KR100723609B1

KR100723609B1 - 신규한 조성의 알츠하이머형 치매 및 파킨슨씨병 예방 또는 치료용 은행잎 추출물, 그리고 은행잎으로부터의 추출 및 정제 방법

Info

Publication number: KR100723609B1
Application number: KR1020060038554A
Authority: KR
Inventors: 김형춘; 김현표; 이경희; 이용오; 김유선; 김영하; 홍준기
Original assignee: 주식회사 유유
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2007-06-04
Also published as: WO2007126264A1; CN101432008A; CN101432008B

Abstract

본 발명은 총 중량에 대하여 테르펜 트리락톤(terpene trilactones) 10-14중량%(바람직하게는 11-13중량%, 가장 바람직하게는 12중량%), 깅코 플라본 배당체(Ginkgo flavone glycoside) 20-30중량% 및 깅콜산(ginkgolic acid) < 5 ppm을 함유함으로써, 표준화된 은행잎 추출물(standardized Ginkgo biloba extract, 독일약전 2000)을 포함하는 종래의 은행잎 추출물보다 뛰어난 NO(nitric oxide)생성 억제작용을 나타내고 알츠하이머형 치매 및 파킨슨씨병 모델에서도 보다 향상된 치료효과를 나타내는 신규한 조성의 은행잎 추출물과 그 추출 및 정제 방법, 그리고 상기 은행잎 추출물을 활성 성분으로 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

은행잎, 깅코 플라본, 테르펜 트리락톤, 깅콜산, 알츠하이머형 치매, 파킨슨씨병

Description

신규한 조성의 알츠하이머형 치매 및 파킨슨씨병 예방 또는 치료용 은행잎 추출물, 그리고 은행잎으로부터의 추출 및 정제 방법{Ginkgo biloba leave extract having novel composition useful for prevention or treatment of Alzheimer's disease and Parkinson's disease, and extracting and purifying method thereof}

도 1은 시험물질로 사용된 각각의 은행잎 추출물의 산화질소(nitric oxide) 생성 억제율을 도시한다.

도 2는 웨스턴 흡입법(western blotting)에 의한 iNOS 단백질 측정 결과를 도시한다.

도 3은 RT-PCR 방법에 의한 iNOS mRNA 측정 결과를 도시한다.

도 4는 7일간 ICR 마우스에 시험 물질(각각의 은행잎 추출물)을 50mg/kg의 농도로 경구투여 후 베타-아밀로이드(400 pmol, i.c.v)를 투여한 다음 작업기억 테스트(work memory test)를 실시한 결과인 평균 탈출 시간(mean escape latency)을 도시한다.

도 5는 7일간 COX-2(+/+) 마우스에 시험 물질(각각의 은행잎 추출물)을 50mg/kg의 농도로 경구 투여 후 베타-아밀로이드(400 pmol, i.c.v)를 투여한 다음 프로브 테스트(probe test)를 실시한 결과인 횡단 횟수(number of annulus crossings)를 도시한다.

도 6은 MPTP유도 운동량 감소에 대한 은행잎 추출물의 효과로서, 8일 동안 마우스에 시험물질을 50mg/kg(p.o)의 농도로 투여하고 시험물질의 투여기간 중 운동량 감소와 신경 독성을 일으키는 MPTP(25mg/kg, i.p)를 1일 간격으로 6회 투여한 다음 자발운동량(locomotor activity)을 측정한 결과를 도시한다.

도 7 및 8은 MPTP 투여시 흑질에서 티로신 하이드록실라아제 발현이 감소하고 시험물질 투여 시 티로신 하이드록실라아제의 발현이 증가하는 것을 보여주는 현미경 사진 및 티로신 하이드록실라아제에 대한 면역반응을 수치화하여 표시한 그래프이다.

도 9 및 도 10은 MPTP 투여시 흑질에서 염증성 반응인 미세아교세포(microglial cell)의 증식이 증가하고 시험물질 투여 시 미세아교세포의 증식이 감소한 것을 보여주는 현미경 사진 및 미세아교세포의 증식에 대한 면역반응을 수치화하여 표시한 그래프이다.

도 11 및 도 12는 MPTP 투여 시 선조체에서 염증성 반응인 미세아교세포의 증식이 증가하고 시험물질 투여 시 미세아교세포의 증식이 감소한 것을 보여주는 현미경 사진 및 미세아교세포의 증식에 대한 면역반응을 수치화하여 표시한 그래프이다.

도 13 및 도 14는 MA(메스암페타민) 투여시 흑질에서 티로신 하이드록실라아제 발현이 감소하고 시험물질 투여 시 티로신 하이드록실라아제의 발현이 증가하는 것을 보여주는 현미경 사진 및 티로신 하이드록실라아제에 대한 면역반응을 수치화하여 표시한 그래프이다.

도 15 및 도 16은 MA(메스암페타민) 투여시 흑질에서 염증성 반응인 미세아교세포(microglial cell)의 증식이 증가하고 시험물질 투여 시 미세아교세포의 증식이 감소한 것을 보여주는 현미경 사진 및 미세아교세포의 증식에 대한 면역반응을 수치화하여 표시한 그래프이다.

도 17 및 도 18은 MA(메스암페타민) 투여 시 선조체에서 염증성 반응인 미세아교세포의 증식이 증가하고 시험물질 투여 시 미세아교세포의 증식이 감소한 것을 보여주는 현미경 사진 및 미세아교세포의 증식에 대한 면역반응을 수치화하여 표시한 그래프이다.

은행잎 추출물은 말초동맥순환장애, 어지러움(현운), 혈관성 및 퇴행성 이명, 기질성 뇌기능 장애의 치료에 효과가 있으며 독일과 프랑스에서 의약품으로 사용되기 시작하여 현재는 유럽 및 세계 각지에서 사용되고 있는 식물추출물이다. 은행잎 추출물은 깅코 플라본 배당체 (quercetin, kaempferol, isorhamnetin), 테르펜 트리락톤 (깅코라이드[ginkgolide] A, B, C, 빌로바라이드[bilobalide])과 같은 여러 가지 유효성분으로 구성되어 있고 이들의 복합적인 약리작용에 의해 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Drugs R. D., vol. 4(3), 188-193, 2003). 표준화된 은행잎 추출물(standardized Ginkgo Biloba Extract, 독일 약전 DAB 2000)은 테르펜 트리락톤 5 ~ 7 %, 깅고플라본 배당체 22 ~ 27 %, 깅콜산 5 ppm 미만인 성분으 로 되어 있고, 이 중 깅고플라본 배당체는 항산화작용과 자유라디칼 소거작용, 테르펜 트리락톤은 혈소판활성화 인자(PAF) 길항작용, 혈소판응집억제작용, 산화질소(nitric oxide) 생성억제작용, 신경세포 보호 작용 등을 나타내며 (Curr Drug Targets, Vol. Jul:1(1), 25-58, 2000), 깅콜산(ginkgolic acid)은 알레르기와 암을 유발하는 물질로 알려져 있다.

특히 은행잎 추출물의 신경세포 보호 작용에 대한 연구가 활발히 진행되어 많은 연구결과가 보고되고 있는데 DeFeudis F.V. 등은 플라보노이드와 깅코라이드(ginkgolide)는 자유라디칼 소거작용 및 항산화작용이 있어 활성산소종 및 지질과산화를 방지하고 빌로바라이드(bilobalide)는 미토콘드리아에서의 호흡률을 개선시킨다고 보고하였다 (Curr Drug Targets, Vol. Jul:1(1), 25-58, 2000). Beal M.F. 등은 파킨슨씨병의 발병이 뇌세포에서 미토콘드리아의 기능저하와 관련이 있고 동물실험모델에서 은행잎 추출물이 미토콘드리아의 기능저하로 인한 파킨슨씨병 모델을 개선시켰다고 한다. (Ann. Neurol., Vol. 53 Suppl 3, 39-47, 2003). 이와 비슷한 연구결과로 Yang S.F. 등은 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyrine)로 유도한 파킨슨씨병 동물모델에서 은행잎 추출물이 현저한 개선효과를 나타내었다고 보고하고 있다 (Acta Pharmacol. Sin., Vol. 22(12), 1089-1093, 2001). 또한 알츠하이머형 치매와 관련하여 Smith J.V. 등은 베타-아밀로이드(β-amyloid)가 신경세포에서 자유라디칼의 생성을 촉진시키는데 은행잎 추출물은 베타-아밀로이드(β-amyloid)에 의해 유도된 자유라디칼을 효과적으로 감소시킨다고 발표하였다 (J. Alzheimers Dis., Vol. 5(4), 287-300, 2003). 이와 같이 은 행잎 추출물은 뛰어난 신경세포 보호 작용을 나타내고 혈관성 치매, 알츠하이머형 치매, 인지력 개선 등에 효과를 보여 오랜 기간 동안 기질성 뇌기능 장애와 말초동맥순환장애의 치료제로 사용되어 왔다.

이에 많은 연구자들은 보다 효능이 뛰어난 은행잎 추출물을 제조하기 위하여 새로운 추출법과 정제법 등을 개발하였으나 대부분 특정 성분만이 고 함량으로 함유된 은행잎 추출물이거나 기존의 은행잎 추출물과 유사한 성분을 함유하는 은행잎 추출물의 신규한 제조방법일 뿐, 표준화된 은행잎 추출물 (standardized Ginkgo biloba extract, DAB)보다 효과가 개선된 은행잎 추출물 및/또는 그러한 추출물을 은행잎으로부터 직접 추출 및 정제하는 제조방법은 개발되지 못한 실정이다.

예로써 독일 특허공보 DE-B 1767098에는 다량의 플라본 글리코시드를 함유하는 은행잎 추출물의 제조방법이 기재되어 있고, 미국 특허공보 US6844451에는 은행잎으로부터 테르펜 트리락톤(깅코라이드, 빌로바라이드)을 분리하는 방법이 소개되어 있으나 기존의 은행잎 추출물보다 뛰어난 효능을 나타내는지는 불명확하다. 또한, 은행잎 추출물은 한 가지 또는 특정 계열의 성분만이 치료효과를 나타내는 것이 아니라 추출물 중에 함유되어 있는 깅코 플라본 배당체와 테르펜 트리락톤 계열 성분의 독특한 약리작용에 의해 그 효과를 발휘하는바 이들 기술에 의한 추출물은 기존의 은행잎 추출물을 대체하기에는 미흡하다.

본 발명자들은 표준화된 은행잎 추출물의 약리작용을 유지하면서 보다 향상된 치료효과를 발휘할 수 있는 새로운 조성의 은행잎 추출물을 개발하고자 많은 연 구를 거듭하였으며, 그 결과 깅코 플라본 배당체는 종래의 은행잎 추출물과 동일하게 함유하고 테르펜 트리락톤은 보다 고 함량으로 함유하는 특정 조성의 은행잎 추출물이 이러한 목적에 부합한다는 결론을 얻게 되었다.

따라서 본원 발명의 발명자들은 종래의 표준화된 은행잎 추출물과 깅코 플라본 배당체는 유사하게 함유하며 테르펜 트리락톤은 고 함량으로 함유하는 특정 조성의 신규한 은행잎 추출물을 은행잎으로부터 직접 제조할 수 있는 추출 및 정제 방법을 개발하였으며, 다각적인 실험을 통하여 그러한 은행잎 추출물의 우수성을 입증함으로써 효능이 향상된 신규 조성의 은행잎 추출물을 개발하였다. 그러나 본원 발명의 우수성은 단순히 테르펜 트리락톤 계열 성분의 함량을 증가시킨 것에 그치는 것이 아니라 유효성분에 대하여 최적의 비율을 찾아냄으로써 알츠하이머형 치매 모델과 파킨슨씨병 모델에서보다 향상된 치료효과를 나타내는 은행잎 추출물을 개발한 것에 그 의의가 있다.

요약하면, 본 발명은 항산화작용 및 자유라디칼 소거작용을 갖는 깅코 플라본 배당체는 종래의 은행잎 추출물과 동일하게 함유하고 테르펜 트리락톤은 종래의 은행잎 추출물보다 다량 함유하여 뇌신경 세포의 손상과 관련된 질환, 특히 알츠하이머형 치매, 파킨슨씨병 등에 뛰어난 효능을 갖는 신규 조성의 은행잎 추출물, 그 제조방법 및 이를 함유한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 목적은 알츠하이머형 치매 및 파킨슨씨병과 같은 뇌기능 장애에 우수한 치료효과를 나타내는 신규 조성의 은행잎 추출물 및 그 제조방법과 이를 유효성분으로 하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에서는 알츠하이머 치매 및 파킨슨씨병과 같은 뇌기능 장애에 우수한 치료효과를 나타내는 신규한 조성의 은행잎 추출물, 그리고 이를 제조하기 위한 추출 및 정제 방법을 제공한다.

구체적으로 본 발명에서는 총 중량에 대하여 테르펜 트리락톤 10-14중량%(바람직하게는 11-13중량%, 가장 바람직하게는 12중량%), 깅코 플라본 배당체 20-30중량% 및 깅콜산 < 5 ppm을 함유하는 은행잎 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 다음의 단계를 포함하며, 추출물 총 중량에 대하여 테르펜 트리락톤 10-14중량%(바람직하게는 11-13중량%, 가장 바람직하게는 12중량%), 깅코 플라본 배당체 20-30중량% 및 깅콜산 < 5 ppm을 함유하는 은행잎 추출물을 은행잎으로부터 직접 추출 및 정제하는 방법을 제공한다. :

1) 은행잎을 아세톤, C₁-C₅ 알코올로 구성된 그룹에서 선택된 유기 용매 또는 상기 유기 용매의 20 내지 80v/v% 수용액인 용매에 침지하고 5~140℃의 온도에서 침출시킨 다음 여과하여 제 1 추출 용액을 수득하는 제 1단계,

2) 상기 제 1 추출 용액을 헵탄 또는 헥산으로 분별 추출하고 헵탄 또는 헥산 가용부를 제거함으로써 제 2 추출 용액을 수득하는 제 2단계,

3) 상기 제 2 추출 용액에 부피 비로 1:2 내지 2:1의 부탄올-톨루엔 혼합용매를 사용하여 분별 추출함으로써 부탄올-톨루엔 혼합용매 가용부인 제 3 추출 용액을 수득하는 제 3단계,

4) 상기 제 3 추출 용액을 5~30℃에서 2~24시간 방치 한 후 여과하여 제 4 추출 용액을 수득하는 제 4단계, 그리고

5) 여과액인 상기 제 4 추출 용액을 감압 농축 후 건조하는 제 5단계.

보다 구체적으로, 본원 발명의 일 실시예에 따르면 제 1단계에서는 건조된 은행잎 분말을 은행잎 중량의 약 1 내지 30배, 바람직하게는 5 내지 10배 부피의 아세톤 및 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜타놀 등의 C₁-C₅ 알코올로 구성된 그룹에서 선택된 유기 용매 또는 상기 유기 용매의 약 20 내지 80v/v% 수용액(바람직하게는 40 내지 70v/v%, 가장 바람직하게는 50 내지 60v/v% 수용액)인 용매에 침지하고, 약 5 내지 140℃, 바람직하게는 용매의 비점 온도에서 약 1시간 내지 24시간, 바람직하게는 10 내지 18시간 동안 추출하여 은행잎 추출물 조추출액을 얻는다. 그 후 여과를 통해 잔류물을 제거한 다음 감압 하에서 유기용매를 제거하여 전체중량의 10중량%이하로 농축한다. 경우에 따라, 위와 같이 농축된 추출액에 물을 가하여 농축된 추출액이 전체 수용액에 10 내지 50중량%가 되도록 희석시킨 다음, 20℃ 이하로 냉각한 후 지용성 성분을 침전시켜 여과한다. (제 1 추출 용액)

제 2단계에서는, 상기 제 1 추출 용액 층에 0.1 내지 10배, 바람직하게는 0.3 내지 1.0배 부피의 헵탄(또는 헥산)을 가하여 분별 추출하고 헵탄(또는 헥산) 가용부를 제거함으로써 알레르기 및 암을 유발하는 것으로 알려진 깅콜산이 제거된 제 2 추출 용액 층을 수득한다.

제 3단계에서는, 상기 제 2단계에서 얻어진 제 2 추출 용액에 부탄올:톨루엔 의 부피 비로 2:1 내지 1:2, 바람직하게는 1:1의 부탄올-톨루엔 혼합용액을 이용하여 수 회(1 내지 7회, 바람직하게는 2 내지 3회) 분별 추출하여 정제함으로써, 부탄올-톨루엔 혼합 용매 가용부인 제 3 추출 용액을 수득한다.

제 4단계에서는, 상기 제 3 추출 용액을 5 내지 30℃에서 2 내지 24시간 방치 한 후 여과하여 제 4 추출 용액 층을 수득한다.

제 5단계에서는 정제된 제 4 추출 용액을 증발 건고 시킴으로써 최종적으로 원하는 조성을 갖는 추출물, 즉 추출물 총 중량에 대하여 테르펜 트리락톤 10-14중량%(바람직하게는 11-13중량%, 가장 바람직하게는 12중량%), 깅코 플라본 배당체 20-30중량% 및 깅콜산 < 5 ppm을 함유하는 은행잎 추출물을 얻을 수 있다.

본원 발명에 따른 신규한 조성의 은행잎 추출물 및/또는 본원 발명에 따른 방법에 의하여 제조되는 은행잎 추출물은 테르펜 트리락톤은 10-14중량%(바람직하게는 11-13중량%, 가장 바람직하게는 12중량%), 깅코 플라본 배당체는 20-30중량%을 함유하여 종래의 은행잎 추출물보다 뛰어난 산화질소(NO, nitric oxide) 생성억제작용, 알츠하이머 형 치매 및 파킨슨씨병 동물모델에서 기존의 은행잎 추출물보다 향상된 효능을 나타낸다. 또한, 알레르기 및 암을 유발하는 것으로 알려진 깅콜산(ginkgolic acid)은 중량으로 5 ppm 미만으로 함유한다.

본원 발명에 따른 신규한 조성의 은행잎 추출물 및/또는 본원 발명의 발명에 따라 제조된 신규한 은행잎 추출물을 함유하는 약제학적 조성물은 산제, 과립제, 정제, 경질캡슐제, 연질캡슐제, 주사제 등으로 제형화 할 수 있으며, 희석제, 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제 등 약제학적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 공지의 방법에 의하여 제형화 될 수 있다.

본원 발명에서 사용할 수 있는 희석제, 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제 등 약제학적으로 허용 가능한 담체의 예시는 대한약전(KP), 미국약전(USP), 일본약전(JP) 및 독일약전(DAB) 등에 기재된 물질을 포함하며, 상기 문서들을 포함하여 본 명세서에서 인용하고 있는 특허 공보를 포함하는 각종 인용 문헌들은 그 내용이 전체로서 본 명세서에 포함된다.

본 발명의 은행잎 추출물을 함유하는 제약학적 조성물은 단위투여 제형 내에 20mg 내지 240mg이 바람직하며, 특히 단위투여 제형당 40mg 내지 120mg이 바람직하다. 또한, 본 발명의 약제조성물의 1일 투여량은 투여방법이나 치료조건에 따라 차이가 있을 수 있으나 경구투여시 성인의 경우 1일 1 내지 4회 투여하는 것이 바람직하다.

이하에서는 본원 발명의 은행잎 추출물의 추출 및 정제 방법을 실시예 및 도면을 통하여 더욱 상세히 설명하고 있으나, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 국한되는 것은 아니다.

[실시예]

<비교예 1>

은행잎 건조분말 10kg을 추출용기에 채워놓고 60v/v% 아세톤 수용액 100L을 넣어 침출한다. 12시간 경과 후 가압 여과하고 여액을 감압 하에 총량이 10L가 되 도록 농축시킨다. 농축액에 물을 가해 20L로 하고 격렬하게 교반한 후 12시간 동안 15℃로 냉각시켜 방치한 후 상등액을 침전물과 분리 여과한다. 여과된 여액을 감압 농축 및 건조하여 추출된 은행잎 추출물 252g을 얻었다.

<실시예 1>

은행잎 건조분말 5kg을 추출용기에 채워놓고 50v/v% 에탄올 수용액 50L를 넣어 침출한다. 12시간 경과 후 가압 여과하고 여액을 감압 하에 총량이 5L가 되도록 농축시킨다. 농축액에 물을 가해 10L로 하고 격렬하게 교반한 후 12시간 동안 15℃로 냉각시켜 방치한 후 상등액을 침전물과 분리 여과한다. 얻은 수용액 층에 헵탄 5L로 3회 추출하여 헵탄 가용부를 제거한 후 남은 수용액 층을 부탄올-톨루엔 혼합용매(1:1,v/v) 10L로 3회 추출한다. 추출한 혼합용매 층을 15℃에서 12시간 동안 방치한 후 여과지로 여과하고, 여액을 감압농축 및 건조하여 정제된 은행잎 추출물 57.3g을 얻었다.

<실시예 2>

비교예 1에서 얻은 은행잎 추출물 중 100g을 50v/v% 에탄올 수용액 1L에 용해시킨다. 용해 후 헥산 500ml로 3회 추출하여 헥산 가용부를 제거한 후 남은 수용액 층을 부탄올-톨루엔 혼합용매(1:1,v/v) 1L로 3회 추출한다. 추출한 혼합용매 층을 15℃에서 12시간 동안 방치한 후 여과지로 여과하고, 여액을 감압농축 및 건조하여 정제된 은행잎 추출물 54.7g을 얻었다.

<실시예 3>

은행잎 건조분말 5kg을 추출용기에 채워놓고 50v/v% 에탄올 수용액 50L를 넣 어 침출한다. 12시간 경과 후 가압 여과하고 여액을 감압 하에 총량이 5L가 되도록 농축시킨다. 농축액에 물을 가해 10L로 하고 격렬하게 교반한 후 12시간 동안 15℃로 냉각시켜 방치한 후 상등액을 침전물과 분리 여과한다. 얻은 수용액 층에 헥산 5L로 3회 추출하여 헥산 가용부를 제거한 후 남은 수용액 층을 부탄올-톨루엔 혼합용매(2:1,v/v) 10L로 3회 추출한다. 추출한 혼합용매 층을 15℃에서 12시간 동안 방치한 후 여과지로 여과하고, 여액을 감압농축 및 건조하여 정제된 은행잎 추출물 48.7g을 얻었다.

<실시예 4>

비교예 1에서 얻은 은행잎 추출물 중 100g을 50v/v% 에탄올 수용액 1L에 용해시킨다. 용해 후 헵탄 500ml로 3회 추출하여 헵탄 가용부를 제거한 후 남은 수용액 층을 부탄올-톨루엔 혼합용매(1:2,v/v) 1L로 3회 추출한다. 추출한 혼합용매 층을 15에서 12시간 동안 방치한 후 여과지로 여과하고, 여액을 감압농축 및 건조하여 정제된 은행잎 추출물 60.1g을 얻었다.

<비교예 2>

은행잎 건조분말 5kg을 추출용기에 채워놓고 50v/v% 에탄올 수용액 50L를 넣어 침출한다. 12시간 경과 후 가압 여과하고 여액을 감압 하에 총량이 5L가 되도록 농축시킨다. 농축액에 물을 가해 10L로 하고 격렬하게 교반한 후 12시간 동안 15℃로 냉각시켜 방치한 후 상등액을 침전물과 분리 여과한다. 얻은 수용액 층에 헵탄 5L로 3회 추출하여 헵탄 가용부를 제거한 후 남은 수용액 층을 부탄올-톨루엔 혼합용매(1:6,v/v) 10L로 3회 추출한다. 추출한 혼합용매 층을 15℃에서 12시간 동안 방치한 후 여과지로 여과하고, 여액을 감압농축 및 건조하여 정제된 은행잎 추출물 35.3g을 얻었다.

<비교예 3>

비교예 1에서 얻은 은행잎 추출물 중 100g을 정제수 1L에 용해시킨다. 용해 후 헵탄 500ml로 3회 추출하여 헵탄 가용부를 제거한 후 남은 수용액 층을 부탄올 톨루엔 혼합용매(1:4,v/v) 1L로 3회 추출한다. 추출한 혼합용매 층을 15℃에서 12시간 동안 방치한 후 여과지로 여과하고 여액을 감압농축 및 건조하여 정제된 은행잎 추출물 28.2g을 얻었다.

<비교예 4>

은행잎 건조분말 5kg을 추출용기에 채워놓고 50v/v% 에탄올 수용액 50L를 넣어 침출한다. 12시간 경과 후 가압 여과하고 여액을 감압 하에 총량이 5L가 되도록 농축시킨다. 농축액에 물을 가해 10L로 하고 격렬하게 교반한 후 12시간 동안 15℃로 냉각시켜 방치한 후 상등액을 침전물과 분리 여과한다. 얻은 수용액 층에 헵탄 5L로 3회 추출하여 헵탄 가용부를 제거한 후 남은 수용액 층을 부탄올-톨루엔 혼합용매(4:1,v/v) 10L로 3회 추출한다. 추출한 혼합용매 층을 15℃에서 12시간 동안 방치한 후 여과지로 여과하고, 여액을 감압농축 및 건조하여 정제된 은행잎 추출물 80.2g을 얻었다.

<비교예 5>

은행잎 건조분말 5kg을 추출용기에 채워놓고 50v/v% 에탄올 수용액 50L를 넣어 침출한다. 12시간 경과 후 가압 여과하고 여액을 감압 하에 총량이 5L가 되도록 농축시킨다. 농축액에 물을 가해 10L로 하고 격렬하게 교반한 후 12시간 동안 15℃로 냉각시켜 방치한 후 상등액을 침전물과 분리 여과한다. 얻은 수용액 층에 헵탄 5L로 3회 추출하여 헵탄 가용부를 제거한 후 남은 수용액 층을 부탄올-톨루엔 혼합용매(1:3,v/v) 10L로 3회 추출한다. 추출한 혼합용매 층을 15℃에서 12시간 동안 방치한 후 여과지로 여과하고, 여액을 감압농축 및 건조하여 정제된 은행잎 추출물 79.1g을 얻었다.

상기 실시예 및 비교예에서 제조된 은행잎 조성물의 성분 분석은 독일 약전 DAB 2000(Ginkgo dry extract, standardised)에 수록된 분석법에 따라 분석하였다.

실시예 및 비교예의 함량분석 결과

구 분		비교예 1	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	비교예 2	비교예 3	비교예 4	비교예 5
깅코 플라본 배당체 (%)	Quercetin	11.27	11.39	11.65	11.27	11.89	11.34	11.30	12.51	11.71
	Kaempferol	10.49	10.89	10.07	10.42	10.92	9.96	10.45	12.23	11.22
	Isorhamnetin	2.55	2.12	2.44	2.22	2.52	2.59	2.38	2.80	2.24
	총계	24.30	24.40	24.16	23.91	25.33	23.89	24.13	27.54	25.17
테르펜 트리락톤 (%)	Bilobalide	3.20	6.32	6.27	6.62	5.80	10.61	9.12	4.52	8.21
	Ginkgolide A	1.05	3.28	3.24	3.53	2.78	6.10	5.26	2.12	4.33
	Ginkgolide B	0.81	0.95	1.00	1.42	0.82	1.81	1.56	1.15	1.31
	Ginkgolide C	0.96	1.42	1.74	1.95	1.03	2.59	2.49	1.22	1.51
	총계	6.02	11.97	12.25	13.52	10.43	21.11	18.43	9.01	15.36
깅콜산 (ppm)		4342	0.2	0.3	0.2	0.3	0.4	0.3	0.4	0.4

< 제제예 > 은행잎 추출물을 함유하는 약제학적 조성물

본원 명세서에서 테르펜 트리락톤 약 12 중량% 및 깅코 플라본 배당체를 약 24 중량% 함유하는, 실시예 2에서 제조된 은행잎 추출물을 YY-1224으로 지시한다.

< 제제예 1>

YY-1224 함유 정제

원료명		1정 중 (mg)
원료명		제제예 1	제제예 2	제제예 3
YY-1224		40 mg	80 mg	120 mg
미결정셀룰로오스		90 mg	109 mg	163.5 mg
유당		100 mg	45.5 mg	68.25 mg
옥수수전분		10 mg	10 mg	15 mg
크로스카멜로스나트륨		5 mg	10 mg	15 mg
콜로이드성이산화규소		2.5 mg	2 mg	3 mg
스테아린산마그네슘		2.5 mg	3.5 mg	4 mg
히드록시프로필메칠셀룰로오스 2910		12 mg	9.25 mg	13.875 mg
폴리에칠렌글리콜	PEG 400	3 mg		6.938 mg
	PEG 1500		4.625 mg
	PEG 6000	3 mg
황색산화철		0.5 mg	1.4 mg	2.06 mg
이산화티탄		0.5 mg	0.17 mg	0.25 mg
씨메치콘에멀젼			0.008 mg	0.016 mg
탈크			0.576 mg	0.864 mg
카르나우바납		0.1 mg	0.1 mg	0.1 mg

※ 상기의 성분들을 통상의 제조방법에 따라 타정 및 코팅하여 정제를 제조한다.

< 제제예 2>

YY-1224 함유 경질캡슐제

원료명	1캡슐 중 (mg)
원료명	제제예 4	제제예 5	제제예 6
YY-1224	40 mg	80 mg	120 mg
미결정셀룰로오스	90 mg	109 mg	163.5 mg
유당	100 mg	45.5 mg	68.25 mg
옥수수전분	10 mg	10 mg	15 mg
전분글리콜산나트륨	5 mg	10 mg	15 mg
콜로이드성이산화규소	2.5 mg	2 mg	3 mg
스테아린산마그네슘	2.5 mg	3.5 mg	4 mg
공캡슐	1 호	1 호	0 호

※ 상기의 성분들을 통상의 제조법에 따라 혼합 및 충전하여 경질캡슐을 제조한다.

< 제제예 3>

YY-1224 함유 연질캡슐제

원료명	1캡슐 중 (mg)
원료명	제제예 7	제제예 8	제제예 9
YY-1224	40 mg	80 mg	120 mg
콩기름	136 mg	272 mg	382 mg
레시틴	4.8 mg	9.6 mg	12.2 mg
황납	4.8 mg	9.6 mg	10.2 mg
야자경화유	14.5 mg	29 mg	30.6 mg
호박산젤라틴	65.5 mg	131 mg	186.7 mg
디-소르비톨액	8.75 mg	17.5 mg	24.9 mg
농글리세린	20.25 mg	40.5 mg	57.7 mg
산화티탄	0.25 mg	0.5 mg	0.7 mg
산화철	0.25 mg	0.5 mg	0.7 mg

※ 상기의 성분들을 통상의 연질캡슐 제조방법에 따라 혼합 및 충전하여 연질캡슐을 제조한다.

< 제제예 4>

YY-1224 함유 주사제

원료명	함량
은행잎 추출물 YY-1224	3.5 mg
D-소르비톨 (분말)	40 mg
에탄올 (95 %)	30 mg
수산화나트륨	0.2 mg
주사용수	적량

※ 상기의 성분들을 통상의 주사제 제조방법에 따라 조제 및 충전하여 주사제를 제조한다.

<약물학적 효능 시험>

이하에서는 본원 발명에 따른 은행잎 추출물에 대한 NO(nitric oxide) 생성 억제 효과에 대한 효력시험과 치매 및 파킨슨씨 모델에서의 효력시험을 제공한다.

본원 명세서에서 시험물질로써 사용된 각각의 은행잎 추출물은,

테르펜 트리락톤 6 중량% 및 깅코 플라본 배당체 24 중량%를 함유하는 은행잎 추출물을 GBE (표준화된 은행잎 추출물)로;

테르펜 트리락톤 9 중량% 및 깅코 플라본 배당체 24 중량%를 함유하는 은행잎 추출물을 YY-0924로;

테르펜 트리락톤 12 중량% 및 깅코 플라본 배당체 24 중량%를 함유하는 은행잎 추출물을 YY-1224(본원 발명)로; 그리고

테르펜 트리락톤은 18 중량% 및 깅코 플라본 배당체를 24 중량%를 함유하는 은행잎 추출물을 YY-1824로 지시하였다.

<실험예 1> 산화질소( nitric oxide ) 생성억제작용

산화질소(nitric oxide)는 신호전달물질로서 매우 중요한 역할을 수행하기도 하나 염증, 신경세포의 손상, 알츠하이머병의 발병 등과 관련이 있다. 따라서 iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의하여 과량의 산화질소(nitric oxide)가 생성되는 것을 억제하는 작용기전을 가진 치료제 개발이 연구되고 있고 깅코라이드 A, B 및 빌로바라이드는 이러한 산화질소(nitric oxide)의 생성을 억제하는 것으로 보고된 바 있다.

마우스 마크로파지 세포인 RAW 264.7 세포를 배양하여 96 웰 플레이트(well plate)에서 2시간 동안 인큐베이션 시키고 리포폴리사카라이드(lipopolysacharide, LPS)와 여러 가지 농도의 (1 ~ 1000 /mL) 시험물질을 가한 후 24시간 동안 인큐베이션 시켰다. 산화질소(nitric oxide) 생성량을 측정하기 위해 그리스(Griess) 시약으로 발색시킨 후 흡광 분석기(microplate reader)로 550nm에서 측정하였다.

도 1은 GBE, YY-1224, YY-1824의 산화질소(nitric oxide) 생성 억제율을 도시한다. 실험결과 본원 발명의 은행잎 추출물인 YY-1224는 GBE(표준화된 은행잎 추출물)에 비해 뛰어난 산화질소(nitric oxide) 생성 억제능을 나타내었다.

<실험예 2> iNOS 단백질 및 iNOS mRNA 의 측정

YY-1224 및 YY-1824에 의한 산화질소(nitric oxide) 생성 억제효과의 작용기전을 알아보기 위하여 CHi YS 등의 실험방법(Biochem. Pharmacol. 61, 1195-1203, 2001)에 따라 웨스턴 흡입법(western blotting)과 RT-PCR 방법으로 iNOS 단백질 및 iNOS mRNA를 측정하였으며 그 결과를 도 2와 도 3에 나타내었다.

도 2는 웨스턴 흡입법(western blotting)에 의한 iNOS 단백질 측정 결과이다. YY-1224와 YY-1824는 표준화된 은행잎 추출물(GBE)보다 낮은 농도에서 iNOS 단백질의 생성량을 감소시켰다. 도 3은 RT-PCR 방법에 의한 iNOS mRNA를 측정 결과를 도시한다. YY-1224와 YY-1824는 표준화된 은행잎 추출물보다 낮은 농도에서 iNOS mRNA 생성량을 감소시켰다. 상기의 실험결과로 볼 때 YY-1224와 YY-1824에 의한 산화질소(nitric oxide) 생성량의 감소는 iNOS 단백질의 양과 iNOS mRNA양의 감소에 기인한 것으로 유추할 수 있다.

<실험예 3> ICR 마우스에서 베타-아밀로이드(β- amyloid ) 유도 인지기능 저하에 대한 YY -1224의 개선 효과

7일간 ICR 마우스에 시험 물질을 50mg/kg의 농도로 경구투여 후 베타-아밀로이드(400 pmol, i.c.v, Aβ40-1 : 알츠하이머 플라크를 잘 생성하지 않는 40 아미노산 펩티드[대조군], Aβ1-42 : 알츠하이머 플라크를 쉽게 생성하는 42 아미노산 펩티드[실험군])를 투여하였으며, 그 후 작업기억 테스트(working memory test) 결과를 비교하였다. 작업기억 테스트는 지름 90cm, 높이 60cm인 원형 욕조에 물을 가득 채우고 욕조의 4등분 한 것 중 한군데에 수면으로부터 1 cm 깊이에 투명한 플랫폼을 설치하여 욕조 외곽에서 2cm 떨어진 5개의 고정된 위치에서 무작위로 마우스를 넣어 플랫폼에 도달하는 시간을 측정하였다.

도 4는 작업기억 테스트 결과 대조군 및 각 샘플에서의 평균 탈출 시간(mean escape latency)을 도시한다. 작업기억 테스트 결과 알츠하이머 플라크를 쉽게 생성하는 42 아미노산 펩티드인 Aβ1-42 베타-아밀로이드의 투여는 평균 탈출 시간을 지연시켰고(##), GBE, YY-0924, YY-1224, YY-1824 전투여 후 Aβ1-42 베타-아밀로이드 처리 시(**)에는 평균 탈출 시간이 줄어들어 기억능이 향상되었다. 특히, YY-1224의 개선효과가 다른 비교예보다 가장 뛰어난 것으로 나타나 YY-1224는 베타-아밀로이드에 의한 인지력, 기억능 감소를 효과적으로 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다.

< 실험예 4> COX -2(+/+) 마우스에서 베타-아밀로이드 유도 인지기능 저하에 대한 YY -1224의 개선 효과

7일간 COX-2(+/+) 마우스(COX-2유전자가 있는 야생형[wild type] 마우스)에 시험 물질을 50mg/kg의 농도로 경구투여 후 베타-아밀로이드(400 pmol, i.c.v, Aβ40-1 : 알츠하이머 플라크를 잘 생성하지 않는 40 아미노산 펩티드[대조군], Aβ1-42 : 알츠하이머 플라크를 쉽게 생성하는 42 아미노산 펩티드[실험군])를 투여하였으며, 프로브 테스트(probe test) 결과를 비교하였다. 프로브 테스트 방법은 지름 90cm, 높이 60cm인 원형 욕조에 물을 가득 채우고 욕조의 4등분 한 것 중 한군데에 수면으로부터 1 cm 깊이에 투명한 플랫폼을 설치하여 욕조 외곽에서 2cm 떨어진 5개의 고정된 위치에서 무작위로 마우스를 넣어 플랫폼의 위치를 기억시킨 후 플랫폼을 제거하고 입수시켜 플랫폼이 있던 위치를 지나는 회수를 기록한다.

도 5는 COX-2(+/+) 마우스에 7일간 시험 물질을 50mg/kg의 농도로 경구투여 후 베타-아밀로이드(400 pmol, i.c.v)를 투여하고 프로브 테스트(probe test)를 실시한 결과 횡단 횟수(number of annulus crossings)를 비교한 그래프이다.

프로브 테스트(Probe test) 결과 Aβ1-42 베타-아밀로이드 투여 시 횡단 횟수(number of annulus crossings)가 유의하게 감소되었으나(##), GBE, YY-0924, YY-1224, YY-1824 전투여 후 Aβ1-42 베타-아밀로이드 처리 시(**)에는 증가하였다. 특히, YY-1224의 개선효과가 다른 비교예보다 현저히 뛰어난 것으로 나타나 YY-1224는 Aβ1-42 베타-아밀로이드에 의한 인지력, 기억능 감소를 효과적으로 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다.

<실험예 5> MPTP 유도 운동량 감소에 대한 YY -1224의 효과

8일 동안 COX-2(+/+) 마우스에 시험물질을 50mg/kg(p.o)의 농도로 투여하고 시험물질의 투여기간 중에 운동량 감소와 신경 독성을 일으키는 MPTP(25mg/kg, i.p)를 1일 간격으로 6회 투여한 후 Burns R. S. 등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 4546 - 4550, 1983)에 따라 자발운동량(locomotor activity)을 측정하였다. (대조군 : 생리식염수[saline])

도 6은 MPTP유도 운동량 감소에 대한 은행잎 추출물의 효과로서 마우스에 시험물질을 8일 동안 50mg/kg(p.o)의 농도로 투여하고 시험물질의 투여기간 중 운동량 감소와 신경 독성을 일으키는 MPTP(25mg/kg, i.p)를 1일 간격으로 6회 투여한 후 자발운동량(locomotor activity)을 측정한 결과를 도시한다. MPTP 단독 투여군에서는 마우스의 운동량이 유의하게 감소되었고(##) GBE, YY-0924, YY-1224, YY-1824 투여군(*)에서는 운동량이 증가하였다. 특히 YY-1224의 투여군(**)에서 운동량의 증가가 가장 크게 나타나 YY-1224의 효과가 가장 큰 것으로 나타났다.

< 실험예 6> MPTP 유도 도파민합성효소발현 소실과 뇌 염증세포( microglia ) 발현에 대한 억제작용 측정

도파민은 중요한 신경전달물질로서 흑질에서 그 양이 감소할 경우 파킨슨씨병이 나타나는 것으로 보고되고 있다. MPTP 투여는 티로신 하이드록실라아제(tyrosine hydroxylase) 발현을 감소시켜 동물실험에서 파킨슨씨병의 모델을 만드는데 많이 이용되며 또한 MPTP 투여에 의한 미세아교세포(microglial cell)의 증식(F4/80 단백 발현증가)은 뇌 내에서 염증성 모델로 이용되고 있다.

8일 동안 COX-2(+/+) 마우스에 시험물질을 50mg/kg(p.o)의 농도로 투여하고 시험물질의 투여기간 중에 운동량 감소와 신경 독성을 일으키는 MPTP(25mg/kg, i.p)를 1일 간격으로 6회 투여한 후 흑질에서의 티로신 하이드록실라아제 발현, 흑질과 선조체에서 미세아교세포의 증식을 Liu, X.H. 등의 방법 (Brain Research, 625, 29-37, 1993) 에 따라 측정하였다. (대조군 : 생리식염수[saline])

도 7은 MPTP 투여시 흑질에서 티로신 하이드록실라아제 발현이 감소하고 시험물질 투여 시 티로신 하이드록실라아제의 발현이 증가하는 것을 보여주는 현미경 사진이며, 도 8은 티로신 하이드록실라아제에 대한 면역반응을 수치화하여 표시한 그래프이다. (Y축: 티로신 하이드록실라아제를 발현한 세포의 개수) MPTP 투여시 흑질에서 티로신 하이드록실라아제 발현이 감소하는 것을 보여주고 있으며(##) 이는 GBE, YY-1224, YY-1824 투여(*, **, *)에 의해 증가하였다.

도 9는 MPTP 투여시 흑질에서 염증성 반응인 미세아교세포의 증식이 증가하고 시험물질 투여 시 미세아교세포의 증식기 감소한 것을 보여주는 현미경 사진이며, 도 10은 미세아교세포의 증식에 대한 면역반응을 수치화하여 표시한 그래프이다. (Y축: 미세아교세포의 특이적 단백질인 F4/80의 발현정도를 염색된 넓이와 진하기로 표시, 이 때 saline 투여군을 1로 환산하여 이에 대한 비율로서 표시) MPTP 투여시 흑질에서 염증성 반응인 미세아교세포의 증식이 증가한 것과(##) GBE, YY-1224, YY-1824 투여에 의해 미세아교세포의 증식이 감소한 것(**)을 보여주고 있다.

도 11은 MPTP 투여 시 선조체에서 염증성 반응인 미세아교세포의 증식이 증가하고 시험물질 투여 시 미세아교세포의 증식이 감소한 것을 보여주는 현미경 사진이며, 도 12는 미세아교세포의 증식에 대한 면역반응을 수치화하여 표시한 그래프이다. (Y축: 미세아교세포의 특이적 단백질인 F4/80의 발현정도를 염색된 넓이와 진하기로 표시, 이 때 saline 투여군을 1로 환산하여 이에 대한 비율로서 표시) MPTP 투여 시 선조체에서 염증성 반응인 미세아교세포의 증식이 증가한 것(##)과 GBE, YY-1224, YY-1824 투여에 의해 미세아교세포의 증식이 감소한 것(**)을 보여주고 있다.

상기의 실험결과로 YY-1224, YY-1824는 흑질에서 도파민 합성효소발현의 감소를 유의하게 증가시키고 흑질, 선조체에서 염증성 반응을 유의하게 감소시켜 주며 특히 YY-1224의 효과가 가장 뛰어남을 알 수 있다.

< 실험예 7> 메스암페타민( MA : methamphetamine ) 유도 도파민합성효소 발현 소실과 미세아교세포( microglia ) 발현에 대한 억제효과

7일 동안 COX-2(+/+) 마우스에 GBE, YY-1224, YY-1824 등의 시험물질을 투여(50mg/kg, p.o)하고 메스암페타민(MA:methamphetamine)을 2시간 간격으로 4회 투여(7.5mg/kg)한 뒤 흑질에서의 티로신 하이드록실라아제 발현, 흑질과 선조체에서 미세아교세포의 증식을 측정하였다. (대조군 : 생리식염수[saline])

도 13은 메스암페타민 투여시 흑질에서 티로신 하이드록실라아제 발현이 감소하고 시험물질 투여 시 티로신하이드록실라아제의 발현이 증가하는 것을 보여주는 현미경 사진이며, 도 14는 티로신 하이드록실라아제에 대한 면역반응을 수치화하여 표시한 그래프이다. (Y축: 티로신 하이드록실라아제를 발현한 세포의 개수) 메스암페타민 투여시 흑질에서 티로신 하이드록실라아제 발현이 감소하는 것(##)을 보여주고 있으며 이는 GBE, YY-1224, YY-1824 투여에 의해 증가(*, **, *)하였다.

도 15는 메스암페타민 투여시 흑질에서 염증성 반응인 미세아교세포(microglial cell)의 증식이 증가하고 시험물질 투여 시 미세아교세포의 증식이 감소한 것을 보여주는 현미경 사진이며, 도 16은 미세아교세포의 증식에 대한 면역반응을 수치화하여 표시한 그래프이다. (Y축: 미세아교세포의 특이적 단백질인 F4/80의 발현정도를 염색된 넓이와 진하기로 표시, 이 때 saline 투여군을 1로 환산하여 이에 대한 비율로서 표시) 메스암페타민 투여시 흑질에서 염증성 반응인 미세아교세포(microglial cell)의 증식이 증가한 것과(##) GBE, YY-1224, YY-1824 투여에 의해 미세아교세포의 증식이 감소한 것(**)을 보여주고 있다.

도 17은 메스암페타민 투여 시 선조체에서 염증성 반응인 미세아교세포의 증식이 증가하고 시험물질 투여 시 미세아교세포의 증식이 감소한 것을 보여주는 현미경 사진이며, 도 18은 미세아교세포의 증식에 대한 면역반응을 수치화하여 표시한 그래프이다. (Y축: 미세아교세포의 특이적 단백질인 F4/80의 발현정도를 염색된 넓이와 진하기로 표시, 이 때 saline 투여군을 1로 환산하여 이에 대한 비율로서 표시) 메스암페타민 투여 시 선조체에서 염증성 반응인 미세아교세포의 증식이 증가한 것(##)과 GBE, YY-1224, YY-1824 투여에 의해 미세아교세포의 증식이 감소한 것(**)을 보여주고 있다.

상기의 실험결과로 YY-1224, YY-1824는 흑질에서 메스암페타민에 의한 도파민 합성효소발현의 감소를 유의하게 증가시키고 흑질, 선조체에서 염증성 반응을 유의하게 감소시켜 주며 특히 YY-1224의 효과가 가장 뛰어남을 알 수 있다.

본원 발명에 따른 은행잎 추출물을 이용하여 산화질소(nitric oxide) 생성억제작용, 베타-아밀로이드(β-amyloid) 유도 알츠하이머형 치매모델에서의 개선효과, MPTP 유도 파킨슨씨병 모델에서의 개선효과, 메스암페타민(methamphetamine) 유도 신경세포손상에 대한 개선효과 등을 측정한 결과 YY-1224와 YY1824는 표준화된 은행잎 추출물보다 뛰어난 산화질소(nitric oxide) 생성억제작용을 나타내었으며, 특히 YY-1224는 베타-아밀로이드 유도 알츠하이머형 치매모델, MPTP 유도 파킨슨씨병 모델에 대해 표준화된 은행잎 추출물 및 비교예(YY-0924, YY-1824)보다 현저히 뛰어난 효과를 나타내었다.

따라서 본 발명의 은행잎 추출물은 산화질소(nitric oxide) 생성에 의한 질병의 치료에 사용될 수 있고, 베타-아밀로이드에 의한 알츠하이머형 치매, 파킨슨씨병과 같은 신경세포손상에 의한 뇌기능 장애의 치료에 사용될 수 있다.

상기에 언급한 바와 같이 본원 발명에 따른 은행잎 추출물은 종래의 은행잎 추출물에 비해 산화질소 (nitric oxide) 생성억제작용이 뛰어나고 알츠하이머형 치매 및 파킨슨씨병 모델에서도 뛰어난 개선효과를 나타내었다. 또한, 본원 발명의 방법에 따르면 신규한 테르펜 트리락톤 고 함량 은행잎 추출물은 은행잎으로부터 간단한 공정을 통하여 직접 추출 및 정제되므로 생산성이 뛰어나다. 본 발명에서 명시하고 있는 신규 조성의 은행잎 추출물은 기질성 뇌기능 장애의 개선에 있어서 향상된 효능을 나타내고 산제, 과립제, 정제, 경질캡슐제, 연질캡슐제, 주사제 등의 제형으로 개발 가능하며 알츠하이머형 치매 및 파킨슨씨병, 그 외 산화질소(nitric oxide) 생성과 관련된 여러 가지 질병의 치료에 사용될 수 있다.

Claims

총 중량에 대하여 테르펜 트리락톤 10-14중량%, 깅코 플라본 배당체 20-30중량% 및 깅콜산 < 5 ppm을 함유하는 알츠하이머형 치매 및 파킨슨씨병 예방 또는 치료용 은행잎 추출물.
1) 은행잎을 아세톤, C₁-C₅ 알코올로 구성된 그룹에서 선택된 유기 용매 또는 상기 유기 용매의 20 내지 80v/v% 수용액에 침지하고 5~140℃의 온도에서 침출시킨 다음 여과하여 제 1 추출 용액을 수득하는 제 1단계,

2) 상기 제 1 추출 용액을 헵탄 또는 헥산으로 분별 추출하고 헵탄 또는 헥산 가용부를 제거함으로써 제 2 추출 용액을 수득하는 제 2단계,

3) 상기 제 2 추출 용액에 부피 비로 1:2 내지 2:1의 부탄올-톨루엔 혼합용매를 사용하여 분별 추출함으로써 부탄올-톨루엔 혼합용매 가용부인 제 3 추출 용액을 수득하는 제 3단계,

4) 상기 제 3 추출 용액을 5~30℃에서 2~24시간 방치한 후 여과하여 제 4 추출 용액을 수득하는 제 4단계, 그리고

5) 여과액인 상기 제 4 추출 용액을 감압 농축 후 건조하는 제 5단계를 포함하는,

추출물 총 중량에 대하여 테르펜 트리락톤 10-14중량%, 깅코 플라본 배당체 20-30중량% 및 깅콜산 < 5 ppm을 함유하는 알츠하이머형 치매 및 파킨슨씨병 예방 또는 치료용 은행잎 추출물을 은행잎으로부터 추출 및 정제하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 단계 3)에서 부탄올-톨루엔 혼합용매의 부피 비는 1:1임을 특징으로 하는 은행잎 추출물을 은행잎으로부터 추출 및 정제하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 은행잎 추출물은 테르펜 트리락톤 11-13중량%을 포함함을 특징으로 하는 은행잎 추출물을 은행잎으로부터 추출 및 정제하는 방법.
제 2항의 방법에 따라 제조되며, 총 중량에 대하여 테르펜 트리락톤 10-14중량%, 깅코 플라본 배당체 20-30중량% 및 깅콜산 < 5 ppm을 함유하는 알츠하이머형 치매 및 파킨슨씨병 예방 또는 치료용 은행잎 추출물.
제 1항 또는 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 은행잎 추출물은 산화질소(nitric oxide) 생성억제작용을 나타내고, 베타-아밀로이드(β-amyloid) 유발 인지력 및 기억력 감소를 개선시키며 MPTP 및 메스암페타민(methamphetamine)에 의한 도파민 발현 효소의 감소와 신경세포에서의 염증반응을 개선시키는 것을 특징으로 하는 알츠하이머형 치매 및 파킨슨씨병 예방 또는 치료용 은행잎 추출물.
제 1항 또는 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 은행잎 추출물은 테르펜 트리락톤 11-13중량%을 포함함을 특징으로 하는 은행잎 추출물.
제 7항에 있어서, 상기 은행잎 추출물은 테르펜 트리락톤 12중량%을 포함함을 특징으로 하는 은행잎 추출물.
제 1항 또는 제 5항 중 어느 한 항에 따른 은행잎 추출물을 단위 제형 당 20 ~ 240 mg 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 9항에 있어서, 희석제, 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제 중에서 선택된 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 함유하며 산제, 과립제, 정제, 경질 캡슐제, 연질 캡슐제, 주사제 중에서 선택된 제형으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.