CN110169965A

CN110169965A - 一种化合物在治疗软骨退变性疾病方面的应用

Info

Publication number: CN110169965A
Application number: CN201910453575.1A
Authority: CN
Inventors: 肖伟; 刘莉娜; 周军; 谢雪; 王红梅; 孙晓萍; 常秀娟; 顾莎莎; 王振中
Original assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2019-08-27
Anticipated expiration: 2039-05-28
Also published as: CN110169965B

Abstract

本发明提出了一种丁基苯酞化合物、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防软骨退变性疾病的药物中的应用。本发明通过建立兔骨关节炎模型，研究丁基苯酞对兔骨关节炎软骨的作用，发现本发明所述的丁基苯酞化合物具有抗软骨细胞凋亡的活性，表明其对骨关节炎具有良好的改善作用。而且本发明还通过对受试物的体外软骨细胞抗凋亡活性进行研究，也证实了本发明所述的化合物具有抗软骨细胞凋亡的活性，其能有效地治疗软骨退变性疾病。

Description

一种化合物在治疗软骨退变性疾病方面的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种化合物在治疗软骨退变性疾病方面应用。

背景技术

肌肉骨骼疾病是个人、卫生系统和社会保健系统的主要负担，其间接花费也占据了很大的比重。联合国和世界卫生组织通过批准的《骨与关节2000-2010十年》确认了这一负担。肌肉骨骼疾病最终会导致软骨退变，引起关节和腰背的疼痛。一旦发生关节软骨结构和功能的退化，骨关节炎就产生了。其主要临床表现以关节痛、关节僵硬为主，随着病情的发展会出现关节骨性肥大，关节功能减退，直至残废或生活不能自理。多累及膝、髋、脊柱、指间等关节。发病多见于中年女性、有明显家庭聚集现象。类风湿关节炎是一种病因不明的自身免疫性疾病，亦是软骨退变性病变的一种疾病形式，多见于中年女性。主要表现为对称性、慢性、进行性多关节炎，关节滑膜的慢性炎症、增生，形成血管翳，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，造成关节软骨、骨和关节囊破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。原发性骨质疏松症是以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变，和软骨退变性变化相互影响。疼痛是原发性骨质疏松症最常见的症状，以腰背痛多见。临床表现为疼痛沿脊柱向两侧扩散，仰卧或坐位时疼痛减轻，直立时后伸或久立、久坐时疼痛加剧，弯腰、咳嗽、大便用力时加重。以上和软骨退变相关的疾病对人们的生活和工作造成了极大的不便，严重还会致残。因此，寻找和开发治疗软骨退变性疾病的药物一直是人们关注的焦点所在。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种治疗或预防软骨退变性疾病的药物。

具体地，本发明提出了一种具有式I结构的化合物、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防软骨退变性疾病的药物中的应用。

具体地，所述软骨退变性疾病包括骨关节炎、类风湿关节炎、骨质疏松症、腰背痛等等类似症状或疾病。

具体地，所述药学上可接受的盐包括但不限于化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。

进一步地，所述治疗或预防软骨退变性疾病的药物可以是药剂学上所说的任何一种剂型，如口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。

具体地，所述治疗或预防软骨退变性疾病的药物包括但不限于片剂、胶囊剂、软胶囊、凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、静脉乳剂、脂质体注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。

本发明还提出了一种具有前述式I结构的化合物、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防骨关节炎的药物中的应用。

所述治疗或预防骨关节炎的药物可以是药剂学上所说的任何一种剂型，如口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。

具体地，所述治疗或预防骨关节炎的药物包括但不限于片剂、胶囊剂、软胶囊、凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、静脉乳剂、脂质体注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。

上述式I结构的化合物、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物/制剂的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选为0.5-90％的本发明化合物，其余可以是其它具有类似作用或者发挥协同作用的活性成分、也可以是或进一步包括药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

本发明通过建立兔骨关节炎模型，研究丁基苯酞对兔骨关节炎软骨的作用，发现本发明所述的式I结构化合物具有抗软骨细胞凋亡的活性，表明其对骨关节炎具有良好的改善作用。而且本发明还通过对受试物的体外软骨细胞抗凋亡活性进行研究，也证实了本发明所述的式I结构化合物具有抗软骨细胞凋亡的活性，其能有效地治疗软骨退变性疾病。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

其次，需要注意的是，除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。另，本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明。

实施例1发明受试物对兔骨关节炎软骨的影响

1、实验材料

1.1药物及试剂

受试药物：戊巴比妥钠(Merck)；4-羟基-3-丁基苯酞(江苏康缘药业股份有限公司自制)；生理盐水(国药集团)；金属基质蛋白酶-3检测试剂盒、TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)

1.2动物

新西兰大白兔，体质量(2.0±2.5)kg，48只，由南京市浦口区莱芙养殖场提供，动物合格证号：SCXK(苏)2014--0004。

1.3仪器

电子天平(赛多利斯)；离心机(安徽中佳)；Flex station 3钙流工作站(MD)；倒置显微镜(OLYPUS)

2、实验方法

2.1造模

采用Hulth法，将兔用3％戊比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉，仰卧固定于手术台,右膝关节局部脱毛，消毒，切断膝关节内侧副韧带，切除前后交叉韧带和内侧半月板。逐层缝合，消毒。术后分笼饲养，每天肌肉注射青霉素20万U/kg，连续7天。手术1周后，每天强迫动物活动30min，分2次。4周后即可获得骨关节炎模型。

2.2分组与给药

48只健康的新西兰兔随机分为4组。造模后随机分成模型组、实验治疗低剂量组、实验治疗高剂量组，每组12只。正常对照组每日给予生理盐水10ml/kg灌胃。实验治疗组给予4-羟基-3-丁基苯酞(15、30mg/kg)灌胃，给药16周。

2.3取材方法

关节液在无菌条件下麻醉后施行左膝关节穿刺，注入生理盐水1mL，反复回抽并注入3次后，再尽量将液体抽出并注入试管内，-80℃冰箱保存待测。

动物处死，余下软骨切下后放入10％的甲醛溶液中固定，用于原位末端标记(TUNEL)法。

2.4检测指标及方法

2.4.1金属基质蛋白酶-3(MMP-3)水平测定实验步骤按照检测试剂盒说明书进行。

2.4.2原位末端标记(TUNEL)法10％甲酸甲醛脱钙液脱钙10～15d。石蜡标本制成5μm厚连续切片，切片脱蜡至水。微波增透白蛋白酶K消化20min。TdT 37℃恒温湿盒孵育60min，POD 37℃恒温湿盒孵育30min，DAB显色。

细胞凋亡指数公式：AI＝TUNEL标记阳性细胞数/软骨细胞数×100％。

2.5统计分析采用SPSS 18.0软件进行数据分析，实验结果以表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

3、实验结果

从表1可见，与空白对照组比较，模型组的关节液中MMP-3含量显著增加(p<0.01)；与模型组比较，治疗低剂量和高剂量组的关节液中MMP-3含量明显降低(p<0.05，P<0.01)。均具有统计学差异。

从表1可见，与空白对照组比较，模型组的细胞凋亡指数显著增加(p<0.01)；与模型组比较，治疗低剂量和高剂量组的细胞凋亡指数明显降低(p<0.05，p<0.01)。均具有统计学差异。

表1发明受试物对兔关节液中MMP-3含量和细胞凋亡指数的影响

与空白对照组比较，##p<0.01，#p<0.05；与模型组比较，**p<0.01，*p<0.05

各组关节液中MMP-3数值提示，组间比较有统计学意义。金属基质蛋白酶-3可降解蛋白多糖、基底膜成分、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白等，起胶原酶作用，基质的降解破坏导致软骨细胞凋亡。而且，原位标记细胞凋亡指数更能直接显示细胞的凋亡情况。因此，从表1数据可知发明受试物具有抗软骨细胞凋亡的活性，其对骨关节炎有一定的改善作用。

实验例2：发明受试物对体外软骨细胞抗凋亡抗炎的研究

1、实验材料

1.1药物及试剂

受试药物：4-羟基-3-丁基苯酞；胎牛血清、DMEM(Gbico)；IL-1β(南京金斯瑞)；细胞凋亡检测试剂盒(碧云天)；Caspase-3/7检测试剂盒(Promega),calcium 6-QF试剂盒(Molecular Devices)

1.2动物

SD大鼠，体质量(100±20g)，3只，由南通大学提供，动物合格证号：SCXK(苏)2014--0001。

1.3仪器

电子天平(赛多利斯)；离心机(安徽中佳)；Flex station 3钙流工作站(MD)；流式细胞仪

2、实验方法

原代软骨细胞取自SD大鼠椎间盘软骨，经分离培养，传至第三代进行试验。

细胞以1×10⁵cells/mL的浓度接种于相应的培养板，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24小时。

弃上清液，按照实验需要分成空白组、模型组、治疗低剂量组、治疗高剂量组，空白组给予无血清培养基，模型组给予用无血清培养基配制的终浓度为10μg/L的IL-1β，给药组用浓度为含10μg/L IL-1β的无血清DMEM配制，使其终浓度为25、50μM，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24小时。每组至少3个复孔。

2.2检测指标及方法

2.2.1Caspase-3/7活性测定实验步骤按照检测试剂盒说明书进行。

2.2.2细胞凋亡流式检测细胞分组收集后，按照说明书加入不同的染色液，孵育，流式细胞仪检测。

2.2.3钙离子检测细胞接种于黑色透明板24h，加入钙离子探针于37℃、5％CO₂细胞培养箱中2h，给药15min后，上机检测。

2.5统计分析

采用SPSS 18.0软件进行数据分析，实验结果以表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

3、实验结果

从表2可见，与空白对照组比较，模型组的Caspase-3/7活性显著增加(p<0.01)；与模型组比较，治疗低剂量和高剂量组的Caspase-3/7活性明显降低(P<0.01)。均具有统计学差异。

从表2可见，与空白对照组比较，模型组的细胞凋亡指数显著升高(p<0.01)；与模型组比较，治疗低剂量和高剂量组的细胞凋亡指数明显降低(p<0.05，p<0.01)。均具有统计学差异。

从表2可见，与空白对照组比较，模型组的细胞内钙离子明显增加(p<0.01)；与模型组比较，治疗低剂量和高剂量组的细胞内钙离子明显减少(p<0.05，p<0.01)。均具有统计学差异。

表2发明受试物对软骨细胞凋亡的影响

Caspase-3/7是细胞程序性死亡途径中的重要蛋白，PI/FITC凋亡检测反映了细胞前期和末期的凋亡情况，钙离子的超载同样对细胞凋亡有重要参考价值。因此，从表2数据可知发明受试物具有抗软骨细胞凋亡的活性。由此可见，4-羟基-3-丁基苯酞能够有效地治疗软骨退变性疾病。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.具有式I结构的化合物、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防软骨退变性疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药学上可接受的盐包括盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述治疗或预防软骨退变性疾病的药物为口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述治疗或预防软骨退变性疾病的药物选自注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂、喷剂、气雾剂。

5.具有式I结构的化合物、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防骨关节炎的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述治疗或预防骨关节炎的药物包括片剂、胶囊剂、软胶囊、凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、静脉乳剂、脂质体注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。