CN104606216B - 莫诺苷在制备治疗骨性关节炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
莫诺苷在制备治疗骨性关节炎药物中的应用，涉及莫诺苷的应用。莫诺苷可促进体外培养的人骨性关节炎软骨细胞存活，减弱软骨细胞凋亡的指标；提高体外培养的人骨性关节炎软骨细胞的细胞外基质内的II型胶原蛋白、蛋白多糖Aggrecan的表达水平，提高人骨性关节炎软骨细胞内蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶的磷酸化水平，有效促进体外培养的人骨性关节炎软骨细胞存活、减弱其凋亡活动。有效减缓实验大鼠骨性关节炎模型中软骨组织的损伤，包括增加软骨层厚度、提高软骨细胞外聚多糖的含量等指标。
Description
技术领域
本发明涉及莫诺苷的应用，尤其是涉及莫诺苷在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。
背景技术
莫诺苷(morroniside)，最早是从山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalisSieb.et Zucc)的果肉中提炼出来的环烯醚萜苷类化合物，分子式为C17H26O11，结构式参见图1，是中药六味地黄丸有效成分之一。近期学者陆续发现，从灰毡毛忍冬(Loniceramacranthoides)的茎、叶以及金银花(Lonicera japonica)的花芽等众多药用植物中也均可提炼。
目前研究结果显示，莫诺苷的主要药理作用包括：
1.神经细胞保护：在毒理条件下保护神经细胞，或抵抗过氧化氢等诱导的神经细胞凋亡的作用，因此多作为一种神经保护类药物。
2.代谢：参与肝细胞的炎症反应及脂类代谢的调节；人脐静脉内皮细胞抵抗高糖环境(high ambient glucose)的损伤等。
3.抑制血小板凝聚：莫诺苷能显著抑制由ADP、AA、PAF诱导的兔血小板聚集,尤对ADP的抑制作用选择性强。
骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)即关节软骨的退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。临床表现主要症状为关节疼痛，常发生于晨间，活动后疼痛反而减轻，但如活动过多，疼痛又可加重。另一症状是关节僵硬，常出现在早晨起床时或白天关节长时间保持一定体位后。检查受累关节可见关节肿胀、压痛，活动时有摩擦感或“咔嗒”声，病情严重者可有肌肉萎缩及关节畸形。
骨性关节炎的病理如下：
以关节软骨退行性病变和破坏为主要病理改变，软骨细胞明显减少和软骨基质崩解为主要特征。
软骨细胞作为软骨组织中唯一的一种细胞，合成软骨细胞的细胞外基质。正常软骨组织中软骨细胞细胞外基质包括胶原蛋白(以II型胶原蛋白为主)与聚多糖两种主要成分。已有的研究结果显示，在骨性关节炎病理状态下，软骨细胞的存活率下降、细胞数目减少；软骨细胞外基质含量下降，软骨层厚度变薄为主要改变。进一步研究还显示骨性关节炎病理进程中，软骨细胞分泌的基质金属蛋白酶MMPs活性提高进而降解II型胶原蛋白；ADAMTS5活性提高使蛋白多糖中主要成分aggrecan解离等。同时，软骨细胞内相应的信号分子参与了软骨细胞增殖、凋亡调控，诸如蛋白激酶家族、转录因子家族等。因此，减缓软骨细胞凋亡、阻止软骨基质降解业已成为近年来治疗骨性关节炎的主要分子靶向。
目前，对于骨性关节炎的发病机制的认识尚缺乏统一性，主要有以下几个学说：
①骨关节炎的诱因：肥胖、年龄，关节周围的韧带松弛、神经反射减缓及外伤等，这些原因均可致关节不稳，造成软骨承受的压力不平衡及损伤，进一步出现软骨细胞激活、蛋白酶类及炎性细胞因子分泌增加等骨性关节炎的病理变化。
②自由基学说：有研究显示骨性关节炎患者红细胞内的SOD(超氧化物歧化酶)/LPO(脂质过氧化物)比值明显下降，氧自由基升高，氧自由基可攻击软骨细胞膜，使软骨细胞形态功能改变受损，合成、分泌蛋白多糖及胶原蛋白受阻，引起软骨基质的生理功能异常。还可以损伤软骨内的胶原纤维，减弱胶原纤维对软骨的支撑作用和对软骨细胞的保护作用。
③细胞因子学说：细胞因子可以调节细胞生理功能、参与免疫应答和介导炎症反应，目前研究所知与骨关节炎的主要有IL，TNF，转化生长因子—β，热休克蛋白，脂联素等，如:IL-1能够增强关节软骨金属基质蛋白酶家族中MMP-13的表达，促进软骨基质的降解，加速软骨细胞的退化。
④基质金属蛋白酶降解学说：MMPs与基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)之间的关系失衡是OA软骨降解的重要机制。但是以上学说并没有得到广泛的共识，均有一定的局限性，至今对其发病机制并不明确，所以影响着对其的治疗。
骨性关节炎主要的治疗方法是减少关节的负重和过度的大幅度活动，以延缓病变的进程。肥胖患者应减轻体重，减少关节的负荷。下肢关节有病变时可用拐杖或手杖，以求减轻关节的负担。理疗及适当的锻炼可保持关节的活动范围，必要时可使用夹板支具及手杖等，对控制急性期症状有所帮助，只能减缓病人的症状，却无法改变骨性关节炎的发病过程。
(1)药物治疗：现在虽然有多种药物在临床上应用，均只能减轻或控制症状，概括起来有：
①软骨成分补充物：如氨基葡萄糖类、玻璃酸类等，由于骨性关节炎时软骨细胞数目减少、合成功能减弱，故这类软骨全成成分无法有效利用，达不到有效治疗作用。
②非甾类药物(NSAID)：不同种类的NSAID有相同的作用机制，它们都是通过抑制环氧化酶的活性，从而抑制花生四烯酸最终生成前列环素(PGI1)、前列腺素(PGE1，PGE2)和血栓素A2(TXA2)，最终达到消炎镇痛的作用。此外，还可抑制炎症过程中缓激肽的释放，改变淋巴细胞反应，减少粒细胞和单核细胞的迁移和吞噬作用。也正因为NSAID抑制了前列腺素的合成，所以除了有止痛和抗炎作用外，还同时出现相应的副作用。主要表现在胃肠道与肾脏两方面。
③甾体类抗炎药，主要是指皮质激素类药物,因其有共同的结构特点，即它们都为甾体，甾体类药物虽然有极好的消炎止痛作用，但长期使用可引起水盐代谢和糖、脂肪、蛋白质代谢的严重紊乱。
(2)手术治疗：晚期病例，在全身情况能耐受手术的条件下，行人工关节置换术，目前是公认的消除疼痛、矫正畸形、改善功能的有效方法，可以大大提高患者的生活质量。但由于是关节替代疗法，人工关节金属假体有一定的作用寿命，不适合中青年和早中期病人。
(3)其他疗法：中药外敷等。
以上各种治疗方法治疗骨性关节炎均是治末不治本的方法，所以寻找或开发一些能延缓骨性关节炎发病过程的药物极为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供莫诺苷在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。
所述莫诺苷(morroniside)的分子式为C17H26O11，结构式如下：
实验表明，莫诺苷可促进体外培养的人骨性关节炎软骨细胞存活(参见图2～4)，减弱软骨细胞凋亡的指标(参见图5～7)，莫诺苷可提高体外培养的人骨性关节炎软骨细胞的细胞外基质内的II型胶原蛋白(参见图8，9)、蛋白多糖Aggrecan的表达水平(参见图10，11)，莫诺苷可以提高人骨性关节炎软骨细胞内蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平(参见图12～14)，莫诺苷对体外培养的人骨性关节炎软骨细胞存活率(参见图15)、细胞外基质内的II型胶原蛋白、蛋白多糖Aggrecan的调节与蛋白激酶B(PKB/Akt)的磷酸化水平提高密切相关，蛋白激酶B(PKB/Akt)的抑制剂LY294002预处理可以减弱莫诺苷对软骨细胞的作用(参见图16～19)，莫诺苷对体外培养的人骨性关节炎软骨细胞存活率(参见图20)、细胞外基质内的II型胶原蛋白、蛋白多糖Aggrecan的调节与细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平提高密切相关，细胞外调节蛋白激酶(ERK)的抑制剂U0126预处理可以减弱莫诺苷对软骨细胞的作用(参见图21～24)；蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶(ERK)参与莫诺苷作用的相关调节机制与S6、P70S6K、mTOR信号分子相关；莫诺苷激活的蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶(ERK)可分别启动Akt/S6(参见图25，26)、ERK/P70S6K/S6信号通路(参见图27～30)。
本发明在大鼠骨性关节炎模型的膝关节腔局部注射莫诺苷所用剂量可为1×10-5～1×10-2g/kg，优选5×10-4g/kg，最好为1×10-2g/kg。
本发明在大鼠骨性关节炎模型中关节腔局部注射莫诺苷的频率为：每隔3天关节腔注射一次；处理时间分别持续3周与6周。
实验表明，大鼠骨性关节炎模型中通过膝关节腔局部注射莫诺苷3周或6周后处死，与对照组比较，观察到关节软骨损伤减弱：诸如软骨厚度与软骨细胞数量增加(参见图31，32)、软骨聚多糖的含量(基质密度)增加(参见图33，34)等特征。并且随莫诺苷浓度提高、莫诺苷处理时间的延长，软骨厚度增加更为明显(参见图32)。尤其是同等浓度莫诺苷处理后，6周组软骨增厚程度明显强于3周组(参见图32)；大鼠骨性关节炎模型中通过膝关节腔局部注射莫诺苷3周或6周后处死，与对照组比较，观察到代表关节软骨损伤程度的Manke’s评分有明显下降，并伴随莫诺苷注射浓度增加而更为明显(参见图35)；大鼠骨性关节炎模型中通过膝关节腔局部注射莫诺苷6周后处死，与对照组比较，TUNEL试剂盒检测到凋亡的软骨细胞减少(参见图36)；大鼠骨性关节炎模型中通过膝关节腔局部注射莫诺苷后所致的关节软骨的形态学改变伴随蛋白激酶B(PKB/Akt)(参见图37，38)与细胞外调节蛋白激酶(ERK)(参见图39，40)的磷酸化水平的提高，这也与细胞水平检测结果相当。
体外细胞实验表明，莫诺苷对体外培养的人骨性关节炎软骨细胞具有维持存活、减弱凋亡、促进基质中胶原蛋白与蛋白多糖表达提高的功效。动物实验表明，针对大鼠骨性关节炎模型的关节腔注射莫诺苷可有效缓解软骨损伤，包括增加软骨层厚度、提高软骨聚多糖的含量(基质密度)。莫诺苷的作用机制可能是通过提高软骨细胞内蛋白激酶B(PKB/Akt)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平，进而激活Akt/S6、ERK/p70S6K/S6相关信号通路。以上研究结果首次证实莫诺苷具有治疗骨性关节炎的功效，可作为制备治疗骨性关节炎药物。
总之，本发明在实施骨性关节炎治疗中可达到下列效果：
(1)有效促进体外培养的人骨性关节炎软骨细胞存活、减弱其凋亡活动。
(2)有效减缓实验大鼠骨性关节炎模型中软骨组织的损伤，包括增加软骨层厚度、提高软骨细胞外聚多糖的含量(基质密度)等指标。
附图说明
图1：莫诺苷化学结构。
图2：MTT试剂盒检测不同浓度莫诺苷(0.1μM、20μM、100μM)对人骨性关节炎软骨细胞存活率影响的统计分析结果(*P<0.05)。
图3：蛋白电泳技术检测不同浓度莫诺苷(0.1μM、20μM、100μM)对软骨细胞核增殖抗原PCNA表达影响。
图4：蛋白电泳技术检测不同浓度莫诺苷(0.1μM、20μM、100μM)对软骨细胞核增殖抗原PCNA表达影响的统计分析结果(*P<0.05)。
图5：免疫荧光技术检测不同浓度莫诺苷对软骨细胞凋亡影响。
图6：免疫荧光技术检测不同浓度莫诺苷对软骨细胞凋亡影响的统计分析结果(*P<0.05，**P<0.01)。
图7：蛋白电泳技术检测不同浓度莫诺苷(0.1μM、20μM、100μM)对软骨细胞内裂解的聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶PARP表达水平的影响。
图8：蛋白电泳技术检测不同浓度莫诺苷(0.1μM、20μM、100μM)对软骨细胞II型胶原蛋白表达的影响。
图9：蛋白电泳技术检测不同浓度莫诺苷(0.1μM、20μM、100μM)对软骨细胞II型胶原蛋白表达影响的统计分析结果(*P<0.05)。
图10：蛋白电泳技术检测不同浓度莫诺苷(0.1μM、20μM、100μM)对蛋白多糖Aggrecan表达水平的影响。
图11：蛋白电泳技术检测不同浓度莫诺苷(0.1μM、20μM、100μM)对蛋白多糖Aggrecan表达水平影响的统计分析结果(*P<0.05，**P<0.01)。
图12：蛋白电泳技术检测到不同浓度莫诺苷(0.1μM、20μM、100μM)对人骨性关节炎软骨细胞内蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶(ERK)的蛋白表达与磷酸化水平的影响。
图13：蛋白电泳技术检测到不同浓度莫诺苷(0.1μM、20μM、100μM)对人骨性关节炎软骨细胞内蛋白激酶B(PKB/Akt)磷酸化水平影响的统计分析结果(*P<0.05)。
图14：蛋白电泳技术检测到不同浓度莫诺苷(0.1μM、20μM、100μM)对人骨性关节炎软骨细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平影响的统计分析结果(*P<0.05)。
图15：蛋白激酶B(PKB/Akt)的抑制剂LY294002预处理细胞后加入0.1μM莫诺苷处理，并MTT试剂盒检测人骨性关节炎软骨细胞存活率变化的统计分析结果(*P<0.05)。
图16：蛋白激酶B(PKB/Akt)的抑制剂LY294002预处理细胞后加入0.1μM莫诺苷处理，并蛋白电泳技术检测细胞核增殖抗原PCNA、II型胶原蛋白及蛋白多糖Aggrecan的蛋白表达水平变化。
图17：蛋白激酶B(PKB/Akt)的抑制剂LY294002预处理细胞后加入0.1μM莫诺苷处理，并蛋白电泳技术检测细胞核增殖抗原PCNA的蛋白表达水平变化的统计分析结果(**P<0.01)。
图18：蛋白激酶B(PKB/Akt)的抑制剂LY294002预处理细胞后加入0.1μM莫诺苷处理，并蛋白电泳技术检测II型胶原蛋白的蛋白表达水平变化的统计分析结果(*P<0.05)。
图19：蛋白激酶B(PKB/Akt)的抑制剂LY294002预处理细胞后加入0.1μM莫诺苷处理，并蛋白电泳技术检测蛋白多糖Aggrecan的蛋白表达水平变化的统计分析结果(*P<0.05)。
图20：细胞外调节蛋白激酶(ERK)的抑制剂U0126预处理细胞后加入100μM莫诺苷处理，并MTT试剂盒检测人骨性关节炎软骨细胞存活率变化的统计分析结果(*P<0.05)。
图21：细胞外调节蛋白激酶(ERK)的抑制剂U0126预处理细胞后加入100μM莫诺苷处理，并蛋白电泳技术检测细胞核增殖抗原PCNA、II型胶原蛋白及蛋白多糖Aggrecan的蛋白表达水平变化。
图22：细胞外调节蛋白激酶(ERK)的抑制剂U0126预处理细胞后加入100μM莫诺苷处理，并蛋白电泳技术检测细胞核增殖抗原PCNA的蛋白表达水平变化的统计分析结果(*P<0.05)。
图23：细胞外调节蛋白激酶(ERK)的抑制剂U0126预处理细胞后加入100μM莫诺苷处理，并蛋白电泳技术检测II型胶原蛋白的蛋白表达水平变化的统计分析结果(*P<0.05)。
图24：细胞外调节蛋白激酶(ERK)的抑制剂U0126预处理细胞后加入100μM莫诺苷处理，并蛋白电泳技术检测蛋白多糖Aggrecan的蛋白表达水平变化的统计分析结果(**P<0.01)。
图25：蛋白激酶B(PKB/Akt)抑制剂LY294002预处理细胞后加入0.1μM莫诺苷处理，蛋白电泳技术检测观察S6的磷酸化水平的变化。
图26：蛋白激酶B(PKB/Akt)抑制剂LY294002预处理细胞后加入0.1μM莫诺苷处理，蛋白电泳技术检测观察S6的磷酸化水平变化的统计分析结果(*P<0.05)。
图27：细胞外调节蛋白激酶(ERK)的抑制剂U0126预处理细胞后加入100μM莫诺苷处理，蛋白电泳技术检测观察mTOR、P70S6K、S6的蛋白表达及磷酸化水平的变化。
图28：细胞外调节蛋白激酶(ERK)的抑制剂U0126预处理细胞后加入100μM莫诺苷处理，蛋白电泳技术检测观察mTOR的磷酸化水平变化的统计分析结果(*P<0.05)。
图29：细胞外调节蛋白激酶(ERK)的抑制剂U0126预处理细胞后加入100μM莫诺苷处理，蛋白电泳技术检测观察P70S6K的磷酸化水平变化的统计分析结果(*P<0.05)。
图30：细胞外调节蛋白激酶(ERK)的抑制剂U0126预处理细胞后加入100μM莫诺苷处理，蛋白电泳技术检测观察S6的磷酸化水平变化的统计分析结果(*P<0.05)。
图31：根据动物体重注射不同浓度莫诺苷(1×10-5g/kg、5×10-4g/kg、1×10-2g/kg)至大鼠膝关节腔，持续3周或6周处死大鼠，H.E.染色显示大鼠关节软骨形态结构、软骨层厚度的变化。
图32：根据动物体重注射不同浓度莫诺苷(1×10-5g/kg、5×10-4g/kg、1×10-2g/kg)至大鼠膝关节腔，持续3周或6周处死大鼠，H.E.染色显示大鼠关节软骨层厚度变化的统计分析结果(***P<0.001)
图33：根据动物体重注射不同浓度莫诺苷(1×10-5g/kg、5×10-4g/kg、1×10-2g/kg)至大鼠膝关节腔，持续3周或6周处死大鼠，番红O染色显示关节软骨聚多糖的含量的变化。
图34：根据动物体重注射不同浓度莫诺苷(1×10-5g/kg、5×10-4g/kg、1×10-2g/kg)至大鼠膝关节腔，持续3周或6周处死大鼠，番红O染色显示关节软骨聚多糖的含量变化的统计分析结果(**P<0.01，***P<0.001)。
图35：根据动物体重注射不同浓度莫诺苷(1×10-5g/kg、5×10-4g/kg、1×10-2g/kg)至大鼠膝关节腔，持续3周或6周处死大鼠，Mankin’s评分显示关节软骨损伤程度(*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001)。
图36：根据动物体重注射不同浓度莫诺苷(1×10-5g/kg、5×10-4g/kg、1×10-2g/kg)至大鼠膝关节腔，持续6周处死大鼠，TUNEL试剂盒检测大鼠关节软骨细胞的凋亡状况(放大倍数×100)。
图37：根据动物体重注射不同浓度莫诺苷(1×10-5g/kg、5×10-4g/kg、1×10-2g/kg)至大鼠膝关节腔，持续3周或6周处死大鼠，免疫组化检测关节软骨细胞内蛋白激酶B(PKB/Akt)的磷酸化水平变化。
图38：根据动物体重注射不同浓度莫诺苷(1×10-5g/kg、5×10-4g/kg、1×10-2g/kg)至大鼠膝关节腔，持续3周或6周处死大鼠，免疫组化检测关节软骨细胞内蛋白激酶B(PKB/Akt)的磷酸化水平变化的统计分析结果(*P<0.05，**P<0.01，放大倍数×100)。
图39：根据动物体重注射不同浓度莫诺苷(1×10-5g/kg、5×10-4g/kg、1×10-2g/kg)至大鼠膝关节腔，持续3周或6周处死大鼠，免疫组化检测关节软骨细胞内细胞外蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平变化。
图40：根据动物体重注射不同浓度莫诺苷(1×10-5g/kg、5×10-4g/kg、1×10-2g/kg)至大鼠膝关节腔，持续3周或6周处死大鼠，免疫组化检测关节软骨细胞内细胞外蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平变化的统计分析结果(***P<0.001，放大倍数×100)。
具体实施方式
有学者研究已经证实莫诺苷可以对体外培养的神经细胞起到保护作用，使神经细胞可以抵抗不良环境导致的细胞凋亡。本发明在这些学者研究的基础上通过体外培养人骨性关节炎软骨细胞，细胞与分子生物学技术检测莫诺苷对软骨细胞生长、凋亡活动的作用；并同步检测软骨细胞细胞外基质主要成分胶原蛋白、蛋白多糖Aggrecan的表达变化以及部分信号分子，诸如蛋白激酶B(PKB/Akt)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)的表达，从细胞与分子水平初步了解莫诺苷对软骨细胞作用功效与机制。另一方面，为了更为全面了解莫诺苷对骨性关节炎的软骨损伤的治疗作用，本发明构建大鼠骨性关节炎动物模型(前交叉韧带并内侧半月板切断术，ACLT+MMx)，通过关节腔给药，不同时间段处死大鼠，检测软骨组织相应变化，获得接近人体条件的动物实验结果。在此基础上发现莫诺苷治疗骨性关节炎的功效、具有制备治疗骨性关节炎药物的可能。
第一部分：体外细胞实验
一、材料：手术废弃物分离获得人骨性关节炎软骨细胞；成都试剂公司购买99％纯度莫诺苷粉剂溶于水中制成储存液；实验所需试剂与试剂盒购于Cell Signaling公司、SantaCruz公司、Carlsbad公司、上海生物工程公司等。
二、方法：
1.软骨细胞培养：取自膝关节置换抛弃的关节软骨，经胶原酶消化，常规细胞培养。
2.细胞活性检测：细胞无血清培养6h后加入不同浓度莫诺苷，处理24h后按照MMT试剂盒说明，加入相应试剂，在酶标仪490nm波长(参考波长690nm)检测不同处理组细胞OD值。
3.免疫荧光检测细胞凋亡：莫诺苷处理的细胞经4％多聚甲醛固定，PBS清洗，DAPI避光染色后在荧光显微镜下观察凋亡的软骨细胞计数并拍照。
4.蛋白提取并电泳分析各种相关细胞信号分子蛋白表达水平：莫诺苷处理的细胞消化、裂解、提取蛋白，行蛋白凝胶电泳，并转膜结合相关抗体检测莫诺苷对诸如胶原蛋白、aggrecan、细胞核增殖抗原(PCNA)、细胞凋亡指标PARP、蛋白激酶B(PKB/Akt)、细胞外基质调节蛋白激酶(ERK)等分子蛋白表达水平的影响。
5.统计方法：上述每个实验重复3～5次，使用SPSS软件统计，P<0.05具有统计学意义。
三、结果：
1.莫诺苷提高人骨性关节炎软骨细胞的存活(抑制凋亡)、促进基质合成：
图2可见不同浓度(0.1μM、20μM、100μM)莫诺苷处理细胞后均能提高细胞存活率，但是具有统计学意义的是100μM浓度莫诺苷(P*<0.05)。
图3显示伴随莫诺苷浓度的提高，细胞核增殖抗原(PCNA)表达水平也有提高，图4显示具有统计学意义的浓度是100μM浓度莫诺苷(*P<0.05)。
图5显示伴随莫诺苷处理浓度的提高软骨细胞凋亡率下降，图6显示具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)，其中更为明显的下降发生在100μM浓度莫诺苷处理组(*P<0.01)；同时，裂解的PARP也伴随莫诺苷处理浓度的增加更为明显(图7)。
图8，9结果显示不同浓度(0.1μM、20μM、100μM)的莫诺苷处理其中0.1μM与20μM浓度的莫诺苷能明显提高II型胶原蛋白表达水平，具有统计学意义(*P<0.05)。
图10，11显示不同浓度(0.1μM、20μM、100μM)莫诺苷处理细胞可观察到蛋白多糖Aggrecan的表达水平均有明显提高(*P<0.05)，其中以100μM浓度的莫诺苷作用最为显著(**P<0.01)。
以上这些结果表明：莫诺苷可以提高人骨性关节炎软骨细胞的存活率，减弱其凋亡；促进基质合成。
2.莫诺苷对人骨性关节炎软骨细胞的作用机制与蛋白激酶B(PKB/Akt)、细胞外基质调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平密切相关
通过蛋白电泳技术检测到不同浓度莫诺苷(0.1μM、20μM、100μM)都能够明显提高人骨性关节炎软骨细胞内蛋白激酶B(PKB/Akt)的磷酸化水平，而总蛋白量没有改变(图12，13，*P<0.05))。同时在100μM莫诺苷处理的软骨细胞内检测到细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平明显提高(图12，14，*P<0.05)。
进一步，在莫诺苷处理细胞之前使用上述两种酶的化学抑制剂预处理2h，结果发现：与莫诺苷单独处理组比较，蛋白激酶B(PKB/Akt)的抑制剂LY294002(25μM)预处理后可明显减弱莫诺苷对细胞存活率(图15)、核增殖抗原PCNA、II型胶原蛋白及蛋白多糖Aggrecan表达水平的增强作用(图16～19，*P<0.05,**P<0.01)。
类似的，与莫诺苷单独处理组比较，细胞外调节蛋白激酶(ERK)的抑制剂U0126的预处理也能够减弱莫诺苷对细胞存活率(图20)、核增殖抗原PCNA、II型胶原蛋白及蛋白多糖Aggrecan的表达的增强作用(图21～24，*P<0.05,**P<0.01)。
以上结果显示蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶(ERK)参与了莫诺苷促进人骨性关节炎软骨细胞存活与基质合成过程，尤其是磷酸化的蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶(ERK)；而且与细胞外调节蛋白激酶(ERK)比较发现蛋白激酶B(PKB/Akt)对莫诺苷更为敏感。
3.蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶(ERK)参与莫诺苷作用的相关调节机制与S6、P70S6K、mTOR信号分子相关
mTOR/P70S6K/S6是细胞内促进蛋白合成的主要信号通路，在此说明了莫诺苷激活的蛋白激酶B与细胞外调节蛋白激酶(ERK)可能作用机制是否与mTOR/P70S6K/S6信号通路相关。
图25，26显示0.1μM莫诺苷可以提高S6分子的磷酸化水平，而蛋白激酶B(PKB/Akt)的抑制剂LY294002(25μM)预处理后，与莫诺苷单独处理组比较，可明显减弱莫诺苷对S6磷酸化水平的增强作用(图25，26，*P<0.05)。
图27～30显示100μM莫诺苷提高P70S6K与S6的磷酸化水平，对mTOR的磷酸化水平无增强作用。但细胞外调节蛋白激酶(ERK)的抑制剂U0126预处理后，与莫诺苷单独处理组比较，可以明显减弱莫诺苷对P70S6K与S6的磷酸化水平的增强作用(图27，29，30，*P<0.05)。同时还观察到U0126能明显增加mTOR与P70S6K的磷酸化水平(图27～29，*P<0.05)。
以上结果显示在莫诺苷调节软骨细胞机制中，蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶(ERK)的调节机制与S6、P70S6K、mTOR信号分子有关。
第二部分：动物模型实验
一、材料：9周雄性Sprague–Dawley大鼠，体重250～300g饲养于厦门大学动物中心。99％纯度莫诺苷采购自成都试剂公司。检测所需要主要试剂购自上海生物工程公司、Cell Signaling公司、SantaCruz公司、Carlsbad公司等。
二、方法：
1.大鼠骨性关节炎模型构建
前交叉韧带并内侧半月板切断术(ACLT+MMx)构建大鼠骨性关节炎模型后，将大鼠分为八组(每组六只)：假手数组、对照组(骨性关节炎+水处理组)、骨性关节炎+低、中、高莫诺苷处理组(3周)、骨性关节炎+低、中、高莫诺苷处理组(6周)。
2.组织病理学检测:
常规组织学固定包埋，石蜡切片行H.E.染色与番红O染色其中H.E.显示软骨组织的形态学结构变化；番红O显示软骨基质内聚多糖的含量。结合上述结果Manke’s评分确定动物模型骨性关节炎软骨损伤分级。
3.免疫组化检测：
按照常规免疫组化实验方法结合相应抗体检测软骨组织与细胞内蛋白表达变化。
4.TUNEL检测软骨细胞凋亡状况:
按照TUNEL试剂盒说明，显微镜下检测石蜡切片中软骨细胞凋亡变化并拍照。
5.统计学方法：Image-Pro Plus 6.0软件统计分析相关数据。
三、结果
1.莫诺苷能够减缓大鼠骨性关节炎软骨组织损伤
图31，32显示：关节腔注射不同浓度莫诺苷(1×10-5g/kg、5×10-4g/kg、1×10-2g/kg)3周、6周后处死，与对照组比较，均可以提高关节软骨的厚度，并且伴随浓度增加、注射时间增长而增强；同时6周组软骨厚度明显高于3周组(图31，32，***P<0.001)。
图33，34显示：与对照组比较，莫诺苷关节腔注射可以提高软骨聚多糖的含量(图33，34，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)
图35显示Mankin’s评分结果。Mankin’s评分越高显示骨性关节炎软骨损伤程度越严重。与对照组比较，莫诺苷关节腔注射3周与6周均可以使骨性关节炎软骨损伤程度明显下降，并随着莫诺苷浓度提高效果更为显著(图35，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)
图36显示TUNEL检测结果。与对照组比较，在莫诺苷关节腔注射6周处死组中凋亡的软骨细胞明显少于对照组。
以上结果显示不同浓度的莫诺苷关节腔注射可以有效减缓关节软骨的损伤，并伴有凋亡的软骨细胞数量减少。
2.莫诺苷减缓大鼠骨性关节炎软骨组织损伤过程中蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶的磷酸化水平也有明显提高
图37，38显示，与对照组比较，莫诺苷关节腔注射3周、6周能够明显提高蛋白激酶B(PKB/Akt)的磷酸化水平，并与莫诺苷浓度与注射时间正相关(图37，38，*P<0.05，**P<0.01)。
图39，40显示，与对照组比较，莫诺苷关节腔注射能够明显提高细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平，其中尤以最高浓度莫诺苷效果明显(图39，40，***P<0.001)。
以上结果显示：在大鼠骨性关节炎动物模型中，膝关节腔注射不同浓度莫诺苷可以明显减缓骨性关节炎的软骨损伤，并随着注射剂量的增加、注射时间的延长效果更佳；同期伴有蛋白激酶B(PKB/Akt)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化水平的提高。
第三部分：讨论
减少骨性关节炎软骨细胞的凋亡或维持软骨细胞存活是当前治疗骨性关节炎的比较有潜力的治疗靶向。本发明观察到莫诺苷可以提高体外培养的人骨性关节炎软骨细胞的存活率、降低细胞凋亡；并且可以提高II型胶原蛋白以及蛋白多糖Aggrecan的表达水平，促进了软骨细胞基质的合成，可以确信莫诺苷对骨性关节炎软骨细胞具有软骨保护作用。
蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶(ERK)及其下游分子参与调节细胞各种代谢活动，尤其是在外界因子刺激引发的软骨细胞保护作用中发挥功效。其可以将外界的信号分子信息传递到细胞内，引发一系列保护软骨细胞的功效。本发明实验结果表明，蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶(ERK)作为莫诺苷调节骨性关节炎软骨细胞存活、基质合成等作用的传递者，使莫诺苷发挥其软骨保护作用的功效。深入探讨蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶(ERK)的作用机制发现：莫诺苷激活的蛋白激酶B(PKB/Akt)可以促进蛋白合成关键分子S6的表达提高，显示莫诺苷对软骨细胞的调节与Akt/S6通路的启动密切相关；同时，莫诺苷激活的细胞外蛋白激酶(ERK)可以通过启动ERK/P70S6K/S6通路提高蛋白合成。
以上这些细胞学研究结果首次证明莫诺苷对骨性关节炎中的作用机制与蛋白激酶B(PKB/Akt)及细胞外调节蛋白激酶(ERK)的激活密切相关，其促进骨性关节炎软骨细胞存活及基质合成与这两种激酶传递作用密不可分。
为了更有利支持在细胞学实验中的研究结果，本发明构建大鼠骨性关节炎模型，通过关节腔注射莫诺苷，不同时间处死大鼠，首次观察到骨性关节炎所导致的软骨损伤，包括软骨磨损所致的软骨层变薄、软骨细胞数目减少、软骨基质密度下降均得到了减缓；同时通过Mankin’s评分全方位的确证莫诺苷关节腔注射可以明显缓解骨性关节炎引起的软骨组织的形态学改变，降低Mankin’s值。此外，还观察到莫诺苷明显抑制凋亡的软骨细胞数目的增加，以及蛋白激酶B(PKB/Akt)与细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平的提高，在动物水平为本发明前面的细胞学研究结果给予支持。
总之，体外细胞实验表明莫诺苷对体外培养的人骨性关节炎软骨细胞具有维持存活、减弱凋亡、促进基质中胶原蛋白与蛋白多糖表达提高的功效。动物实验表明针对大鼠骨性关节炎模型的关节腔注射莫诺苷可有效缓解软骨损伤，包括增加软骨层厚度、提高软骨基质密度。莫诺苷的作用机制可能是通过提高软骨细胞内蛋白激酶B(PKB/Akt)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平，进而激活Akt/S6、ERK/p70S6K/S6相关信号通路。
本发明的实验结果首次证实：莫诺苷能够通过促进人骨性关节炎软骨细胞存活、基质合成提高减缓骨性关节炎软骨损伤；其作用机制与蛋白激酶B(PKB/Akt)及细胞外调节蛋白激酶(ERK)的激活密切相关。从而提出莫诺苷具有治疗骨性关节炎的药物功效，可以成为治疗骨性关节炎的药物。
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1.莫诺苷在制备治疗骨性关节炎药物中的应用。
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| 六味地黄丸主要血中移行成分对培养大鼠成骨细胞促增殖作用的研究;孙晖 等;《中国中药杂志》;20080930;第33卷(第17期);2161-2164 * |
| 复方六味地黄丸治疗骨性关节炎的实验研究;梁文清;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20060115(第01期);E056-6 * |
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