KR101179340B1

KR101179340B1 - 우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101179340B1
Application number: KR1020100109548A
Authority: KR
Inventors: 김형춘; 신은주
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2010-11-05
Publication date: 2012-09-03
Also published as: KR20120048105A

Abstract

우루소데옥시콜린산 및 우루소데옥시콜린산과 은행잎 추출물을 함유하는 본 발명의 조성물은 치매환자에 있어서 인지기억능과 콜린성 신경계 기능을 유의의하게 항진시키고, 아밀로이드 플라크생성을 억제한다. 특히, 우루소데옥시콜린산과 은행잎 추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은 각 약물의 단독투여군에 비하여 상승된 약리효과(synergisitc effect)를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물을 사용하는 경우, 은행잎 추출물의 단독투여군에 비해서 투여용량을 감소시키는 것이 가능하기 때문에, 출혈부작용 등의 부작용을 줄일 수 있으며, 기존에 투여가 금기시되던 항응고제 투여환자나 항우울제 투여환자에게도 투여가 가능하다는 잇점을 갖는다.

Description

우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 예방 및 치료용 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF ALZHEIMER'S DISEASE CONTAINING URSODEOXYCHOLIC ACID GINKGO BILOBA EXTRACT}

본 발명은 우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은, 은행잎 추출물과 우르소데옥시콜린산을 병용하는 경우, 이들을 단독으로 사용할 때보다 뛰어난 상승효과를 보인다는 지견에 기초한 것으로서, 부작용은 감소하면서 치료효과는 뛰어난 알츠하이머병의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은, 우르소데옥시콜린산의 의약용도에 관한 것으로서, 우르소데옥시콜린산이 알츠하이머병의 예방 및 치료에 사용되는 것을 특징으로 한다.

우르소데옥시콜린산(Ursodeoxycholic acid, UDCA)은 담즙산의 일종으로 계면활성 작용으로 지질대사에 관여하는 생체 물질인데, 주로 간조직을 이용한 in vitro 및 in vivo 연구를 통하여 그 항산화 효능 및 항염증 효과가 보고되어 있다.

우르소데옥시콜린산의 항산화 작용 기전으로는 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion) 과 하이드록시 라디칼(hydroxyl radical)을 직접적으로 소거하는 기전과 막안정화제(membrane stabilizing agent) 로서 작용하여 세포막의 산화적인 손상과 과산화지질의 생성을 억제하는 기전이 제시되어 있다. 또한, 글루타치온 합성의 율속단계에 관여하는 효소들인 감마-글루타치온 신테타제(gamma-glutamylcysteine synthetase), 감마-크리스타치온아제(gamma-cystathionase)와 메탈로치오닌(metallothionein)의 합성을 증가시켜, 세포질과 미토콘드리아의 글루타치온과 프로틴치올 수치를 유지시켜주는 것으로 보고되었다. 우르소데옥시콜린산은 이러한 항산화 작용 이외에도 항염증 작용을 지님이 알려져있다.

한편, 치매는 노령인구의 증가와 더불어 그 유병율이 증가하고 있는 질환으로서, 알츠하이머병이 가장 흔한 원인(60%)이며, 혈관성 치매(20%), Lewy body를 가지는 치매(파킨슨성 치매, 15%), 그 외의 원인 (5%)에 의한다. 이중에서, 알츠하이머병은 해마 및 피질부위에 아밀로이드 플라크(amyloid plaque) 및 신경섬유의 꼬임(neurofibrillay tangle)을 가지는 것을 조직학적 특징으로 하는 질환으로, 알츠하이머병의 병인론에서 가장 중요한 과정은 비수용성의 베타-아밀로이드(β-amyloid, Aβ) 펩타이드의 축적과정이다. 비수용성의 베타아밀로이드 펩타이드에는 Aβ (1-40)와 Aβ (1-42)가 가장 많은데, Aβ (1-42)가 Aβ (1-40)에 비하여 아밀로이드 플라크로 응집되기 쉽기 때문에 더욱 독성이 높은 것으로 증명되었다. 이 외에도, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 프레세닐린(PS)-1, PS-2, 아포리포프로틴등의 유전자의 차이 및 산화적인 독성이 알츠하이머병의 병인론에 관여한다고 생각되어지는데, 이는 각종 유전자 조작 동물, 예를들면 APP 발현생쥐를 이용하거나 독성의 Aβ peptide를 중추 투여하여 알츠하이머병의 동물모델을 확립함으로서 확인된다.

은행잎 추출물은 깅코플라본배당체 (quercetin, kaempferol, isorhamnetin), 테르펜 트리락톤 (깅코라이드[ginkgolide] A, B, C, 빌로바라이드[bilobalide])과 같은 여러 가지 유효성분으로 구성되어 있고 이들의 복합적인 약리작용에 의해 다양한 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이 중 깅고플라본 배당체는 항산화작용과 자유라디칼 소거작용, 테르펜 트리락톤은 혈소판활성화인자(PAF) 길항작용, 혈소판응집억제작용, 산화질소(nitric oxide) 생성억제작용을 통하여 신경세포 보호 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 은행잎 추출물은 알츠하이머병의 in vitro , in vivo 모델에서 신경보호 및 인지기억능 항진효과를 나타내는데, 임상에서는 이러한 우수한 신경보호 효과와 인지력 개선효과를 바탕으로 하여 오랜 기간 동안 알츠하이머병을 비롯한 기질성 뇌기능 장애에 치료제로 사용되어 왔다.

1. 한국공개특허공보 제2006-0007861호 2. 한국특허 제0723609호 3. 한국공개특허공보 제1998-0085591호

1. Ljubuncic P, Abu-Salach O, Bomzon A. Ursodeoxycholic acid and superoxide anion. World J. Gastroenterol. 2005; 11(31): 4875-4878. 2. Burns A, O'Brien J. Clinical practice with anti-dementia drugs: a consensus statement from British Association for Psychopharmacology. J. Psychopharmacol. 2006; 20(6): 732-755. 3. EGb761: ginkgo biloba extract, Ginkor. Drugs in R&D 2003; 4(3): 188-193. 4. Mahadevan S, Park Y. Multifaceted therapeutic benefits of Ginkgo biloba L.: Chemistry, efficacy, Safety, and Uses. J. Food Sci. 2008; 73(1): R14-R19.

하지만, 은행잎 추출물이 우수한 약리효과를 보이며, 비교적 안전성이 확보된 약물임에도 불구하고, 출혈 및 과다출혈 부작용을 보이는 문제가 있어 이부프로펜, 아스피린, 와파린 등의 항응고제와는 병용투여에서는 주의가 요망되어 왔다. 특히, 알츠하이머병이나 치매는 노인에게서 빈발하는 질환이라는 점 및 노인들은 일반적으로 내출혈등의 위험에 노출될 가능성이 더 크다는 점을 고려할 때, 항응고제와의 병용투여를 할 때 뿐만 아니라 은행잎 추출물 제제의 단독투여를 할 때에도 출혈에 대한 위험성을 필연적으로 수반하게 되고, 이는 치료에 있어서의 약제선택의 자유를 제한하는 요인이 된다. 또한, 은행잎 추출물은 모노아민 옥시다제 억제제 (monoamine oxidase inhibitor) 혹은 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 (selective serotonin reuptake inhibitor)를 항우울제로 투여받고 있는 환자나, 임산부에게의 투여도 주의가 요망되고 있으며, 따라서, 그 사용에 있어서의 제약이 따르게 된다. 이에, 동일하거나 또는 그 이상의 약리효과를 나타내면서도 은행잎 추출물의 용량을 줄일 수 있다면 이와 같은 제약을 극복할 수 있을 것인데, 본 발명은 이를 해결하려는 과제로 한다.

본 발명자들은 알츠하이머병의 in vivo 동물모델에서 나타나는 인지기억능 저하 및 콜린성 시스템(cholinergic system)의 기능저하에 대해서 우르소데옥시콜린산과 은행잎 추출물의 병용투여가 단독투여에 비해 뛰어난 상승효과를 나타낸다는 지견을 얻었다. 이와 같이, 우르소데옥시콜린산과 은행잎 추출물의 병용투여가 상승효과를 나타낼 경우, 은행잎 추출물의 투여용량을 감소시켜도 동일한 약리효능을 나타낼 수 있으며, 투여량 감소에 따라 출혈성 부작용 등의 부작용도 줄일 수 있어 기존에 투여가 금기시되던 항응고제 투여환자나 항우울제 투여환자에게도 투여가 가능해질 수 있다. 또한, 본 발명자들은 우르소데옥시콜린산을 단독으로 사용하여도, 알츠하이머병의 치료에 사용할 수 있다는 사실을 in vivo 동물모델에서 그 약리효능을 확인함으로서 규명하였고, 이와 같은 신규한 의약용도는 본 발명의 또 다른 특징으로 된다.

도 1은, Aβ의 중추투여로 성립하는 알츠하이머병 모델에서 우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물의 병용투여의 약리효능을 평가하기 위한 실험일정을 나타내는 도이다.
도 2는, APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 우루소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물의 병용투여의 약리효능을 평가하기 위한 실험일정을 나타내는 도이다.
도 3은, Aβ (1-42)의 중추투여로 인해 저하된 인지기억능 감소 (Y-maze test로 평가)에 대한 우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물의 병용투여의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 4는, Aβ (1-42)의 중추투여로 인해 저하된 인지기억능 감소 (novel object recognition test로 평가)에 대한 우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물의 병용투여의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 5는, Aβ (1-42)의 중추투여로 인해 저하된 인지기억능 감소 (passive avoidance test로 평가)에 대한 우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물의 병용투여의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 6은, Aβ (1-42)의 중추투여로 유도된 해마의 아세틸콜린의 농도의 저하를 나타내는 도이다.
도 7은, Aβ (1-42)의 중추투여로 유도된 대뇌피질의 아세틸콜린의 농도의 저하를 나타내는 도이다.
도 8은, APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐의 인지기억능 (Y-maze test로 평가)에 대한 우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물의 병용투여의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 9는, APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐의 인지기억능 (novel object recognition test로 평가)에 대한 우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물의 병용투여의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 10은, APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐의 인지기억능 (passive avoidance test로 평가)에 대한 우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물의 병용투여의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 11은, APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐의 해마조직에서 아세틸콜린 농도 (A), 아세틸콜린에스테라아제의 활성 (B) 및 콜린 아세틸트랜스페라제의 활성(C)에 미치는 우루소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물의 병용투여의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 12는, APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐의 대뇌피질조직에서 아세틸콜린 농도(A), 아세틸콜린에스터라아제의 활성 (B) 및 콜린 아세틸트랜스페라제의 활성(C)에 미치는 우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물의 병용투여의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 13은, APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐의 해마와 대뇌피질 조직에서 아밀로이드 플라크의 생성에 미치는 우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물의 병용투여의 약리효과를 나타내는 도이다.

본 발명자들은 우르소데옥시콜린산이 가지고 있는 치매의 예방 및 치료효과, 그리고, 우르소데옥시콜린산과 은행잎 추출물의 병용제제가 나타내는 상승효과를 검토하였다. 약리효과를 검증하는 동물모델로서는 Aβ를 중추에 투여한 생쥐모델 및 APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐를 사용하였으며, 각 동물모델에 대해서 Y자형 미로실험(Y maze test), 객체인식실험(Novel object test), 수동회피반응실험(passive avoidance test)을 통해서 인지기억능을 평가하고, 이어서, 해마와 피질조직에서의 아세틸콜린의 수치 및 아세틸콜린 에스터라제의 활성과 콜린 아세틸트란스페라제의 활성을 측정함으로서 약리효과를 측정하였다. 또한, APPswe/PS1dE9 이중발현생쥐의 해마와 피질조직에서 아밀로이드 플라크의 생성을 면역조직화학적 염색법을 이용해서 평가했다. 군간 통계학적인 유의성은 일원분산분석 (one-way ANOVA) 혹은 중복측정 일원분산분석 (one-way ANOVA for repeated measures)을 사용하였으며, 사후검정으로서 Fisher's PLSD 평가 혹은 Bonferroni's 평가를 수행하였다.

실시예

실시예 1_Aβ의 중추투여로 성립하는 알츠하이머병 모델에서의 약물투여 및 실험일정

Aβ에 의한 인지기억능의 저하가 12주령의 생쥐에서 평가되었다. ICR 생쥐 [(주)오리엔트바이오, 경기, 한국]를 구입하여 실험동물실에 1주일간 적응시켰다. 약물투여 및 인지기억능의 평가는 도 1과 같은 일정으로 실시하였다. 요약하면, UDCA (25 혹은 50 mg/kg; Tokyo Chemical Industry, CO., Ltd, 도쿄, 일본) 투여군, 은행잎 추출물 (EGb 761로서 30 mg/kg; 유유주식회사, 경기, 한국) 투여군, 또한 UDCA (25 혹은 50 mg/kg)과 은행잎 추출물 (30 mg/kg)의 병용투여군으로 나누어, 1일 1회씩 5일간 경구투여 하였다. 독성의 Aβ (1-42) (American Peptide Company, Sunnyvale, CA, USA)와 대조물질인 무독성의 Aβ (42-1) (American Peptide Company, Sunnyvale, CA, USA)은 400 pmol을 제 3뇌실로 투여하였다. Aβ의 투여 3일 후부터 인지기억능 평가를 실행하였다. 인지기억능 평가가 이루어지는 기간에는 행동에 약물들이 직접적인 영향을 미치는 것을 막기 위하여, 행동 및 인지기능 평가가 끝난 후 약물을 투여하였다. 인지기억능 평가가 끝나고 1일 후 동물을 희생시켜 해마(hippocampus) 및 피질조직(cortex)을 취하였다.

실시예2_알츠하이머병 모델인 amyloid precursor protein/presenilin-1 (APPswe/PS1dE9) 이중발현 생쥐에 대한 약물투여 및 실험일정

본 실험에는 6월령의 APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐 (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, MA, USA)를 사용하였다. APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐를 UDCA (25 혹은 50 mg/kg) 투여군, 은행잎 추출물 (EGb 761로서 30 mg/kg) 투여군, 혹은 UDCA (25 혹은 50 mg/kg)과 은행잎 추출물 (30 mg/kg)의 병용투여군으로 나누어 1일 1회씩 3개월간 경구투여 한 후 인지기억능 평가를 실행하였다(그림 2). 인지기억능 평가가 이루어지는 기간에는 행동에 약물들이 직접적인 영향을 미치는 것을 막기 위하여, 행동 및 인지기능 평가가 끝난 후 약물을 투여하였다. 인지기억능 평가가 끝나고 1일 후 동물을 희생시켜 해마 및 피질조직을 취했다.

실시예 3_Y자형 미로 실험법(Y-maze)

Y-maze 의 구성은 Y-자 형태의 암(arm)으로 되어 있고 길이 25 cm 와 높이 14 cm 넓이 5 cm 의 검은 플라스틱 상자로 되어 있다. 생쥐를 한쪽 팔의 끝에 놓고 8분 동안 암사이를 자유롭게 왕래하도록 한다. 생쥐가 각각의 암에 들어가는 횟수를 비디오 카메라로 찍는다. 공간 교체행동(Alternation behavior)의 평가지표는 3개의 암을 모두 들어가는 경우에 1점을 획득하는 것으로 하여 대조군과 비교했다. 생쥐의 교체 스코어는 실제 생쥐가 획득한 스코어를 가능한 교체 스코어로 나누어 100% 로 환산한다.

실시예 4_객체인식실험법(Novel object test)

첫 날에는 생쥐를 40 cm X 40 cm X 30 cm 의 상자에 넣고 10 분간 자유롭게 이동하도록 하여 적응시킨다. 2일째에는 상자에 두 개의 물체를 놓고 각각의 물체에 대한 반응시간을 기록한다. 이로부터 24시간 후 두 개중 한 개의 물체를 새로운 물체 (novel object)로 바꾼 후 이에 대한 반응시간을 기록한다.

실시예 5_수동회피반응실험법(passive avoidance test)

수동회피반응실험법은 Gemini Avoidance System (San Diego Instrument, San Diego, CA)를 이용하여 측정한다. 이 시스템은 바닥에 쇼크발생기가 장치되어진 2개의 공간으로 이루어져 있으며 두 공간의 사이에는 길로틴 도어(guillotine door)를 구비한다. 학습단계(Acquisition trial)에서는 생쥐를 한 공간 (start chamber)에 넣은 후 20초간 적응시킨다. 20초 후 생쥐가 넣어진 공간에 불이 켜지면서 가운데의 길로틴 도어가 열리고, 생쥐가 불이 켜지지 않은 반대편 공간으로 들어가는 즉시 길로틴 도어가 닫히면서 전기 쇼크 (0.3 mA, 3s, 1회)가 주어지게 된다. 24시간 후 기억단계(retention trial)에서는 생쥐를 스타트 챔버에 다시 넣고 불을 켠 후, 반대쪽 공간으로 가는 시간 (step-through latency)을 기록한다.(최고 300초)

실시예6_아세틸콜린(ACh), 아세틸콜린에스터라제(AChE) 및 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)의 활성측정

해마와 피질조직의 ACh 수치 및 AChE의 활성은 AmplexRed Acetylcholine/ Acetylcholinesterase Assay Kit (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)을 이용하여 제작회사의 프로토콜에 따라 측정하였다. ChAT의 활성은 다음과 같이 측정했다. 0.5M sodium phosphate buffer (pH 7.2), acetyl-CoA (6.2mM), choline chloride (1M), neostigmine sulfate (0.76mM), NaCl (3M), EDTA (1.1mM)의 용액을 각각 25μl씩 취한 후 증류수를 이용하여 부피를 400μl로 맞추고, 이 용액을 37°C에서 5분간 프리인큐베이션한 후, 시료 100μl을 넣어 37°C에서 20분간 인큐베이션하였다. 검체를 2분간 끓여서 반응을 종결시킨 후, 1ml의 증류수를 넣었다. 원심분리를 통하여 변성된 단백질을 제거한 후 1ml의 상등액을 4,4‘-dithiopyridine (10mM)이 30μl 들어 있는 시험관에 넣었다. 15분 후 324nm에서 흡광도를 측정하였다. ChAT의 활성을 coenzyme nmol/hrg protein으로 표기하였다. 단백질 농도는 BCA protein assay reagent (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 제작회사의 프로토콜에 따라 측정하였다.

실시예 7_면역조직화학적 염색

APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐의 해마와 피질조직에서 아밀로이드 플라크의 생성을 면역조직화학적 염색법을 이용하여 평가하였다. 관류시켜 4% p-포름알데히드로 고정된 뇌조직을 40μm씩으로 절단 후 Aβ (1-42) 항체 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 1일 밤 배양시키기 전에 section을 0.2% Triton X-100에 15분간 노출시키고 4% normal goat serum에 배양시켰다. 1일 밤이 지난 후 2차 항체에 1시간 배양시키고 3,3-디아미노벤지딘을 크로모겐으로 하여 면역 염색했다. 각 단계마다 PBS (pH 7.4)로 세척하였다.

실험예 1_ Aβ (1-42)의 중추투여로 유도된 인지기억능 저하와 콜린성 신경계 기능저하에 대한 UDCA 및 은행잎 추출물의 약리효과

1) Y자형 미로 실험(Y-maze)

Aβ (1-42)의 투여는 Y-maze에서 공간교체행동을 유의하게 감소시켰으며 (P < 0.01), 이는 단기공간기억력 (short-term spatial)의 저하를 의미한다. UDCA (50 mg/kg, P < 0.05), 은행잎 추출물 (P < 0.05)의 단독투여 및 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여 (P < 0.01)는 Aβ (1-42)에 의한 공간교체행동의 감소를 용량의존적으로 [P < 0.05, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42)] 유의하게 억제하였다. 또한, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여는 각 약물의 단독투여에 비하여 유의하게 약리효능이 우수하였다 [P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. Saline + GB + Aβ (1-42)]. 이상의 결과는 UDCA와 은행잎 추출물이 Aβ (1-42)에 의해 유도된 단기공간기억력 감소에 유의한 약리효능이 있음을 나타내며, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여가 각 약물의 단독투여군에 비하여 유의한 상승효과를 나타냄을 의미한다(도 3).

2) 객체인식실험(novel object test)

Aβ (1-42)의 투여는 객체인식실험에서 새로운 객체에 대한 인식(exploration)을 유의하게 감소시켰으며 (P < 0.01), 이는 시각재인지기억 (visual recognition memory)의 저하를 의미한다. UDCA (50 mg/kg, P < 0.05), 은행잎 추출물 (P < 0.05)의 단독투여 및 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여 (P < 0.01)는 Aβ (1-42)에 의해 유도된 새로운 객체에 대한 인식의 감소를 용량의존적으로 [P < 0.05, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42)] 유의하게 억제하였다. 또한, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여는 UDCA 혹은 은행잎 추출물의 단독투여에 비하여 유의하게 약리효능이 우수하였다 [P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. Saline + GB + Aβ (1-42)]. 이상의 결과는 UDCA와 은행잎 추출물이 Aβ (1-42)에 의해 유도된 시각재인지기억력의 감소에 유의한 약리효능이 있음을 나타내며, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여가 각 약물의 단독투여군에 비하여 유의한 상승효과를 나타냄을 의미한다 (그림 4).

3) 수동회피반응실험법(Passive avoidance test)

Aβ (1-42)의 투여는 수동회피반응실험에서 검은 방으로 가는 step-through latency를 유의하게 감소시켰으며 (P < 0.01), 이는 연합학습능력 (associative learning)의 저하를 의미한다. UDCA (50 mg/kg, P < 0.05), 은행잎 추출물 (P < 0.05)의 단독투여 및 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여 (P < 0.01)는 Aβ (1-42)에 의해 유도된 step-through latency의 감소를 용량의존적으로 [P < 0.05, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42)] 유의하게 억제하였다. 또한, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여는 각 약물의 단독투여에 비하여 유의하게 약리효능이 우수하였다 [P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. Saline + GB + Aβ (1-42)]. 이상의 결과는 UDCA와 은행잎 추출물이 Aβ (1-42)에 의해 유도된 연합학습 능력의 감소에 유의한 약리효능이 있음을 나타내며, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여가 각 약물의 단독투여군에 비하여 유의한 상승효과를 나타냄을 의미한다(그림 5).

4) 해마에 있어서의 아세틸콜린 농도 및 아세틸콜린에스터라제와 콜린 아세틸트랜스퍼라제의 활성의 측정결과

Aβ (1-42)의 투여는 해마 (hippocampus) 조직의 아세틸콜린 농도(P < 0.001)와 아세틸콜린 합성효소인 콜린아세틸트렌스페라제의 활성을 유의하게 감소시킨 반면 (P < 0.01), 아세틸콜린 분해효소인 아세틸콜린에스터라제의 활성은 유의하게 증가시켰으며 (P < 0.01), 이는 해마의 콜린성 신경계 기능이 저하되었음을 의미한다. UDCA (50 mg/kg, P < 0.05), 은행잎 추출물 (P < 0.05)의 단독투여 및 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여 [acetylcholine: P < 0.01, UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. Saline + Saline + Aβ (1-42); P < 0.001, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. Saline + Saline + Aβ (1-42); acetylcholinesterase and choline acetyltransferase: P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. Saline + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. Saline + Saline + Aβ (1-42)]는 Aβ (1-42)에 의한 아세틸콜린 농도의 감소와 콜린 아세틸트랜스페라제 활성의 감소 및 아세틸콜린에스테라제 활성의 증가를 용량의존적으로 [acetylcholine: P < 0.05, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42)] 유의하게 억제하였다. 각 지표에 대하여 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여는 각 약물의 단독투여에 비하여 유의하게 약리효능이 우수하였다. [acetylcholine: P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. Saline + GB + Aβ (1-42); acetylcholiesterase and choline acetylstransferase: P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42)]. 이상의 결과는 UDCA와 은행잎 추출물이 Aβ (1-42)에 의해 유도된 해마의 콜린성 신경계 기능저하에 대하여 유의한 약리효능이 있음을 나타내며, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여가 각 약물의 단독투여군에 비하여 유의한 상승효과를 나타냄을 의미한다 (그림 6).

5) 대뇌피질에 있어서의 아세틸콜린 농도 및 아세틸콜린에스터라제와 콜린 아세틸트랜스퍼라제의 활성의 측정결과

Aβ (1-42)의 투여는 대뇌피질 (cerebral cortex) 조직의 아세틸콜린 농도 (P < 0.001)와 아세틸콜린 합성효소인 콜린 아세틸트랜스페라제의 활성을 유의하게 감소시킨 반면 (P < 0.01), 아세틸콜린 분해효소인 아세틸콜린에스테라제의 활성은 유의하게 증가시켰으며 (P < 0.01), 이는 해마의 콜린성 신경계 기능이 저하되었음을 의미한다. UDCA (50 mg/kg, P < 0.05), 은행잎 추출물 (P < 0.05)의 단독투여 및 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여 [acetylcholine: P < 0.01, UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. Saline + Saline + Aβ (1-42); P < 0.001, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. Saline + Saline + Aβ (1-42); acetylcholinesterase and choline acetyltransferase: P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. Saline + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. Saline + Saline + Aβ (1-42)]는 Aβ (1-42)에 의한 아세틸콜린 농도의 감소와 콜린 아세틸트랜스페라제의 활성 감소 및 아세틸콜린에스테라제의 활성의 증가를 용량의존적으로 [acetylcholine: P < 0.05, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42)] 유의하게 억제하였다. 각 지표에 대하여 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여는 각 약물의 단독투여에 비하여 유의하게 약리효능이 우수하였다 [acetylcholine: P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. Saline + GB + Aβ (1-42); acetylcholiesterase and choline acetylstransferase: P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42); P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB + Aβ (1-42) vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline + Aβ (1-42)]. 이상의 결과는 UDCA와 은행잎 추출물이 Aβ (1-42)에 의해 유도된 해마의 콜린성 신경계 기능저하에 대하여 유의한 약리효능이 있음을 나타내며, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여가 각 약물의 단독투여군에 비하여 유의한 상승효과를 나타냄을 의미한다 (그림 7).

실험예 2_APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 인지기억능 저하, 콜린성 신경계 기능저하 및 아밀로이드 플라크 형성에 대한 UDCA 및 은행잎 추출물의 약리효과

(1) Y-자형 미로 실험

PPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 단기공간기억력 (short-term spatial)을 평가하는 Y-maze test를 수행한 결과, UDCA (50 mg/kg, P < 0.05), 은행잎 추출물 (P < 0.05)의 단독투여 및 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여 (P < 0.01)는 공간교체행동을 용량의존적으로 [P < 0.05, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. UDCA (25 mg/kg) + GB] 유의하게 증가시켰다. 또한, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여는 각 약물의 단독투여에 비하여 유의하게 약리효능이 우수하였다. [P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline; P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. Saline + GB; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. Saline + GB]. 이상의 결과는 UDCA와 은행잎 추출물이 APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 단기공간기억력을 유의하게 개선시키는 약리효능이 있음을 나타내며, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여가 각 약물의 단독투여군에 비하여 유의한 상승효과를 나타냄을 의미한다 (그림 8). 2) Novel object test

APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 시각재인지기억 (visual recognition memory)을 평가하는 객체인식실험을 실시한 결과, UDCA (50 mg/kg, P < 0.05), 은행잎 추출물 (P < 0.05)의 단독투여 및 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여 (P < 0.01)는 신규한 객체에 대한 인식을 용량의존적으로 [P < 0.05, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. UDCA (25 mg/kg) + GB] 유의하게 증가시켰다. 또한, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여는 각 약물의 단독투여에 비하여 유의하게 약리효능이 우수하였다 [P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. Saline + GB]. 이상의 결과는 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여가 APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 시각재인지기억력을 유의하게 항진시키는 약리효능이 있음을 나타내며, 각 약물의 단독투여군에 비하여 유의한 상승효과를 나타냄을 의미한다 (그림 9).

3) 수동회피반응실험법

APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 연합학습능력 (associative learning)을 평가하는 수동회피반응실험을 실시한 결과, UDCA (50 mg/kg, P < 0.05), 은행잎 추출물 (P < 0.05)의 단독투여 및 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여 [P < 0.01, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. Saline + Saline; P < 0.001, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. Saline + Saline]는 step-through latency를 용량의존적으로 [P < 0.05, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. UDCA (25 mg/kg) + GB] 유의하게 증가시켰다. 또한, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여는 각 약물의 단독투여에 비하여 유의하게 약리효능이 우수하였다 [P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. Saline + GB]. 이상의 결과는 UDCA와 은행잎 추출물이 APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 연합학습 능력을 유의하게 항진시키는 약리효능이 있음을 나타내며, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여가 각 약물의 단독투여군에 비하여 유의한 상승효과를 나타냄을 의미한다 (그림 10).

APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 해마의 콜린성 신경계 기능을 평가하기 위해 해마조직의 아세틸콜린 농도와 아세틸콜린의 합성효소인 콜린 아세틸트랜스퍼라제의 활성, 아세틸콜린 분해효소인 아세틸콜린에스터라제의 활성을 평가한 결과, UDCA (50 mg/kg, P < 0.05), 은행잎 추출물 (acetylcholine: P < 0.01; acetylcholinesterase and choline acetyltransferase: P < 0.05)의 단독투여 및 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여 [acetylcholine: P < 0.01, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. Saline + Saline; P < 0.001, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. Saline + Saline; acetylcholinesterase: P < 0.01, UDCA (25 or 50 mg/kg) + GB vs. Saline + Saline]는 아세틸콜린 농도와 콜린 아세틸트랜스퍼라제의 활성을 유의하게 증가시켰으며 (그림 11A와 11C), 아세틸콜린에스터라제의 활성 [P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. Saline + Saline; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. Saline + Saline]은 유의하게 억제했다. (그림 11B). 각 지표에 대하여 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여는 각 약물의 단독투여에 비하여 유의하게 약리효능이 우수하였다 [acetylcholine: P < 0.01, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. Saline + GB; acetylcholiesterase: P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline; P < 0.05, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. Saline + GB; choline acetylstransferase: P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline; P < 0.05, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline]. 이상의 결과는 UDCA와 은행잎 추출물이 APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 해마의 콜린성 신경계의 기능을 유의하게 항진시키는 약리효능이 있음을 나타내며, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여가 각 약물의 단독투여군에 비하여 유의한 상승효과를 나타냄을 의미한다 (그림 11).

5) 대뇌피질에 있어서 아세틸콜린 농도 및 아세틸콜린에스터라제와 콜린 아세틸트랜스퍼라제 활성의 측정결과

APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 대뇌피질의 콜린성 신경계 기능을 평가하기 위해 해마조직의 아세틸콜린 농도와 아세틸콜린 합성효소인 콜린 아세틸트랜스페라제의 활성, 아세틸콜린 분해효소인 아세틸콜린에스터라제의 활성을 평가한 결과, UDCA (50 mg/kg, P < 0.05), 은행잎 추출물 (acetylcholine: P < 0.01; acetylcholinesterase and choline acetyltransferase: P < 0.05)의 단독투여 및 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여 [acetylcholine: P < 0.01, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. Saline + Saline; P < 0.001, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. Saline + Saline; acetylcholinesterase: P < 0.01, UDCA (25 or 50 mg/kg) + GB vs. Saline + Saline]는 아세틸콜린 농도와 콜린 아세틸트랜스페라제의 활성을 유의하게 증가시켰으며 (그림 12A와 12C), 아세틸콜린 에스테라제의 활성 [P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. Saline + Saline; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. Saline + Saline]은 유의하게 억제하였다 (그림 12B). 각 지표에 대하여 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여는 각 약물의 단독투여에 비하여 유의하게 약리효능이 우수했다 [acetylcholine: P < 0.01, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. Saline + GB; acetylcholiesterase: P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline; P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline; P < 0.05, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. Saline + GB; choline acetylstransferase: P < 0.05, UDCA (25 mg/kg) + GB vs. UDCA (25 mg/kg) + Saline; P < 0.05, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline]. 이상의 결과는 UDCA와 은행잎 추출물이 APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서 대뇌피질의 콜린성 신경계의 기능을 유의하게 항진시키는 약리효능이 있음을 나타내며, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여가 각 약물의 단독투여군에 비하여 유의한 상승효과를 나타냄을 의미한다 (그림 12).

6) 해마와 대뇌피질의 아밀로이드 플라크 생성

APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐의 해마와 대뇌피질 조직에서 면역조직화학적 염색법을 이용하여 아밀로이드 플라크의 생성을 평가한 결과, UDCA (P < 0.05), 은행잎 추출물 (P < 0.05)의 단독투여 및 UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여 (P < 0.01)시 아밀로이드 플라크의 생성이 유의하게 억제되었다. 또한, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여는 각 약물의 단독투여에 비하여 유의하게 약리효능이 우수하였다 [P < 0.01, UDCA (50 mg/kg) + GB vs. UDCA (50 mg/kg) + Saline; P < 0.05]. 이상의 결과는 은행잎 추출물이 APPswe/PS1dE9 이중발현 생쥐에서의 아밀로이트 플라크 형성을 유의하게 억제하는 약리효능이 있음을 나타내며, UDCA와 은행잎 추출물의 병용투여가 각 약물의 단독투여군에 비하여 유의한 상승효과를 나타냄을 의미한다 (그림 13).

본 발명의 우루소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여, 서방성 및 속방성 정제, 연질캅셀제, 경질캅셀제, 환제, 과립제 또는 산제, 주사제, 액제 등의 형태로 알츠하이머병 및 치매와 같은 알츠하이머병과 관련된 동반 질환 병적 상태의 치료 및 예방용 약제학적 제제를 제조할 수 있다. 또한, 바람직하게는 본 발명의 약제학적 조성물에는 우루소데옥시콜린산이 25mg 내지 300mg 및 은행잎 추출물이 40mg 내지 120mg으로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 우루소데옥시콜린산이 100mg 내지 200mg, 은행잎 추출물이 60mg 내지 120mg으로 포함될 수 있다.

Claims

우루소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물을 25:30의 중량비로 포함하며, 아밀로이드 플라크의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
우루소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물을 50:30의 중량비로 포함하며, 아밀로이드 플라크의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 알츠하이머병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
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