KR101917128B1

KR101917128B1 - 산양삼 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101917128B1
Application number: KR1020170055100A
Authority: KR
Inventors: 김형춘; 고성권; 신은주; 이상일
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 이상일
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2018-11-09
Also published as: KR20180121001A; WO2018199654A1; US11207363B2; EP3616704A4; US20210113639A1; EP3616704A1

Abstract

본 발명은 산양삼 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 알츠하이머병의 증상 완화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 산양삼 추출물을 포함하는 조성물은 알츠하이머병 치료를 위한 의료 분야에서 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 알츠하이머병의 증상 완화용 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

산양삼 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating Alzheimer's disease comprising mountain-cultivated ginseng extract}

본 발명은 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 산양삼 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

산양삼은 약리작용이 탁월한 유기 게르마늄과 사포닌 함량이 풍부해 아동과 노약자를 비롯하여 연령에 관계없이 건강 증진의 효과가 있다. 산양삼은 인공시설이 없는 산지에서 생산되는 삼을 말하며, 7년 이상 같은 자리에서 자연 상태로 재배되기 때문에 생육 속도가 느리다. 산양삼의 재배지로서는 여름 기온이 20 ~ 25℃인 서늘한 산지, 80 ~ 90% 가 20년 이상된 나무로 우거진 음지, 유기질이 풍부하고 배수가 좋은 약산성 사질양토 및 동향, 북향 또는 서북향 산능선이 아닌 곳을 확보해야 하므로 생육 조건도 까다롭다.

인삼은 사람이 만든 밭에서 비가림 시설을 설치하여 인위적으로 관리하며 재배기간에 따라서 4, 5 및 6년근으로 구분한다. 수량을 증대시키기 위해서 적당한 비료와 퇴비, 농약 등을 사용하여 굵기가 크다. 반면에, 산양삼은 산 속에 재배장소를 두고 7년에서 10년 가량 재배할 수 있다. 11년 이상 자란 것은 야생삼 또는 산삼으로 구분된다. 삼은 생육 연수에 따라서 인삼 사포닌의 종류와 생체조직 구성성분이 달라지므로, 유용한 성분이 증가하게 된다. 그러나 인삼은 토양능력의 제한으로 밭에서 7년 이상 재배할 수 없으므로 가장 명확한 구분 기준은 생육연수인 것으로 알려져 있다.

산양삼은 깊은 산 속 박달나무, 옻나무 등 그늘지고 습기가 많은 곳에서 자라고, 특히, 절반 정도 그늘지고 외진 곳에서만 자라며 산삼의 종자를 산속에 심어서 가꾼 뒤에 6 ~ 30 년 만에 거둔 것을 말한다. 인삼의 경우 대부분 머리 부분(노두)이 3 ~ 7개 정도인데 반해 산양삼은 연령에 따라 그 이상도 많고, 몸통에는 가락지 모양의 태가 둘러져 있지만 인삼에서는 찾아볼 수 없다. 인삼의 뿌리는 굵고 짧지만 산양삼은 가늘고 길어서 1 m가 넘는 것도 있으며, 산양삼의 수명은 토양과 기후 조건에 따라 50년 ~ 수백년 이상이지만 인삼은 최대 20년 안팎이며, 또한 산양삼은 인삼에 비해 향기가 강한 것이 특징이다. 인삼의 효능은 간 기능 활성화, 혈당 강하 작용, 당뇨병 완화, 암세포 성장억제, 혈압 강하, 동맥경화 예방, 체내 면역기능 활성화, 빈혈예방, 체내 신진대사 촉진, 중추 신경에 대한 자극 효과로 학습능력과 기억력 촉진, 50 mg/kg와 피로 해소 효과 등으로 매우 다양한 효과를 가지고 있다고 한다.

산양삼과 재배삼의 인삼사포닌 비교연구에 있어서, 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)과 파낙사트리올(protopanaxtriol)의 비율에 있어서 산양삼은 3.25로, 재배산 4년근 2.45 및 6년근 2.18에 비하여 높게 나타났으며, 특히 진세노사이드(ginsenoside) Rb1과 Rg1의 비율에 있어서 산양삼은 10.22로, 재배삼 4년근 3.51 및 6년근 4.86에 비하여 높게 나타난 것으로 보고된 바 있다. 이외에 Rd 및 Re에서도 그 함량이 재배삼보다 산양삼에서 높은 수치를 나타낸 것으로 보고되었다(Analysis of Ginsenoside Composition of Woods Grown Ginseng Roots, Sung Tai Han, Cha Gyun Shin, Byung Wook Yang, Young Tae Hahm, Uy Dong Sohn, Byung Ok Im, Soon Hyun Cho, Boo Yong Lee and Sung Kwon Ko, Food Science & Biotechnology, 16(2), 281-284, 2007).

알츠하이머병은 해마 및 피질부위에 아밀로이드 플라크(amyloid plaque) 및 신경섬유의 꼬임(neurofibrillay tangle)을 가지는 것을 조직학적 특징으로 하는 질환으로(Neuron, 6, 487-498), 알츠하이머병의 병인론에서 가장 중요한 과정은 비수용성의 베타-아밀로이드(β-amyloid, Aβ) 펩타이드의 축적과정이다. 비수용성의 베타아밀로이드 펩타이드에는 Aβ(1-40)와 Aβ(1-42)가 가장 많은데, Aβ(1-42)가 Aβ(1-40)에 비하여 아밀로이드 플라크로 응집되기 쉽기 때문에 더욱 독성이 높은 것으로 증명되었다(Acta Biolchm. Pol., 52, 417-423). 이 외에도, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 프레세닐린(PS)-1, PS-2, 아포리포프로틴등의 유전자의 차이 및 산화적인 독성이 알츠하이머병의 병인론에 관여한다고 알려져 있는데(BBA, 2007, 285-297), 이는 각종 유전자 조작 동물, 예를 들면 APP 발현 마우스를 이용하거나 독성의 Aβ 펩티드를 중추 투여하여 알츠하이머병의 동물모델을 확립함으로써 확인된다.

비수용성의 Aβ의 축적에 따른 산화적인 손상은 알츠하이머병의 주요한 병인론 중의 하나로 알려져 있으며, 알츠하이머병 환자의 뇌조직에서 산화적인 손상지표의 증가(Neurochem. Res. 33, 450-458; Neurotox. Rex. 2, 167-168) 및 내인성 항산화계의 이상(Neurotox. Rex. 2, 167-168)이 보고되었고, 이러한 현상은 알츠하이머병의 동물모델(Behav. Brain Res., 155, 185-196; J. Neurosci., 27, 5394-5404)에서도 보고되었다. 더불어, 이에 따른 해마 및 피질부위의 콜린성 계(cholinergic system)의 손상 및 기능저하가 알츠하이머병의 특징적 증상인 인지기억능 저하에 기여한다(Neurology 51, S18-S29; Curr. Alzheimer Res. 1, 241-248).

한편, 알츠하이머병의 예방 또는 치료를 위한 종래 기술로서는, 한국공개특허공보 제10-2005-0101537호에 알츠하이어병을 비롯한 아밀로이드β 관련질환의 치료를 위해서 3-아미노-1-프로판술폰산과 신경보호제 또는 신경영양제와의 병용투여가 개시되어 있으며, 한국공개특허공보 제10-2012-48105호에는 우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물을 배합함으로써 상승적인 알츠하이머병의 치료효과를 갖는 약제학적 조성물이 개시되어 있다. 이 외에도 알츠하이머병 치료용 조성물 또는 의약용도에 관한 다양한 발명이 행해져 왔으나, 여전히 알츠하이머병 치료에 유용한 다양한 약물의 개발이 요구되고 있다.

한국공개특허 제10-2009-0118465호 (2009.11.18.) 한국공개특허 제10-2012-0001977호 (2012.01.05.) 한국공개특허 제10-2012-0022293호 (2012.03.12.) 한국공개특허 제10-2011-0066400호 (2011.06.17.)

본 발명자들은 항알츠하이머 효능을 나타내는 생약 추출물에 대하여 연구하던 중, 산양삼 추출물이 알츠하이머병 모델 동물에서 항알츠하이머 효능이 우수하다는 점을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 산양삼 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따라, 산양삼 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 추출물은 에탄올 추출물 및 물 추출물의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올 추출물 및 물 추출물이 1:1 비율(부피비)의 에탄올 및 물로 추출된 것의 혼합물일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 알츠하이머병은 Iba-1-IR 양성 반응 또는 아밀로이드 플라크의 생성을 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 산양삼 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 증상 완화용 식품 조성물이 제공된다.

본 발명에 의해, 산양삼 추출물은 수삼 추출물보다 진세노사이드 함량이 높은 것으로 나타났으며, 수삼 추출물에 비하여 알츠하이머병 모델 동물에서 공간 작동 기억력 증가, 시각 재인지 기억력 증가, 연합학습능력 증가, 해마의 콜린성 신경계 기능 향상, 미세아교세포(Microglia)의 Iba-1-IR 양성 반응 억제 및 아밀로이드 플라크의 생성 억제 효과가 우수한 것으로 나타나, 수삼 추출물에 비하여 항알츠하이머 효능이 우수하다는 것이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 산양삼 추출물을 포함하는 조성물은 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 알츠하이머병의 증상 완화용 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 알츠하이머병 모델 동물에서 산양삼 추출물 처리 및 실험 과정을 나타낸 개략도이다[산양삼 추출물을 처리한 군(n=8), 수삼 추출물을 처리한 군(n=8) 및 대조군(No treatment, n=6)].
도 2는 알츠하이머병 모델 동물의 Y-미로 실험에서 대조군, 산양삼 추출물 처리군 및 수삼 추출물 처리군의 평가 결과를 나타낸 그래프이다[*: p < 0.05, **: p < 0.01 vs. 대조군; #: p < 0.05 vs. 수삼 추출물 처리군].
도 3은 알츠하이머병 모델 동물의 신물체 인식실험에서 대조군, 산양삼 추출물 처리군 및 수삼 추출물 처리군의 평가 결과를 나타낸 그래프이다[*: p < 0.05, **: p < 0.01 vs. 대조군; #: p < 0.05 vs. 수삼 추출물 처리군].
도 4는 알츠하이머병 모델 동물의 수동회피시험에서 대조군, 산양삼 추출물 처리군 및 수삼 추출물 처리군의 평가 결과를 나타낸 그래프이다[*: p < 0.05, **: p < 0.01 vs. 대조군; #: p < 0.05 vs. 수삼 추출물 처리군].
도 5는 대조군, 산양삼 추출물 처리군 및 수삼 추출물 처리군의 해마(hippocampus) 및 대뇌피질(Cortex)에서의 콜린 아세틸트랜스퍼라제 활성(ChAT activity)의 측정 결과를 나타낸 그래프이다[*: p < 0.05, **: p < 0.01 vs. 대조군; #: p < 0.05 vs. 수삼 추출물 처리군].
도 6은 대조군, 산양삼 추출물 처리군 및 수삼 추출물 처리군의 해마 및 피질에서의 아세틸콜린 수준(Ach level)의 측정 결과를 나타낸 그래프이다[*: p < 0.05, **: p < 0.01 vs. 대조군; #: p < 0.05 vs. 수삼 추출물 처리군].
도 7은 대조군, 산양삼 추출물 처리군 및 수삼 추출물 처리군의 해마 및 피질에서의 아세틸콜린 분해효소 활성(AchE activity)의 측정 결과를 나타낸 그래프이다[*: p < 0.05, **: p < 0.01 vs. 대조군; #: p < 0.05 vs. 수삼 추출물 처리군].
도 8은 APPswe/PS1dE9 이중발현 마우스의 해마와 대뇌피질 조직에서 미세아교세포(Microglia)의 Iba-1-IR 양성 반응에 미치는 산양삼 추출물 및 수삼 추출물의 약리 효과를 나타내는 (A) 사진 및 (B) 그래프이다[*: p < 0.01 vs. 대조군; #: p < 0.05 vs. 수삼 추출물 처리군].
도 9는 APPswe/PS1dE9 이중발현 마우스의 해마와 대뇌피질 조직에서 아밀로이드 플라크의 생성에 미치는 산양삼 추출물 및 수삼 추출물의 약리 효과를 나타내는 (A) 사진 및 (B) 그래프이다[*: p < 0.01 vs. 대조군; #: p < 0.05 vs. 수삼 추출물 처리군].

본 발명은 산양삼 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 추출물은 에탄올 추출물 및 물 추출물의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올 추출물 및 물 추출물이 1:1 비율(부피비)의 에탄올 및 물로 추출된 것의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 함유되는 추출물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 추출물은 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 1000 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구, 복강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 산양삼 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 증상 완화용 식품 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 알츠하이머병는 Iba-1-IR 양성 반응 또는 아밀로이드 플라크의 생성을 나타내는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 산양삼의 추출 및 성분 분석

(1) 산양삼 추출 방법

에탄올 20 L에 산양삼 1.5 ㎏을 넣고, 초음파 처리기(KODO, Hwaseong, Korea, 출력 1,200 W, 주파수 28 KHz)로 65℃에서 48시간 추출한 후, 여과하였다. 잔사에 증류수 20 L를 가하고, 100 ℃에서 10시간 추출하여 여과한 여액을 상기에서 얻은 여액과 합하여 감압농축해서 산양삼 추출물(엑스)을 얻었다.

상기와 동일한 조건으로 음성에서 수확한 수삼(6년근)의 추출물을 제조하였다.

(2) 조사포닌의 조제

위에서 얻은 산양삼 엑스에 디에틸에테르 50 ㎖를 넣고, 실온에서 1시간 동안 초음파 추출을 반복하여 3회 실시한 후, 원심분리하여 상등액을 제거하고, 잔사에 수포화 부탄올 50 ㎖를 넣고, 실온에서 2시간씩 초음파 추출을 반복하여 3회 실시하였다. 원심분리하여 얻은 부탄올 층을 모아 감압 농축하여 조사포닌을 얻었다.

(3) HPLC 분석

위에서 얻은 엑스를 상법에 따라 표품과 직접 비교하여 인삼사포닌의 함량 및 조성을 각 시료당 3회 반복 실험하여 결과의 재현성을 확인하여 분석하였다. 표품은 크로마덱스(Chromadex, U.S.A.)와 암보(Ambo) 연구소(한국)로부터 구입한 순도 99% 이상의 진세노사이드(ginsenoside)를 사용하였다. HPLC 장치(Waters 1525 binary HPLC system, Waters, 미국), 컬럼(Eurospher 100-5 C18, 250*3mm)을 사용하여 분석하였다. 이동상은 아세토니트릴(acetonitrile, HPLC급, Sigma, 미국)과 HPLC용 증류수를 혼합하여 사용하였으며, 아세토니트릴의 비율을 17 %(0 min)에서 25 %(20 min), 42 %(38 min), 100%(42 min) 그리고 100 %(52 min)로 순차적으로 늘려주고 마지막으로 다시 17%로 조절하였다. 전개 온도는 실온, 유속은 분당 0.8 ml, 크로마토그램은 검출기(uv/vis Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector, Waters, U.S.A.)를 이용하여 203 nm에서 검출하였다.

(4) 산양삼 추출물 및 수삼 추출물의 진세노사이드 조성 비교

산양삼 추출물 및 수삼 추출물의 진세노사이드 조성을 분석한 결과를 하기 표 1에 나타냈으며, 산양삼 추출물이 수삼 추출물보다 진세노사이드 함량이 높은 것으로 측정되었다.

진세노사이드	산양삼	수삼
Rb1	0.990±0.019	0.889±0.018
Rb2	0.253±0.002	0.255±0.002
Rc	0.412±0.006	0.295±0.001
Rd	0.205±0.004	0.067±0.000
Re	0.376±0.009	0.244±0.004
Rf	0.064±0.002	0.040±0.000
Rg1	0.338±0.013	0.294±0.003
합계	2.639	2.085

2. 동물 준비 및 추출물 처리

(1) 동물의 준비

모든 동물은 실험용 동물에 대한 복지 및 이용을 위한 NIH 가이드(NIH Publication No. 85-23, 1985; www.dels.nas.edu/ila)를 준수하여 처리하였다. 본 발명은 실험용 동물에 대한 복지 및 이용을 위한 ILAR(Institute for Laboratory Animal Research) 가이드라인에 따라 수행되었다.

알츠하이머병 모델 동물로서 6월령의 APP/PS1(amyloid precursor protein / presenilin-1, APPswe/PS1dE9) 이중 발현(double transgenic) 마우스(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, MA, USA)를 사용하였으며, 12:12 h 명:암 사이클을 유지하며 자유식(ad libitum)시켰다.

(2) 추출물 처리

실험 동물에 산양삼 추출물을 처리한 과정을 도 1에 나타내었다. 각각의 추출물(산양삼 추출물 또는 수삼 추출물, 50 mg/kg, p.o.)을 실험 동물에 90일 동안 투여하였고, 60일 ∼ 63일 및 90일 ∼ 93일에 행동 평가(Y-미로 실험, 신물체인식실험, 수동회피시험)을 수행하였다.

행동 평가가 이루어지는 기간에는 각 추출물이 행동에 직접적인 영향을 미치는 것을 막기 위하여, 행동 평가가 끝난 후 추출물을 투여하였다. 행동 평가가 끝나고 1일 후 동물을 희생시켜 해마 및 피질조직을 취했다.

실험은 산양삼 추출물을 처리한 군(n=8), 수삼 추출물을 처리한 군(n=8) 및 대조군(No treatment, n=6)의 3개 군으로 분류하여 진행하였고, 각 군은 n=6이었다.

3. 항알츠하이머 효능 평가

(1) Y-미로 실험(Y-maze)

Y-자형 미로 실험은 선행문헌[J. Alzheimers Dis.(31, 207-223)]에 기재된 바에 따라 수행하였다. Y-maze의 구성은 Y-자 형태의 arm으로 되어 있고 길이 25cm 와 높이 14cm, 넓이 5 cm 의 검은 플라스틱 상자로 되어 있다. 마우스를 한쪽 팔의 끝에 놓고 8분 동안 암 사이를 자유롭게 왕래하도록 한다. 마우스가 각각의 암에 들어가는 횟수를 비디오 카메라로 찍는다. 공간 교체행동(Alternation behavior)의 평가 지표는 3개의 암을 모두 들어가는 경우에 1점을 획득하는 것으로 하여 대조군과 비교했다. 마우스의 교체 스코어는 실제 마우스가 획득한 스코어를 가능한 교체 스코어로 나누어 100% 로 환산한다.

(2) 신물체 인식실험(Novel Object Recognition)

신물체 인식실험은 선행문헌[Learn. Mem.(14, 117-125)]에 기재된 바에 따라 수행하였다. 첫 날에는 마우스를 40 cm X 40 cm X 30 cm 의 상자에 넣고 10 분간 자유롭게 이동하도록 하여 적응시킨다. 2일째에는 상자에 두 개의 물체를 놓고 각각의 물체에 대한 반응시간을 기록한다. 이로부터 24시간 후 두 개중 한 개의 물체를 새로운 물체(novel object)로 바꾼 후 이에 대한 반응시간을 기록한다.

(3) 수동회피시험(Passive Avoidance test)

수동회피시험은 선행문헌[Behav. Brain Res.(155, 185-196)]에 기재된 바에 따라 Gemini Avoidance System(San Diego Instrument, San Diego, CA)를 이용하여 수행하였다. 상기 시스템은 바닥에 쇼크발생기가 장치되어진 2개의 공간으로 이루어져 있으며 두 공간의 사이에는 기요틴 도어(guillotine door)가 있다. 학습단계(Acquisition trial)에서는 마우스를 한 공간(start chamber)에 넣은 후 20초간 적응시키고, 20초 후 마우스가 넣어진 공간에 불이 켜지면서 가운데의 기요틴 도어(guillotine door)가 열리게 된다. 마우스가 불이 켜지지 않은 반대편 공간으로 들어가는 즉시 기요틴 도어(guillotine door)가 닫히면서 전기 쇼크(0.3 mA, 3s, 1회)가 주어지게 된다. 24시간 후 보류 시험(retention trial)에서는 마우스를 시작 챔버(start chamber)에 다시 넣고 불을 켠 후, 반대쪽 공간으로 가는 시간(step-through latency)를 기록한다(최고 300초).

(4) 콜린 아세틸트랜스퍼라제 활성( ChAT activity), 아세틸콜린 수준( Ach level) 및 아세틸콜린 분해효소 활성( AchE activity) 측정

마우스는 수동 회피시험이 끝난 24시간 뒤, 해마 및 피질 부위를 절취하여 초음파 조직분쇄기(Bronson Sonic, NY)로 분쇄한 후 10,000 g, 4 ℃ 에서 20분간 원심분리 후 상층액을 취하여 아세틸콜린(acetylcholine) 농도, 아세틸콜린 분해효소(acetyl cholinesterase), 콜린 아세틸트랜스퍼라제(choline acetyltransferase)의 활성을 측정하였다.

해마와 피질 조직의 ACh 수치 및 AChE의 활성은 키트(Amplex® Red Acetylcholine/ Acetylcholinesterase Assay Kit, Molecular Probes, Inc., Eugene, KOR)를 이용하여 제작회사의 프로토콜에 따라 측정하였다.

ChAT의 활성은 Mehta 등의 방법[Mehta H, Haobam R, Usha R, Mohanakumar KP. Evidence for the involvement of central serotonergic mechanism in cholinergic tremor induced by tacrine in Balb/c mice. Behav. Brain Res. 2005; 163: 227-236]에 따라 측정하였다. 즉, 0.5M 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer, pH 7.2), 아세틸-CoA(acetyl-CoA, 6.2mM), 콜린 클로라이드(choline chloride, 1M), 네오스티그민 설페이트(neostigmine sulfate, 0.76mM), NaCl(3M), EDTA(1.1mM)의 용액을 각각 25 μl씩 취한 후 증류수를 이용하여 부피를 400 μl로 맞추었다. 이 용액을 37 ℃에서 5분간 미리 인큐베이션(preincubation)한 후, 시료 100 μl을 넣어 37 ℃에서 20분간 인큐베이션(incubation)하였다.

검체를 2분간 끓여서 반응을 종결시킨 후, 1 ml의 증류수를 넣고, 원심분리하여 변성된 단백질(denatured protein)을 제거한 후 1 ml의 상등액을 디티오피리딘(4,4′-dithiopyridine, 10mM)이 30 μl 들어 있는 시험관에 넣고, 15분 후 324 nm에서 흡광도를 측정하였다.

ChAT의 활성은 조효소(coenzyme) nmol/hr·g protein으로 표기하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 에세이 시약(protein assay reagent, Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 제작회사의 프로토콜에 따라 측정하였다.

(5) 미세아교세포( Microglia )의 면역세포학

면역세포학은 선행문헌(Shin et al., 2014, Mol. Neurobiol. 50, 60-75)에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 마우스를 50 mL의 얼음-냉각 PBS(10 mL/10 g 체중)에 이어 4% 파라포름알데히드(20 mL/10 g 체중)로 경피적으로 관류시켰다. 뇌를 제거하여 4% 파라포름알데히드에서 밤새 저장하였다. 뇌를 35 mm 두께의 관상단면(coronal section)으로 절단하였다. 뇌 절편을 0.3% 과산화수소 함유 PBS로 30 분간 블로킹한 다음 0.4% 트리톤 X-100(Triton X-100) 및 1% 정상혈청 함유 PBS에서 20 분간 배양하였다.

(6) 베타-아밀로이드(Beta- amyloid )

APPswe/PS1dE9 이중발현 마우스의 해마와 피질조직에서 아밀로이드 플라크의 생성을 면역조직화학적 염색법을 이용하여 평가하였다. 관류시켜 4% p-포름알데히드로 고정된 뇌조직을 40 μm씩으로 절단 후 Aβ(1-42) 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 1일 밤 배양시키기 전에 절편(section)을 0.2% Triton X-100에 15분간 노출시키고 4% normal goat serum에 배양시켰다. 1일 밤이 지난 후 2차 항체에 1시간 배양시키고 3,3-디아미노벤지딘을 크로모겐으로 하여 면역 염색했다. 각 단계마다 PBS(pH 7.4)로 세척하였다.

4. 결과

(1) Y-자형 미로실험(Y-maze test)

마우스에서 산양삼 추출물의 투여는 수삼 추출물에 비하여 공간교체행동을 유의하게 증가시켰다(50 mg/kg, P < 0.05)(도 2). 이러한 증가 경향은, 수삼 추출물에 있어서 추출물 투여 기간이 증가함에 따라 공간교체행동의 증가 현상이 감소되는 반면에, 산양삼 추출물에 있어서는 투여 기간이 증가함에 따라 증가하였다. 상기 결과는 산양삼 추출물이 수삼 추출물에 비하여 공간 작동 기억력 증가 효능이 우수함을 의미한다.

(2) 신물체 인식실험

마우스에서 산양삼 추출물의 투여는 수삼 추출물에 비하여 새로운 물체 인식 실험에서 새로운 물체에 대한 탐색행위를 유의하게 증가시켰으며(P < 0.05), 이는 시각 재인지 기억력(visual recognition memory)의 증가를 의미한다(도 3). 이러한 증가 경향은, 수삼 추출물에 있어서 추출물 투여 기간이 증가함에 따라 새로운 물체에 대한 탐색행위의 증가 현상이 감소되는 반면에, 산양삼 추출물에 있어서는 투여 기간이 증가함에 따라 증가하였다. 상기 결과는 산양삼 추출물이 수삼 추출물에 비하여 시각 재인지 기억력 증가에 유의한 약리 효능이 있음을 나타낸다.

(3) 수동회피시험

마우스에서 산양삼 추출물의 투여는 수삼 추출물에 비하여 수동회피반응실험에서 검은 방으로 가는 step-through latency를 유의하게 증가시켰으며(P < 0.05), 이는 연합학습능력(associative learning)의 증가를 의미한다(도 4). 이러한 증가 경향은, 수삼 추출물에 있어서 추출물 투여 기간이 증가함에 따라 step-through latency의 증가 현상이 유지되는 반면에, 산양삼 추출물에 있어서는 투여 기간이 증가함에 따라 증가하였다. 상기 결과는 산양삼 추출물이 수삼 추출물에 비하여 연합학습능력 증가에 유의한 약리 효능이 있음을 나타낸다.

(4) 콜린 아세틸트랜스퍼라제 활성, 아세틸콜린 수준 및 아세틸콜린 분해효소 활성 측정

마우스에서 산양삼 추출물의 투여는 수삼 추출물에 비하여 해마(hippocampus) 조직의 아세틸콜린 농도(P < 0.05)와 아세틸콜린 합성효소인 콜린아세틸트렌스페라제의 활성을 유의하게 증가시켰고(P < 0.05), 아세틸콜린 분해효소인 아세틸콜린에스터라제의 활성은 유의하게 감소시켰으며(P < 0.05), 이는 해마의 콜린성 신경계 기능이 증가되었음을 의미한다(도 5 내지 도 7). 상기 결과는 산양삼 추출물이 수삼 추출물에 비하여 해마의 콜린성 신경계 기능 향상에 유의한 약리 효능이 있음을 나타낸다.

(5) 미세아교세포의 면역조직화학

APPswe/PS1dE9 이중발현 마우스의 해마와 대뇌피질 조직에서 면역조직화학적 염색법을 이용하여 미세아교세포(Microglia)의 Iba-1-IR 양성 반응을 측정한 결과, 산양삼 추출물의 투여는 수삼 추출물에 비하여 유의하게 Iba-1-IR 양성 반응을 억제하는 것으로 나타났다(도 8).

(6) 베타-아밀로이드

APPswe/PS1dE9 이중발현 마우스의 해마와 대뇌피질 조직에서 면역조직화학적 염색법을 이용하여 아밀로이드 플라크의 생성을 측정한 결과, 산양삼 추출물의 투여는 수삼 추출물에 비하여 유의하게 아밀로이드 플라크의 생성을 억제하는 것으로 나타났다(도 9).

Claims

산양삼:에탄올 = 3:40(kg:L) 비율로 초음파 처리하면서 65℃에서 48시간 추출하고 여과한 후 얻어진 여과액과, 상기 여과 후 얻어진 잔사에 산양삼:증류수 = 3:40(kg:L) 비율로 100 ℃에서 10시간 추출하고 여과한 후 얻어진 여과액을 합하여 얻어진 산양삼 혼합 용매 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 알츠하이머병이 Iba-1-IR 양성 반응 또는 아밀로이드 플라크의 생성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
산양삼:에탄올 = 3:40(kg:L) 비율로 초음파 처리하면서 65℃에서 48시간 추출하고 여과한 후 얻어진 여과액과, 상기 여과 후 얻어진 잔사에 산양삼:증류수 = 3:40(kg:L) 비율로 100 ℃에서 10시간 추출하고 여과한 후 얻어진 여과액을 합하여 얻어진 산양삼 혼합 용매 추출물을 포함하는 알츠하이머병의 증상 완화용 식품 조성물.
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제5항에 있어서, 상기 알츠하이머병이 Iba-1-IR 양성 반응 또는 아밀로이드 플라크의 생성을 나타내는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.