、不良反应较大而临床应用受限。因此,临床上尚无理想的痛风治疗药物。
痛风性关节炎( gouty arthritis, GA) 是由嘌呤代谢障碍所致血尿酸浓度增高,从而尿酸盐结晶沉积于关节引起的一种代谢性骨关节病。尿酸钠( monsodium urate , MSU) 晶体被证实为GA的非微生物性病原体, 其诱导的免疫性炎症在GA的发病中起重要作用。
急性GA发作主要由滑膜炎性细胞浸润、尿酸沉积、组织局部坏死,早期尿酸盐结晶从沉着的滑膜上脱落进入滑液中,滑液中的蛋白质立即吸附于结晶表面,并为滑膜细胞、多核白细胞、单核白细胞、巨噬细胞所吞噬,滑膜表面充血水肿,炎细胞浸润所致。在治疗学上,目前治疗药物如非类固醇类抗炎药、秋水仙碱等均因疗效有限或不良反应较重而临床应用受限。因此,继续探索治疗急性GA的高效低毒药物具有重要意义。
中草药治疗缺血性疾病历史悠久,但按照现代医学,尤其是循证医学的的标准,目前尚无确切证据。如果从中草药活性成分中能够发现一种有效的促血管新生化合物,这对中草药治疗缺血性疾病的解释及该化合物用于缺血性疾病的治疗意义重大。
淫羊藿苷(Icariin)为一种已知化合物,分子式:C33H40O15,其结构式为:
该化合物为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornum Maxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum Maxim. 、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxim.、巫山淫羊藿Epimedium wushanense T.S.Ying或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai 的干燥茎叶提取物。
已知该化合物具有增加心脑血管血流量、促进造血功能、提高免疫功能及骨代谢等作用,具有补肾壮阳、抗衰老、抗肿瘤等功效。淫羊藿苷能促进性功能是阴气科室精液分泌亢进,精囊充满后,刺激感觉神经,间接兴奋性欲而引起。淫羊藿苷可以从不同方面影响衰老机制,如影响细胞传代,延长生长期,调节免疫和分泌系统,改善机体代谢和各器官功能。在心血管系统,淫羊藿苷对垂体后叶素引起的大鼠心肌缺血有一定保护作用,具有明显的降压作用。此外,淫羊藿苷还具有抑菌、抗病毒、抗炎等作用,以及降血脂、降血糖作用和抗肿瘤等作用。但迄今尚无抗痛风的报道。
发明内容
本发明的目的是:提供一种淫羊藿苷在制备抗痛风药物中的应用,它发现淫羊藿苷具有抗痛风的作用,特别是对急性痛风性关节炎具有防治作用。
本发明是这样实现的:淫羊藿苷在制备抗痛风药物中的应用。
为了验证本发明的技术效果,通过采用关节腔注射尿酸钠(以下简称MSU诱)导的大鼠急性痛风性关节炎(以下简称GA)模型,观察了ICA对该模型的防治效果。
材料
1.1动物
SD大鼠72只,雄雌各半,体重200-250g。第三军医大学大坪医院动物中心提供,动物许可证号:SCXK(渝)2012-0005。
仪器
BS-110S型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司);HH.W21.420型电热恒温水温箱(北京市用光明医疗仪器厂);F45-30-11型高速冷冻离心机(德国Eppendorf 公司);超声机(上海冠特超声仪器有限公司)。BM4000B显微镜(德国Leica公司),石蜡切片机(美国Sandon公司)。
试药与试剂
ICA购自南京替斯艾么中药研究所,HLPC鉴定纯度>98%,秋水仙碱为云南吴邦制药有限公司产品,批号:090105,MSU购自美国sigma公司。
方法
2.1动物分组及给药
实验动物适应性饲养7d后随机按性别分成6组,分别为空白对照组、模型组、ICA低(20mg/kg)、中(40mg/kg)、高(80mg/kg)剂量组、阳性药物组(秋水仙碱,0.15mg/kg),共6组,每组12只,灌胃给药7d,正常对照组和模型组给予等量蒸馏水灌胃。
溶液的配制
将3g MSU 加入100mL 蒸馏水中煮沸并充分搅拌, 待MSU 完全溶解后, 通过超声破碎处理,配置成3.0%MSU溶液备用。
造模
第5天给药后1 h 造模,腹腔注射水合氯醛(35mg/kg)麻醉,各组大鼠仰卧固定,碘伏消毒右后肢踝关节,用6 号注射针在大鼠右后肢踝关节背后从45°方向插入至胫骨肌腱内侧,感觉有落空感后,注入体积分数3.0%MSU溶液100 μL,以关节囊对侧鼓起为注入标准,制备急性GA模型。对照组右后肢踝关节注射等体积生理盐水[1]。
计算大鼠关节肿胀度
造模前1 h 及造模后36h 用缚线法测取右后肢踝关节同一部位周径,根据以下公式计算肿胀率。肿胀率(%)=(致炎后后肢踝关节周径-致炎前后肢踝关节周径)/致炎前后肢踝关节周径×100%。
大鼠行为学评分
造模后,每9h、18h、27h、36h观察大叔步态,评分标准[8]:0 分为正常步态, 双足均匀着地;1 分为轻度跛行,受试下肢略有弯曲; 2 分为中度跛行, 受试下肢刚触及地面; 3 分为重度跛行, 受试下肢离开地面,三足着地行走。
大鼠血常规中白细胞的检测
在每大组中随机抽取5只大鼠取其血液进行血常规检测,观察每组大鼠白细胞的变化趋势,分析ICA对其炎症因细胞的作用。
踝关节腔积液涂片
用5号针头在大鼠右后肢肿胀踝关节背后插入并抽取关节积液,将抽取出的关节积液均匀的涂取在载玻片上,苏木素- 伊红(HE) 染色,光镜下观察踝关节积液炎细胞浸润情况。
大鼠踝关节病理改变的观察:
造模36h 后处死各组大鼠,取其踝关节于10%中性福尔马林溶液固定,溶液固定,EDTA-2NA溶液进行脱钙,常规脱水、透明、包埋、切片和苏木素- 伊红(HE) 染色,光镜下观察局部病理组织学变化。
结果
3.1 ICA对MSU溶液诱导大鼠急性GA踝关节肿胀率的影响
造模前1h及造模后36h测取了大鼠右后肢踝关节同一部位周径,并计算出其关节肿胀率。结果发现,空白组无肿胀,模型组出现明显肿胀(p < 0.01),肿胀率为60%,说明造模成功。然而,ICA中、高剂量组与及阳性药组(秋水仙碱)疗效相似,其肿胀率较模型组明显降低(均p < 0.05),如图1所示。
图1注:空白组与模型组比较:* p <0.01;各治疗组与模型组比较:# p<0.05。
对MSU溶液诱导大鼠急性GA步态行为学的影响
造模后9h后模型组大鼠活动减少,右后肢弯曲,不太异常,表现为不同程度的跛行,评分显著升高,27h变现最为明显,持续到36h。与模型组比较,ICA 中、高剂量组及阳性药物组大鼠活动状态显著得到改善,评分有效降低(见表1)。
对大鼠血常规白细胞的影响
模型组动物较空白组白细胞数量明显增加。模型组与各药物组比较,ICA中、高剂量组白细胞数量均有明显降低,与阳性药组(秋水仙碱)疗效相当,如图2所示。
图2注:空白组与模型组比较:* p <0.05;各治疗组与模型组比较:# p<0.05。
对MSU溶液诱导大鼠急性GA滑膜组织与踝关节积液病理学的影响
滑膜病理学观察结果显示,空白对照组大鼠踝关节滑膜及周围组织正常,无炎性细胞浸润;模型组大鼠踝关节炎症较显著,滑膜表面粗糙不平,充血水肿,可见大量的炎性细胞浸润,滑膜呈现增生样改变;ICA各剂量组和阳性药物(秋水仙碱)组踝关节炎症均不同程度的减轻, 周围软组织充血不显著,见少量炎性细胞浸润吗,如图3所示。踝关节积液病理学观察结果显示,模型组大鼠踝关节积液中发现大量炎症细胞且密集,ICA各剂量组对大鼠踝关节积液炎症细胞均有不同程度的减轻,中、高剂量组见少量炎性细胞且疏松,如图4所示。
图3注:A,空白组;B,模型组;C,ICA低剂量组;D,ICA中剂量组;E,ICA高剂量组;F,阳性药组。
图4注:A,模型组;B,ICA低剂量组;C,ICA中剂量组;D,ICA高剂量组。
讨论
急性GA是因血液尿酸增高,尿酸盐结晶沉积于关节囊、滑膜、软骨及骨质等组织,刺激关节而引起的踝关节滑膜及周围组织的病理学损伤及炎症反应。MSU在医学上常作为工具药用于诱导大鼠急性GA模型的方法之一,该法具有简单、快速及成功率高等优点。因此,本实验采用该法复制急性GA模型。结果发现,步态评分进行性增高,病变关节明显肿胀,提示造模成功。
目前,抗痛风药物主要有抑制尿酸合成的药物如别嘌呤、增加尿酸排出的药物如丙磺舒及抑制白细胞游走的药物如秋水仙碱和非甾体类抗炎药等,但这些药物均存在不同程度的不良反应,因而临床应用受限。ICA为中药淫羊藿的黄酮类主要有效成分,已有研究发现ICA是一种天然的抗炎药物。本实验发现ICA可明显改善急性GA模型大鼠踝关节肿胀程度和MSU引起的踝关节滑膜病理损害,降低步态评分,血液和关节积液炎症细胞浸润明显好转,表明ICA对MSU所致的大鼠急性GA具有一定的防治作用,展示了ICA在治疗急性GA方面存在良好的临床应用前景,值得进一步深入研究。
本发明发现淫羊藿苷对痛风性关节炎具有防治作用,包括急性痛风性关节炎和慢性痛风性关节,并通过动物实验证明,淫羊藿苷的确可减轻尿酸钠诱导急性痛风性关节炎。因此将淫羊藿苷用于制备抗痛风药物,可为治疗痛风提供一种天然药物,从而降低使用抗痛风药物造成的不良反应,发掘了已知中草药淫羊藿中的特异性单体淫羊藿苷在抗痛风上的新用途,开拓了新的应用领域。虽然其机制尚需进一步研究,但是,本发明了为ICA用于急性GA的后续研究提供基础药理学依据。本发明材料来源广泛,易于获取,用于制备药物简单易行、具有较好的治疗效果。