CN102085257A - 一种桂枝茯苓微丸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桂枝茯苓微丸的制备方法，包括以：桂枝、牡丹皮提取易挥发成分；将桂枝、牡丹皮的药渣和赤芍、桃仁混合，水煮，所得煎煮液与桂枝、牡丹皮提取易挥发成分后的药液合并，浓缩、醇沉、过滤取滤液；将桂枝、牡丹皮的易挥发成分进行包结，得包结物；用滤液、茯苓细粉、包结物分别制备浸膏粉、浸膏和流浸膏，以浸膏粉为模芯，浸膏为黏合剂制母模丸，以流浸膏为喷浆增大剂，以流化床制粒法制备微丸，包衣得桂枝茯苓微丸。本发明有效地提取了药物有效成分，提高了药效，性能质量稳定。用纯桂枝茯苓浸膏粉为模芯，微丸载药含量高，采用流化床制粒法制备微丸，收率高。包衣处理后，微丸吸湿性明显降低，解决了纯浸膏制剂吸湿的难题。

Description

一种桂枝茯苓微丸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种桂枝茯苓制剂的制备方法，具体涉及一种桂枝茯苓微丸的制备方法，属于制药技术领域。

背景技术

桂枝茯苓丸出自《金遗要略·妇人妊娠病脉证并治》篇，张仲景以其有活血化痕、消症化积之功用于治疗妇人妊娠后漏下不止，胎动不安之病。方中以桂枝为主药，温通血脉；桃仁、丹皮，活血化瘀；赤芍，柔肝敛阴，调和营卫；茯苓，健脾补中，利湿而助桂通行。近年来，国内外对桂枝茯苓丸进行了大量实验研究，药效学研究表明，桂枝茯苓丸具有较广泛的药效作用，尤其在妇科疾病的治疗方面，具有独特的优势，对其进行剂型改革，提高药物的生物利用度和临床疗效，具有重要意义。

微丸剂(pellets)又称小丸剂，是指直径约为1mm，一般不超过2.5mm的小球状口服剂型。研究表明，微丸制剂与其他口服制剂相比，自身有许多优点，如提高药物的生物利用度、吸收重现性好、容易实现预期的释药速率，达到理想的血药浓度、可避免药物突释带来的危害等，但是我国微丸的制备工艺具有工艺落后、工作强度大、效率低等缺点。专利200510200475和200610059817对桂枝茯苓微丸的制备都进行了一些改进，但是在上述专利材料中，桂枝采用醇或水提取有效成份，而桂枝中主要含有挥发油，其中桂皮醛、肉桂酸含量较高，桂皮醛、肉桂油均有显著的抑制血小板聚集活性，具有镇痛作用等，若用上述方法必然会使桂枝中有效药物成分得到损失，从而降低药效。而且，国内一般采用滚圆-挤压法制备微丸，未见采用桂枝茯苓浸膏粉和浸膏制备微丸的文献。因此，最大程度的保留药物的有效成分、提高药物的药效和微丸质量是桂枝茯苓微丸制备工艺进一步优化的一个关键点。

发明内容

本发明针对现有桂枝茯苓微丸制备工艺中存在的不足，提供了一种桂枝茯苓微丸的制备方法，该方法最大程度的保留了原料中的药物有效成分，所得微丸疗效好，稳定性高、生物利用度高、安全性强、载药量高。

本发明是通过一下措施实现的：

本发明是将桂枝茯苓丸制成微丸，原料为桂枝、茯苓、丹皮、赤芍、桃仁。从本方中各味原料所含有效成分及其溶解性能分析，桂枝主要含有肉桂醛、肉桂酸挥发性等成分，且为活性成分，应采用双提法提取，保留挥发性和非挥发性成分。牡丹皮含有丹皮酚等挥发性成分，应同桂枝一样提取处理，先提取挥发性成分，再用水提取非挥发成分。赤芍、桃仁主要含有水溶性苷类成分，易溶于水，多用水为提取溶媒进行提取。为减少工艺的复杂性，提取挥发油后桂枝、牡丹皮药渣与赤芍、桃仁混合，用水提取。在提取上述四种药材有效成分的同时，还有一些大分子等无效成分被提出，为了减少服用量，减小制剂体积，在制剂过程中应尽可能除去无效成分，达到去粗存精的目的。根据目前一般制剂除杂生产工艺，选择乙醇沉淀方法去除杂质。

茯苓含有茯苓素等萜类成分，用水不易提取。为保留茯苓有效成分，增加制剂稳定性，减少辅料用量，将茯苓制成微粉，加入制剂中。

为增加挥发性成分的稳定性，应将提取的挥发油用β-环糊精包结，制成β-环糊精包结物加入制剂中。

制备工艺具体如下：

一种桂枝茯苓微丸的制备方法，其特征是包括以下步骤：

(1)将茯苓磨成细粉待用；

(2)将桂枝加入6-8质量倍的水中，温浸后用挥发油提取器提取挥发油，提取完毕后保存挥发油，将药液和药渣分离待用；

(3)将牡丹皮粉碎，加入15-25质量倍的水温浸，然后用水蒸气蒸馏收集牡丹皮8-15质量倍的蒸馏液，蒸馏液冷藏析出结晶，过滤后将结晶保存，滤液中加入氯化钠继续蒸馏提取，收集收集牡丹皮3-5质量倍的蒸馏液，蒸馏液再次冷藏析出结晶，过滤后将两次结晶合并，干燥后保存；

(4)将桂枝、牡丹皮的药渣和赤芍、桃仁混合，用水煎煮三次，将煎煮液合并；

(5)将煎煮液与桂枝提取挥发油后的药液、牡丹皮水蒸气蒸馏提取结晶后的药液合并，浓缩为60℃下相对密度为1.14～1.18的浸膏，加入乙醇至含醇量达50-70体积％，搅匀，冷藏后过滤，滤液备用；

(6)将桂枝挥发油和牡丹皮提取的结晶混合，用乙醇溶解后，用β-环糊精进行包结，得包结物；

(7)取步骤(5)滤液的一小部分，回收乙醇得相对密度在60℃下测为1.34-1.38的浸膏，在浸膏中加入步骤(1)中茯苓细粉的一小部分，减压干燥得干浸膏，干浸膏与包结物的一小部分混合，粉碎，得浸膏粉；

(8)取步骤(5)滤液的一小部分，回收乙醇至含醇量为30％，然后加入茯苓细粉和包结物的一小部分，得浸膏；

(9)将乘余的步骤(5)的滤液回收乙醇，得60℃下相对密度为1.20-1.24的浸膏，然后在浸膏中加入剩余的茯苓细粉和包结物，加水得室温下相对密度为1.14-1.16的流浸膏；

(10)以流化床制粒法制备微丸，过程为：将浸膏粉作为模芯，以浸膏作为黏合剂起母模丸得粒径为250～355μm的母模丸，然后以流浸膏作为喷浆增大剂，在母模丸表面喷洒流浸膏得粒径500～600μm的微丸，微丸以羟丙基甲基纤维素包衣，得桂枝茯苓微丸。

上述步骤(6)中，包结物的制备过程为：将步骤(2)的挥发油和步骤(1)的结晶混合，用乙醇溶解，然后加入混合物6-10质量倍的β-环糊精，再加入β-环糊精2质量倍的水，研磨1h，研磨后在40℃以下干燥，得包结物。

进一步的，上述包结物的制备过程中，β-环糊精的加入量优选为混合物质量的8倍。

上述步骤(7)中，需取步骤(5)中所述滤液、茯苓细粉和包结物中的一小部分制备浸膏粉，具体所取量可按下列比例：步骤(5)中滤液的3-5wt％，步骤(1)中茯苓细粉的3-5wt％，步骤(6)中包结物的3-5wt％。

上述步骤(8)中，需取步骤(5)中所述滤液、茯苓细粉和包结物中的一小部分制备浸膏，具体所取量可按下列比例：步骤(5)中滤液的5-7wt％，步骤(1)中茯苓细粉的5-7wt％，步骤(6)中包结物的5-7wt％。

进一步的，上述步骤(2)中，温浸1-2h，提取4-5h；步骤(4)中，每次煎煮加入6-10质量倍的水，每次煎煮1-2h。

更进一步的，优选的，步骤(2)中，桂枝加入7质量倍的水中；步骤(3)中牡丹皮加入20质量倍的水中，第一次收集牡丹皮10质量倍的蒸馏液；步骤(4)中，每次加8质量倍的水；步骤(5)中，浸膏加入乙醇至含醇量达60体积％。

进一步的，在喷气流量300L/min、喷气压强2.3bar、输液泵转速15r/min、转盘电机转速25Hz、进风温度60℃、物料温度50℃的条件下制备母模丸。

进一步的，在喷气流量250L/min、喷气压强2.2bar输液泵转速20r/min、转盘电机转速25Hz、进风温度55℃、物料温度50℃的条件下喷洒流浸膏，得微丸。

进一步的，包衣时，羟丙基甲基纤维素溶液的质量分数为35-40％，羟丙基甲基纤维素溶液的流速为2ml/min，雾化压力为2.0bar，进风温度为60℃，待包衣液喷完后继续鼓风干燥30min。

本发明所用的桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的干燥嫩枝，春、夏二季采收，除去叶，晒干，或切片晒干。其质量应符合《中国药典》2005年版(一部)第195页桂枝项下有关规定。茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，多于7～9月采挖，挖出后除去泥沙，堆置“发汗”后，摊开晾至表面干燥，再“发汗”，反复数次至现皱纹、内部水分大部散失后，阴干，称为“茯苓个”。其质量应符合《中国药典》2005年版(一部)第166页茯苓项下的有关规定。牡丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，秋季采挖根部，除去细根，剥取根皮，晒干。其质量应符合《中国药典》2005年版(一部)第119页牡丹皮项下的有关规定。赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veitchiiLynch的干燥根，春、秋二季采挖，除去根茎、须根及泥沙，晒干。其质量应符合《中国药典》2005年版(一部)第109页赤芍项下的有关规定。桃仁：为蔷薇科植物桃Prunus persica(L.)Batsch或山桃Prunus davidiana(Carr.)Franch.的干燥成熟种子。果实成熟后采收，除去果肉及核壳，取出种子，晒干。其质量应符合《中国药典》2005年版(一部)第196页桃仁项下的有关规定。

有益效果：本发明提供了桂枝茯苓微丸的制备方法，该方法制得的微丸有效地提取了药物有效成分，并除去了药物提取中的无效成分，减少了药物服用分量，提高了药效，所得微丸服用体积小、与胃肠道接触面积大、生物利用度高、性能质量稳定，优于现有的丸剂、胶囊剂。采用流化床制粒法制备微丸，使微粒更加趋于圆整、结实，干燥迅速，按起母模丸、母模丸增大和包衣3个过程，制备的微丸粒径分布在500～600μm、粒径分布百分率达84.6％，经包衣处理后，微丸吸湿性明显降低，解决了纯浸膏制剂吸湿的难题；同时起母模丸用纯桂枝茯苓浸膏粉，而不用添加赋形剂，微丸载药含量高，收率高。本方法操作过程简单，制备工艺先进，适合于大规模生产。

附图说明

图1为实施例1中微丸和包衣微丸中芍药苷溶出曲线；

图2为实施例1中微丸与包衣微丸的吸湿率曲线图；

图3为实施例1中微丸和包衣微丸的平衡吸湿曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

桂枝茯苓微丸所需原料药的配比为：桂枝1份，茯苓1份，牡丹皮1份，赤芍1份，桃仁1份。

实施例1

取桂枝700g，茯苓700g，牡丹皮700g，赤芍700g，桃仁700g待用。

制备方法为：

1、将茯苓磨成细粉待用；

2、将桂枝中加入7质量倍的水中，温浸1-2h后用挥发油提取器提取挥发油4-5h，提取完毕后保存挥发油，将药液和药渣分离待用；

3、将牡丹皮粉碎，加入20质量倍的水温浸1-2h，然后用水蒸气蒸馏收集牡丹皮10质量倍的蒸馏液，蒸馏液冷藏析出结晶，过滤后将结晶保存，滤液中加入滤液5wt％的氯化钠继续蒸馏提取，收集收集牡丹皮3-5质量倍的蒸馏液，蒸馏液再次冷藏析出结晶，过滤后将两次结晶合并，在40℃下干燥1h后保存。

4、将桂枝、牡丹皮的药渣和赤芍、桃仁混合，用水煎煮三次，每次加入8质量倍的水，煎煮1-2h，将煎煮液合并；

5、将煎煮液与桂枝提取挥发油后的药液、牡丹皮水蒸气蒸馏提取结晶后的药液合并，浓缩为60℃下相对密度为1.14～1.18的浸膏，加入乙醇至含醇量达60体积％，搅匀，冷藏24h后过滤，滤液备用；

6、将桂枝挥发油和牡丹皮提取的结晶混合，用适量乙醇溶解，然后加入混合物8质量倍的β-环糊精，再加入β-环糊精2质量倍的水，研磨1h，研磨后在40℃以下干燥，得包结物；

7、取步骤(5)滤液的3wt％，回收乙醇得相对密度在60℃下测为1.34-1.38的浸膏，在浸膏中加入3wt％的茯苓细粉，减压干燥得干浸膏，干浸膏与3wt％的包结物混合，粉碎，得浸膏粉；

8、取步骤(5)滤液的7wt％，回收乙醇至含醇量为30％，加入7wt％的茯苓细粉和包结物，得浸膏；

9、将剩余的步骤(5)的滤液回收乙醇，得60℃下相对密度为1.20-1.24的浸膏，然后在浸膏中加入剩余的茯苓细粉和包结物，加水得室温下相对密度为1.14-1.16的流浸膏；

10、将浸膏粉置于MINI-DPL多功能实验机中，以浸膏作为黏合剂，在喷气流量300L/min、喷气压强2.3bar、输液泵转速15r/min、转盘电机转速25Hz、进风温度60℃、物料温度50℃的条件下制备母模丸，所得母模丸棕褐色、球形圆整、表面光滑，松密度69.6g/cm³，休止角23°，粒径在250～355μm范围内。

11、取母模丸，置于MINI-DPL多功能实验机内，用桂枝茯苓流浸膏作为微丸的喷浆增大剂，在喷气流量250L/min、喷气压强2.2bar输液泵转速20r/min、转盘电机转速25Hz、进风温度55℃、物料温度50℃的条件下增大制丸，制备完成后，进行各项指标的检测。结果微丸粒径在450～500μm者，粒径分布为10.5％；微丸粒径在500～600μm者，粒径分布为84.6％；微丸粒径在600～710μm者，粒径分布为3.8％；微丸粒径在710～850μm，粒径分布为1.3％。微丸表面圆整、光滑，呈黑褐色，松密度为松密度86.1g/100cm3，休止角为23°。

12、取羟丙基甲基纤维素，配制成浓度为40wt％的水溶液，将制得的干燥微丸置于流化床中，采用底喷工艺调节风机频率为27Hz(此时微丸颗粒在其内部呈流化状态)。当进风温度恒定后，预热10min，控制羟丙基甲基纤维素包衣液的流速为2ml/min，雾化压力为2.0bar，进风温度为60℃，进行喷雾包衣，待包衣液喷完后继续鼓风干燥30min，最终得桂枝茯苓微丸。结果包衣后的微丸表面光亮、圆整、呈黑褐色，松密度为89.8g/100cm³，休止角为21°。可见，经包衣处理后，除外观光亮及松密度有所增加外，其余各项指标影响不大。

实施例2

制备方法同实施例1，不同的是，步骤2中将桂枝中加入6质量倍的水中；步骤3中牡丹皮加入25质量倍的水温浸，然后收集15倍的蒸馏液；最终所得微丸松密度为89.2g/100cm³，休止角为21.7°

实施例3

制备方法同实施例1，不同的是，步骤4中，每次加入10质量倍的水煎煮；步骤5中，加入醇至醇含量为50体积％；步骤6中，加入混合物6质量倍的β-环糊精。最终所得微丸松密度为88.5g/100cm³，休止角为21.9°

实施例4

制备方法同实施例1，不同的是，步骤7中，取分别取滤液、茯苓细粉、包合物的5％做成浸膏粉，步骤8中，再取分别取滤液、茯苓细粉、包合物的5％做成浸膏。最终所得微丸松密度为89.6g/100cm³，休止角为21.1°。

实施例5

制备方法同实施例1，不同的是，制备方法同实施例1，不同的是，步骤2中将桂枝中加入8质量倍的水中；步骤3中牡丹皮加入15质量倍的水温浸，然后收集8倍的蒸馏液；最终所得微丸松密度为89.4g/100cm³，休止角为21.5°

实施例6

制备方法同实施例1，不同的是，步骤4中，每次加入6质量倍的水煎煮；步骤5中，加入醇至醇含量为70体积％；步骤6中，加入混合物10质量倍的β-环糊精。最终所得微丸松密度为88.3g/100cm³，休止角为22.1°。

实施例7

制备方法同实施例1，不同的是，包衣时包衣液的浓度为35wt％。

下面以实施例1制得的微丸为例，对其稳定性、吸湿性、释放性、毒副作用、药效等性能进行研究。

一、桂枝茯苓微丸的初步稳定性试验

按《药品注册管理办法》对中药、天然药物注册申报中有关初步稳定性试验的要求，采用实施例1-3的方法制备一批桂枝茯苓微丸，在包装条件下，采用自然条件下的室温留样观察，进行初步稳定性试验考察，时间三个月，考察项目有性状、鉴别、检查、含量测定、卫生学检查等，采用标准草案及起草说明中的试验方法和《中国药典》2005年版(一部)对药品卫生标准的规定进行检验，实施例1所制微丸的检验数据见表1，实施例2和3的结果与表1相近。从表中检验结果可知，本品室温自然放置三个月，其外观性状和内在质量与刚生产的0月样品均未见明显差异，这表明本品常温放置三个月，其质量是稳定的。

表1桂枝茯苓微丸的初步稳定性试验观察表

二、桂枝茯苓微丸的溶出、吸湿性试验

1、溶出实验

分别取实施例1的方法制得的微丸和包衣微丸研碎，取2.5g，精密称定，投人溶出杯中，按照中国药典(2005)年版附录)溶出度测定法第二法，以1000mI脱气蒸馏水为介质，转速为70r/min，温度为(37+0.5)℃，分别于5、10、20、30、60、120min取样2mL，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，按照质量标准中芍药苷的测定方法和条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得，每次取样后均向溶出杯中补充相同温度和体积的水，计算不同时间芍药苷的溶出量，结果见表2和图1。

表2微丸和包衣微丸溶出度测定结果

实验表明包衣后，对微丸中的芍药苷成分溶出度基本没有影响，不会影响疗效的发挥。

2、吸湿率实验

2.1包衣微丸吸湿百分率测定包衣微丸吸湿率的高低是考察包衣质量的主要指标。将底部盛有氯化钠饱和溶液的玻璃干燥器，放入25℃的恒温干燥箱内恒温48h，，此时干燥器内的相对湿度为75％，在已干燥至恒重的扁称量瓶底部放入厚2～3mm的样品约2g，轻摇使其分布均匀，精确称取后，置盛有氯化钠过饱和溶液的干燥器内(称量瓶盖揭开)，25℃恒温保存，按不同时间称量，并按公式所得计算吸湿百分率。吸湿百分率＝(吸湿后重量-吸湿前重量)÷吸湿前重量×100％。所得包衣微丸和未包衣微丸经上法测定，计算吸湿百分率。结果见表3和图2。

表3包衣微丸、未包衣微丸不同时间吸湿率

上述结果表明，微丸包衣后吸湿性明显降低。

2.2临界相对湿度的测定配制CH₃COOK、MgCl₂、K₂CO₃、NaBr、NaNO₂、NaCl、KCl、KNO₃的过饱和溶液，分别置于不同的玻璃干燥器中，密闭放入25℃的恒温培养箱中，放置24h以上，使其内部构成不同相对湿度的环境。分别在已恒重的称量瓶底部放入厚约2mm的微丸与包衣微丸，打开瓶盖，在45℃的真空干燥箱中烘约5h，使其恒重，取出，干燥器中冷却，准确称量后打开瓶盖，放入上述不同相对湿度的干燥器中，25℃恒温中吸湿120h后称重，计算吸湿百分率，以吸湿率对相对湿度作图，结果见表4和图3。

表4不同相对湿度中微丸与包衣微丸的吸湿百分率

作未包衣微丸临界相对湿度直线部分与横坐标相交的直线。从中计算未包衣微丸临界相对湿度为53％，包衣微丸临界相对湿度为73％，说明微丸包衣后，防吸湿性能得以增强。

三、桂枝茯苓微丸的急性毒性试验

1、目的：观察大剂量桂枝茯苓微丸灌胃后动物的急性毒性反应，为临床用药提供安全评价。

2、实验材料

2.1受试药物：浓度为含桂枝茯苓微丸0.222g/ml(用蒸馏水配制)，药物批号：20070426，本院制剂室提供。桂枝茯苓微丸成人用量：每日二次，每次1g相当生药量3.5g。每日服2g，相当于生药7.0g，即成人日服0.0333g/kg，相当生药量0.117g/kg。

2.2动物：昆明种小鼠，雌雄各半，山东大学实验动物中心提供，SPF级动物，许可证号：SCXK(鲁)20030004。

3、实验方法与结果

3.1实验方法：经预试无法测出LD50，故改测其最大给药量。取健康昆明种小鼠40只，雌雄各半，禁食12小时(不禁水)，随机分为给药组和对照组，每组20只。给药组按0.4ml/10g(即相当于给微丸量为8.88g/kg，相当于生药量31.08g/kg)给小鼠灌胃，一日两次，使一日内给微丸总量达17.76g/kg(相当生药量62.16g/kg)。对照组给予小鼠同等体积的蒸馏水灌胃，均连续观察14天。注意观察记录动物的饮食、活动、大小便及有无死亡等情况。

3.2观察指标与结果见表5、表6。

表5给药前后小鼠体重变化(X±S，n＝20)

给药之后小鼠活动自如，未发现明显异常反应，无死亡。小鼠灌胃给药14d后全部存活，活动自如，毛发光滑，饮食正常，呼吸道、眼及口腔等处无异常分泌物，体重均有增加，无明显差异，未发现中毒症状及死亡。小鼠上述灌胃给药剂量按下式计算最大给药量和按公斤体重计算拟临床相当成人日用量的倍数。结果见表6。

表6小鼠最大给药量测定结果

*一日给微丸药粉为17.76g/kg，相当于生药量62.16g/kg。

3.3结论根据国家食品药品监督管理局新药审评办法《有关中药部分的修订和补充规定》附件五“毒理研究的技术要求”，在一次给药无法测出LD₅₀时，可作动物最大给药量测定。桂枝茯苓微丸对小鼠最大给药量测定结果为：灌服桂枝茯苓微丸溶液0.4ml/10g，一日两次，累计给药微丸药粉为17.76g/kg(相当生药量为62.16g/kg)，相当于临床成人拟用量的532.8倍，小鼠在该剂量下无明显异常，无一只死亡，表明本药物临床拟用剂量安全范围较大。

四、桂枝茯苓微丸的主要药效

试验目的：桂枝茯苓微丸具有活血、化瘀、消症的功能，用于妇宿有瘸块，或血瘀经闭，行经腹痛，产后恶露不尽。为验证其疗效，对桂枝茯苓微丸进行解痉、抗炎、镇痛、活血化瘀等有关药效学实验，并与原剂型进行了比较，观察桂枝茯苓微丸的舒张平滑肌的作用、抗炎作用、镇痛作用和活血化瘀作用。

1、实验材料

1.1药物

桂枝茯苓微丸：成人用量：每日二次，每次1g，1g微丸内容物含生药3.5g，相当于7.0g生药/日，以下动物给药量均按生药量计算。由本院制剂室提供，批号：20070426。

桂枝茯苓丸：山西杨文水制药有限公司，批号：20060610。

1.2试剂

己烯雌酚：上海通用药业股份有限公司出品，批号：060503；缩宫素：上海第一生化药业有限公司，批号：060951；盐酸肾上腺素注射液：天津金耀氨基酸有限公司，批号：0712141。

1.3动物和饲料

昆明种小鼠，购于山东大学实验动物中心，SPF级动物，合格证号：SCXK鲁2003004号。Wistar大鼠，购于山东大学实验动物中心，SPF级动物，合格证号：SCXK鲁2003004号。饲料：实验动物标准饲料，山东省实验动物中心康大公司生产，许可证号：鲁饲准字364号。

1.4仪器

XZC-2B型自控温度热板仪：山东医学科学院设备供应维修站；GB303基本型电子天平：Mettler-Totado公司生产；BL-310biolap生物机能实验系统：德国ADInstruments公司，FASCO-3010型全自动血流变快测仪：重庆大学维多生物工程研究所；LBY-NJZ血小板聚集仪：北京普利生公司

2、实验方法与结果

2.1离体子宫实验

取上述健康大鼠40只，雌性、未孕，体重250g左右，实验室饲养适应2周，实验前40h每鼠皮下注射己烯雌酚0.2mg/100g体重，实验时将大鼠击毙，迅速剪开腹腔，轻轻玻璃子宫周围脂肪组织，穿线结扎阴道端，剪取约2cm长的子宫，立即置于盛有De.Jalons氏液的玻璃平皿中，小心清除残留的结缔组织，并固定于盛有洛氏液25ml的浴槽的L型连通器上。恒温水浴保持工作温度在37℃±0.5℃，并不断向工作液中通入O₂(60-80个气泡/分)。记录一段正常曲线后5分钟，除正常对照组外，加入0.02u/ml(生理盐水配)缩宫素0.5ml，5分钟后，模型对照组加生理盐水0.5ml，给药组加不同药物(桂枝茯苓丸高、中、低剂量、桂枝茯苓微丸高、中、低剂量)0.5ml，记录缩宫素前5分钟、缩宫素后5分钟、药后10分钟、20分钟的子宫收缩最大幅度(MAX)、最小幅度(MIN)、最大最小幅度的差(MAX-MIN)、频率(F)。结果见表7、表8。

表7：桂枝茯苓微丸对MAX-MIN作用(n＝10，x±s，mm)

^**P＜0.01，^***P＜0.001与模型对照组比较

^△△P＜0.01，^△△△P＜0.001与同剂量的桂枝茯苓丸比较

由表7看出，造模后模型对照组的大鼠子宫的收缩幅度明显大于正常对照组；与模型对照组比较桂枝茯苓微丸三个剂量组在药后20分钟均能明显抑制缩宫素所致的大鼠子宫平滑肌的收缩(MAX-MIN)。其作用强度明显优于同剂量的桂枝茯苓丸。

表8：桂枝茯苓微丸对子宫收缩频率的作用(n＝10，x±s)

^**P＜0.01，^***P＜0.001与模型对照组比较：

^△P＜0.05，^△△P＜0.01，^△△△P＜0.001与同剂量的桂枝茯苓丸比较

由表8可以看出，造模后模型对照组大鼠子宫收缩频率明显增加。与模型对照组比桂枝茯苓微丸各组大鼠子宫的收缩频率均减少；桂枝茯苓微丸降低大鼠离体子宫收缩频率作用明显优于同剂量的桂枝茯苓丸。

2.2桂枝茯苓微丸的抗炎作用试验

2.2.1对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响取健康昆明小鼠70只，体重25-30g，雄性，随机分7组，按表9剂量灌胃给药，正常对照组给等量的水，连续3天，末次给药后0.5h每鼠左耳涂二甲苯0.1ml，4h后处死动物，沿耳廓基线剪下双耳，用9mm的打孔器分别在同一位置打下圆耳片，电子天平称重，两耳片的重量差即为耳肿胀的程度，结果经t检验，按[1]方法计算抑制率，见表9。

表9：桂枝茯苓微丸对小鼠耳肿胀的作用(n＝10，X±s)

^*P＜0.05，^**P＜0.01与正常对照组比较：

实验结果表明，与正常对照组比桂枝茯苓微丸高、中剂量组及桂枝茯苓丸高剂量组均能明显减轻小鼠耳肿胀程度；桂枝茯苓微丸的该作用有优于桂枝茯苓丸的趋势。

2.2.2桂枝茯苓微丸对大鼠棉球肉芽肿的影响取健康雄性Wistar大鼠70只，体重190g左右，按体重随机分为7组：正常对照组、桂枝茯苓丸高、中、低剂量组、桂枝茯苓微丸高、中、低剂量组，各组于乙醚浅麻下，无菌操作，将棉球(重50mg，经高压灭菌并加10mg/ml氨卞青霉素0.1ml/个棉球)植入大鼠左侧腋窝部皮下，同时各组按表10剂量灌胃相应药物，连续7天，第8天处死大鼠，剥离并取出棉球肉芽组织，于烘箱内80℃，4h干燥后称重，减去原棉球重量，即为肉芽肿净重，抑制率＝(对照组肉芽肿重-实验组肉芽肿重)/对照组肉芽肿重×100％。结果见表10。

表10：对大鼠棉球肉芽肿的影响(n＝10，x±S)

^*P＜0.05，^**P＜0.01与正常对照组比较：^△P＜0.05与同剂量的桂枝茯苓丸组比较

实验结果表明，桂枝茯苓微丸和桂枝茯苓丸与正常对照组比对大鼠棉球肉芽组织增生有明显的抑制作用，且同等剂量桂枝茯苓微丸对大鼠棉球肉芽肿的抑制作用明显优于桂枝茯苓丸。

3、镇痛实验

3.1小鼠热板实验取雌性昆明种小鼠，体重22g，55℃±0.5℃，两次预测痛阈平均值小于60S的动物70只，按痛阈随机分为7组：正常对照组、桂枝茯苓丸高、中、低剂量组、桂枝茯苓微丸高、中、低剂量组。按表11剂量灌胃给药1次，药后1h、2h各测痛阈1次，热板控温于55℃±0.5℃，以小鼠出现舔后足的时间秒(s)作为该鼠的痛阈。结果见表11。

表11：桂枝茯苓微丸对小鼠热板痛阈的影响(n＝10，X±S)

^*p＜0.05与对照组比较

从表中可以看出，各组给药后1h至2h小鼠的痛阈与对照组比较均有所延长，但只有桂枝茯苓丸的高剂量组有显著性差异，提示该品对该疼痛作用较弱。

3.2小鼠醋酸扭体实验取昆明种小鼠70只，体重22g左右，雌雄各半，按体重随机分为7组：正常对照组、桂枝茯苓丸高、中、低剂量组、桂枝茯苓微丸高、中、低剂量组。按表12剂量灌胃给药1次，灌胃容量为0.3ml/10g，药后1h每鼠腹腔注射0.4％的醋酸溶液0.1ml/10g，记录开始扭体的时间(潜伏期)和注射后20分钟内的各鼠的扭体次数，结果见表12。

表12：桂枝茯苓微丸对醋酸致小鼠扭体的影响(n＝10，X±S)

^*P＜0.05与正常对照组比较

结果表明，桂枝茯苓微丸高、中剂量组及桂枝茯苓丸高、中剂量组与正常对照组比小鼠的扭体潜伏期明显延长，扭体次数明显减少，二者之间的差别无显著意义。

4、桂枝茯苓微丸对大鼠血流变的影响

取Wistar大鼠80只，雌雄各半，体重250g，大鼠随机分为8组：正常对照组、模型对照组、桂枝茯苓丸高、中、低剂量组、桂枝茯苓微丸高、中、低剂量组，给药各组按表中剂量灌胃给药，正常对照组及模型对照组灌胃等容量的生理盐水，连续5天，于第4天，每只大鼠皮下注射0.1％的肾上腺素0.2ml，共注射2次并在其间进行1次冷刺激(正常对照组除外)，复制血瘀模型⁽¹⁾，于第5天药后2小时乙醚麻醉，心脏取血，测定全血粘度和血小板聚集率，结果见表13、14。

表13：桂枝茯苓微丸对血瘀大鼠血粘度的影响(n＝10，X±S)

^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001与模型对照组比较

^△△P＜0.01与同剂量桂枝茯苓丸组比较

由表13看出，模型对照组与正常对照组比大鼠的全血粘度高切(P＜0.01)、中切(P＜0.01)、低切(P＜0.001)均明显增高，说明造模成功。桂枝茯苓微丸三个剂量组及桂枝茯苓丸高、中与模型组比较，均能明显抑制全血粘度的增高，且同剂量的桂枝茯苓微丸降低血瘀大鼠血粘度的作用明显优于桂枝茯苓丸。

表14：桂枝茯苓微丸对血瘀大鼠血小板聚集的影响(n＝10，X±S)

^*P＜0.05，^**P＜0.01与模型组比较

由表14看出，与正常对照组比较造模后大鼠的血小板聚集率明显增加(P＜0.01)。桂枝茯苓微丸三剂量组均有一定的降低血小板聚集的作用；其中剂量组降低作用有显著性意义。

上述实验中，桂枝茯苓微丸设三个剂量组，其低剂量约相当于推荐临床等效量，中剂量组为2倍等效剂量，高剂量组为4倍等效剂量，桂枝茯苓丸各组所用剂量与桂枝茯苓微丸相应各组所用剂量相等。试验结果表明：

1.解痉作用：桂枝茯苓微丸三个剂量组对缩宫素所致的大鼠离体子宫平滑肌的收缩幅度和频率的增加均有明显的抑制作用。且该作用本制剂明显优于桂枝茯苓丸。这可能因为本制剂工艺改进后有效成分更容易溶出，起效更快有关。

2.抗炎作用：桂枝茯苓微丸高、中剂量组能明显减轻小鼠耳肿胀程度，该作用有优于同剂量的桂枝茯苓丸组的趋势；能明显抑制大鼠棉球肉芽肿的生长，高、中剂量组抑制棉球肉芽肿生长的作用强度明显优于同剂量的桂枝茯苓丸。表明桂枝茯苓微丸有良好的抗炎效果。

3.镇痛作用：桂枝茯苓微丸有提高小鼠对热刺激的痛阈的趋势；能明显减少小鼠的扭体次数，延长潜伏期，其作用与桂枝茯苓丸相似。表明本品对热刺激所致疼痛作用较弱，对化学刺激性刺激所致疼痛作用较明显。表明桂枝茯苓微丸有一定镇痛作用。

4.活血化瘀作用：桂枝茯苓微丸能明显降低血瘀大鼠的全血粘度，桂枝茯苓微丸高剂量组降低血瘀大鼠血粘度的作用明显优于同剂量的桂枝茯苓丸；对血瘀大鼠血小板聚集的有一定的抑制作用。表明本品有较强的活血化瘀作用，优于桂枝茯苓丸。

综上所述，桂枝茯苓微丸具有明显的平滑肌解痉作用、抗炎作用、镇痛作用及活血化瘀作用，且其抑制缩宫素致离体子宫平滑肌收缩作用、降低血瘀大鼠全血粘度作用、抑制大鼠棉球肉芽肿作用明显优于桂枝茯苓丸。

Claims (10)

1.一种桂枝茯苓微丸的制备方法，其特征是包括以下步骤：

(1)将茯苓磨成细粉待用；

(2)将桂枝加入6-8质量倍的水中，温浸后用挥发油提取器提取挥发油，提取完毕后保存挥发油，将药液和药渣分离待用；

(3)将牡丹皮粉碎，加入15-25质量倍的水温浸，然后用水蒸气蒸馏收集牡丹皮8-15质量倍的蒸馏液，蒸馏液冷藏析出结晶，过滤后将结晶保存，滤液中加入氯化钠继续蒸馏提取，收集收集牡丹皮3-5质量倍的蒸馏液，蒸馏液再次冷藏析出结晶，过滤后将两次结晶合并，干燥后保存；

(4)将桂枝、牡丹皮的药渣和赤芍、桃仁混合，用水煎煮三次，将煎煮液合并；

(5)将煎煮液与桂枝提取挥发油后的药液、牡丹皮水蒸气蒸馏提取结晶后的药液合并，浓缩为60℃下相对密度为1.14～1.18的浸膏，加入乙醇至含醇量达50-70体积％，搅匀，冷藏后过滤，滤液备用；

(6)将桂枝挥发油和牡丹皮提取的结晶混合，用乙醇溶解后，用β-环糊精进行包结，得包结物；

(7)取步骤(5)滤液的一小部分，回收乙醇得相对密度在60℃下测为1.34-1.38的浸膏，在浸膏中加入步骤(1)中茯苓细粉的一小部分，减压干燥得干浸膏，干浸膏与的包结物的一小部分混合，粉碎，得浸膏粉；

(8)取步骤(5)滤液的一小部分，回收乙醇至含醇量为30％，然后加入茯苓细粉和包结物的一小部分，得浸膏；

(9)将剩余的步骤(5)的滤液回收乙醇，得60℃下相对密度为1.20-1.24的浸膏，然后在浸膏中加入剩余的茯苓细粉和包结物，加水得室温下相对密度为1.14-1.16的流浸膏；

(10)以流化床制粒法制备微丸，过程为：将浸膏粉作为模芯，以浸膏作为黏合剂起母模丸得粒径为250～355μm的母模丸，然后以流浸膏作为喷浆增大剂，在母模丸表面喷洒流浸膏得粒径500～600μm的微丸，微丸以羟丙基甲基纤维素包衣，得桂枝茯苓微丸。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(6)中，包结物的制备过程为：将步骤(2)的挥发油和步骤(1)的结晶混合，用乙醇溶解，然后加入混合物6-10质量倍的β-环糊精，再加入β-环糊精2质量倍的水，研磨1h，研磨后在40℃以下干燥，得包结物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是：包结物的制备过程中，β-环糊精的加入量为混合物质量的8倍。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(7)中，制备浸膏粉所需的组分为：步骤(5)中滤液的3-5wt％，步骤(1)中茯苓细粉的3-5wt％，步骤(6)中包结物的3-5wt％。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：步骤(8)中，制备浸膏所需的组分为：步骤(5)中滤液的5-7wt％，步骤(1)中茯苓细粉的5-7wt％，步骤(6)中包结物的5-7wt％。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征是：步骤(2)中，温浸1-2h，提取4-5h；步骤(4)中，每次煎煮加入6-10质量倍的水，每次煎煮1-2h。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是：步骤(2)中，桂枝加入7质量倍的水中；步骤(3)中牡丹皮加入20质量倍的水中，第一次收集牡丹皮10质量倍的蒸馏液；步骤(4)中，每次加8质量倍的水；步骤(5)中，浸膏加入乙醇至含醇量达60体积％。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征是：在喷气流量300L/min、喷气压强2.3bar、输液泵转速15r/min、转盘电机转速25Hz、进风温度60℃、物料温度50℃的条件下制备母模丸。

9.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征是：在喷气流量250L/min、喷气压强2.2bar输液泵转速20r/min、转盘电机转速25Hz、进风温度55℃、物料温度50℃的条件下喷洒流浸膏，得微丸。

10.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征是：包衣时，羟丙基甲基纤维素溶液的质量分数为35-40％，羟丙基甲基纤维素溶液的流速为2ml/min，雾化压力为2.0bar，进风温度为60℃，待包衣液喷完后继续鼓风干燥30min。

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