CN113181226A - 一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物及制备方法及分离检测方法及组合物及应用 - Google Patents

一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物及制备方法及分离检测方法及组合物及应用 Download PDF

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Abstract

一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物及制备方法及分离检测方法及组合物及应用，它属于中药有效成分提取领域。本发明要解决的技术问题为刺嫩芽提取物的制备及其应用。本发明包括楤木叶皂苷F、楤木叶皂苷G。本发明制品为纯天然配方，可应用于护肝与预防肝癌的产品。所述刺嫩芽主要含有三萜皂苷类成分，经药理试验证实，本发明提供的刺嫩芽提取物具有优异的保肝活性和确切的抑制肿瘤细胞增殖的活性，该提取物可作为原料药制成各种剂型的药物应用，添加药学上可接受的辅料后可制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂等口服型制剂，也可添加到饼干、露酒和饮料等食品中起到保健的作用。

Description

一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物及制备方法及分离检测 方法及组合物及应用
技术领域
本发明属于中药有效成分提取领域，具体涉及一种保肝及预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法及分离检测方法及组合物及应用。
背景技术
二十世纪以来，肿瘤、心脑血管等非传染性疾病成为人类健康的主要敌人，其中尤以肿瘤危害为甚。世界卫生组织认为至少三分之一的癌症病例可以得到预防。预防为癌症控制提供了最具成本效益的长期战略。因此，对于肿瘤的疾病预防尤为重要，且刻不容缓。肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，尽管我国肝癌的人口标准化发病率近年来逐步下降，但发病率仍相对较高。面对我国肝癌的发病情况，加强肝癌的预防，对降低肝癌发病率及提高患者生活质量有重要意义。
目前研究的预防癌症的化学药物多具有较为严重的毒副作用。与之相比，中草药具有药食同源的优势，更以其低毒、无残留等独特优势，被广泛地应用于临床，用来预防和治疗多种肿瘤疾病。选择天然、毒副作用小、使用安全的中草药作为癌症预防剂，已显示了极具吸引力的应用前景，将为研究预防日趋严重的肝癌疾病提供新途径和新方法。
刺嫩芽是五加科楤木属植物辽东楤木的嫩芽，刺嫩芽的别名还可以是辽东楤木(Liao Dong Cong Mu)、刺龙孢(Ci Long Bao)、刺老芽(Ci Lao Ya)、龙芽楤木(Long YaCong Mu)、刺嫩芽(Ci Nen Ya)，为优良的绿色食品，其味稍苦，具有开胃、爽口、清火、安神降压、壮肾利尿、解热驱虫之功效，属于山珍之一，在我国东北地区己大片种植成功。
发明内容
本发明目的是提供了一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物及制备方法及分离检测方法及组合物及应用。
本发明通过以下技术方案实现：
一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，由刺嫩芽(辽东楤木嫩叶)单独提取制得。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物包括楤木叶皂苷F、楤木叶皂苷G。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物包括齐墩果酸-3-O-α-L-阿拉伯糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、奥丝瓜苷A、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、楤木皂苷A、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖]-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷、常春藤皂苷元-3-O-β-吡喃葡萄糖苷、常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、刺囊酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、楤木芽皂苷C、刺囊酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、楤木芽皂苷A。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、按照料液比为1：6～9g/mL将刺嫩芽用乙醇溶液浸泡1～3h，然后加热回流2～3次，每次2～3h，合并滤液，减压回收乙醇，得到乙醇提取物；
步骤2、将步骤1得到的乙醇提取物用纯净水溶解后，经AB-8大孔树脂吸附，依次用水、30wt％乙醇、70wt％乙醇、90wt％乙醇洗脱，收集70wt％乙醇洗脱液，浓缩、干燥，得到保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法，步骤1中乙醇溶液的浓度为65～75wt％；步骤2中乙醇提取物和纯净水的料液比为1：6～9g/mL，AB-8大孔树脂柱的柱径：柱高比为1：3，上样流速为每小时1.0至1.5倍柱体积，上样结束后依次用到6～8倍柱体积的水、5～7倍柱体积的30wt％浓度的乙醇、6～9倍柱体积的70wt％浓度的乙醇、4～7倍柱体积的90wt％浓度的乙醇进行洗脱，洗脱流速控制在每小时0.5～0.8倍柱体积。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的分离检测方法，将所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物用纯净水溶解，再经硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、制备型HPLC分离技术分离得到单体，然后用13C-NMR、1H-NMR、MS中的一种或几种波谱技术鉴定化合物的结构。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的分离检测方法，所述的刺嫩芽提取物总皂苷的含量采用可见分光光度法法进行测定，对照品为齐墩果酸、楤木皂苷Ⅴ，所述的刺嫩芽提取物总皂苷的含量大于30％。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的分离检测方法，刺嫩芽提取物的含量采用HPLC-ELSD法进行测定，其对照品为常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、楤木皂苷A、奥丝瓜苷A、楤木芽皂苷C、楤木芽皂苷A、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖]-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷，色谱柱为迪马钻石C18(2)，柱温为30℃，以乙腈溶液为流动相，梯度洗脱，检测器为蒸发光散射检测器，载气流速为3.2L/min，漂移管温度为100℃。进样量为10μL，流速为1.0mL/min。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的应用，用于预防肝癌的药物，所述的用于预防肝癌的药物为口服制剂。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的应用，用于对化学性肝损伤有辅助保护作用的药物，所述的对化学性肝损伤有辅助保护作用的药物为口服制剂。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的组合物，所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的组合物包括颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液、酒剂、露酒。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，根据植物来源可命名为辽东楤木提取物(Liao Dong Cong Mu Ti Qu Wu)、刺龙孢提取物(Ci Long Bao Ti Qu Wu)、刺老芽提取物(Ci Lao Ya Ti Qu Wu)、龙芽楤木提取物(Long Ya Cong Mu Ti Qu Wu)、刺嫩芽提取物(Ci Nen Ya Ti Qu Wu)。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，可加入制备不同剂型时所需的各种药学上可接受的辅料后，以常规的中药制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂，例如颗粒剂、片剂、口服液、胶囊剂等口服制剂。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，楤木叶皂苷F的结构式如下：
Figure BDA0003066733160000031
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，楤木叶皂苷G的结构式如下：
Figure BDA0003066733160000032
本发明的有益效果：
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，刺嫩芽为五加科楤木属植物辽东楤木的嫩芽，是东北著名的山野菜，被誉为“天下第一山珍”，味道鲜美，且具有药食两用的特征。其味甘，性凉，归肝经，具有益气补肾，清热除湿，镇静安神，活血止痛等功效。所用刺嫩芽中含有多种营养物质和活性成分，如人体所需的多种氨基酸、微量元素、维生素、黄酮类、三萜皂苷类以及多糖类成分，使其具有保肝护肝、防癌抗癌、抗炎、降血脂、降血糖、抗氧化等现代药理作用，是一种药食两用的保健佳品。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，在保肝、肝癌预防基础上，选用纯中药，按照中医药基础理论组方，经严格筛选，结合现代先进工艺制法组合而成。该组合药物可达到治疗的药效，具有疗效显著、安全毒副作用小，费用低，操作简便等特点。
本发明所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，经药理学实验证明，用刺嫩芽提取物治疗二乙基亚硝胺诱导的肝癌小鼠，在给药16周后，阳性对照组小鼠有明显的肝癌抑制作用，与模型组有显著性差异，刺嫩芽提取物高、中、低剂量组在一定程度上有抑制效果，其中高剂量组有明显的抑制效果。
附图说明
图1为具体实施方式四一种刺嫩芽提取物的分离检测方法的高效液相色谱-蒸发光散射检测图谱；
图2为本发明所用的对照例的7种三萜皂苷的高效液相色谱-蒸发光散射检测图谱；
图3为具体实施方式二方法制备的一种刺嫩芽提取物及其对比例的小鼠动物实验肝的形态与变化图片；
图4为具体实施方式二方法制备的一种刺嫩芽提取物及其对比例的小鼠动物实验的肝组织HE染色结果照片，图4中(1、模型组2、低剂量组3、中剂量组4、高剂量组5、阳性药组6、空白组)；
图5为本发明方法制备的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物中化合物的结构式，其中齐墩果酸-3-O-α-L-阿拉伯糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、奥丝瓜苷(2)、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、楤木皂苷A(4)、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖]-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)、常春藤皂苷元-3-O-β-吡喃葡萄糖苷(7)、常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(8)、常春藤皂苷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(9)、刺囊-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(10)、楤木芽皂苷C(11)、刺囊酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(12)、楤木芽皂苷A(13)、楤木叶皂苷F(14)、楤木叶皂苷G(15)。
具体实施方式
具体实施方式一：
一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法，将刺嫩芽3kg，用7倍量65％乙醇(质量比体积为1:7)；加热回流提取，提取3次，每次2h，过滤得到滤渣及滤液，合并提取液。减压回收乙醇，得到乙醇提取物，将乙醇提取物用水溶解后，经AB-8大孔树脂柱(柱径：柱高＝1：3)进行吸附，上样流速为每小时1.0至1.5倍柱体积，上样结束后依次用水(5到8倍柱体积)、30％乙醇(5到7倍柱体积)、70％乙醇(6到9倍柱体积)、90％乙醇洗脱(4到7倍柱体积)洗脱，洗脱流速控制在每小时0.5到0.8倍柱体积，收集70％乙醇洗脱液，浓缩、干燥，得到刺嫩芽提取物。
本实施方式所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法，提取效率为13％，提取效率一般。
具体实施方式二：
一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法，将刺嫩芽3kg，用8倍量70％乙醇(质量比体积为1:8)；加热回流提取，提取3次，每次2h，过滤得到滤渣及滤液，合并提取液。减压回收乙醇，得到乙醇提取物，将乙醇提取物用水溶解后，经AB-8大孔树脂柱(柱径：柱高＝1：4)进行吸附，上样流速为每小时1.0至1.5倍柱体积，上样结束后依次用水(5到8倍柱体积)、30％乙醇(5到7倍柱体积)、70％乙醇(6到9倍柱体积)、90％乙醇洗脱(4到7倍柱体积)洗脱，洗脱流速控制在每小时0.6到0.8倍柱体积，收集70％乙醇洗脱液，浓缩、干燥，得到刺嫩芽提取物。
本实施方式所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法，提取效率为36％，提取效率最佳。
具体实施方式三：
一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法，将刺嫩芽3kg，用9倍量70％乙醇(质量比体积为1:9)；加热回流提取，提取3次，每次2h，过滤得到滤渣及滤液，合并提取液。减压回收乙醇，得到乙醇提取物，将乙醇提取物用水溶解后，经AB-8大孔树脂柱(柱径：柱高＝1：5)进行吸附，上样流速为每小时1.0至1.5倍柱体积，上样结束后依次用水(5到8倍柱体积)、30％乙醇(5到7倍柱体积)、70％乙醇(6到9倍柱体积)、90％乙醇洗脱(4到7倍柱体积)洗脱，洗脱流速控制在每小时0.6到0.8倍柱体积，收集70％乙醇洗脱液，浓缩、干燥，得到刺嫩芽提取物。
本实施方式所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法，提取效率为24％，提取效率较好
具体实施方式一至三所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法中总皂苷的含量测定结果如下：
一、对照品为齐墩果酸
对照品溶液的制备：精密称取齐墩果酸13.20mg置于5mL容量瓶，用甲醇-水溶解至刻度线，取1mL，置于10mL的容量瓶中，用甲醇-水稀释至刻度线，即得齐墩果酸0.2640mg/mL对照品溶液。
供试品溶液的制备：称取刺嫩芽约50g，置于1000mL圆底烧瓶中，70％乙醇加热回流提取3次，2h/次，合并滤液浓缩后得乙醇提取物，提取物加水分散后经石油醚、水饱和的正丁醇各萃取3次(体积比1:1)，收集正丁醇组分，回收溶剂得总皂苷部位。精密称取50mg，于10mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容到刻度线，取1mL，置于5mL的容量瓶中，用甲醇-水稀释至刻度线，备用。
测定法：精密吸取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，水浴蒸干，加5％香草醛-冰醋酸0.2mL，高氯酸0.8mL，80℃水浴20min，取出冰浴5min，加5mL冰醋酸，550nm处测定吸光度，以齐墩果酸浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程A＝3.7332C-0.4868(r＝0.9998)。结果显示，齐墩果酸对照品在0.1320～1.320mg内线性关系良好。
表1不同批次提取物总皂苷的含量测定结果
分离方法 吸光度A 浓度C(mg/mL) 百分含量(g/g)
具体实施方式一(第一次) 0.344 0.0131 0.131
具体实施方式一(第二次) 0.361 0.0146 0.146
具体实施方式一(第三次) 0.346 0.0142 0.142
具体实施方式二(第一次) 0.513 0.0215 0.215
具体实施方式二(第二次) 0.482 0.0206 0.206
具体实施方式二(第三次) 0.508 0.0212 0.212
具体实施方式三(第一次) 0.362 0.0163 0.163
具体实施方式三(第二次) 0.421 0.0181 0.181
具体实施方式三(第三次) 0.385 0.0177 0.177
二、对照品为楤木皂苷Ⅴ
对照品溶液的制备：精密称取楤木皂苷Ⅴ10.04mg置于5mL容量瓶，用甲醇-水溶解至刻度线，取2.5mL，置于10mL的容量瓶中，用甲醇-水稀释至刻度线，即得楤木皂苷Ⅴ0.502mg/mL对照品溶液。
供试品溶液的制备：称取刺嫩芽约50g，置于1000mL圆底烧瓶中，70％乙醇加热回流提取3次，2h/次，合并滤液浓缩后得乙醇提取物，提取物加水分散后经石油醚、水饱和的正丁醇各萃取3次(体积比1:1)，收集正丁醇组分，回收溶剂得总皂苷部位。精密称取50mg，于10mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容到刻度线，取1mL，置于5mL的容量瓶中，用甲醇-水稀释至刻度线，备用。
测定法：精密吸取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，水浴蒸干，加5％香草醛-冰醋酸0.2mL，高氯酸0.8mL，80℃水浴20min，取出冰浴5min，加5mL冰醋酸，550nm处测定吸光度，以楤木皂苷Ⅴ浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程A＝4.0263C-0.4752(r＝0.9998)。结果显示，楤木皂苷Ⅴ对照品在0.2510～2.510mg内线性关系良好。
表2不同批次提取物总皂苷的含量测定结果
分离方法 吸光度A 浓度C(mg/mL) 百分含量(g/g)
具体实施方式一(第一次) 0.456 0.0152 0.152
具体实施方式一(第二次) 0.475 0.0163 0.163
具体实施方式一(第三次) 0.441 0.0141 0.141
具体实施方式二(第一次) 0.623 0.0232 0.232
具体实施方式二(第二次) 0.620 0.0225 0.2225
具体实施方式二(第三次) 0.654 0.0241 0.241
具体实施方式三(第一次) 0.502 0.0176 0.176
具体实施方式三(第二次) 0.573 0.0201 0.201
具体实施方式三(第三次) 0.541 0.0194 0.194
具体实施方式四：
一种刺嫩芽提取物的分离检测方法，7种主要成分的含量测定结果如下：
混合对照品溶液的制备
精密称取7种三萜皂苷对照品适量，置于试管中，用甲醇配成含常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(0.971mg/mL)、含楤木皂苷A(1.725mg/mL)含奥丝瓜苷A(1.361mg/mL)、含楤木芽皂苷C(1.603mg/mL)、含楤木芽皂苷A(1.346mg/mL)、含齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖]-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷(1.486mg/mL)、含齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷(1.459mg/mL)的混合对照品溶液备用。
供试品溶液的制备：
取不同产地刺嫩芽鲜品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇100mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，精密量取续滤液10mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次10mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
色谱条件和适用性实验：
Diamonsil C18(2)(4.6×250mm，5μm)；柱温为30℃；以乙腈(A)-水(B)溶液为流动相，梯度洗脱(0～15min,10％→40％A；15～40min,40％A)。检测器为蒸发光散射检测器，载气流速为3.2L/min，漂移管温度为100℃。进样量为10μL，流速为1.0mL/min。
测定法：取0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5mL混合对照品溶液分别置于10mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度线配成一系列混合对照品溶液。按条件注入高效液相色谱，测定峰面积，以峰面积的对数(Y)为纵坐标，以进样质量的对数(X,μg)为横坐标，绘制标准曲线，测试结果如图1和图2所示，得回归方程：
1：Y＝1.5621X+1.4127(r＝0.9932)；
2：Y＝1.7842X+1.2112(r＝0.9992)；
3：Y＝1.6513X+1.5892(r＝0.9984)；
4：Y＝1.8001X+0.9656(r＝0.9941)；
5：Y＝1.6759X+1.5623(r＝0.9910)；
6：Y＝1.7902X+1.1013(r＝0.9984)；
7：Y＝1.8035X+1.3210(r＝0.9931)；
分别在0.2428～1.457μg(1)、0.4312～2.588μg(2)、0.3403～2.042μg(3)、0.4008～2.405μg(4)、0.3365～2.019μg(5)、0.3715～2.229μg(6)、0.3647～2.189μg(7)内线性关系良好。
精密度实验：精密吸取混合对照品溶液10μL，按色谱条件连续进样6次，测定峰面积，计算1、2、3、4、5、6、7的峰面积的RSD(n＝6)分别为2.72％、2.08％、1.32％、1.87％、0.64％、0.46％、0.72％，表明仪器的精密度良好。
稳定性试验：取同一供试品溶液，按照色谱条件分别于0、2、4、8、12、24h进样测定，计算7种成分峰面积的RSD分别为2.35％、1.82％、1.96％、2.52％、1.86％、2.23％、1.66％。表明样品中的4个皂苷成分在提取后24h内稳定性良好。
重复性试验：精密称取总皂苷粉末1.0g，6份，制备成供试品溶液，按色谱条件进样测定峰面积，RSD值分别为2.41％、3.52％、1.86％、2.33％、1.26％、0.92％、2.01％，表明本方法重复性良好。
加样回收试验
称取已知含量的总皂苷粉末0.1g，9份，精密称定。分别精密加入一定量的4个对照品制备供试品溶液，按色谱条件进样测定峰面积，计算平均加样回收率分别为：100.1％、98.6％、102.3％、101.6％、99.60％、100.4％、98.45％；RSD分别为：2.16％、2.01％、2.31％、2.51％、1.06％、0.98％、1.24％，结果表明回收率符合要求。
表3不同批次样品的含量测定结果
Figure BDA0003066733160000081
具体实施方式五：
一种根据具体实施方式一至三制备的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的组合物，包括固体制剂(片剂、胶囊剂和颗粒剂)。
片剂的制备
Figure BDA0003066733160000082
Figure BDA0003066733160000091
将刺嫩芽提取物在60℃下充分减压干燥，粉碎，过80目筛；辅料在50-70℃下充分干燥，过100目筛，备用。以淀粉和微晶纤维素为填充剂，羧甲基淀粉钠为解崩剂，混合均匀，在相同压力下压制片剂，片重约为330mg。
片剂检查
②外观形状：淡绿色片剂
②重量差异：按《中国药典》(2020版)检查崩解时限，在30分钟内全部崩解，符合规定。
颗粒剂的制备
Figure BDA0003066733160000092
将刺嫩芽提取物与乳糖和可溶性淀粉按适宜比例混合,加适量40％的乙醇制成软材,轻压即散为标准,过3号筛(50目筛)制粒，40℃烘干40-80分钟后整粒(取过3号筛但不能通过5号筛的颗粒作为成品),整粒后50-60摄氏度烘干即得成品，装袋，每袋重量约为1000mg。
颗粒剂检查:
①外观性状:颗粒剂应干燥，粒径均匀,色泽一致,无吸潮、结块、潮解等现象。
②粒度检查:按《中国药典》(2020版)照粒度和粒度分布测定法(通则0982第二法双筛分法)测定,不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不超过12％。
③干燥失重:按《中国药典》(2020版)照干燥失重测定法(通则0831)测定,于在80C减压干燥至恒重,减失重量不超过2.0％。
④溶化性检查:可溶颗粒检查法中药单剂量包装取1袋,加热水200ml,搅拌5分钟，立即观察,可溶颗粒应全部溶化或轻微浑浊。
⑤水分:按《中国药典》(2020版)中药颗粒剂照水分测定法(通则0832)测定,水分不得超过6.0％。
⑥装量:照《中国药典》(2020版)最低装量检查法(通则0942)检查,符合规定。
胶囊剂的制备:
Figure BDA0003066733160000093
Figure BDA0003066733160000101
将刺嫩芽提取物在60℃下充分减压干燥,粉碎,过80日筛；辅料过100日筛，备用。以淀粉和微晶纤维素为填充剂，羧甲基淀粉钠为崩解剂，混合均匀，以适量纯化水为润湿剂制软材，20目筛制粒，60℃干燥,加入润滑剂硬脂酸镁和助流剂微粉硅胶,混合均匀，装入胶囊，制成1000粒胶囊，即得。每粒胶囊重约为300mg。
颗粒剂检查:
①外观性状:淡绿色或褐色内容物。
②水分:取供试品内容物，照《中国药典》(2020版)水分测定法(通则0832)测定,不超过8.0％。
③装量差异:超出装量差异限度的不多于2粒,并没有1粒超出限度1倍。平均装量装量差异限度为士8％。
④崩解时限:按《中国药典》(2020版)崩解时限检查法(通则0921)检查,在30分钟内全部崩解,符合规定。
药理学实验研究
效果例1：
具体实施方式二制备的刺嫩芽提取物对二乙基亚硝胺诱导的肝癌小鼠的影响：
研究目标为ICR小鼠，采用二乙基亚硝胺(DEN)刺激的方法建立小鼠肝癌动物模型。考察刺嫩芽中的皂苷类成分对模型小鼠肝脏大小及重量的影响；并与空白和模型组进行比较。
实验分组：70只ICR小鼠适应性喂养一周后，将小鼠随机分为6组，空白组、模型组、对照药组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。除空白组外，12只/组。
通过二乙基亚硝胺(DEN)刺激的方法建立小鼠肝癌动物模型。低、中、高剂量组先分别以70mg/kg、150mg/kg、250mg/kg浓度的提取物，对照药组以200mg/kg的阿司匹林给小鼠灌胃，小鼠每10g灌胃0.2mL，1次/日，连续16周。同时除空白组外，其余5组在每周最后一天腹腔注射80mg/kg浓度的DEN，1次/周，连续16周。空白组在同样条件下，给以等量的生理盐水。实验过程中小鼠体重每周称量一次，用于后期指标计算。实验结束后，腹腔注射水合氯醛麻醉，摘眼球取血。然后迅速取其肝脏，生理盐水将肝脏冲洗干净，后用吸水纸吸干表面的水分并称重，用于计算肝脏指数。随后将肝脏分为两部分，一部分(不同肝脏的同一部位)用10％的中性福尔马林固定，用于组织病理学检测。另一部分迅速用液氮预冷后冻存于-80℃冰箱中，用于后期指标检测。血液静置30min后离心(3500r/min，20min)取上清于2mLEP管中，冻存于-20℃冰箱中备用。
观察指标：小鼠体重、肝脏指数、组织病理学观察、血清指标、肝脏生化指标
小鼠体重结果如表4所示：
表4不同组小鼠体重比较
Figure BDA0003066733160000111
*P<0.05,**P<0.01,与空白组比较；ΔP<0.05,ΔΔP<0.01,与模型组比较。
小鼠肝脏重量和肝脏指数比较结果如表5所示：
表5不同组中肝脏重量和肝脏指数比较
Figure BDA0003066733160000112
*P<0.05,**P<0.01,与空白组比较；ΔP<0.05,ΔΔP<0.01,与模型组比较。
各组肝的形态与变化如图3所示，图3中(1、模型组2、低剂量组3、中剂量组4、高剂量组5、阳性药组6、空白组)，各组肝组织HE染色结果照片如图4所示，图4中(1、模型组2、低剂量组3、中剂量组4、高剂量组5、阳性药组6、空白组)，从图3和图4中能给个看出模型组与空白组相比有明显的肝癌病变发生，与模型组比较，给药组的上述表现有不同程度的改善。
小鼠不同血清生化指标的测定结果如表6所示：
表6不同血清生化指标的测定结果
Figure BDA0003066733160000121
*P<0.05,**P<0.01,与空白组比较；ΔP<0.05,ΔΔP<0.01,与模型组比较。
表7不同组肝脏生化指标的测定结果
Figure BDA0003066733160000122
*P<0.05,**P<0.01,与空白组比较；ΔP<0.05,ΔΔP<0.01,与模型组比较。
从以上动物实验数据表明，采用DEN诱导的小鼠肝癌模型，造成小鼠食欲减退，活动量减少，毛发蓬乱，反应迟钝；体重显著下降，肝脏指数明显升高；肝脏组织中MDA、IL-6、TNF-α的水平显著升高，SOD、GSH-Px活力显著减弱，即DEN造成了小鼠的一般行为、组织蛋白等多个方面都发生显著变化。干预组上述小鼠情况则呈现不同程度的改善，说明刺嫩芽提取物不仅对DEN诱发的小鼠肝癌具有干预作用，而且对DEN导致的小鼠肝损伤具有一定的保护和减缓作用，进而延缓了DEN诱发小鼠肝脏癌变的进程。
刺嫩芽提取物能明显改善肝癌小鼠的生活状态，提高其生存质量，说明该药物具有保肝和肝癌预防作用。
具体实施方式六：
一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物包括楤木叶皂苷F、楤木叶皂苷G。
具体实施方式七：
根据具体实施方式六所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物包括齐墩果酸-3-O-α-L-阿拉伯糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、奥丝瓜苷A、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、楤木皂苷A、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖]-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷、常春藤皂苷元-3-O-β-吡喃葡萄糖苷、常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、刺囊酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、楤木芽皂苷C、刺囊酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、楤木芽皂苷A。
具体实施方式八：
根据具体实施方式六所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、按照料液比为1：6～9g/mL将刺嫩芽用乙醇溶液浸泡1～3h，然后加热回流2～3次，每次2～3h，合并滤液，减压回收乙醇，得到乙醇提取物；
步骤2、将步骤1得到的乙醇提取物用纯净水溶解后，经AB-8大孔树脂吸附，依次用水、30wt％乙醇、70wt％乙醇、90wt％乙醇洗脱，收集70wt％乙醇洗脱液，浓缩、干燥，得到保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物。
具体实施方式九：
根据具体实施方式八所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法，步骤1中乙醇溶液的浓度为65～75wt％；步骤2中乙醇提取物和纯净水的料液比为1：6～9g/mL，AB-8大孔树脂柱的柱径：柱高比为1:3，上样流速为每小时1.0至1.5倍柱体积，上样结束后依次用到6～8倍柱体积的水、5～7倍柱体积的30wt％浓度的乙醇、6～9倍柱体积的70wt％浓度的乙醇、4～7倍柱体积的90wt％浓度的乙醇进行洗脱，洗脱流速控制在每小时0.5～0.8倍柱体积。
具体实施方式十：
根据具体实施方式八所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法，将所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物用纯净水溶解，再经硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、制备型HPLC分离技术分离得到单体，然后用13C-NMR、1H-NMR、MS中的一种或几种波谱技术鉴定化合物的结构。
具体实施方式十一：
根据具体实施方式六所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的分离检测方法，所述的刺嫩芽提取物总皂苷的含量采用可见分光光度法法进行测定，对照品为齐墩果酸、楤木皂苷Ⅴ，所述的刺嫩芽提取物总皂苷的含量大于30％。
具体实施方式十二：
根据具体实施方式十一所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的分离检测方法，刺嫩芽提取物的含量采用HPLC-ELSD法进行测定，其对照品为常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、楤木皂苷A、奥丝瓜苷A、楤木芽皂苷C、楤木芽皂苷A、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖]-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷，色谱柱为迪马钻石C18(2)，柱温为30℃，以乙腈溶液为流动相，梯度洗脱，检测器为蒸发光散射检测器，载气流速为3.2L/min，漂移管温度为100℃。进样量为10μL，流速为1.0mL/min。
具体实施方式十三：
根据具体实施方式六所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的应用，用于预防肝癌的药物，所述的用于预防肝癌的药物为口服制剂。
具体实施方式十四：
根据具体实施方式十三所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的应用，用于对化学性肝损伤有辅助保护作用的药物，所述的对化学性肝损伤有辅助保护作用的药物为口服制剂。
具体实施方式十五：
根据具体实施方式六所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的组合物，所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的组合物包括颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液、酒剂、露酒。

Claims (10)

1.一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，其特征在于：由刺嫩芽(辽东楤木嫩叶)单独提取制得。
2.根据权利要求1所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物，其特征在于：所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物包括齐墩果酸-3-O-α-L-阿拉伯糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、奥丝瓜苷A、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、楤木皂苷A、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖]-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷、常春藤皂苷元-3-O-β-吡喃葡萄糖苷、常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、刺囊酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、楤木芽皂苷C、刺囊酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷、楤木芽皂苷A、楤木叶皂苷F、楤木叶皂苷G。
3.一种权利要求1-2所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1、按照料液比为1：6～9g/mL刺嫩芽用乙醇溶液浸泡1～3h，然后加热回流2～3次，每次2～3h，合并滤液，减压回收乙醇，得到乙醇提取物；
步骤2、将步骤1得到的乙醇提取物用纯净水溶解后，经AB-8大孔树脂吸附，依次用水、30wt％乙醇、70wt％乙醇、90wt％乙醇洗脱，收集70wt％乙醇洗脱液，浓缩、干燥，得到保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物。
4.根据权利要求3所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的制备方法，其特征在于：步骤1中乙醇溶液的浓度为65～75wt％；步骤2中乙醇提取物和纯净水的料液比为1：6～9g/mL，AB-8大孔树脂柱的柱径：柱高比为1:3，上样流速为每小时1.0至1.5倍柱体积，上样结束后依次用到6～8倍柱体积的水、5～7倍柱体积的30wt％浓度的乙醇、6～9倍柱体积的70wt％浓度的乙醇、4～7倍柱体积的90wt％浓度的乙醇进行洗脱，洗脱流速控制在每小时0.5～0.8倍柱体积。
5.一种权利要求1-2所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的分离检测方法，其特征在于：将所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物用纯净水溶解，再经硅胶柱色谱、反相ODS柱色谱、制备型HPLC分离技术分离得到单体，然后用13C-NMR、1H-NMR、MS中的一种或几种波谱技术鉴定化合物的结构。
6.根据权利要求5所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的分离检测方法，其特征在于：所述的刺嫩芽提取物总皂苷的含量采用可见分光光度法法进行测定，对照品为齐墩果酸、楤木皂苷Ⅴ，所述的刺嫩芽提取物总皂苷的含量大于30％。
7.根据权利要求5所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的分离检测方法，其特征在于：刺嫩芽提取物的含量采用HPLC-ELSD法进行测定，其对照品为常春藤皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(1)、楤木皂苷A(2)、奥丝瓜苷A(3)、楤木芽皂苷C(4)、楤木芽皂苷A(5)、齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖]-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖苷(7)，色谱柱：迪马钻石C18(2)(4.6×250mm，5μm)；柱温为30℃；以乙腈(A)-水(B)溶液为流动相，梯度洗脱(0～15min,10％→40％A；15～40min,40％A)，检测器为蒸发光散射检测器，载气流速为3.2L/min，漂移管温度为100℃，进样量为10μL，流速为1.0mL/min。
8.一种权利要求1-2所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的应用，其特征在于：用于预防肝癌的药物，所述的用于预防肝癌的药物为口服制剂。
9.一种权利要求1-2所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的应用，其特征在于：用于对化学性肝损伤有辅助保护作用的药物，所述的对化学性肝损伤有辅助保护作用的药物为口服制剂。
10.一种权利要求1-2所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的组合物，其特征在于：所述的一种保肝和预防肝癌的刺嫩芽提取物的组合物包括颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液、酒剂、露酒。
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尹丽颖等: "辽东楤木叶总皂苷对荷瘤小鼠抑瘤作用的实验研究", 《中医药信息》 *
王秋红等: "辽东楤木叶有效部位中楤木皂苷Ⅴ、Ⅵ及总皂苷质量控制", 《中成药》 *
邹淑君等: "辽东楤木叶皂苷成分及其药学研究进展", 《中医药学报》 *
颜廷才等: "HPLC法测定刺嫩芽皂甙中齐墩果酸的含量", 《食品研究与开发》 *

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